BACKGROUND  

•  During  aging,  the  immune  system  becomes  less  ef5icient  in  deterring  invaders,  infections,  and  disease.    

•  It  is  currently  known  that  aging  of  hematopoietic  stem  cells  (HSCs)  leads  to  an  increased  production  of  myeloid  cells  and  a  decreased  production  of  T  and  B  cells.  How  this  clonal  phenotype  arises  remains  inconclusive.    

•  To  better  understand  the  aging  process  ,  it  is  important  to  examine  the  clonal  behavior  of  the  heterogeneous  stem  cell  population  over  time.  

Tracking  Hematopoietic  Stem  Cells  in  vivo  Over  Time  Keck  School  of  Medicine  of  USC  

Mike  Chin,  Rong  Lu  

METHODS  

Figure  1.  Genetic  barcoding  and  tracking  of  HSC  clones  in  vivo.  Donor  HSCs  were  isolated  from  the  bone  marrow  of  mice.  HSCs  (ckit+/lineage(CD3,CD4,  CD8,B220,Gr1,Mac1,Ter119)-­‐Sac1+/CD34-­‐/CD150+/Flk2-­‐)  were  infected  with  a  lentiviral  vector  so  that  each  HSC  received  a  unique  barcode.  Mice  were  lethally  irradiated  and  transplanted  with  barcoded  HSCs.    Peripheral  blood  was  collected  from  recipient  mice  at  several  time  points  over  1  year.  Genomic  DNA  from  granulocytes,  B,  CD4T,  and  CD8T  cells  were  quanti5ied  with  high  throughput  sequencing.      

Figure  2.  HSC  production  changes  over  time.  The  proportion  of  granulocytes,  B,  CD4T,  and  CD8T  cells  relative  to  total  number  of  white  blood  cells  was  examined  on  Day  61,  117,  297,  362.    Myeloid  production  is  seen  to  increase  while  lymphoid  production  is  seen  to  decrease  over  these  4  time  points.  

BLOOD  PRODUCTION  OVER  TIME  

REFERENCES    Lu  R,  Neff  NF,  Quake  SR,  Weissman  IL.  (2011)  Tracking  single  hematopoieCc  stem  cells  in  vivo  using  

 high-­‐throughput  sequencing  in  conjuncCon  with  viral  geneCc  barcoding.  Nat  Biotechnol.  29,    928-­‐33.  

Leventhal  J,  Miller  J,  Abecassis  M,  Tollerud  DJ,  Ildstad  ST.  (2013)  Evolving  approachs  to  hematopoieCc    stem  cell-­‐based  therapies  to    induce  tolerance  to  organ  transplants:  the  long  road  to    tolerance.  Clin.  Pharmacol  Ther.  93,  36-­‐45.  Weissman  IL,  Shizuru  JA.  (2008)  The  origins  of  the  idenCficaCon  and  isolaCon  of  hematopoieCc  stem  

 cells,  and  their  capability  to    induce  donor-­‐specific  transplantaCon  tolerance  and  treat    autoimmune  diseases.  Blood.  112,  3543-­‐53.  

F    Med

ian  Pe

rcen

tage  

Figure  3.  Lineage  bias  of  HSC  clones  varies  over  time.    (A-­‐D)  Proportion  of  granulocyte,  B,  CD4T,  CD8T  clones  from  irradiated  recipients  on  days  61,  117,  297,  362  were  examined  for  clonal  lineage  bias.    Lineage-­‐biased  clones  are  de5ined  as  those  whose  relative  copy  numbers  in  one  lineage  are  more  than  2.4142  (cotangent  22.5  degree)  times  their  relative  copy  numbers  in  the  other  lineage.    (E-­‐H)  Histograms  indicate  clonal  lineage  bias  behavior  over  time.  Clones  are  assigned  a  score  from  -­‐1.0  to  1.0,  indicating  the  relative  bias.    

Figure  4.  Dominant  clone  production  varies  with  cell  type  over  time.    (A-­‐B)  Clonal  dominance  is  de5ined  as  the  percentage  of  a  cell  population  contributed  by  the  top  3  or  top  5  most  abundant  clones.    Averages  for  top  clones  are  plotted  for  all  cell  types  over  days  61,  117,  297,  and  362.  (C)  Heat  map  examining  clonal  contribution  over  time  for  each  cell  type.  Each  horizontal  line  represents  a  clone.  Bright  red  indicates  high  clonal  production.  

0  

20  

40  

60  

80  

Granulocyte  Bias   Balance   CD8T  Bias  

Clon

al  Com

posiC

on  (%

)  

*

* *

*

0  

20  

40  

60  

80  

100  

CD4T  Bias    Balance     CD8T  Bias  

*** ***

*** *** *** ***

*

*

Gr  Bias   B  Bias  

D61   D117   D297   D362  

0  

10  

20  

30  

40  

50  

60  

Granulocyte     B   CD4  T   CD8T  

Bloo

d  compo

siCon

(%)  

*** ***

**

*** ***

*** **

** ***

** ** **

*** **

Med

ian  Pe

rcen

tage  

Med

ian  Pe

rcen

tage  

Med

ian  Pe

rcen

tage  

0  

10  

20  

30  

40  

50  

Granulocyte  Biased  

Balance   B  Cell  Biased    

Clon

al  Com

posiC

on  (%

)  

0  10  20  30  40  50  60  70  

Granulocyte  Bias    Balance     CD4T  Bias  

* *

Gr  Bias   B  Bias   Gr  Bias   B  Bias   Gr  Bias   B  Bias  

C    

CLONAL  LEVEL  LINEAGE  BIAS   CLONAL  DOMINANCE  

H    

G    

E    

A    

D    C    

B    

Gr  Bias   CD4T  Bias   Gr  Bias   CD4T  Bias   Gr  Bias   CD4T  Bias   Gr  Bias   CD4T  Bias  

Gr  Bias   CD8T  Bias   Gr  Bias   CD8T  Bias   Gr  Bias   CD8T  Bias   Gr  Bias   CD8T  Bias  

CD4T  Bias   CD8T  Bias   CD4T  Bias   CD8T  Bias   CD4T  Bias   CD8T  Bias  CD4T  Bias   CD8T  Bias  

A    

cv  

0  

10  

20  

30  

40  

50  

D61   D117   D297   D362  

Clon

al  Com

posiC

on  (%

)  

*

*

0  

10  

20  

30  

40  

50  

60  

70  

D61   D117   D297   D362  

*

*

TOP  3     TOP  5    

D61   D117   D297   D362   D61   D117   D297   D362   D61   D117   D297   D362   D61   D117   D297   D362  

Granulocyte   CD4T    B     CD8T    

D61   D117   D297   D362  

D61   D117   D297   D362  

D61   D117   D297   D362  

B    

cv