PRCTICA 6 SEPARACIN ELECTROFORTICA DE PROTEINAS SRICAS
SOBRE ACETATO DE CELULOSA
1. Introduccin terica El fenmeno de electroforesis, se basa en
el desplazamiento de partculas portadoras de carga a travs de
un medio lquido, bajo la influencia de un campo elctrico
aplicado. La aplicacin de este fenmeno a la separacin de los
componentes de una mezcla compleja hace
necesaria la existencia de diferentes velocidades de migracin,
que a su vez dependen del campo elctrico aplicado. De aqu que se
defina el concepto de movilidad electrofortica (m) como la
velocidad de migracin para un campo elctrico de gradiente potencial
unidad:
EVm =
La movilidad es proporcional a la relacin Carga/masa. Pudindose
alterar por otros factores, tales como
volumen de la partcula cargada, posibilidad de solvatacin,
interacciones inicas, viscosidad del medio .... . Por eso se hace
necesario controlar adecuadamente las condiciones experimentales
(pH, temperatura, fuerza inica,...) de forma que si las nicas
variables son el tiempo de migracin y el gradiente de potencial
aplicado, los valores obtenidos para la movilidad pueden ser
reproducibles.
De entre los diferentes tipos de electroforesis existentes, la
ms empleada para separar las protenas del
suero sanguneo es la electroforesis de zona, con ella se
consigue una distribucin de los componentes de las zonas
perfectamente delimitadas, puesto que las partculas cargadas se
desplazan a velocidades constantes a travs de un medio soporte.
La utilizacin de los diferentes soportes modificar las
movilidades y, por lo tanto, el tiempo necesario de
aplicacin del potencial, para poder realizar una separacin
completa entre los distintos componentes del suero. Las
macromolculas de protenas se comportan como partculas coloidales
cargadas. Las cargas positivas
son portadas por las funciones bsicas de restos de lisina,
arginina y los aminocidos N-terminales, mientras que las negativas
las proporcionan los grupos carboxlicos de los restos glutmico,
asprtico y los aminocidos C-terminales. La carga total ser la que
condicione la movilidad electrofortica y aquella a su vez est
condicionada por el pH del medio, pues es conocido que a pH cido se
inhibe la disociacin de los grupos cidos y con un pH bsico se
consigue reprimir la disociacin de los grupos bsicos. Entre estos
valores extremos de pH existe el denominado punto isoelctrico
(p.i.) que es el pH para el cual una protena en disolucin salina
presenta una carga global nula, es decir, el mismo nmero de cargas
positivas y negativas.
Si una disolucin de protenas se somete a la accin de un campo
elctrico se producir una migracin
cuyo sentido y velocidad depender de la carga neta, magnitud y
forma de las molculas. En la zona de pH menor que el p.i. las
protenas se comportan como cationes y si el pH del medio es
superior al p.i. se comportan como aniones.
A partir de pH 8.4 las protenas sricas migran hacia el nodo, la
albmina con un p.i. de 4.7 estar cargada
ms negativamente que la -globulina que tiene un p.i. de 7.2, la
albmina recorrer mayor distancia que la -globulina cuando se siten
en un campo elctrico. Las fracciones que se obtienen son:
-Albmina (la ms negativa) -1-globulina -2-globulina --globulina
--globulina (la menos negativa) Para identificar la presencia y
separacin de protenas hay que realizar un revelado mediante
colorantes
cidos (azul de bromofenol, negro amido, rojo Ponceau A, etc...)
que se fijan sobre las funciones bsicas de las protenas. El exceso
de colorante se arrastra con mezclas actico-agua,
metanol-actico-agua.
Existen dos procedimientos para cuantificar las fracciones
electroforticas: a)Por densitometra: se emplea un fotmetro que
permite cuantificar el colorante fijado a diferentes
distancias del punto de aplicacin de las protenas, y con ello la
representacin grfica de la separacin y que se conoce como espectro
electrofortico.
b)Por elucin, cortando el soporte correspondiente a las zonas de
separacin observadas y eluyendo el
colorante fijado en el disolvente adecuado. La medida posterior
de la absorbancia de estas disoluciones permite calcular la
proporcin de las fracciones separadas.
