8/16/2019 Secuenciación automática
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INTRODUCCIÓN
Cada nucleótido está formado por un azúcar: ladesoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser de
cuatro tipos diferentes: adenina (A), guanina (G), citosina
(C) timina (!) un grupo fosfato"
#a estructura de un determinado A$% está definida por la
ordenación o &secuencia& de las bases nitrogenadas enla cadena de polinucleótidos, residiendo precisamente en
esta secuencia de bases la información gen'tica del
A$%"
#a estructura en doble 'lice del A$%, con elapareamiento de bases limitado (A!* GC), implica que
el orden o secuencia de bases de una de las cadenas
determina automáticamente el orden de la otra, por ello
se dice que las cadenas son complementarias"
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SECUENCIACIÓN DE ADN
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Métodos clásicos de secuenciación
Método químico de Maxam y Gilbert Método enzimático de Sanger
Secuenciación automática empleando el método enzimático Secuenciación con cebadores fluorescentes Secuenciación con terminadores fluorescentes
Secuenciadores automáticos
Secuenciadores capilares Secuenciadores en geles desnaturalizantes
Equipamiento
Secuenciador en geles ABI 377 Modo operativo: Preparación de las muestras.
Otros métodos de secuenciación automática de ADN
Secuenciación de ADN empleando microarrays Pirosecuenciación
http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htm
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Gracias a la +C, la &insuficiente cantidad de A$%& a no esuna limitación en la in-estigación en .iolog/a 0olecular, ni en
los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio del
A$%" 1l número de aplicaciones de esta t'cnica parecen
infinitas, continúan creciendo sin parar" 2na de sus posibles
aplicaciones se centra en la secuenciación del A$% demuestras biológicas"
PCR
Investigación
forense
Aislamiento
de genes
Estudios de
identidad y filiación
Mutagénesis
dirigida
Diagnóstico de
enfermedades
hereditarias y cáncer
Diagnóstico
de genes
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MÉTODOS CLÁSICOS DESECUENCIACIÓN
#os dos protocolos clásicos de secuenciación (m'todo
qu/mico enzimático) comparten etapas comunes"
Marcado: 1s necesario marcar las mol'culas a secuenciar
radiacti-a o fluorescentemente
Searación: Cada protocolo genera una serie de cadenassencillas de A$% marcadas cuos tama3os se diferencian en
una única base" 1stas cadenas de distintas longitudes
pueden separarse por electroforesis en
geles desnaturali!antes de acrilamidabisacrilamidaurea,
donde aparecen como una escalera de bandas cua longitud
-ar/a en un único nucleótido"
+ara obtener estas cadenas
se emplean dos procedimientos:
http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/ayuda1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/ayuda1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/ayuda1.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/ayuda1.htm
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MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM YGILBERT
1sta t'cnica consiste en romper cadenas de A$% de
cadena sencilla marcadas radiacti-amente con
reacciones qu/micas espec/ficas para cada una de las
cuatro bases"
#os productos de estas cuatro
reacciones se
resuel-en, por electrofor'sis,
en función de su tama3o en
geles de poliacrilamida donde
la secuencia puede leerse
en base al patrón de bandas
radiacti-as obtenidas"
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MÉTODO ENZIMÁTICO DESANGER
Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador,
cebador o "primer" complementario de una región
del ADN molde anterior a donde va a iniciarse lasecuencia.
Este cebador se utiliza como
sustrato de la enzima ADN
polimerasa I que va a
extender la cadena
copiando de forma
complementaria el molde
de ADN.
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SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICAEMPLEANDO EL METODO ENZIMÁTICO
Es una alternativa al método de Sanger. Consisteen marcar el oligo cebador o los terminadores conun compuesto fluorescente y activar la reacción
de secuencia. Los productos de la reacción sedetectan directamente durante la electroforésis alpasar por delante de un láser que al excitar losfluoróforos permite detectar la fluorescenciaemitida.
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SECUENCIACIÓN EMPLEANDO CEBADORESFLUORESCENTES
4e realizan cuatro
reacciones de secuencia
distintas en cada una de
las cuales se a3ade eloligonucleótido o cebador
marcado con una sonda
fluorescente distinta un
dd%!+ diferente en cada
una de ellas" Al finalizar
las cuatro reacciones se
mezclan en un único tubo
Ó
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SECUENCIACIÓN EMPLEANDOTERMINADORESFLUORESCENTES
4e realiza una única reacción de secuencia en presencia
de los cuatro dd%!+s, cada uno de ellos marcados con
una sonda fluorescente distinta"
$e modo alternati-o, la secuenciación puede lle-arse a
cabo empleando terminadores marcados cada uno con unfluoróforo diferente" 1sta qu/mica es mas sencilla porque
permite lle-ar a cabo la reacción en un solo tubo, en que
se a3aden los cuatro terminadores marcados"
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SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS
Secuenciadores automáticos cailares
1xisten instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan
una alternati-a clara al sistema basado en geles de
acrilamida5bisacrilamida donde este soporte a sido sustituido
por un pol/mero que se inecta de forma automática en un
capilar antes de cargar la muestra de
secuenciación* las muestras se -an
analizando una a una" 1ste tipo de
secuenciadores se utiliza para lecturas
no superiores a unos 678pb"
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SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EN GELESDESNATURALIZANTES DE ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA
#a secuenciación automática mediante geles
desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de
acrilamida5bisacrilamida entre dos cristales montados
adecuadamente sobre el cassette que sir-e de soporte para
los mismos que posteriormente se acoplará en el
secuenciador automático para proceder a la carga de la
muestras"#a secuenciación automática
mediante geles desnaturalizantes, se
realiza polimerizando un gel de
acrilamida5bis entre dos cristalesmontados adecuadamente sobre el
cassette que sir-e de soporte para los
mismos que posteriormente se
acopla en el secuenciador automático
para proceder a la carga de lamuestras"
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EQUIPAMIENTO
Secuenciador automático ABI 377
9ntroducir en un tubo de +C la muestra de A$% de doble cadena, el
primer a utilizar la mezcla de reacción9+rogramar la reacción de +C (multiplicación del A$%) sometiendo lamezcla anterior a ;7 ciclos de las siguientes caracter/sticas: C
(desnaturalización), ?7s a 67>C (anillamiento) 6min" a @8>C (elongación)"91nfriar el tubo a 6>C9+urificar el resultado de la reacción de secuencia de +C, en una
solución de etanol cloruro magn'sico: dear precipitar la mezcla,
centrifugar eliminar por aspiración el etanol"9esuspender el resultado de la reacción de +C en un peque3o -olumen
de formamida: azul de dextrano"9$esnaturalizar la muestra calentándola durnte ; min" a =8>C" 1nfriar en
ielo"
9Cargar los fragmentos de A$% fluorescentes en el gel de secuencia"
http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/abi377.htmhttp://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/abi377.htm
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OTROS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
Secuenciación de AD" emleando microarrays
Princiio:
1xisten mucas -ariedades de microarras o A$%cips como
tambi'n se les denomina" .ásicamente un microarra consiste
en una matriz de &pocillosB microminiaturizados sobre un
substrato de -idrio en donde se
implantan, utilizando di-ersas t'cnicas, cadenas simples de
oligonucleótidos"
1l poder aderir una cadena corta de oligo
4obre una superficie plana es decisi-o en el dise3o de los
microarras"
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$ado que conocemos la secuencia distribución
de los oligonucleótidos en el microarra podemos,
al excitar el microarrra con un laser estar las
cadenas ibridadas fluorescentemente, conocer laubicación de las cadenas de las mismas su
secuencia"
#isuali!ación t$ica de una secuenciación mediante microarrays
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Pirosecuenciación
4e trata de un m'todo simple consistente, útil para la
secuenciación de fragmentos de A$% de tama3os
peque3os o medianos"
1tapas del proceso:
9 2n cebador espec/fico se une a una cadena de A$%sencilla en presencia de d%!+4, A$% polimerasa, A!+
sulfurilasa, luciferasa apirasa as/ como de los
sustratos A+4 (adenosina 7 fosfosulfato) luciferina"
9
1l primero de los cuatro d%!+s se a3ade a la reacción"#a A$% polimerasa cataliza su incorporación a la
cadena* si este d%!+ es complementario de la
secuencia del A$% molde se libera ++i en una cantidad
equimolar a la cantidad de nucleótido incorporado"
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APLICACIONES DE LA SECUENCIACIÓN DE ADN
$etección de mutaciones
4ecuenciación de A$%s fósiles
$iagnóstico de enfermedades gen'ticas
dentificación de especies control de cruces
entre animales
+roecto genoma umano
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PROYECTO GENOMA HUMANO
1l +roecto Genoma umano es un proecto
internacional cuo obeti-o final es obtener una
descripción completa del genoma umano a tra-'s
de la secuenciación del A$%" 1l genoma que se
in-estiga es el genoma nuclear"
$esde su inicio, el proecto a
sido ustificado especialmente por los
beneficios m'dicos que se espera
obtener del conocimiento de la
estructura de cada gen umano"
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