UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA FLORESTAL
UM ESTUDO DE SIMULAÇÃO A PARTIR DE DADOS
DE MARCADORES MICROSSATÉLITES EM
FRAGMENTOS DE Luehea divaricata Mart. & Zucc. NO
BIOMA PAMPA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Caetano Miguel Lemos Serrote
Santa Maria, RS, Brasil.
2015
UM ESTUDO DE SIMULAÇÃO A PARTIR DE DADOS DE
MARCADORES MICROSSATÉLITES EM FRAGMENTOS DE
Luehea divaricata Mart. & Zucc. NO BIOMA PAMPA
Caetano Miguel Lemos Serrote
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação
em Engenharia Florestal, Área de Concentração em Silvicultura, da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS),
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Engenharia Florestal.
Orientadora: Profª Drª Lia Rejane Silveira Reiniger
Co-orientador: Valdir Marcos Stefenon
Santa Maria, RS, Brasil.
2015
© 2015 Todos os direitos autorais reservados a Caetano Miguel Lemos Serrote. A reprodução de partes ou do todo deste trabalho só poderá ser feita mediante a citação da fonte. E-mail: [email protected]
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
UM ESTUDO DE SIMULAÇÃO A PARTIR DE DADOS DE
MARCADORES MICROSSATÉLITES EM FRAGMENTOS DE Luehea
divaricata Mart. & Zucc. NO BIOMA PAMPA
elaborada por
Caetano Miguel Lemos Serrote
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Engenharia Florestal
COMISSÃO EXAMINADORA:
Lia Rejane Silveira Reiniger, Drª (UFSM)
(Presidente/Orientadora)
Valdir Marcos Stefenon, Dr. (UNIPAMPA)
(Co-orientador)
Aline Ritter Curti, Drª (UFPEL)
Berta Maria Heinzmann, Profa Drª (UFSM)
Santa Maria, 21 de agosto de 2015.
“A tarefa não é tanto ver aquilo que
ninguém viu, mas pensar o que ninguém
ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.”
Arthur Schopenhauer
“Alguns homens vêem as coisas como são, e dizem „Por quê?‟
Eu sonho com as coisas que nunca foram e digo „Por que não?'”
Geroge Bernard Shaw
Dedico esse trabalho à memória dos meus pais,
Miguel Lemos Serrote e Lúcia Sizela, cujos
feitos com amor, carinho e dedicação,
me transformaram no homem que sou.
Ofereço com o mesmo amor ao meu filho
Daniel para que sirva de inspiração nessa
caminhada rumo à construção de sonhos.
AGRADECIMENTOS A Deus que me deu a vida e me dá inspiração para realizar todos os meus sonhos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal da Universidade Federal de Santa
Maria e ao CNPq pelo apoio material e financeiro para minha formação.
A Universidade Lúrio pela liberação e apoio financeiro para a realização desse sonho.
A minha esposa, Angelina, grande amor da minha vida, pelo carinho e dedicação na
construção da família que juntos sonhamos. Agradeço também pelo companheirismo,
compreensão, cumplicidade, incentivo e paciência. Te amo, Lina!
Aos meus irmãos e demais familiares pelos conselhos valiosos, carinho, apoio moral e
financeiro, sobretudo, por poder contar convosco sempre que necessário. Compartilho este
sucesso que pertence a toda família.
A minha orientadora, professora Dra. Lia Rejane Silveira Reiniger, pelos valiosos
conhecimentos transmitidos, pelo excelente profissionalismo e rigor, combinados com muita
simplicidade, atenção e amizade, ingredientes determinantes para o sucesso deste trabalho.
Agradeço pela confiança em mim depositada e pela oportunidade concedida para encarar este
desafio importante para meu crescimento na carreira acadêmica.
Ao meu coorientador, professor Dr. Valdir Marcos Stefenon, pela excelente contribuição na
realização deste trabalho, pelo tempo a mim dedicado e pela amizade.
Aos amigos, Adriel Oliveira, Aldeize Santos, Carol Weimann, Chimica Francisco, Gonçalves
Dauala, Leonardo Costa, Luciano Moura, Noé Hofiço, Paulo Fernando, Quemile Martins,
Sabrina Finatto, Taissane Rodrigues, os quais contribuíram imenso para minha adaptação na
cidade e na universidade. Obrigado pela parceria.
Aos colegas de Laboratório, Aline Curti, Aline Paim, Amistrong Mafaldo, Carla Moro,
Charlene Kunz, Charlene Stefanel, Clarissa Gomes, Enrique Benitez León, Éric Gindri, Iana
Somavilla, Karol Buron, Larissa Bittencourt, Leandro Dutra, Leonardo Costa, Marina
Scheuer, Silvia Machado, pela disponibilidade em ajudar e ensinar, pelos momentos bons que
passamos nessa página de vida de muito aprendizado.
Aos colegas de outros laboratórios e amigos que fiz durante a formação, muito obrigado pelo
acolhimento, companheirismo e carinho. Passei com vocês por momentos muito bons os quais
irei me lembrar com muito carinho.
Muito obrigado a todos!
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
UM ESTUDO DE SIMULAÇÃO A PARTIR DE DADOS DE MARCADORES
MICROSSATÉLITES EM FRAGMENTOS DE Luehea divaricata Mart. & Zucc.
NO BIOMA PAMPA
AUTOR: CAETANO MIGUEL LEMOS SERROTE
ORIENTADORA: LIA REJANE SILVEIRA REINIGER
CO-ORIENTADOR: VALDIR MARCOS STEFENON
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 21 de agosto de 2015.
No presente trabalho foram utilizados dados de marcadores de DNA do tipo microssatélites
em simulações para estudar padrões genéticos, ecológicos e reprodutivos que contribuíram
para a estrutura genética de cinco fragmentos da espécie arbórea florestal Luehea divaricata
Mart. & Zucc, em desenvolvimento em área brasileira do bioma Pampa. Várias taxas de
autofecundação e de migração foram simuladas, tendo como critério de seleção a
heterozigosidade observada e a heterozigosidade esperada, com valores de 0,52 e 0,64,
respectivamente (com base em marcadores microssatélites). Os resultados permitiram
caracterizar a população, quanto ao modo reprodutivo, como mista com predominância de
cruzamentos (taxa = 0,7), sugerindo a presença de algum sistema de autoincompatibilidade
nessa espécie, o qual reduz, mas não impede a autofecundação. A baixa migração (taxa =
0,02) sugere isolamento por distância entre os fragmentos, que aumentou os coeficientes de
endogamia. Com base nos índices de diversidade genética de Nei, apenas 6% da variabilidade
genética está distribuída entre os fragmentos e 94%, dentro, devido à elevada taxa de
cruzamentos observada. Os parâmetros para conservação genética (População Mínima Viável
e Área Mínima Viável), determinados para conservação em curto e longo prazo, sugerem que
somente o fragmento da Fazenda Inhatinhum apresentou potencial para persistência em curto
prazo. Porém, em longo prazo nenhum dos fragmentos se mostrou viável, necessitando assim
de uma intervenção urgente de modo a evitar seu declínio, sendo a criação de corredores
ecológicos uma alternativa útil para conectar os fragmentos através do fluxo gênico entre si. A
importância dos aplicativos computacionais para a simulação de parâmetros genéticos,
ecológicos e reprodutivos populacionais, foi claramente evidente no neste estudo,
demonstrando seu potencial na antecipação de fenômenos futuros, permitindo, assim, a
identificação de populações prioritárias para a conservação.
Palavras-chave: Simulação em Easypop. Fluxo Gênico. Modo Reprodutivo. Conservação.
ABSTRACT
Master Degree Dissertation
Post-Graduation Course in Forest Engineering
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brazil
A SIMULATION STUDY FROM MICROSATELLITE MARKERS DATA ON Luehea
divaricata Mart. & Zucc. FRAGMENTS OF THE PAMPA BIOME
AUTHOR: CAETANO MIGUEL LEMOS SERROTE
ADVISOR: LIA REJANE SILVEIRA REINIGER
CO-ADVISOR: VALDIR MARCOS STEFENON
Date and Place of Defense: Santa Maria, RS, August 21, 2015.
The objective was to use microsatellite DNA markers in simulations to study genetic,
ecological and reproductive patterns that contributed to the genetic structure of five fragments
of the forest tree species Luehea divaricata Mart. & Zucc, growing in the Pampa biome
(Brazil). Various rates of selfing and migration were simulated. Selection criteria included
observed and expected heterozygosity, whith values of 0,52 and 0,64, respectively (based on
microsatellite markers). Reproductive mode was mixed, with a predominance of outcrosses
(rate = 0,7), consistent with a self-incompatibility system in this species, which reduced but
did not prevent self-fertilization. Migration at the rate of 0,02, implied existence of isolation
by distance between fragments, which increased inbreeding coefficients. Based on Nei‘s gene
diversity analysis, only 6% of genetic variability was distributed among fragments, with 94%
inside them, due to the high outcrosses observed. Parameters for genetic conservation,
namely, Minimum Viable Population and Minimum Viable Area, determined for conservation
in the short and long terms, suggested that only the Inhatinhum fragment had the potential to
maintain its genetic diversity in the short term. However, in the long term, none of the
fragments proved feasible, thus requiring urgent intervention to prevent a decline, with
creation of ecological corridors as a useful alternative to connect fragments through gene
flow. The importance of computer programs for simulation of genetic, ecological and
reproductive population parameters were clearly evident, demonstrating its potential for
predicting future phenomena, thereby enabling identification of priority populations for
conservation.
Keywords: Easypop Simulation. Gene Flow. Reproductive Mode. Conservation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação esquemática dos principais modelos de mutação: A – modelo de
sítios infinitos; B – modelo de alelos infinitos; C – modelo de mutação passo a passo. Fonte:
Ethier e Griffiths (1987); Walsh (2002). .................................................................................. 42
Figura 2 – Modelos de fluxo gênico. A: Modelo de alpondras (stepping stone) uni-
dimensional; B: Modelo de alpondras (stepping stone) bi-dimensional; C: Modelo de ilhas; D:
Modelo de ilha hierárquico; E: Modelo de isolamento por distância; F: Modelo continente-
ilha. Fonte: KIMURA e WEISSS (1964); BALLOUX (2001); ZUCCHI (2002); JOMBART
et al. (2010) ............................................................................................................................... 46
Figura 3 – Locais identificados de ocorrência natural de açoita-cavalo (Luehea divaricata
Mart. & Zucc.) no Brasil. Fonte: Carvalho (2008). .................................................................. 58
Figura 4 – Localização geográfica dos fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc.
estudadas. A: Delimitações do Pampa strictu sensu no sul do Brasil, com a área amostral
destacada na Figura. B: Localização dos cinco fragmentos de L. divaricata plotados nas
imagens de satélite do bioma Pampa, usadas na caracterização molecular e simulações do
presente estudo. Fonte: Nagel et al. (2015). ............................................................................. 61
Figura 5 – Distribuição espacial das cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc.
com as duas coordenadas geográficas inseridas sobre o mapa. Fonte: adaptado de Nagel et al.
(2015). ...................................................................................................................................... 62
Figura 6 – Comportamento da heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada
(Hs) em função da taxa de migração para as autofecundações de 0,3 e 0,5 de cinco fragmentos
de L. divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul.
Santa Maria, RS, 2015. ............................................................................................................. 67
Figura 7 – Evolução do número de alelos com o passar das 400 gerações de cinco fragmentos
de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do
Sul. Santa Maria, RS, 2015. ..................................................................................................... 72
Figura 8 – Comportamento da heterozigosidade observada (Ho) e esperada (Hs) ao longo das
gerações de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no
bioma Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015. ..................................................... 73
Figura 9 – Heterozigosidade observada e esperada considerando a taxa de migração de 1% de
cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa,
Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015. ............................................................................. 78
Figura 10 – Heterozigosidade observada e esperada considerando a taxa de migração de 90%
de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma
Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015. ................................................................ 78
Figura 11 – Diferenças entre as heterozigosidades (Hs-Ho) e índices de fixação em função do
número de gerações de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em
desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015. .................... 79
Figura 12 – Plotagem das estatísticas F de Wright para uma taxa de migração de 0,02 de cinco
fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio
Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015. .................................................................................... 80
Figura 13 – Plotagem das estatísticas F de Wright para uma taxa de migração de 0,9 de cinco
fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio
Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015. .................................................................................... 80
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Esquema de análise de variância molecular (AMOVA) para locos com dois alelos.
.................................................................................................................................................. 33
Tabela 2 – Estimativas de heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada (Hs)
geradas por simulações no programa EASYPOP (BALLOUX, 2001) sob diferentes taxas de
autofecundação e de migração, de cinco fragmentos de L. divaricata Mart. & Zucc. em
desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul. .......................................................... 64
Tabela 3 – Estimativas de heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada (Hs)
geradas por simulações no programa EASYPOP (BALLOUX, 2001), em função de diferentes
taxas de autofecundação, taxas de migração, números de locos e números de estados alélicos
possíveis, de cinco fragmentos de L. divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma
Pampa, Rio Grande do Sul. ...................................................................................................... 66
Tabela 4 – Valores de heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada (Hs) em
função de diferentes taxas de migração, obtidos em simulações no programa EASYPOP
(BALLOUX, 2001), de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em
desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul, considerando a taxa de
autofecundação de 0,3, número de locos igual a 10 e número de estados alélicos possíveis
igual a 50. ................................................................................................................................. 68
Tabela 5 – Número de indivíduos no fragmento (N), número de alelos (Na), riqueza alélica
(Ar), Hs = heterozigosidade esperada (Hs), Fis=coeficiente de endogamia dentro do
fragmento e taxa de cruzamento aparente ( ) de fragmento de Luehea divaricata Mart &
Zucc., obtidos a partir de dados de marcadores microssatélites e análises no programa
FSTAT. ..................................................................................................................................... 72
Tabela 6 – Índices de diversidade genética de Nei entre e dentro de cinco fragmentos de
Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul.
.................................................................................................................................................. 73
Tabela 7 – Estatísticas de estrutura genética sob diversas abordagens, geradas pelo programa
FSTAT para cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no
bioma Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015. ..................................................... 75
Tabela 8 – Estimativas de FST (diagonal superior) e fluxo gênico (diagonal inferior) par a par
de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma
Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015. ................................................................ 76
Tabela 9 – Validação das estatísticas de Cockerham com base em reamostragens e erro padrão
de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma
Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015. ................................................................ 81
Tabela 10 – Parâmetros para conservação genética da população de cinco fragmentos de
Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul.
Santa Maria, RS, 2015. ............................................................................................................. 82
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice 1– Entrada de dados no software EASYPOP para as simulações ............................ 96
Apêndice 2 – Lista de aplicativos computacionais comumente usados em genética de
populações. ............................................................................................................................... 98
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 16
2 OBJETIVOS .................................................................................................................... 18
2.1 Objetivo Geral .......................................................................................................... 18
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................................... 18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 19
3.1 Sistemas reprodutivos em plantas .......................................................................... 19
3.2 Importância da variabilidade genética .................................................................. 22
3.3 Os efeitos genéticos da fragmentação florestal ...................................................... 23
3.4 Evolução de marcadores moleculares .................................................................... 25
3.5 Estrutura genética populacional ............................................................................. 28
3.5.1 Caracterização da estrutura genética de populações .............................................. 29
3.5.2 A estatística RST para dados microssatélites .......................................................... 35
3.6 O Equilíbrio de Hardy – Weinberg ........................................................................ 38
3.6.1. A deriva genética ................................................................................................ 39
3.6.2. Seleção ................................................................................................................ 39
3.6.3 Mutação .................................................................................................................. 40
3.6.4. O fluxo gênico .................................................................................................... 43
3.7 População mínima viável e o tamanho efetivo populacional ............................... 49
3.8 Simulação de dados genéticos ................................................................................. 52
3.8.1 O EASYPOP .......................................................................................................... 54
3.8.2 O FSTAT ................................................................................................................ 55
3.9 Descrição da espécie em estudo .............................................................................. 56
4 METODOLOGIA ........................................................................................................... 59
4.1 Simulações ................................................................................................................ 59
4.2 Parâmetros Genéticos para a Conservação de Populações Naturais de L.
divaricata .............................................................................................................................. 62
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 64
5.1 Seleção de Modelos .................................................................................................. 64
5.2 Caracterização dos fragmentos .............................................................................. 68
5.3 Estrutura genética dos fragmentos ........................................................................ 71
5.4 Parâmetros para a Conservação Genética ............................................................ 81
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................... 86
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 88
1 INTRODUÇÃO
A crescente destruição e consequente fragmentação de habitats pela ação do Homem,
que tem como principais causas o aumento global da população humana, o crescente
desenvolvimento tecnológico e a exploração agropecuária desregrada, têm preocupado
governantes e especialistas há várias décadas. Pelo fato de resultar na redução do tamanho e
aumento do isolamento espacial de populações, podem desencadear processos ecológicos e
genéticos com consequências potencialmente desastrosas, representando assim, a maior
ameaça para a manutenção e viabilidade das populações naturais de plantas (LOWE et al.,
2005; QUESADA et al., 2013).
Torna-se então imperativa a necessidade de uma abordagem mais integrativa para este
problema, que combina ecologia e genética de populações. Espécies tropicais são
particularmente muito vulneráveis aos efeitos da degradação do habitat devido às suas
características demográficas e reprodutivas que incluem baixa densidade de ocorrência,
sistemas complexos de autoincompatibilidade, altas taxas de polinização cruzada e interações
íntimas com polinizadores e dispersores de sementes. Teoricamente, alterações populacionais
associadas à degradação de habitats conduzem a uma erosão genética e aumento na
divergência genética entre populações devido ao efeito da deriva genética aleatória,
endogamia elevada e reduzido fluxo gênico, podendo, também, afetar a viabilidade da
população a curto e longo prazos. Em curto prazo, as populações perturbadas têm aumentada
sua susceptibilidade a doenças e pragas, perda de alelos de incompatibilidade e fixação de
alelos deletérios. Em longo prazo, a perda de variabilidade genética pode conduzir à redução
na capacidade das populações em responder a alterações nas pressões de seleção. A
variabilidade genética é reconhecida como a componente chave para a sustentabilidade das
espécies, pois fornece matéria-prima para a adaptação, evolução e sobrevivência de
populações arbóreas, especialmente sob mudanças ambientais e ataque por doenças
(RAJORA; MOSSELLER, 2001; LOWE et al., 2005).
Sugestões de estratégias para a conservação resultaram no estabelecimento do conceito
de população mínima viável, o tamanho de uma população abaixo do qual os efeitos genéticos
são mais severos, tornando o risco de extinção de espécies extremamente elevado. Porém,
17
esse parâmetro é variável e dependente de aspectos reprodutivos, demográficos e genéticos,
que devem ser estudados com vista ao seu estabelecimento. Devido ao custo e disponibilidade
de amostras genéticas, falta de conhecimento das variantes causais que contribuem para os
fenótipos observados e intratabilidade matemática de modelos evolutivos complexos,
simulações de computador têm sido amplamente utilizadas para, entre várias aplicações,
prever resultados sob cenários genéticos reais e estimar parâmetros de modelos evolutivos
(FLATHER, 2011; PENG et al., 2013).
Inúmeros programas já foram desenvolvidos para realizar simulação de dados
genéticos e ecológicos. No presente trabalho recorreram-se a simulações com o programa
EASYPOP (BALLOUX, 2001) para estudar os padrões genéticos, ecológicos e reprodutivos
que melhor explicam a estrutura genética de cinco fragmentos da espécie arbórea florestal
Luehea divaricata Mart. & Zucc, em desenvolvimento em área brasileira do bioma Pampa, os
quais foram obtidos com base em marcadores de DNA do tipo microssatélites e, deste modo,
entender sua história evolutiva e fornecer subsídios para o planejamento visando a sua
conservação.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Contribuir para a conservação dos recursos genéticos de fragmentos de Luehea
divaricata Mart. & Zucc., por meio de simulações de parâmetros genéticos empregando
programas computacionais.
2.2 Objetivos Específicos
Identificar e selecionar as estimativas de taxas de autofecundação e migração que
melhor se ajustem aos dados obtidos a partir de análises com marcadores
microssatélites em fragmentos de Luehea divaricata, por meio de simulações
computacionais.
Estimar parâmetros genéticos populacionais de utilidade para o planejamento de
programas de conservação de fragmentos naturais de Luehea divaricata no bioma
Pampa, baseado em dados de simulação.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Neste capítulo são revisados temas relacionados ao sistema reprodutivo em plantas,
fragmentação do habitat e efeitos associados, variabilidade genética, marcadores moleculares,
estrutura genética e sua respectiva caracterização, o Equilíbrio de Hardy-Weinberg e fatores
evolutivos a ele associados, parâmetros para a conservação dos recursos genéticos e a
importância das simulações em aplicativos computacionais. Será dada maior atenção aos
trabalhos com Luehea divaricata Mart. & Zucc., ou à família a qual pertence (Malvaceae)
com vista a contribuir para a conservação de populações naturais dessa espécie arbórea
florestal no bioma Pampa.
3.1 Sistemas reprodutivos em plantas
O sistema de reprodução refere-se à forma como as populações de uma espécie
recombinam seus genes a cada geração para formar a população descendente, determinando,
desse modo, como a variabilidade genética de uma espécie se organiza no espaço e no tempo.
O conhecimento do sistema reprodutivo das espécies que compõem uma dada formação
florestal permite definir estratégias eficientes para a conservação de recursos genéticos
(SEBBENN, 2002; BREIER, 2008).
No caso de populações vegetais, florestais em particular, devem ser conhecidas
características básicas da biologia reprodutiva da espécie, incluindo-se época de floração e
frutificação, principais agentes polinizadores e dispersores, e sistemas de cruzamento.
Espécies que se reproduzem predominantemente por cruzamentos apresentam menor
divergência genética entre populações do que espécies que se reproduzem predominantemente
por autofecundação, porque as fecundações cruzadas recombinam a variabilidade genética a
cada geração e favorecem a dispersão dos genes via pólen a distâncias mais longas (BREIER,
2008).
Conforme o modo de reprodução sexual predominante, populações naturais de
espécies florestais podem ser classificadas em autógamas, alógamas ou mistas. Existem
diversos critérios para classificar uma espécie quanto ao modo reprodutivo, sendo que, de
20
acordo com a classificação comumente utilizada, quando, em suas populações, predomina a
autofecundação (acima de 95% das fecundações que ocorrem), a espécie é classificada como
autógama; quando predomina a fecundação cruzada (acima de 95%), ela é alógama; espécies
intermediárias ou mistas possuem uma taxa de autofecundação entre 5 e 95% e são,
normalmente, tratadas no melhoramento como alógamas (DESTRO; MONTALVÁN, 1999).
A grande maioria das espécies de angiospermas é hermafrodita, com flores bissexuais
que contêm órgãos reprodutivos tanto androicos como ginoicos (estames e gineceu
respectivamente), e somente 6% delas são dioicas (BAWA et al., 1985; MATSUNAGA et al.,
2003), o que, neste caso, implica, obrigatoriamente, em alogamia. Apesar de não haver
separação espacial dos órgãos sexuais na maioria das angiospermas, as espécies arbóreas
tropicais geralmente apresentam sistema misto de reprodução com predomínio de
cruzamentos (taxa média estimada em 0,88), embora parte dos cruzamentos ocorra de forma
não aleatória, mas, sim, entre árvores aparentadas (cruzamentos endogâmicos) e de forma
sistemática entre as mesmas árvores (cruzamentos biparentais), gerando progênies compostas
por misturas de irmãos de autofecundação, irmãos germanos ou completos, além de meios
irmãos. Esse fato se deve a adaptações evolutivas desenvolvidas por essas espécies para evitar
a autofecundação e conservar a variação genética (SEBBENN, 2002; SOBIERAJSKI et al.,
2006).
Dentre os vários mecanismos que favorecem a fecundação cruzada, a
autoincompatibilidade é considerada o mais frequente (FRANKEL; GALUN, 1977). A
autoincompatibilidade é um mecanismo genético-fisiológico que consiste na impossibilidade
de produção de zigoto pela autofecundação ou pela fecundação de plantas que apresentam os
mesmos alelos de incompatibilidade (SOBIERAJSKI et al., 2006). Brewbaker (1959)
registrou sua ocorrência em, pelo menos, 71 famílias e em 250 de 600 gêneros estudados. Um
dos primeiros estudos do sistema de reprodução em espécies arbóreas tropicais, levado a cabo
por Bawa (1974), através de polinização controlada e observações sobre a biologia floral das
espécies, comprovou que 79,4% possuíam algum mecanismo de autoincompatibilidade.
Estudos realizados em cinco diferentes tipos de florestas neotropicais indicaram uma
percentagem variando entre 76 a 86% de espécies autoincompatíveis (GIBBS, 1990).
Os sistemas de autoincompatibilidade (AI) são, geralmente, controlados por um único
loco principal (o gene S), com muitas formas alélicas alternativas, os quais podem estar
associados a outros genes que não contribuem para a especificidade da AI, mas parecem
21
participar de sua expressão. Existem dois tipos principais de autoincompatibilidade em
espécies vegetais: a gametofítica (AIG), em que a especificidade do pólen é gerada pelo alelo
S do genoma haploide do grão do pólen (gametófito), e a esporofítica (AIE), em que a
especificidade é gerada pelo genótipo diploide da planta adulta (esporófito) que deu origem ao
grão de pólen. A AIE pode ser homomórfica, quando não existem modificações florais que
acompanham o processo, ou heteromórfica, quando, com o processo de AI, ocorrem
modificações florais. Esses sistemas são geneticamente controlados por mecanismos que
previnem a germinação do próprio pólen sobre o estigma, ou impedem o desenvolvimento do
tubo polínico até o ovário, caracterizando, neste caso, sistemas de autoincompatibilidade pré-
zigótica (GIBBS; BIANCHI, 1999). Existe, porém, um sistema diferenciado de
autoincompatibilidade no qual frutos provenientes de flores autopolinizadas são abortados,
determinando um sistema de autoincompatibilidade tardia ou pós-zigótica (DE
NETTANCOURT, 1997; SCHIFINO-WITTMANN; DALL'AGNOL, 2002).
Os mecanismos de AI para alguns grupos de plantas já foram descritos, cuja reação
engloba desde o impedimento da germinação do pólen até o rompimento do tubo polínico.
Em ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), por exemplo, o determinante feminino da
AIG é uma ribonuclease (S-RNase) expressa no gineceu, onde as proteínas, localizadas
principalmente na parte superior do estilete, atuam ao inibir ou degradar o RNA do tubo
polínico que compartilha o mesmo alelo S do gineceu. Por sua vez, o determinante do alelo S
do pólen é uma proteína F-box (SFB-S-haplotype-specific F-box) que, geralmente, atua como
componente ligante da ubiquitina, envolvida em uma via de degradação proteica, mediada
pela ubiquitina de S-RNases de pólen oriundo de cruzamento. Em uma situação de
incompatibilidade, a S-RNase do gineceu degrada o RNA do pólen, o que impede o
crescimento do tubo polínico (DE CONTI et al., 2013). Além da autoincompatibilidade, a
machoesterilidade (incapacidade da planta hermafrodita ou monoica de produzir pólen viável
ou até mesmo de não diferenciar estames) e a heterostilia, que consiste na diferença de
comprimento entre estiletes e filetes da mesma flor, favorecem a fecundação cruzada
(FRANKEL; GALUN, 1977).
Na família Malvaceae, entretanto, há um importante mecanismo que favorece a
autofecundação, com os estames unidos aos seus filamentos em uma cobertura estaminal que
rodeia o gineceu, através do qual deve passar o gineceu jovem para chegar a sua maturidade
funcional. Como o pólen é descarregado no estigma receptivo na medida em que passa pela
coluna estaminal, a autopolinização é efetivada em grande parte. Entretanto, muitas espécies
22
da família são protândricas (os estames amadurecem antes dos ovários) e algumas possuem
nectários, existindo, assim, diversas formas de evitar a autopolinização mesmo na presença
dessa morfologia floral peculiar (ELLIOTT, 1958).
3.2 Importância da variabilidade genética
As pesquisas mais recentes sobre a conservação dos recursos naturais têm focado no
estudo da variabilidade genética existente entre e dentro de populações, pois a população é a
unidade básica para a conservação da biodiversidade no nível de espécies individuais. A
variabilidade genética permitiu o sucesso evolutivo de espécies no passado, sendo igualmente
fundamental na sua sobrevivência e reprodução nas condições atuais. Quanto maior o número
de alelos em uma população, maior será a diversidade de combinações alélicas, permitindo à
população sobreviver e produzir descendentes sob uma ampla gama de condições ambientais
(SILVA et al., 2014; VINSON et al. 2015).
O aumento na resistência de bactérias a antibióticos, insetos a pesticidas, plantas
daninhas a herbicidas, e espécies arbóreas à poluição do ar, são exemplos de estudos dignos
de nota sobre o quão os homens estão alterando as trajetórias evolutivas. Esses exemplos
também ilustram que, na presença dos três requisitos para a evolução natural (isto é, a espécie
é geneticamente variável para uma característica, tal característica influencia na sobrevivência
ou no sucesso reprodutivo da espécie, e as diferenças nessa característica são herdáveis), a
presença de variabilidade genética fornece a base da adaptação e resiliência em longo prazo
de uma população (SCHABERG et al., 2008).
Assim, a conservação da variabilidade genética é determinante para a futura evolução
e adaptabilidade das populações locais e da espécie no geral, pois a evolução atua sobre uma
variabilidade existente na população, permitindo a seleção natural de preservar os indivíduos
com maior aptidão às condições ambientais correntes (SILVA et al., 2014). No próximo
tópico será feita uma abordagem do efeito contrário, ou seja, quando a variabilidade genética
é reduzida em ecossistemas sob fragmentação.
23
3.3 Os efeitos genéticos da fragmentação florestal
A destruição de florestas tropicais tornou-se sinônimo de perda de espécies, pois
apesar das florestas tropicais úmidas ocuparem 7% da superfície terrestre, estima-se que
contenham mais de 50% do total das espécies existentes em nível mundial. Os ecossistemas
das florestas tropicais são facilmente degradados porque seus solos são, com frequência, rasos
e pobres em nutrientes e estão sujeitos à erosão devido à alta densidade pluviométrica. Além
de estarem sendo destruídos rapidamente, os habitats que antes ocupavam grandes áreas, são
com frequência divididos em porções menores, pelas estradas, ferrovias, campos agrícolas,
cidades e outras atividades humanas. A fragmentação do habitat é o processo pelo qual grande
e contínua área é reduzida tanto em termos de área, quanto dividida em dois ou mais
fragmentos, podendo desencadear processos ecológicos e genéticos com consequências
potencialmente desastrosas (PRIMACK; RODRIGUES, 2001; ALTER et al., 2007).
Vários estudos apontam que a fragmentação florestal afeta a fenologia, os padrões de
polinização e o sucesso reprodutivo de espécies florestais (SIH; BALTUS, 1987; KEARNS et
al., 1998; FUCHS et al., 2002; LOWE et al., 2005; QUESADA et al., 2013). Fucks et al.
(2002) observaram, em populações contínuas de Pachira quinata, níveis menores de
parentesco entre indivíduos, maior tendência de cruzamentos e maior quantidade de doadores
de pólen, comparadas às populações fragmentadas. A redução no tamanho da população pode
reduzir a densidade de árvores reprodutivas, limitando, assim, a disponibilidade de pólen. O
isolamento de unidades populacionais pode, também, alterar a atividade dos polinizadores
pela redução na densidade de recursos alimentares potenciais e pelo aumento na distância
entre esses recursos. Por exemplo, o aumento na densidade floral pode atrair mais
polinizadores e induzir polinizadores individuais a visitar mais flores enquanto a redução dos
recursos florais resulta em longas distâncias de viagem entre áreas de repouso e de
alimentação. Quando a distância entre plantas é maior que a área de vida dos polinizadores
(área necessária para o suprimento de suas necessidades vitais e reprodutivas), sua densidade
diminui nas áreas perturbadas e resulta em menos visitas de polinizadores, limitando o
potencial de dispersão, o que resulta no aumento das taxas de cruzamentos biparentais e de
autofecundação.
Além de isolar reprodutivamente indivíduos que contêm apenas uma pequena amostra
do conjunto gênico da população original, a fragmentação florestal pode causar contínua
24
perda de alelos devido à deriva genética (tópico desenvolvido na sequência), caso a população
remanescente permaneça isolada por várias gerações, reduzindo, assim, a diversidade de
combinações alélicas e a consequente flexibilidade adaptativa da população em face de
alterações climáticas, aumentando a probabilidade de seu declínio. Por outro lado, associada a
uma grande variabilidade genética está incluída uma carga genética, uma proporção de alelos
deletérios recessivos que se encontram mascarados pela dominância em indivíduos
heterozigotos e que, quando herdados em homozigose resultam em mortalidade, menor
crescimento, defeitos e instabilidade no desenvolvimento, reduzido potencial reprodutivo,
maior suscetibilidade a doenças, reduzida habilidade de resistência ao estresse e reduzida
habilidade competitiva intra e interespecífica (ALLARD, 1971; SOUZA et al., 2004;
RIDLEY, 2006).
Pinto (1995) destacou a importância da carga genética para a evolução das espécies, a
qual depende da existência constante de variabilidade genética, o que torna inevitável a
produção de indivíduos mal adaptados. A carga genética seria, então, o preço que uma
população precisaria pagar para ter o privilégio da evolução. Em outras palavras, a garantia de
sobrevivência de uma população em longo prazo passa pela produção constante de alguns
indivíduos não tão adaptados às condições presentes, mas que, por acaso, possam estar pré-
adaptados a certo ambiente no futuro. Assim, o aumento nas taxas de autofecundação (alelos
de autoincompatibilidade podem ser perdidos pela deriva) e de cruzamentos biparentais
devido ao isolamento reprodutivo de populações pequenas aumenta a expressão de alelos
deletérios pelo aumento da endogamia, resultando na depressão por endogamia. Enquanto
uma área grande de habitat pode ter sustentado uma única população grande, é possível que
nenhum de seus fragmentos possa sustentar o suficiente uma subpopulação para que ela
sobreviva por um longo período (RIDLEY, 2006; VINSON et al., 2015).
Estudos em genética de populações avançaram significativamente na década de 1960,
a partir do desenvolvimento de técnicas de marcadores moleculares, fornecendo hoje uma
gama de ferramentas passíveis de serem utilizadas em trabalhos de caracterização da
variabilidade genética. Esse tema será abordado a seguir.
25
3.4 Evolução de marcadores moleculares
Diversas técnicas moleculares permitem determinar a variação presente em uma
espécie e em suas populações. Entre essas técnicas, incluem-se aquelas destinadas à detecção
de variação de sequências de DNA, conhecidas como marcadores moleculares. Elas permitem
identificar variabilidade nas sequências de DNA dos indivíduos analisados a um nível de
resolução superior ao polimorfismo passível de detecção ao nível morfológico e reduzem a
enorme complexidade do genoma estudado à análise mendeliana dos segmentos de DNA
detectados (os dados moleculares obtidos permitem estimar parâmetros genéticos úteis para
um amplo espectro de estudos, desde identidade genética e construção de mapas genéticos até
análises filogenéticas e evolucionárias) (FERREIRA, 2001; PEREZ-SWEENEY, 2004).
Com o desenvolvimento da eletroforese de isoenzimas, pela associação entre
eletroforese de proteínas e coloração histoquímica (HUNTER; MARKET, 1957), tornou-se
possível obter, rapidamente, grandes quantidades de dados de frequência gênica de
populações naturais e maiores níveis de diferenciação genética. O termo isoenzima (ou
isozima) foi introduzido por Market e Moller (1959) para designar formas moleculares
múltiplas de enzimas, que ocorrem em um mesmo organismo e em membros da mesma
espécie. Estudos bioquímicos usando a eletroforese de proteínas, que são os produtos
primários dos genes, possuem a vantagem de serem de derivação genética conhecida,
normalmente o produto direto de um único loco gênico, e que, em quase todos os casos, a
estrutura molecular é exclusivamente determinada geneticamente, sem influência ambiental
(THORPE e SOLÉ-CAVA, 1994).
Na eletroforese, a taxa de migração de uma molécula depende de vários fatores,
incluindo seu tamanho e a carga elétrica. Uma substituição de um aminoácido em uma
molécula de proteína pode alterar sua carga líquida, ou causar alterações conformacionais e,
deste modo, alterar a taxa de migração no gel de eletroforese. Desse modo, mutações nas
regiões do DNA codificadoras para uma proteína particular, resultarão em diferença de
mobilidade em eletroforese, ou seja, na formação de uma nova proteína. Através do produto
direto do gene, os marcadores moleculares enzimáticos (bioquímicos) vêm sendo utilizados
em pesquisas populacionais e evolutivas de diversos organismos no nível intraespecífico,
possibilitando avaliar o grau de variabilidade genética dentro e entre populações, assim como
estimar os níveis de fluxo gênico entre populações (THORPE; SOLE-CAVA, 1994;
LOXDALE; LUSHAI, 1998).
26
Na década de 1980, foram desenvolvidos marcadores moleculares em nível de DNA,
os quais não são afetados por processos ambientais e biológicos. Teoricamente, qualquer
fragmento de DNA pode ser utilizado como marcador molecular, desde que revele
polimorfismo entre indivíduos. Seu número é ilimitado, desprovidos de efeito epistático
(interação de locos diferentes codificando para uma mesma característica) ou pleiotrópico (um
mesmo loco condicionando várias características) (NASS et al., 2001).
Botstein et al. (1980) propuseram a técnica de Polimorfismo de Comprimento de
Fragmentos de Restrição (RFLP), que é capaz de diferenciar indivíduos através de variações
nos nucleotídeos causadas por mutações, pela hibridização dos fragmentos com sequências
homólogas de DNA (sondas) marcadas com radioatividade ou compostos que desencadeiam
uma reação de luminescência. As enzimas de restrição existem naturalmente em bactérias e
um grande número – mais de 2,3 mil – dessas enzimas é conhecido. Qualquer enzima de
restrição corta a fita de DNA em locais específicos, geralmente com 4 a 8 pares de bases,
denominados sítios de restrição ou de clivagem. A enzima de restrição EcoRl, por exemplo,
reconhece a sequência de bases ...GAATTC... e a cliva entre a G inicial e a primeira A.
Assim, se o DNA de dois indivíduos difere e um possui a sequência GAATTC em um dado
sítio, enquanto o outro possui uma sequência diferente, como, por exemplo, GTATTC, a
incubação do DNA desses indivíduos com EcoRl irá resultar na clivagem do DNA somente
do primeiro indivíduo e não do segundo. A diferença entre os dois indivíduos poderá, então,
ser detectada no comprimento dos fragmentos de DNA: o padrão do comprimento dos
fragmentos será diferente para os dois indivíduos (BOTSTEIN et al., 1980; RIDLEY, 2006).
Apesar de serem codominantes, os marcadores RFLP envolvem uma técnica muito
cara e laboriosa, o que motivou o desenvolvimento de técnicas de marcadores baseados em
amplificação do DNA pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), como: DNA Polimórfico
Amplificado Aleatoriamente (RAPD), Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos
Amplificados (AFLP), Sequências Internas Simples Repetidas (ISSR), Microssatélites ou
Sequências Simples Repetidas (SSR) e Etiquetas de Sequência Expressa (EST) – SSR, que
são comumente usados para avaliar a variabilidade genética em espécies vegetais, incluindo
as florestais. O desenvolvimento dessas ferramentas para as análises genéticas em nível
molecular possibilitou analisar com maiores detalhes a origem evolucionária dos genomas
vegetais, assim como acessar o grau de variabilidade genética relatado em grupos de plantas
(KARDOLUS et al., 1998).
27
Os marcadores microssatélites (SSR) consistem de sequências curtas de nucleotídeos
repetidas na mesma ordem, lado a lado (em tandem), cujo nível de polimorfismo produzido é
devido à variação no número de unidades de repetição em um determinado loco. Os genomas
eucariotos são densamente povoados por sequências simples repetidas, consistindo de dois a
seis nucleotídeos repetidos em tandem. As sequências de DNA que flanqueiam os
microssatélites são geralmente conservadas entre os indivíduos de uma mesma espécie,
permitindo a seleção de primers ou iniciadores específicos que amplificam, via PCR,
fragmentos contendo o DNA repetitivo em todos os genótipos. Resultantes de suas altas taxas
mutacionais, alelos polimórficos ocorrem sempre que em um genoma esteja faltando a
sequência repetida ou naqueles que têm uma deleção ou uma inserção que modifique a
distância entre as repetições, permitindo a comparação do material genético de indivíduos
diferentes (ZUCCHI, 2002; BORÉM; CAIXETA, 2006; RODRIGUES et al., 2010).
A hipervariabilidade dos microssatélites é mantida, principalmente, pelo pareamento
errôneo dos filamentos polinucleotídicos durante a replicação do DNA, com o deslize
(slipage) da enzima DNA polimerase. O número de repetições pode aumentar ou diminuir,
caso ocorra adição ou perda de uma ou mais unidades de repetição pela DNA polimerase e se
houver falha na atividade exonucleásica dessa enzima. Por possuirem elevada
reprodutibilidade e serem de herança codominante, esses marcadores vêm sendo bastante
utilizados para a estimação de parâmetros genéticos de populações vegetais e para a
compreensão de padrões de fluxo gênico e parentesco. Porém, sua utilização em espécies
florestais é limitada pela dificuldade de desenvolver iniciadores para essas espécies devido à
exigência de um conhecimento prévio do genoma a ser estudado, ao elevado custo e tempo
necessário para seu desenvolvimento (MORGANTE; OLIVIERI, 1993; GOULÃO;
OLIVEIRA, 2001; ELLEGREN 2004).
Pesquisas em genética de populações por meio do emprego de marcadores
moleculares buscam analisar o modo de distribuição da variabilidade genética, identificando
se a variação é maior entre ou dentro de populações, fenômeno conhecido como estruturação
genética. A estruturação genética, que é assunto do próximo tópico, serve como guia no ato de
amostragem para coleta de material genético e, também, no planejamento e estabelecimento
de áreas de conservação florestal.
28
3.5 Estrutura genética populacional
Uma população, sob um prisma genético, é um conjunto de indivíduos de uma mesma
espécie que apresentam uma continuidade no tempo e uma capacidade de se cruzar ao acaso,
ou seja, de trocar alelos entre si; essa definição exclui, portanto, as plantas autógamas, as
quais não trocam alelos entre si (ou o fazem em proporções muito baixas). As propriedades
genéticas das populações são determinadas a partir do conhecimento de suas frequências
gênicas e genotípicas (PINTO, 1995).
A distribuição heterogênea (não aleatória) dos alelos e genótipos no espaço e no
tempo, resultante de forças evolutivas, é denominada estrutura genética e pode influenciar
significativamente os processos genéticos e ecológicos das espécies, resultando, assim, em
agregados de genótipos específicos. O nível de alteração genética entre populações naturais é
de importância crítica para o entendimento de muitos processos biológicos, como a
diferenciação genética e a manutenção da variabilidade genética em condições de
fragmentação de populações (HAMRICK, 1982; SHAPCOTT, 1995; ZUCCHI, 2002;
STEFENON, 2010).
A análise espacial da divergência genética entre populações locais sempre
desempenhou um papel central na genética de populações e biologia evolutiva. A divergência
genética pode aumentar com a distância geográfica tanto porque a variação ambiental (e
efeitos seletivos associados) torna-se mais heterogênea em grandes distâncias, ou porque as
baixas taxas de fluxo gênico não restringem a divergência pela deriva aleatória. Estimativas
do fluxo gênico histórico em populações naturais possuem importantes consequências para o
planejamento de estratégias de conservação, recuperação de áreas degradadas ou
planejamento de programas de melhoramento genético (DINIZ-FILHO; TELLES, 2000;
STEFENON, 2010).
Em uma população grande e fusionada existe um número menor de homozigotos do
que a média para o conjunto de populações subdivididas e em equilíbrio. A frequência
elevada de homozigotos em populações subdivididas é denominada efeito Wahlund, que mede
o efeito da subdivisão na endogamia, traduzida pelo aumento da homozigosidade e a
consequente diferenciação genética entre as subpopulações. Nessa condição, o fluxo gênico
adquire grande importância para homogeneização das frequências gênicas. A extensão do
29
fluxo gênico entre populações locais determina seu potencial para a diferenciação genética e a
compreensão do seu papel evolutivo é fundamental para o manejo de espécies ameaçadas de
extinção. Taxas moderadas a altas de fluxo gênico entre as populações evitam seu isolamento
reprodutivo, mantendo, assim, a variabilidade genética (SLATKIN, 1985; STORFER, 1999;
RIDLEY, 2006).
3.5.1 Caracterização da estrutura genética de populações
Os estudos ligados à genética de populações visam descrever e analisar a distribuição
da variabilidade genética total dentro e entre as populações, partindo das frequências alélicas
e genotípicas, tendo como princípio o Equilíbrio de Hardy-Weinberg, um tópico a ser
desenvolvido na sequência. Os resultados de tais estudos constituem um passo importante
para entender que fatores evolutivos estão atuando nessas populações e sua respectiva
magnitude, de modo a desenhar estratégias apropriadas para a conservação dos recursos
genéticos. Os parâmetros comumente usados para caracterizar as populações genéticas
incluem: número de alelos por loco (riqueza alélica) ou total, número de alelos efetivos, raros
ou privados, conteúdo de informação polimórfica, heterozigosidade observada e esperada,
coeficiente de endogamia ou índice de fixação e riqueza genotípica (índice de Shannon-
Wiever) (SÁNCHEZ, 2008).
O número total de alelos existente na população constitui-se em um parâmetro
populacional importante por estar relacionado à capacidade de as populações se adaptarem às
alterações ambientais. Quanto maior o número de alelos na população, maior a diversidade de
combinações possíveis que originam diferentes genótipos capazes de se adaptar a
determinadas condições do ambiente. Por exemplo, determinados genótipos podem ser bem
adaptados a condições de geada, ao passo que outros se adaptam ao estresse hídrico (seca ou
alagamento), resistentes ao ataque de pragas ou doenças, aumentando, assim, a probabilidade
de persistência das populações em um ambiente em constantes alterações de maneira
estocástica (aleatória) (VINSON et al., 2015).
Uma medida relativa da quantidade de alelos é a riqueza alélica, a qual corresponde ao
número médio de alelos segregando em um loco dentro de uma população, mas pode ser
também abordada em termos de número médio de alelos por loco. Esse parâmetro permite
comparar a variabilidade genética de populações com diferente tamanho amostral (baseado no
30
menor tamanho amostral entre as populações) e é expresso pela equação (SANCHEZ-
MAZAS et al., 2012):
, adaptada da equação original de Hurlbert (1971)
para o cálculo da riqueza de espécies:
Em que Ar é a riqueza alélica (do inglês, allelic richness), K é o número de alelos na amostra,
Ni o número de ocorrências do i-ésimo alelo entre os 2N genes amostrados e n o tamanho da
amostra (número total de indivíduos amostrados).
Além de comparar a variabilidade genética entre diferentes populações, a riqueza
alélica pode ser um indicador de uma redução no tamanho populacional ou de gargalos
passados. Além disso, é uma medida relevante em uma perspectiva de longo prazo, pois os
limites da seleção são determinados mais pela composição inicial das frequências alélicas do
que pela heterozigosidade. Como um componente da variabilidade genética, fornece
informação importante para a escolha de populações prioritárias em programas de manejo e
conservação. (PETIT et al., 1998; GREENBAUM et al., 2014).
Outro parâmetro usado na caracterização de uma população é a heterozigosidade, que
pode ser definida para um dado loco ou como uma média de um conjunto de locos analisados
(amostrados). A heterozigosidade de um loco é definida como a probabilidade de um
indivíduo ser heterozigoto naquele loco, em uma população. Subdivide-se em
heterozigosidade observada (a proporção de indivíduos heterozigotos observados em uma
população estudada) e heterozigosidade esperada (equivalente à heterozigosidade observada,
considerando-se que as populações estão em completo equilíbrio). A heterozigosidade
esperada (HS) é também definida como uma fração estimada de todos os indivíduos que
poderiam ser heterozigóticos em um dado loco, com base nas frequências alélicas, sendo que
31
o desvio em relação à heterozigosidade observada (HO) pode ser um indicativo da atuação de
fatores evolutivos (seleção, migração, deriva e mutação) (ARAÚJO, 2004).
Para estudar populações estruturadas, Nei (1977) definiu níveis hierárquicos de
heterozigosidade a partir de frequências alélicas em termos de heterozigosidade média
observada por individuo dentro de subpopulações (HO), heterozigosidade média esperada
dentro de subpopulações com cruzamentos aleatórios (HS) e heterozigosidade esperada na
população total com cruzamentos aleatórios, sob Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HT):
∑∑
∑∑
∑(∑
)
sendo:
= frequência de heterozigotos do loco l na população i
= frequência do alelo k do loco l na população i
s = número de populações
l = número de locos
Conhecidas como estatísticas de Nei, permitem quantificar a variabilidade genética
entre e dentro de populações através da heterozigosidade gênica ou alélica. Baseia-se na
partição da variabilidade genética total (HT) nos seus componentes entre (DST) e dentro (HS)
de populações:
Assim, a variabilidade relativa entre populações (GST) e a variabilidade relativa dentro
das populações (GIS) são dadas, respectivamente, por:
32
Ainda no âmbito de análise genética de populações estruturadas, as estatísticas F de
Wright (1965) e os coeficientes de coancestralidade de Cockerham (COCKERHAM, 1969;
WEIR; COCKERHAM, 1984), são outras abordagens comumente usadas. Com base nos
níveis hierárquicos da heterozigosidade, as estatísticas F permitem caracterizar a distribuição
da variabilidade genética entre populações (FST), o coeficiente de endogamia dentro das
populações (FIS) e o índice de fixação global (FIT):
Se o valor de , for igual a 0 (zero), as populações têm frequências alélicas
idênticas. No outro extremo, um valor de igual a 1 (um) é indicativo de que as populações
fixaram alelos diferentes. Quanto ao índice de fixação (FIS), se o valor for igual a 0 (zero), a
população está em equilíbrio de Hardy-Weinberg; se for superior a 1 (um), existe carência de
heterozigotos na população; se for igual a 1 (um), existe ausência total de heterozigotos; se for
inferior a 0 (zero), significa um excesso de heterozigotos (seleção favorável a heterozigotos)
(ZUCCHI, 2002).
Por sua vez, Cockerham (1969) abordou as estatísticas F para quantificar o grau de
parentesco entre pares de alelos, com base na análise de variância das frequências alélicas,
conhecida como Análise de Variância Molecular (AMOVA). A Tabela 1 apresenta um
esquema de AMOVA, considerando-se três níveis de hierarquia para indivíduos diploides (s =
populações, n = indivíduos e g = número de alelos, igual a 2 em organismos diploides):
33
Tabela 1 – Esquema de análise de variância molecular (AMOVA) para locos com dois alelos.
FONTE DE VARIAÇÃO GL SQ QM E(QM)
Entre populações
Entre indivíduos dentro de
populações
Genes dentro de indivíduos
TOTAL
Fonte: ZUCCHI (2002).
Os componentes de variância podem então ser definidos da seguinte maneira:
, para populações,
indivíduos dentro de populações e alelos dentro de indivíduos, respectivamente, e que podem
ser reescritas para os parâmetros das estatísticas F nos seguintes termos:
Desse modo:
FST de Wright: é o coeficiente de coancestralidade e representa a probabilidade de que
dois indivíduos, pertencentes a subpopulações diferentes, possuam um alelo idêntico por
descendência; θ de Cockerham, parâmetro análogo, é uma medida de correlação de gametas
entre subpopulações.
FIS de Wright: coeficiente de endogamia dentro de subpopulações mede a
probabilidade de que dois alelos em um dado loco, presentes no mesmo indivíduo sejam
idênticos por descendência; análogo ao f de Cockerham, medida de correlação de gametas
devido à endogamia dentro de subpopulações.
34
FIT de WRIGHT: é o coeficiente de endogamia referente aos indivíduos em relação ao
conjunto de populações e reúne a informação dos índices de fixação FST e FIS; mede o desvio
das frequências genotípicas da população em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg,
resultante de cruzamentos não aleatórios na população total, incluindo a endogamia em todos
os níveis; a estatística de Cockerham análoga é o F, que é a correlação entre dois gametas que
formam um zigoto no conjunto das subpopulações.
As estatísticas F podem ser redefinidas e relacionadas com os coeficientes de
coancestria nos seguintes moldes:
Como padrão de qualificação da diferenciação de populações, é usada uma escala para
FST e GST, identificando-se, assim, populações com diferenciação baixa (0 a 0,05),
intermediária (0,05 a 0,15), alta (0,15 a 0,20) e super alta (maior que 0,20) (HARTL;
CLARK, 2010).
O coeficiente de endogamia intrapopulacional (FIS) é útil para estimar, de maneira
indireta, a taxa de cruzamento, permitindo classificar uma população conforme o modo
reprodutivo em autógama (taxa de cruzamento entre 0 e 0,05), mista (taxa de cruzamento
entre 0,05 e 0,95) e alógama (taxa de cruzamento entre 0,95 e 1). Partindo da relação entre a
taxa de cruzamento e o coeficiente de endogamia proposta por Nei e Syakudo (1958):
, a taxa de cruzamentos aparente, também denominada por taxa de
cruzamentos de equilíbrio pode ser estimada:
.
35
A taxa de cruzamento obtida dessa maneira é denominada aparente por ser
proveniente de dados de apenas uma geração e ser estimada a partir do índice de fixação
intrapopulacional, o que torna a estimativa dependente da pressuposição do Equilíbrio de
Wright (que assume a autofecundação como a única causa de endogamia na população), além
de assumir uma constância nas taxas de cruzamento ao longo do tempo. Trata-se, então, de
uma abordagem indireta da taxa de cruzamento, portanto, uma estimativa menos robusta
(RITLAND; JAIN, 1981; MORAES; MONTEIRO, 2002; ZUCCHI, 2002).
Entre os métodos diretos para determinação da taxa de cruzamento, o modelo de
Ritland é o mais aceito em todo mundo e permite a determinação da taxa de cruzamento real
(ou multiloco), baseado na estrutura de progênies. Com base no método de máxima
verossimilhança é obtida uma equação que permite estimar, além da taxa de cruzamento, as
frequências gênicas, através da segregação simultânea de alelos em vários locos analisados
com marcadores moleculares. As proporções genotípicas observadas na progênie de um
genótipo materno conhecido são ajustadas às proporções esperadas sob um modelo misto de
reprodução, sabendo-se que cada progênie é derivada de óvulos que cruzam com
probabilidade t para um conjunto de pólen cuja frequência gênica é p e da autofecundação
com probabilidade (1 - t). Como t e p são desconhecidos, as duas estimativas devem ser
determinadas simultaneamente (RITLAND; JAIN, 1981).
3.5.2 A estatística RST para dados microssatélites
As medidas tradicionais de diferenciação genética, nomeadamente, a variabilidade
genética estre populações (FST), a diversidade genética entre populações (GST) e a correlação
genética de gametas entre populações (θ), se baseiam nos modelos de mutação IAM (em que
os eventos de mutação geram novos alelos não presentes anteriormente na população) ou
KAM (em que as mutações conduzem a qualquer um dos k estados alélicos pré-existentes)
(GOODMAN, 1997). No caso de microssatélites, em que a maioria das mutações envolve
adição ou subtração de unidades de repetição, essas estatísticas se tornam inapropriadas.
Slatkin (1995) demonstrou que o FST tende a subestimar o verdadeiro grau de diferenciação
quando aplicado a dados de microssatélites, pois alelos microssatélites de igual comprimento
(isto é, com igual número de repetições) são normalmente mais relacionados entre si do que
aqueles de comprimentos diferentes (com diferente número de repetições), ocultando, assim,
alguma informação mais detalhada acerca da relação entre alelos (FST faz a diferenciação
36
levando em consideração apenas o número de unidades de repetição de microssatélites entre
indivíduos) (VALDES et al., 1993; SLATKIN, 1995; RODRIGUES et al., 2010; VALLE et
al., 2011).
Além do modelo de mutação, as taxas de mutação consideradas desempenham um
papel igualmente preponderante. Em uma população ideal [modelo de migração de Wright
(1931)], assumindo que a mutação segue o modelo de alelos infinito, FST é uma função
decrescente de N*(m+µ), o produto do tamanho da população local e a soma das taxas de
migração e de mutação. Porém, a taxa de mutação no modelo de alelos infinitos é muito baixa
e pode ser negligenciada, tornando o FST uma função apenas do tamanho populacional e do
número de migrantes. Por outro lado, devido às taxas de mutação elevadíssimas dos locos
microssatélites (cerca de 10-3
por geração), que evoluem segundo o modelo de mutação passo
a passo (SMM), seu padrão de mutação não deve ser negligenciado em estatísticas de
diferenciação genética, pois seria perdida alguma informação adicional acerca das relações
entre alelos (GOODMAN, 1997; BALLOUX; LUGON-MOULIN, 2002).
Por essa razão, foi derivada a estatística RST por Slatkin (1995) e Goodman (1997),
como uma adaptação da estatística FST para locos microssatélites e que permite analisar com
maior precisão as relações entre populações, independente da taxa de mutação. Slatkin (1995)
chegou à seguinte expressão:
em que é a variância no tamanho de alelos na população total e é a variância no tamanho
de alelos dentro das subpopulações.
Uma vez que e são proporcionais às variâncias dentro e entre populações, RST
corresponde, então, à fração da variância total do tamanho alélico que se encontra entre
populações. Desse modo, o valor de RST é idêntico ao θ definido por Cockerham (1969), que é
também um componente da variância interpopulacional, diferindo apenas na abordagem: RST
leva em consideração também o tamanho de alelos, ao passo que θ se baseia apenas na
identidade ou não identidade de estado alélico (SLATKIN, 1995).
37
Por sua vez, Goodman (1997) observou que a expressão derivada por Slatkin (1995),
pode resultar em estimativas não acuradas de RST para um conjunto de dados reais, pois os
dados de populações naturais carecem de correção para diferenças no tamanho amostral entre
populações e na magnitude de variância de tamanhos de alelos entre locos. Quando os
tamanhos amostrais diferem entre populações, aquelas de menor tamanho contribuem menos
para a variância total do que as amostras de maior tamanho. De igual modo, quando existem
diferenças acentuadas nas variâncias de tamanho de alelos entre locos, aqueles com menor
variância (locos menos variáveis) contribuirão menos no valor final de RST, mesmo se,
individualmente, exibam altos níveis de diferenciação. Assim, aquele autor derivou a seguinte
expressão, através da ponderação para essas diferenças, características de populações naturais:
em que: RST é a medida de diferenciação genética entre populações; é a variância do
tamanho de alelos entre populações; e corresponde à variância do tamanho de alelos
dentro de populações.
Contudo, nenhum dos modelos parece se encaixar perfeitamente em todos os locos
microssatélites. Consequentemente, ambos os estimadores tradicionais de diferenciação
(estatísticas F) e os estimadores de diferenciação específicos de microssatélites (estatísticas R)
são comumente usados em estudos com marcadores microssatélites (BALLOUX; LUGON-
MOULIN, 2002).
Devido à fragmentação a que as populações naturais são sujeitas, surge, então, a
necessidade de estudar seu impacto sobre uma população de cruzamentos aleatórios,
denominadas panmíticas. O desvio de panmixia pode ser testado através do modelo de
Equilíbrio de Hardy-Weinberg, assunto abordado no próximo tópico.
38
3.6 O Equilíbrio de Hardy – Weinberg
No âmbito da coleta e conservação da variabilidade genética, o estabelecimento de
estratégias seguras carece de pesquisas sobre o modo de distribuição dos genes nos
indivíduos. A lei de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) tem sido usada há mais de um
século servindo para uma melhor compreensão das características genéticas das populações:
Na ausência de fatores evolutivos (seleção, migração, deriva e mutação) atuando
sobre uma população, as proporções alélicas permanecem inalteradas, e as
proporções genotípicas atingem um equilíbrio estável, mostrando a mesma relação
constante entre si ao longo do tempo (REIS et al., 2011, p. 835).
Conforme demonstrado por Ridley (2006), as frequências genotípicas de Hardy-
Weinberg são alcançadas após uma única geração de cruzamentos aleatórios a partir de
quaisquer frequências genotípicas iniciais, desde que satisfeitas as condições de equilíbrio.
A condição de equilíbrio pressupõe uma população infinita (ou suficientemente
grande) com cruzamentos aleatórios (panmixia), sendo apenas uma idealização, pois (i) por
maior que seja, toda população é uma entidade finita e (ii) cruzamentos aleatórios seriam
aplicados a sistemas em que cada indivíduo da população possui a mesma probabilidade de
gerar descendentes, com cada gameta feminino tendo igual probabilidade de ser fertilizado
por qualquer gameta masculino, uma condição não aplicável a populações naturais devido à
ocorrência constante de seleção natural (gerando indivíduos incapazes de se reproduzir) e
cruzamentos preferenciais e endogâmicos. Deste modo, o modelo de equilíbrio de Hardy-
Weinberg é útil para quantificar os efeitos dos fatores evolutivos e de atividades humanas
sobre os ecossistemas naturais (SANCHEZ, 2008).
O teste de qui quadrado (χ2) pode ser usado para comparar as frequências observadas e
as frequências esperadas, com vistas a verificar se determinada população se encontra ou não
em equilíbrio de Hardy-Weinberg. A seguir serão discutidos os efeitos dos fatores evolutivos
na alteração do equilíbrio de Hardy-Weinberg, os quais incluem a mutação e a migração,
fenômenos que são o objeto do presente estudo com fragmentos de Luehea divaricata.
39
3.6.1. A deriva genética
Em qualquer população, os genes transmitidos para uma geração seguinte são
amostras dos genes existentes na geração corrente; sendo assim, uma variação no tamanho da
amostragem em gerações que se sucedem pode alterar as frequências gênicas. Quanto menor
o tamanho da população, tanto maior será a variação nas frequências gênicas, acelerando,
assim, em direção à fixação ou extinção de um determinado alelo, o efeito extremo da deriva
genética (HELLBERG et al., 2002).
Um caso particular da influência da amostragem aleatória é o efeito do fundador,
definido por Mayr (1963) como: ―o estabelecimento de uma nova população por uns poucos
fundadores originais (em um caso extremo, por uma única fêmea fertilizada), que contêm só
uma pequena fração da variação genética total da população parental‖. Pode ocorrer pela (i)
colonização de um pequeno número de indivíduos de um local previamente desabitado pelas
suas espécies, ou (ii) variação em tamanho de uma população já estabelecida em uma área,
passando por um ―gargalo genético‖, no qual apenas uns poucos indivíduos sobrevivem e,
mais tarde, se expandindo novamente, quando o período favorável retorna (RIDLEY, 2006).
Uma teoria moderna da deriva genética, a teoria da coalescência, permite traçar a
ancestralidade de um determinado gene e construir uma árvore genealógica dos genes (para
um loco particular) em uma amostra populacional, até o ponto em que todos os genes
possuem um único ancestral comum. Com base no princípio do ―ancestral comum mais
recente‖, relações entre espécies podem ser visualizadas através de um diagrama ramificado.
Técnicas cladísticas (inferência baseada em caracteres morfológicos) ou sequências
moleculares são usadas na filogenia, buscando identificar com qual outra espécie (ou grupo de
espécies) uma determinada espécie, ou um determinado grupo de espécies, compartilha o
ancestral comum mais recente, resultando, assim, um diagrama no formato de árvore –
dendrograma (FU; LI, 1999; RIDLEY, 2006).
3.6.2. Seleção
A luta pela sobrevivência impulsiona o aumento nas taxas reprodutivas dos seres
vivos, de modo a garantir a perpetuação da espécie sob condições adversas do ambiente. O
excesso reprodutivo resulta em competição, de tal forma que aqueles indivíduos que menos se
40
adaptam sofrem os efeitos da seleção natural, traduzida em mortalidade ou no baixo potencial
reprodutivo. A seleção atua sobre uma variabilidade limitada, através de um processo de
eliminação, conservando apenas os indivíduos melhor adaptados às condições sob as quais as
populações vivem. Apenas uma fração do número de indivíduos produzidos em qualquer
grupo tem a chance de sobreviver e deixar descendentes, devido a sua adaptação ao ambiente
(WRIGHT, 1931; RIDLEY, 2006).
Fisher demonstrou que numa população diploide e em equilíbrio, a seleção em favor
de um homozigoto resultaria, inevitavelmente, na eliminação do outro. Por outro lado, se o
heterozigoto for mais adaptado que qualquer um dos homozigotos resulta um equilíbrio
estável em um polimorfismo balanceado. Nessas condições, a sobrevivência de novas
mutações tem chances muito pequenas e depende mais do acaso do que da seleção. Assim,
grandes populações seriam reservatórios de variabilidade genética desde que mutações
recorrentes (repetitivas) possuam uma maior chance numérica de sobreviver em baixas
frequências. A seleção atuando sobre populações grandes é o principal mecanismo evolutivo
na natureza, superando a deriva aleatória (FISHER, 1918; PROVINE, 1990).
A importância da seleção natural sobre a evolução está relacionada com o conceito de
carga genética, proposto por Kimura e que sustentou a teoria neutra. A carga genética é
definida como a fração de uma população que deixa de sobreviver ou de se reproduzir devido
aos genes desvantajosos que ela possui. Uma determinada população irá conter vários
genótipos, e cada genótipo possui um determinado valor adaptativo (a probabilidade de
sobrevivência desde o nascimento até a vida adulta). Ao genótipo com o valor adaptativo mais
elevado é atribuído o valor adaptativo relativo de um. A soma dos produtos entre os valores
adaptativos dos genótipos pela respectiva frequência na população resulta no valor adaptativo
médio de toda população, cuja diferença para um corresponde à carga genética da população.
Se todos os indivíduos da população possuírem o genótipo ótimo, o valor adaptativo é um e a
carga genética é zero. Se todos, menos um, possuírem um genótipo de valor adaptativo zero, o
valor adaptativo médio da população é zero e a carga genética é um (RIDLEY, 2006).
3.6.3 Mutação
As moléculas no DNA de um organismo não são estáticas. Com frequência, as bases
nitrogenadas de seus nucleotídeos estão expostas aos agentes, naturais ou artificiais, que
41
provocam modificações em sua estrutura ou composição química. Uma mutação é definida
como qualquer alteração casual e hereditária no conjunto gênico de um organismo, não
explicável pela recombinação da variabilidade genética preexistente. Todos os seres vivos
sofrem mutações como resultado de funções celulares normais ou interações aleatórias com o
ambiente. Uma mutação pontual, ou seja, uma alteração em um único par de bases
nitrogenadas do DNA (substituição) ou em poucos pares de bases (adição/inserção, deleção
ou translocação) pode originar uma proteína alterada conforme o códon resultante da nova
sequência de bases. Uma mutação pontual pode resultar do mau funcionamento do sistema
celular que replica ou repara o DNA, inserindo uma base incorreta na cadeia polinucleotídica
que está sendo sintetizada ou de uma interferência química sobre uma das bases do DNA
(ZAHA et al., 2014).
Uma mutação irreversível de um gene na taxa u por geração altera a frequência gênica
(q) numa taxa ∆q = –uq. Com mutação reversa na taxa v, a alteração na frequência gênica é
∆q = –uq+v(1–q). Na ausência de outros fatores, um equilíbrio é atingido entre as duas taxas
de mutação quando ∆q = 0, dando q=v/(u+v) (WRIGHT, 1931).
A. Modelos de mutação
Inferências em genética de populações dependem dos modelos de mutação assumidos e
as taxas em que elas ocorrem. Os principais modelos de mutação estudados são descritos a
seguir:
Modelo de sítios infinitos: introduzido por Kimura (1969; 1971) e aprofundado por
diversos pesquisadores, assume que (i) um vasto (praticamente infinito) número de sítios para
mutação estão disponíveis (o número de nucleotídeos que compõem o genoma é tão grande,
porém a taxa de mutação por sítio é tão baixa), de tal maneira que (ii) sempre que um mutante
aparece, representa uma mutação em um novo (diferente) sítio. Ethier e Griffiths (1987)
propuseram um esquema tendo como exemplo três genes mutantes (y1,x0,x1,x2,...),
(y4,y3,y2,x0,x1,x2,...) e (y5,y2,x0,x1,x2,...), obtidos do gene selvagem (x0,x1,...), partindo do
modelo padrão com os genes mutantes (...,1,1,0,0,0,0,0,...), (...,1,0,1,1,1,0,0,...) e
(...,1,0,1,0,0,1,0,...) do gene selvagem (...,1,0,0,0,0,0,0,...). Em ambos os modelos pode se
inferir que os três genes possuem um ancestral comum, cinco sítios segregantes e uma árvore
genealógica (condensada) na forma apresentada na Figura 1A.
42
Modelo de alelos infinitos: Assume que toda mutação cria um novo alelo, nunca
observado previamente (Figura 1B). Ao contrário do modelo anterior, não é especificada a
relação entre os diferentes alelos (RUVINSKY; GRAVES, 2005). Um caso especial desse
modelo é o modelo de k-alelo (KAM), limitado a um número finito (k) de estados alélicos, em
que cada alelo pode mutar para qualquer dos outros k-1 possíveis alelos com igual
probabilidade (BALLOUX, 2001).
Modelos de mutação passo a passo (SMM): Na sua forma mais simples, o modelo
assume que a mutação atua no aumento ou diminuição da mobilidade de um alelo em uma
unidade. Originalmente descrito por Ohta e Kimura (1973), é considerado o modelo de
evolução dos tamanhos de alelos microssatélites, segundo Shriver et al. (1993) e Valdes et al.
(1993). Existem diversos modelos de mutação passo-a-passo, desde os de único passo (SSM),
que assumem que todas as alterações são derivadas de uma única repetição, como aqueles de
múltiplos passos, em que as alterações são derivadas de mais de uma repetição (Figura 1C),
conforme descritos por Estoupe et al. (2002).
Figura 1 – Representação esquemática dos principais modelos de mutação: A – modelo de
sítios infinitos; B – modelo de alelos infinitos; C – modelo de mutação passo a passo. Fonte:
Ethier e Griffiths (1987); Walsh (2002).
43
3.6.4. O fluxo gênico
Corresponde à entrada ou saída de genes, capaz de alterar a composição gênica
original em uma determinada população. Segundo Hellberg et al. (2002), o fluxo gênico é o
número de migrantes entre populações por geração, sendo, assim, importante para conectar
reprodutivamente populações isoladas reprodutivamente. Modelos padrão da genética
populacional não estimam as taxas de migração diretamente, mas, sim, a partir do produto da
proporção de indivíduos que migram por geração (m) e o tamanho populacional efetivo (Ne).
Somente aqueles migrantes com sucesso reprodutivo após migração contribuem para o fluxo
gênico, devido à impossibilidade em se fazer inferências com as técnicas genéticas para os
indivíduos sob pressão de seleção ou desprovidos de potencial reprodutivo. Por isso, na
definição de Neigel (1997), são incluídos os efeitos de todos os movimentos de gametas,
propágulos e indivíduos que efetivamente trocam genes, na distribuição espacial. Wright
(1931) idealizou um modelo segundo o qual, uma população infinita, e com uma frequência
média qm para um dado gene, é composta por subgrupos, cada um trocando a proporção m de
suas populações com uma amostra aleatória de toda população, em que a variação nas
frequências para cada subgrupo é dada por: ∆q = –m(q – qm). Porém, esse modelo é bastante
artificial, considerando-se que, em populações naturais, subgrupos tendem a trocar mais genes
com subgrupos vizinhos e, assim, ∆q será apenas uma fração daquela esperada pelo modelo
de ilhas ideal.
A variação genética existente entre populações de uma espécie resulta de um balanço
entre forças evolutivas que tendem a produzir diferenciação genética local – como a deriva e a
seleção natural – e a força que tende a promover uma homogeneização genética entre as
populações – o fluxo gênico. Por isso, a maior parte dos programas de conservação tem seu
enfoque na redução das barreiras para distribuição de genes nas populações de modo a
minimizar a perda de genes. Tais barreiras podem ser fisiológicas e/ou de distância, muitas
vezes criadas pela fragmentação de populações, resultando na restrição do fluxo de genes
entre as subpopulações, propiciando, assim, a endogamia e deriva genética. Assim, o fluxo
gênico em populações naturais de plantas, tanto pelo movimento de organismos individuais
(sementes, rizomas ou estolões), como pelo movimento de gametas (pólen), é fundamental na
homogeneização das frequências alélicas entre populações pequenas, de modo a que se
comportem como uma grande população com cruzamentos aleatórios, mesmo que separadas
geograficamente. Com frequências alélicas que, antes do fluxo eram diferentes, depois do
44
fluxo se tornam homogêneas entre si, minimizando, desse modo, os efeitos da deriva genética
(SLATKIN, 1985; ZUCCHI, 2002).
O princípio invocado por Tobler (1970, p.236) e conhecido como a primeira lei da
geografia, é utilizado para explicar a influência da distância geográfica sobre a diferenciação
genética entre populações: ―invoco a primeira lei da geografia: todas as coisas estão
relacionadas entre si, no entanto, as coisas mais próximas estão mais relacionadas que as
distantes‖.
Com base nesse princípio, o fluxo gênico entre populações é inversamente
proporcional à distância geográfica existente entre elas. O teste de Mantel (1970) tem sido
usado para testar a correlação de duas matrizes, uma com estimativas da distância genética e a
outra com a distância geográfica entre as populações. Uma correlação positiva e significativa
é indicativa do cumprimento da primeira lei da geografia. Uma correlação negativa ou a
ausência de correlação indica o não cumprimento da lei, que pode acontecer quando o fluxo
ocorre mais entre populações mais distantes e menos em populações próximas (normalmente
resultado de intervenção humana), ausência generalizada (ou taxas baixíssimas) de fluxo entre
populações por mais próximas que elas sejam geograficamente, sistemas de
autoincompatibilidade, ou quando as populações são suficientemente grandes, de tal maneira
que possuem todos os alelos e a troca de genes não leva a uma alteração genética significativa
nelas. O fluxo gênico entre populações é realizado sob diferentes modelos, os quais são
descritos a seguir.
A. Modelos de fluxo gênico
a) Modelo de alpondras (stepping stone) uni-dimensional: As populações, nesse modelo, são
ordenadas ao longo de uma linha, cada população recebendo migrantes apenas de populações
vizinhas (Figura 2A). Se m é a taxa de migração, na i-ésima geração, uma proporção de m/2
migrará para a população i-1 e m/2 para a população i+1. A proporção de indivíduos que
permanecem na população é dada por (1-m) (BALLOUX, 2001; KIMURA; WEISSS, 1964).
b) Modelo de alpondras (stepping stone) bi-dimensional: É a extensão do modelo anterior
para duas dimensões, consistindo de um arranjo retangular (Figura 2B) onde cada população
(exceto aquelas na borda) está conectada a quatro outras populações. A proporção de
45
indivíduos que permanece na população é dada por (1-m) (BALLOUX, 2001; KIMURA;
WEISSS, 1964).
c) Modelo de ilhas: O fluxo corre aleatoriamente entre todas as populações do grupo (Figura
2C). Este é o modelo de ilhas clássico de Wright, em que s subpopulações com N indivíduos
reprodutivos trocam genes entre si na mesma proporção e que qualquer migrante possui a
mesma probabilidade de alcançar qualquer uma das s subpopulações, sendo essa
probabilidade igual a m(1/s-1). A probabilidade de dado indivíduo não migrar é dada por 1-m
(BALLOUX, 2001; KIMURA; WEISSS, 1964; JOMBART et al.; 2010).
d) Modelo de ilha hierárquico: Uma extensão do modelo de ilhas clássico para dois níveis
hierárquicos (Figura 2D). Existem diferentes grupos de ilhas com uma taxa de migração (m1)
dentro do conjunto de ilhas e uma taxa de migração (m2) entre as ilhas. Se a migração ocorre
entre grupos de ilhas, a probabilidade de alcançar qualquer grupo é a mesma,
independentemente do tamanho do grupo. A probabilidade de migração para qualquer
indivíduo é m1+m2. Como 1-(m1+m2) é a probabilidade de não migrar, então (m1+m2) deve
ser inferior a um (BALLOUX, 2001; KIMURA; WEISSS, 1964).
e) Modelos espaciais: Incluem modelos de isolamento por distância, como o esquematizado
na Figura 2E, no qual o fluxo ocorre localmente entre vizinhos, em uma população de
distribuição uniforme. Necessita da indicação do número de dimensões do espaço, sobre as
quais deverão ser fornecidas todas as coordenadas populacionais (BALLOUX, 2001;
KIMURA; WEISSS, 1964; ZUCCHI, 2002).
f) Modelo continente-ilha: Baseado no modelo de ilhas assume migração unidirecional de
uma fonte grande continental com uma frequência alélica fixada para uma população menor
isolada; migração no sentido oposto pode ocorrer, porém, em proporção muito baixa,
insuficiente para alterar significativamente as frequências alélicas da população que recebe os
migrantes devido ao seu tamanho elevado (ZUCCHI, 2002; JOMBART et al.; 2010) (Figura
2F).
46
Figura 2 – Modelos de fluxo gênico. A: Modelo de alpondras (stepping stone) uni-
dimensional; B: Modelo de alpondras (stepping stone) bi-dimensional; C: Modelo de ilhas; D:
Modelo de ilha hierárquico; E: Modelo de isolamento por distância; F: Modelo continente-
ilha. Fonte: Kimura e Weisss (1964); Balloux (2001); Zucchi (2002); Jombart et al. (2010).
B. Estimação do fluxo gênico
O fluxo gênico é um dos principais parâmetros populacionais estimados nos trabalhos
que objetivam a conservação da variabilidade genética, pois é o único fator evolutivo que
diminui a estruturação de populações, distribuindo novos genes criados pela mutação e
permitindo combinações alélicas em populações geograficamente isoladas. Em populações
vegetais o fluxo gênico envolve, em uma primeira abordagem, a dispersão de pólen, o sucesso
na fertilização de um óvulo por esse pólen e, finalmente, o estabelecimento da semente
resultante. Em outra abordagem, envolve a dispersão de semente e seu estabelecimento na
nova população. O tamanho da população que recebe o migrante também desempenha um
47
papel crucial no seu sucesso reprodutivo. Essa complexidade toda na sua abordagem torna a
taxa de fluxo gênico um parâmetro de difícil mensuração (SLATKIN, 1987; ENNOS, 1994).
Medidas diretas e indiretas foram desenvolvidas para quantificar o fluxo gênico em
plantas. As estimativas diretas (que quantificam o fluxo gênico contemporâneo) são centradas
quase exclusivamente no fluxo gênico via pólen, utilizando marcadores genéticos para
classificar o pólen com sucesso reprodutivo como sendo local ou externo, pela análise da
exclusão de paternidade. Taxas de migração via pólen são, então, calculadas como a
proporção do pólen externo em relação ao total do pólen com sucesso reprodutivo. A
desvantagem desses métodos é a subestimação da taxa do fluxo gênico total, pela sua
incapacidade de fornecer qualquer informação relativa ao fluxo de sementes que ocorre entre
populações vegetais. Os avanços na área da genética molecular têm proporcionado técnicas
que permitem medir a diferenciação de populações não somente por marcadores genéticos
nucleares, mas também por marcadores nos genomas de organelas como o cloroplasto e a
mitocôndria, ainda assim, sujeitos a restrições (ENNOS, 1994; ZUCCHI, 2002).
Medidas diretas representantes da dispersão por pólen e semente incluem o
movimento de agentes dispersores, porém, evidências apontam que o movimento do
polinizador sub-representa a real movimentação gênica devido ao alto carregamento de pólen.
Outra desvantagem é que, apesar da dispersão por sementes ter grande potencial para
documentar o fluxo gênico, não fornece informações sobre o sistema reprodutivo, uma vez
que espécies autógamas com movimento a longa distância de liberação de pólen podem ter
menor fluxo gênico que aquelas predominantemente alógamas com liberação local de pólen.
Além disso, movimentos de agentes dispersores não fornecem nenhuma informação a respeito
do sucesso do grão de pólen na fertilização ou sobre a sobrevivência e estabelecimento das
sementes (LEVIN; KERSTER, 1974; ZUCCHI, 2002; VINSON et al., 2015).
Já as medidas indiretas (SLATKIN, 1985), as quais quantificam o fluxo gênico
histórico, ou aparente, são baseadas em dados sobre estrutura genética populacional (FST, GST
ou distribuição de alelos raros) obtidos a partir de análises com marcadores moleculares.
Ajustando-se esses dados aos modelos de diferenciação sob um balanço entre migração e
deriva genética, estimativas quantitativas de Nm, o produto do tamanho populacional efetivo e
a taxa de migração, podem ser calculadas. Apesar de ser uma medida importante da
efetividade do fluxo gênico na contraposição dos efeitos da deriva, Nm não distingue o fluxo
gênico por pólen e semente. Com base no modelo de ilhas, Wright (1951) derivou a seguinte
expressão:
48
ou:
(
)
em que FST é a medida de diferenciação genética entre populações, N é o tamanho da
população, m, a taxa de migração (proporção de migrantes) e, Nm, o número de migrantes por
geração.
Conforme mencionado, o fluxo gênico obtido dessa maneira é chamado de histórico,
passado ou aparente, pois admite estrutura genética populacional sob modelo de ilhas de
Wright, assume equilíbrio entre migração-deriva, pressupõe que o tamanho populacional e a
taxa de migração são uniformes e constantes no tempo e no espaço e que todas as populações
contribuem igualmente na troca de genes. Apesar do modelo de ilhas ser o mais convencional,
não reflete o movimento contemporâneo dos genes ou as alterações no processo de dispersão
entre populações, mas fornece informações valiosas sobre efeitos cumulativos de fluxo gênico
na estrutura genética de populações (SORK et al., 1999).
Um valor de Nm inferior a um significa que o fluxo gênico não é suficiente para
contrapor os efeitos da deriva genética, resultando, assim, na diferenciação populacional; por
outro lado, Nm superior a um indica que o fluxo gênico é a força evolutiva predominante na
determinação das frequências alélicas, resultando na homogeneização das populações (menor
diferenciação populacional). A relação inversa entre FST e Nm observada na equação indica
que o aumento no número de migrantes por geração reduz a diferenciação entre populações e
vice-versa (SLATKIN, 1985; ZUCCHI, 2002).
Slatkin propôs outro método indireto para estimar o número de migrantes por geração
(Nm), o qual leva em consideração a frequência dos alelos privados, ou seja, alelos exclusivos
a uma ou poucas populações. O método se baseia no fato de que o logaritmo de Nm é
linearmente relacionado ao logaritmo da frequência média dos alelos privados (pl)
(SLATKIN, 1985; ZUCCHI, 2002):
em que a e b são constantes dependentes do tamanho das amostras.
49
3.7 População mínima viável e o tamanho efetivo populacional
O estabelecimento de prioridades para a conservação de espécies e de objetivos
quantitativos de manejo passa pela estimação dos riscos aleatórios de extinção enfrentados
pelas populações isoladas. Os primeiros trabalhos sobre a estimativa de risco de extinção
tiveram seu foco na Análise de Viabilidade Populacional (AVP) e outros métodos
relacionados que visavam estimar o tamanho limiar, abaixo do qual os riscos de extinção
seriam considerados extremamente altos. Foi, então, proposto o conceito de População
Mínima Viável (PMV), que visa compreender a viabilidade (sobrevivência) em longo prazo de
populações, relacionada com a probabilidade de extinção, sob a premissa de que populações
maiores são mais aptas que aquelas menores para conter os efeitos estocásticos que ameaçam
as populações em extinção (KAGEYAMA; LEPSCH-CUNHA, 2001; FLATHER, 2011).
Segundo Shaffer (1981), população mínima viável pode ser definida como o menor tamanho
necessário para que uma população ou espécie tenha uma probabilidade predeterminada de
persistência para um dado período de tempo.
As primeiras análises de estocasticidade genética resultaram nos chamados números
mágicos 50 e 500, que foram utilizados amplamente nas definições de tamanhos de reserva
genética. O número 50 refere-se ao tamanho mínimo de uma população recomendada para
conter os efeitos da endogamia, consideradas 100 gerações. Porém, como a estocasticidade
genética pode resultar na perda da flexibilidade evolucionária em longo prazo, foram
realizadas análises para o mesmo número de gerações as quais resultaram em um tamanho
mínimo populacional de 500 indivíduos para conter a perda de variabilidade genética,
permitindo sua adaptação às alterações ambientais (KAGEYAMA; LEPSCH-CUNHA, 2001).
Atualmente, a população mínima viável é abordada em termos de tamanho efetivo
populacional, que incorpora variáveis relacionadas à estrutura genética da população. O
tamanho efetivo populacional permite quantificar o efeito da deriva (tamanho efetivo de
variância) e da endogamia (tamanho efetivo de endogamia), relacionados com a
representatividade genética de amostras de indivíduos de uma população finita, sendo, então,
um parâmetro importante na amostragem para coleta de sementes e na delimitação de uma
área mínima viável para conservação in situ de uma espécie. O tamanho efetivo de variância é
definido como o tamanho de uma população ideal com a mesma variância amostral de
frequências alélicas que a população total, enquanto o tamanho efetivo de endogamia
corresponde ao tamanho de uma população ideal com a mesma probabilidade de que alelos
50
amostrados aleatoriamente tenham a mesma identidade por descendência que a população
total (WRIGHT, 1931; KIMURA; CROW, 1963; CABALLERO, 1994).
Diversos autores produziram expressões para o cálculo do tamanho efetivo
populacional, mediante condições específicas. Um resumo de expressões usadas para estimar
os tamanhos efetivos, tanto de endogamia como de variância para populações monoicas e
dioicas, é apresentado no Anexo II, considerando-se casos de especial interesse.
Cockerham (1969) derivou uma expressão para o cálculo do tamanho efetivo de
variância para espécies hermafroditas com sistema misto de reprodução:
(
)
sendo n o tamanho da amostra, F o coeficiente de endogamia e θ o coeficiente de médio de
coancestria.
Se o número de descendentes por autofecundação e por cruzamentos possui
distribuições de Poisson independentes, o tamanho efetivo de endogamia para uma amostra de
tamanho n e sem parentesco pode ser determinado a partir do coeficiente de endogamia (Fis)
com base na seguinte expressão (POLLAK; SABRAN, 1992):
Embora esse estimador considere a endogamia na população, desconsidera a presença
de parentesco entre os membros da população, que é outro fator gerador de endogamia na
descendência. Por esse motivo, Sebbenn e Seoane (2005) derivaram a seguinte expressão para
o tamanho efetivo de endogamia aplicado a indivíduos diploides de espécies monoicas e que
considera tanto a endogamia quanto o parentesco nas populações:
51
em que n é o tamanho amostral; é o coeficiente de coancestria (a probabilidade de
que dois alelos homólogos, retirados aleatoriamente de dois indivíduos, x e y, sejam idênticos
por descendência, isto é, sejam cópias de um mesmo alelo de um antecessor recente); f é o
índice de fixação ou coeficiente de endogamia; é a coancestria entre o par de indivíduos x
e y. Em populações de cruzamentos aleatórios, a coancestria equivale à endogamia na
descendência ( =f).
A população mínima viável pode ser também, abordada em termos de Área Mínima
Viável (AMV), parâmetro muito utilizado como a expressão do tamanho de área mínima de
um fragmento florestal capaz de manter populações viáveis. É estimada com base na
População Mínima Viável (PMV) e nas densidades populacionais dessas espécies, que podem
ser estimadas em campo ou obtidas a partir de dados da literatura (SEBBENN et al., 2003;
SILVA et al., 2014).
A área mínima viável é estimada com base na seguinte expressão:
em que AMV é a área mínima viável; n o tamanho da amostra;d a densidade populacional
(número de indivíduos por hectare); Ne o tamanho efetivo populacional; e Ne(ref), o tamanho
efetivo de referência.
Sebbenn et al. (2003) e Silva et al. (2014) usaram a expressão anterior para o cálculo
da área mínima viável para a conservação in situ de populações, tendo usado o tamanho
efetivo de referência de 1000 indivíduos, conforme recomendado por Lynch (1998). O
tamanho efetivo de referência corresponde ao tamanho mínimo a partir do qual a variância
genética média (decorrente da deriva genética) se torna independente do tamanho
populacional, sendo, então, de especial importância para a conservação em longo prazo.
52
3.8 Simulação de dados genéticos
Devido à crescente perda da biodiversidade, é urgente o desenvolvimento de
estratégias eficientes para prever cenários futuros, em face de ações antrópicas. O
comportamento futuro de uma dada espécie ou população pode ser previsto através da sua
história evolutiva do passado ao presente. Muitos fatores que contribuem podem ser acessados
através da biologia reprodutiva e de marcadores moleculares, haja vista que a história
evolutiva é difícil de acessar (PENG et al., 2013).
Estudos sobre o sistema reprodutivo podem ser conduzidos para determinar, entre
outros parâmetros, taxas de cruzamento, de autofecundação, a proporção de cruzamentos
endogâmicos ou biparentais, a distância de dispersão de pólen, a taxa de fluxo gênico entre
populações. Tais estudos podem ser eficientemente realizados mediante o uso de marcadores
moleculares, em especial àqueles de herança codominante e altamente polimórficos, como os
microssatélites, desde que se adote uma amostragem delineada adequadamente para atingir os
objetivos do estudo (SEBBENN, 2006).
O procedimento envolve a utilização de modelos genéticos para descrever padrões de
reprodução, como o modelo de reprodução e o modelo de cruzamentos correlacionados.
Devido ao custo e disponibilidade de amostras genéticas, falta de conhecimento das variantes
causais que contribuem para os fenótipos observados e intratabilidade matemática de modelos
evolutivos complexos, simulações de computador têm sido amplamente utilizadas para, entre
várias aplicações, prever resultados sob cenários genéticos reais, comparar e verificar os
métodos ou ferramentas e estimar parâmetros de modelos evolutivos (PENG et al., 2013).
Com o avanço cada vez mais crescente na área da informática, novos métodos e
programas de simulação vêm sendo desenvolvidos na área da biologia evolutiva para inferir
com maior acurácia eventos passados a partir de dados atuais. Pela natureza inerentemente
desconhecida dos eventos passados, esses programas permitem desvendar as relações
evolutivas entre caracteres moleculares simples, genes, genomas e espécies. Simulações da
evolução in silico podem ser divididas em duas categorias principais (YUAN et al., 2012;
DALQUEN et al., 2012):
Em genética populacional, a simulação leva em conta as alterações dentro e entre
populações de indivíduos, que surgem através de modelos de sexo, recombinação, ou
53
conversão gênica (recombinação mitótica). A simulação pode ser realizada para trás
(coalescência) ou para frente no tempo.
Em filogenética e biologia evolutiva, a simulação envolve representantes únicos de
espécies relacionadas entre si por uma árvore. Os programas simulam diferentes modelos de
evolução ao nível da sequência do gene ou proteína e do genoma, permitindo, assim, estudar
os efeitos de vários modelos genéticos sobre a variabilidade genética.
Entre os diversos parâmetros que podem ser simulados pelos aplicativos
computacionais, destacam-se:
Padrão de herança: Inferências sobre padrões de cruzamento e herança genética em
populações, com base em combinações parental-descendência.
Frequências gênicas: Estimativas das frequências dos diferentes alelos no conjunto
populacional.
Deriva genética: Uma simulação que ilustra como as frequências alélicas mudam ao
longo do tempo como resultado da deriva genética em populações pequenas. Podem, então,
ser simulados diferentes frequências alélicas iniciais, tamanhos populacionais e números de
gerações.
Seleção natural: Alterações nas frequências alélicas ao longo do tempo em resposta à
seleção natural; podem ser simuladas diferentes aptidões para cada genótipo, sob um número
de gerações fixo.
Modelos e taxas de mutação: Permitem simular diferentes modelos em que
determinado loco transita para um estado alélico diferente, bem como as taxas em que essas
mutações ocorrem na população.
Modelos e taxas de migração: Simulam diferentes modelos em que os genes transitam
de uma geração para outra e diferentes taxas em que isso ocorre.
Divergência de sequências de DNA: Simulação que ilustra a divergência de sequências
de DNA.
Estocasticidade demográfica: Uma simulação que permite avaliar a probabilidade de
persistência de populações estruturadas.
54
Baseados na assunção de que a origem de doenças causadas por mutações pode ser
rastreada através de haplótipos (conjunto de Polimorfismos de Nucleotídeos Únicos – SNPs
do mesmo cromossomo e que são herdados juntos devido à proximidade entre os locos onde
estão presentes, não existindo, portanto, recombinação nessa região do cromossomo) nos
quais são encontradas, Calafell et al. (2001), desenvolveram um programa para simular a
evolução de haplótipos e desequilíbrio de ligação gênica, sob um cenário evolucionário
complexo. Nesse cenário foram incluídos o Tamanho Efetivo Populacional, história
demográfica, taxa e modelos de mutação e taxa de recombinação, e, conforme esperado em
SNPs, as frequências alélicas foram constantes com o passar das gerações, o que validou a
simulação. Por seu turno, COSTA et al. (2015) realizaram simulações no programa Easypop
para estimar a fração mínima a ser amostrada em uma população para se obter estimativas
confiáveis de riqueza alélica e coeficiente de endogamia.
Inúmeros programas já foram desenvolvidos para realizar simulação de dados
genéticos, alguns dos quais se encontram listados no Anexo II. Neste trabalho, foram
utilizados os programas EASYPOP para a simulação e FSTAT para a análise dos dados, que
serão brevemente descritos a seguir.
3.8.1 O EASYPOP
O EASYPOP (BALLOUX, 2001) é um programa destinado a simular conjuntos de
dados sob uma ampla gama de condições, permitindo explorar problemas muito complexos
em genética de populações. Permite simular dados em haploides, diploides ou haplodiploides
(presença de fêmeas diploides oriundas da combinação de gameta masculino e feminino, e de
machos haploides oriundos de óvulos não fecundados, característico de vários himenópteros e
alguns besouros) e seus diversos sistemas reprodutivos. Podem ser simulados, também,
diversos modelos de migração e de mutação em diferentes taxas.
A fim de se ajustar às expectativas analíticas, em especial para variâncias, as funções
implementadas no EASYPOP são probabilísticas e não deterministas, ou seja, as simulações
se apóiam na geração de números aleatórios, permitindo gerar repetições independentes, que
são diferentes realizações de uma mesma expectativa. As entradas do programa estão
55
limitadas aos parâmetros escolhidos pelo utilizador para qualquer simulação, incluindo
parâmetros ecológicos e reprodutivos, ao passo que as saídas consistem de estatísticas de
estruturação genética das populações tais como heterozigosidade observada e esperada e as
estatísticas F. Isso permite, a partir de dados reais de estruturação genética obtidos mediante
marcadores moleculares, realizar simulações visando encontrar o modelo ecológico e
reprodutivo que melhor explica tais resultados. Esses arquivos podem ser analisados
diretamente em diversos programas, incluindo FSTAT (GOUDET, 1996) ou ARLEQUIN
(EXCOFFIER et al., 2005).
3.8.2 O FSTAT
Desenvolvido por Goudet (1995), o software estima diversidades gênicas e
estatísticas de diferenciação a partir de marcadores genéticos codominantes ou de dados
gerados em programas de simulação como o EASYPOP e faz os respectivos testes usando
métodos de aleatorização. A partir de um conjunto de dados de marcadores genéticos
codominantes ou haploides, FSTAT permite determinar os seguintes parâmetros:
Frequência alélica total ou por amostra
Número observado e esperado de cada genótipo por amostra e loco
Variabilidade genética por amostra e loco
Número de alelos e riqueza alélica por loco, amostra e total
O índice de fixação (FIS) por loco e amostra, bem como um teste para saber se é
significativamente positivo ou negativo (significativo para déficit ou excesso de
heterozigotos respectivamente)
Estimadores de diversidade gênica e diferenciação de Nei
Estimativas de F (FIT), θ (FST) e f (FIS) por alelo, loco e total
Estatísticas R (SLATKIN, 1995), especificamente concebidas para microssatélites sob
modelo de mutação passo a passo
Testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada loco, amostra por loco e para todo o
conjunto de dados
Testes de diferenciação para cada par de amostras
56
O programa realiza a conversão do arquivo de saída para o formato GENEPOP. São
fornecidos, também, intervalos de confiança baseados em esquemas de reamostragem para as
estatísticas Weir e Cockerham: o Jackknifing e o Bootstrapping.
3.9 Descrição da espécie em estudo
O açoita-cavalo (Luehea divaricata Mart. & Zucc.) pertence à família Malvaceae, e
ocorre naturalmente em diversos estados do Brasil (Figura 3), nos biomas Mata Atlântica,
Cerrado, Caatinga e Pampa, e, também, no nordeste da Argentina, no leste do Paraguai e no
norte do Uruguai. Sua ocorrência depende do tipo de bioma e formação florestal, sendo que,
no Rio Grande do Sul, ocorre com frequências de até 46 indivíduos por hectare, na Floresta
Ombrófila Mista do bioma Mata Atlântica, e de até 20 indivíduos por hectare, na mata de pau-
ferro (Myracrodruon balansae) do bioma Pampa (CARVALHO, 2008). Levantamentos
fitossociológicos mais recentes revelaram valores de 76,96 (HÜLLER et al., 2011) e 26,32
(FIGUEIREDO, 2014), nos municípios de Santo Ângelo (Bioma de Mata Atlântica), em
2008, e São Martinho da Serra (transição entre os biomas da Mata Atlântica e Pampa), em
2014, respectivamente.
É uma árvore decídua, heliófita, seletiva higrófita, típica de solos aluviais das bacias
hidrográficas, constituindo-se na espécie emergente nas florestas ribeirinhas. Apresenta
dispersão irregular e descontínua, sendo particularmente frequente ao longo de rios, terrenos
rochosos e íngremes, onde a floresta é mais aberta, e nas formações secundárias. Possui uma
das madeiras brasileiras mais valiosas e de amplo uso, incluindo a fabricação de móveis
vergados. Do ponto de vista ambiental, é uma das árvores de uso mais relevante no
reflorestamento em função da adaptação às encostas íngremes, margens de rios e áreas com
solo permanentemente encharcado. Suas lindas flores de diversas tonalidades são muito
visitadas, principalmente por insetos como as abelhas e beija-flores. Seu reconhecimento é
facilitado por suas folhas discolores, verde-escuras na face superior e brancas na face inferior,
bem como seus frutos em forma de cápsula lobada de valvas lenhosas, de coloração castanha,
com densa pilosidade ferrugínea cobrindo inteiramente o tegumento e o pedicelo do fruto
(LORENZI, 2002; CARVALHO, 2008).
57
Trata-se de uma espécie hermafrodita (CARVALHO, 2008) e classificada, quanto ao
sistema reprodutivo, como alógama (RUAS et al., 2009), isto é, com predomínio de
fecundação cruzada em suas populações. Alia dispersão anemocórica (pelo vento) de seus
frutos e sementes com atratividade de insetos polinizadores, principalmente abelhas, a suas
vistosas pétalas róseas, roxas ou, raramente, brancas (CARVALHO, 2008). O fato de essa
espécie florestal ter sofrido grande ação antrópica nas últimas décadas contribuiu bastante
para a redução de suas populações naturais, e consequentemente, de sua variabilidade
genética, sendo esses efeitos mais drásticos por se tratar de uma espécie alógama (FLÔRES et
al., 2011), justificando deste modo a realização de estudos relacionados à sua conservação.
Há poucos trabalhos de caracterização genética de populações de Luehea divaricata
disponíveis na literatura, sendo que fizeram uso de marcadores moleculares do tipo RAPD ou
microssatélites (SSRs). De Carvalho et al. (2008), usaram, com sucesso, marcadores RAPD
para avaliar a diferenciação genética entre populações expostas e não expostas à inundação.
Ruas et al. (2009) identificaram sequências de DNA contendo SSRs, a partir do
desenvolvimento de bibliotecas enriquecidas em microssatélites pelo método de hibridização
e captura; deste processo resultaram 10 locos polimórficos de microssatélites, os quais foram
utilizados para caracterizar uma amostra de 42 indivíduos pertencentes a três populações
distintas, sendo observados um total de 45 alelos, obtido um conteúdo de informação
polimórfica (PIC) de 0,546, heterozigosidade observada variando entre zero e 0,929 e
heterozigosidade esperada entre 0,194 e 0,821. Nove desses locos foram utilizados por
Conson (2012) para estudar a estrutura genética de 268 indivíduos pertencentes a nove
populações dessa espécie, amostrados ao longo da sua área de distribuição no bioma Mata
Atlântica, tendo observando um total de 50 alelos e altos valores de heterozigosidade
observada e esperada (0,53 e 0,67 respectivamente). Por seu turno, Nagel et al. (2015)
utilizaram cinco desses locos microssatélites para caracterizar a diversidade e estrutura
genética de 128 indivíduos pertencentes a cinco fragmentos dessa espécie que ocorrem na
região da Fronteira Oeste do Rio Grande do Sul, no bioma Pampa, o que resultou em uma
heterozigosidade observada e esperada de 0,52 e 0,64, respectivamente, sendo, a partir desses
resultados, realizadas as simulações do presente trabalho. Os resultados dessas simulações se
revestem de enorme importância, pois permitiram determinar parâmetros genéticos para a
conservação dos fragmentos dessa espécie que teve, nas últimas décadas, suas populações
naturais reduzidas e fragmentadas pelas atividades humanas, expondo-a a eventos genéticos
que aumentam o risco de extinção.
58
Figura 3 – Locais identificados de ocorrência natural de açoita-cavalo (Luehea divaricata
Mart. & Zucc.) no Brasil. Fonte: Carvalho (2008).
4 METODOLOGIA
As simulações e análises foram realizadas no Núcleo de Biotecnologia e
Melhoramento do Departamento de Fitotecnia, Centro de Ciências Rurais da UFSM,
localizado em Santa Maria, RS. Os programas usados (EASYPOP e FSTAT) estão
disponíveis para download, de forma gratuita, nas respectivas páginas online, indicadas no
anexo II.
4.1 Simulações
Foi utilizado o programa EASYPOP (versão 2.0.1) para simular diferentes taxas de
autofecundação (0,1, 0,3, ou 0,5) e de migração (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9), a
fim de selecionar o modelo que melhor explica os resultados obtidos por marcadores
microssatélites no trabalho desenvolvido por Nagel et al. (2015). Os fragmentos estudados
foram: Camboazinho (100 indivíduos), Arroio Canas (100 indivíduos), Fazenda Inhatinhum,
no município de São Gabriel (300 indivíduos), Rio Cacequi (100 indivíduos) e BR290 (50
indivíduos), todos localizados na Região da Fronteira Oeste do Rio Grande do Sul (Figura 4).
É oportuno esclarecer que o número de indivíduos de cada fragmento foi obtido em um
levantamento fitossociológico efetuado em 2013 (dados não publicados).
Segundo Nagel (2013), as denominações dos fragmentos amostrais fazem referência
ao local de coleta. O fragmento Camboazinho corresponde à mata ciliar do Rio Camboazinho;
o fragmento Arroio Canas, também de mata ciliar, está localizado junto BR 290; o fragmento
da Fazenda Inhatinhum corresponde à unidade produtiva do mesmo nome, em um
remanescente florestal bem conservado; o fragmento do Rio Cacequi corresponde à mata
ciliar deste recurso hídrico, que fica junto à BR 158; o fragmento denominado BR 290, é um
povoamento quase que homogêneo de Luehea divaricata localizado junto à rodovia do
mesmo nome.
60
O modelo foi simulado para uma espécie diploide, hermafrodita, com cruzamentos não
aleatórios e com ausência de reprodução clonal. A distância média de dispersão considerada
foi de 10.000 m, consoante os resultados obtidos por Nagel et al. (2015). Conforme a
disposição geográfica dos fragmentos foi considerado o modelo de migração espacial,
definido por duas dimensões, as quais foram obtidas por meio da alocação linhas verticais e
horizontais tracejadas no mapa, com intervalos de uma unidade, baseado na posição
geográfica real dos fragmentos (Figura 5).
Foram simulados cinco e dez locos que evoluem de acordo com o modelo de mutação
misto SSM com uma proporção 0,1 de eventos KAM, sob 10, 45 ou 50 estados alélicos
possíveis, os quais. A taxa de mutação foi de 0,0004. A variabilidade da população inicial foi
considerada máxima, diminuindo com o passar de 400 gerações. Foram realizadas 100
repetições para cada combinação de taxa de autofecundação e de migração avaliada.
Foi selecionado o modelo que apresentou os valores mais próximos daqueles obtidos
por marcadores microssatélites, tendo como critério de seleção a heterozigosidade observada
e esperada, cujos valores foram 0,52 e 0,64 respectivamente. Os arquivos no formato .dat,
referentes ao modelo selecionado, foram analisados no programa FSTAT, sendo obtidas as
demais estatísticas, importantes para caracterizar os fragmentos estudados, a saber: a riqueza
alélica, a diversidade genética e os índices de diferenciação genética entre populações,
segundo diferentes abordagens. O valor do índice de fixação intrapopulacional (FIS) foi usado
para estimar a taxa de cruzamentos aparente (ta), dada pela expressão:
Foi determinada a estimativa de fluxo gênico em termos de número médio de
migrantes por geração (Nm) a partir do valor de RST, em se tratando de dados de
microssatélites, conforme a equação, também usada por outros autores, tais como Kasarasawa
et al. (2007) e Nagel et al. (2015):
61
(
)
Foram também estimados os valores de Nm para cada par de fragmentos, baseado nos
valores respectivos de FST par a par, devido a limitação do programa FSTAT em fornecer
valores de RST par a par.
Figura 4 – Localização geográfica dos fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc.
estudadas. A: Delimitações do Pampa strictu sensu no sul do Brasil, com a área amostral
destacada na Figura. B: Localização dos cinco fragmentos de L. divaricata plotados nas
imagens de satélite do bioma Pampa, usadas na caracterização molecular e simulações do
presente estudo. Fonte: Nagel et al. (2015).
62
Figura 5 – Distribuição espacial das cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc.
com as duas coordenadas geográficas inseridas sobre o mapa. Fonte: adaptado de Nagel et al.
(2015).
4.2 Parâmetros Genéticos para a Conservação de Populações Naturais de L.
divaricata
Com base nas estatísticas obtidas, foram determinados os parâmetros importantes para
a conservação, a saber, o Tamanho Efetivo Populacional (Ne), a População Mínima Viável
(PMV) e a Área Mínima Viável (AMV) para cada fragmento. O Ne determinado foi o de
endogamia, o qual correspondeu ao tamanho representativo do fragmento de tamanho n em
termos de identidade por descendência de alelos amostrados aleatoriamente, dado o
coeficiente de endogamia f, sendo usada a equação:
A PMV foi estimada para cada fragmento através da divisão do tamanho efetivo de
referência (Ne(ref.)) pela razão Ne/n, conforme Vieira e Carvalho (2008). A diferença (D) entre
o tamanho amostral e o PMV foi calculada (D = n – PMV), a qual corresponde a:
63
⁄
em que d é a densidade da espécie (indivíduos ha-1
), A é a área do fragmento (ha), n é o
tamanho amostral de cada fragmento e Ne(ref.) é o tamanho efetivo de referência adotado para
100 ou 1000, para conservação em curto ou longo prazo, respectivamente, de acordo com
Nunney e Campbell (1993).
Fragmentos com valores positivos de D foram considerados viáveis para conservação
ao passo que aqueles com valores negativos foram classificados como inviáveis. A AMV foi
estimada com base na equação , para conservação em curto e longo prazos,
considerando-se a densidade de 26,32 estimada por Figueiredo (2014) para esta espécie no
município de São Martinho da Serra, RS, em decorrência de estar inserida no bioma Pampa,
assim como os fragmentos do presente estudo.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Seleção de Modelos
Ao final das simulações inicialmente propostas, em que foram considerados 10 locos
microssatélites e 10 estados alélicos possíveis, o modelo que melhor explicou a análise
genética com marcadores microssatélites, tendo-se como critério os valores de 0,52 e 0,64
para as heterozigosidades observada e esperada, respectivamente, correspondeu àquele em
que a taxa de autofecundação é igual a 0,3 e taxa de migração, entre 0,3 e 0,5 (Tabela 2). A
taxa de migração de 0,4, com valores de heterozigosidade observada e heterozigosidade
esperada de 0,526 e 0,638, respectivamente (na taxa de autofecundação de 0,3), parece a mais
adequada, porém, pelo teste t a 5% de probabilidade de erro, não difere significativamente das
taxas de 0,3 e 0,5, sendo diferente das taxas de 0,2 e 0,6.
Tabela 2 – Estimativas de heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada (Hs)
geradas por simulações no programa EASYPOP (BALLOUX, 2001) sob diferentes taxas de
autofecundação e de migração, de cinco fragmentos de L. divaricata Mart. & Zucc. em
desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul.
Taxa de autofecundação
Taxa de migração
0,1 0,3 0,5
Ho Hs Ho Hs Ho Hs
0,1 0,599 0,631 0,507 0,615 0,381 0,571
0,2 0,609 0,643 0,511 0,618 0,393 0,587
0,3 0,621 0,654 0,520 0,630 0,398 0,595
0,4 0,621 0,657 0,526 0,638 0,407 0,611
0,5 0,630 0,665 0,533 0,646 0,416 0,621
0,6 0,644 0,679 0,536 0,650 0,418 0,627
0,7 0,648 0,684 0,545 0,659 0,418 0,629
0,8 0,650 0,686 0,534 0,651 0,421 0,629
0,9 0,645 0,679 0,544 0,659 0,415 0,622
Fonte: o autor
65
Simulações adicionais, realizadas com a incorporação de novas variáveis obtidas por
outros pesquisadores (RUAS et al., 2009; CONSON, 2012), que caracterizaram
geneticamente essa espécie, sendo considerados 5 locos e 45 estados alélicos possíveis, 10
locos e 45 estados alélicos possíveis, 10 locos e 50 estados alélicos possíveis, resultaram em
heterozigosidades (observada e esperada) semelhantes para todas as taxas de autofecundação
e de migração testadas no presente trabalho (Tabelas 3 e 4). Entretanto, isso não resultou no
modelo de 0,3 de taxa autofecundação e 0,4 de migração obtido pela simulação que empregou
10 locos e 10 estados alélicos.
Nenhum modelo, nas simulações adicionais, apresentou valores idênticos àqueles
obtidos no trabalho de Nagel et al. (2015) com marcadores microssatélites, o que motivou a
inclusão de outras mais taxas de autofecundação (0,2 e 0,4). Após, existiu outra necessidade
de simular taxas mais baixas de migração para a taxa de autofecundação de 0,3, em função do
comportamento dos valores de heterozigosidade observada e esperada. Foram plotados, no
mesmo gráfico, os valores da heterozigosidade observada e esperada em função da taxa de
migração para as taxas de autofecundação de 0,3 e 0,5, para efeito de comparação (Figura 6).
O comportamento dos gráficos sugere que, em se realizando simulações adicionais na taxa de
autofecundação de 0,3, poderia ser obtido o modelo procurado (HO = 0,52 e HS = 0,64), ao
contrário da taxa de autofecundação de 0,5 (e também das restantes taxas de autofecundação).
Por isso, foram selecionadas as taxas de migração de 0,01; 0,02; 0,03 e 0,05, para novas
simulações na taxa de autofecundação de 0,3. Os resultados obtidos estão apresentados na
Tabela 3 e sugerem que a taxa de migração de 0,02 (2%) se ajusta melhor aos dados obtidos
por marcadores microssatélites, com diferença significativa em relação às outras taxas
testadas (teste t ao nível de 5% de probabilidade de erro) em todas as novas simulações com
números de alelos superiores. Por serem observados resultados semelhantes em todas as
combinações foi selecionado o modelo com 10 locos e 45 estados alélicos possíveis para fazer
a caracterização da população e as análises subsequentes no FSTAT
66
Tabela 3 – Estimativas de heterozigosidade observada (HO) e heterozigosidade esperada (HS)
geradas por simulações no programa EASYPOP (BALLOUX, 2001), em função de diferentes
taxas de autofecundação, taxas de migração, números de locos e números de estados alélicos
possíveis, de cinco fragmentos de L. divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma
Pampa, Rio Grande do Sul.
Taxa de autofecundação
Taxa de
migração
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
HO HS HO HS HO HS HO HS HO HS
5 l
oco
s e
45 e
stad
os
alél
icos
poss
ívei
s
0,01
0,510 0,612
0,02
0,524 0,630
0,03
0,533 0,646
0,05
0,536 0,650
0,1 0,660 0,695 0,601 0,675 0,548 0,667 0,487 0,646 0,417 0,624
0,2 0,666 0,702 0,611 0,685 0,556 0,672 0,502 0,665 0,434 0,649
0,3 0,668 0,705 0,619 0,696 0,566 0,686 0,505 0,673 0,434 0,652
0,4 0,677 0,713 0,626 0,704 0,573 0,692 0,510 0,680 0,448 0,671
0,5 0,688 0,726 0,642 0,720 0,579 0,702 0,517 0,688 0,456 0,680
0,6 0,697 0,734 0,641 0,721 0,583 0,705 0,515 0,690 0,460 0,687
0,7 0,790 0,740 0,655 0,735 0,594 0,721 0,527 0,700 0,459 0,689
0,8 0,695 0,733 0,654 0,734 0,595 0,722 0,526 0,701 0,460 0,690
0,9 0,704 0,742 0,646 0,726 0,594 0,721 0,525 0,702 0,455 0,682
10 l
oco
s e
45 e
stad
os
alél
icos
poss
ívei
s
0,01
0,510 0,615
0,02
0,525 0,636
0,03
0,535 0,647
0,05
0,542 0,658
0,1 0,655 0,690 0,601 0,675 0,543 0,659 0,487 0,646 0,417 0,625
0,2 0,671 0,707 0,611 0,685 0,556 0,672 0,502 0,665 0,434 0,643
0,3 0,668 0,706 0,619 0,696 0,568 0,689 0,505 0,673 0,437 0,653
0,4 0,679 0,715 0,626 0,704 0,567 0,688 0,510 0,680 0,443 0,663
0,5 0,692 0,730 0,642 0,720 0,576 0,698 0,517 0,688 0,452 0,678
0,6 0,697 0,736 0,641 0,721 0,585 0,709 0,515 0,690 0,452 0,678
0,7 0,699 0,736 0,655 0,735 0,589 0,714 0,527 0,700 0,462 0,692
0,8 0,696 0,735 0,654 0,734 0,587 0,713 0,526 0,701 0,458 0,686
0,9 0,701 0,739 0,646 0,726 0,587 0,713 0,525 0,702 0,457 0,687
Fonte: o autor
67
Figura 6 – Comportamento da heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada
(Hs) em função da taxa de migração para as autofecundações de 0,3 e 0,5 de cinco fragmentos
de L. divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul.
Santa Maria, RS, 2015.
A análise de todas as simulações geradas indica um aumento na heterozigosidade,
tanto na observada, como na esperada, com o aumento na taxa de migração (Tabelas 2 e 3),
devido à maior distribuição dos alelos entre as populações e sua recombinação. Por se esperar
o mesmo comportamento para a simulação com 10 locos e 50 estados alélicos foram
simuladas somente as taxas de migração 0,01; 0,02; 0,03; 0,05 e 0,1 e a taxa de
autofecundação de 0,3, tendo-se obtido resultados semelhantes (Tabela 4).
68
Tabela 4 – Valores de heterozigosidade observada (HO) e heterozigosidade esperada (HS) em
função de diferentes taxas de migração, obtidos em simulações no programa EASYPOP
(BALLOUX, 2001), de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em
desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul, considerando a taxa de
autofecundação de 0,3, número de locos igual a 10 e número de estados alélicos possíveis
igual a 50.
Taxa de migração HO HS
0,01 0,509 0,617
0,02 0,530 0,637
0,03 0,537 0,648
0,05 0,538 0,654
0,10 0,545 0,662
Fonte: o autor
Em decorrência das análises, resultaram duas possibilidades em relação à taxa de
migração: 0,4 ou 0,02, apesar da convergência em relação à taxa de autofecundação, que foi
igual a 0,3. Para caracterizar, na sequência, os fragmentos, foi escolhido o segundo modelo
(taxa de fecundação de 0,3 e taxa de migração de 0,02), que resultou de diferentes simulações
que incluíram parâmetros obtidos na literatura referente à caracterização dessa espécie
(número de locos e de alelos), além da análise no programa FSTAT apresentar maior
congruência com àquela obtida por marcadores moleculares no estudo de Nagel et al. (2015).
5.2 Caracterização dos fragmentos
Com base no modelo selecionado, a população pode ser caracterizada, quanto ao modo
de reprodução, como mista, com predomínio de cruzamentos, conforme a classificação de
Destro e Montalván (1999), com uma taxa de autofecundação de 0,3, sendo que a taxa de
cruzamentos situa-se na ordem dos 0,7, sugerindo a presença de algum sistema de
autoincompatibilidade nessa espécie, o qual reduz, mas não impede a autofecundação.
Segundo Brewbaker (1959) e Bawa (1974), a autoincompatibilidade é um mecanismo muito
frequente em angiospermas, com vista a prevenir os efeitos adversos da endogamia e da perda
de variabilidade genética.
69
Adicionalmente, deve-se considerar, segundo Lobo et al. (2013), que taxas de
autofecundação em espécies com sistema misto de reprodução dependem de fatores
ecológicos como densidade populacional, abundância e efetividade de polinizadores. Em
ambientes fragmentados ou perturbados, as espécies respondem à escassez de polinizadores
com um aumento nas taxas de autofecundação de modo a garantir a reprodução. Desse modo,
a subdivisão e o consequente isolamento reprodutivo de seus fragmentos (o fluxo gênico
restrito aos fragmentos próximos) resultaram na redução da taxa de cruzamentos, abaixo
inclusive da média registrada em populações naturais de espécies arbóreas folhosas, que é de
0,88 (SEBBENN, 2002; SOBIERAJSKI et al., 2006), sugerindo, também, uma perda de
alelos de autoincompatibilidade pela deriva genética, que permitiu aos indivíduos de se
autofecundar com sucesso. Lobo et al. (2013) estudaram o sistema reprodutivo em uma
população perturbada de Ceiba pentandra (Malvaceae) em diferentes anos, obtendo como
resultado uma taxa de cruzamentos igual a 0,759 (no ano de 2007) e 0,624 (em 2009), em
função da redução no fluxo gênico, valores semelhantes aos obtidos no presente trabalho.
Por outro lado, a presença de sistemas de autoincompatibilidade em espécies que
realizam autofecundação é importante para evitar a depressão endogâmica e permitir o
potencial evolutivo. Quesada et al. (2013) observaram durante um período de 4 anos, em
Ceiba aesculifolia (Malvaceae), taxas de cruzamento próximas a 1,0 em ambientes
perturbados e não perturbados, devido à presença, na espécie, de um rigoroso mecanismo de
autoincompatibilidade. Já Moraes e Monteiro (2002) estimaram as taxas de cruzamento
aparente de Cryptocarya moschata em diferentes classes de idade (progênies, juvenis e
adultos) e obtiveram os valores de 0,51, 1,0 e 0,96, respectivamente, cuja diferença foi
atribuída (i) às diferenças encontradas em diferentes anos, sendo, então, uma mera
coincidência a menor taxa de cruzamento em progênies ou (ii) à uma vantagem diferencial de
indivíduos oriundos de sementes de exocruzamento em relação àquelas autofecundadas,
comprovando a existência de seleção contra os indivíduos oriundos de sementes endogâmicas
devido à depressão endogâmica.
O fluxo de genes entre fragmentos é realizado mediante o modelo espacial, somente
entre fragmentos vizinhos, com uma taxa média de 2%, porém, esse valor somente considera
os migrantes (sementes ou pólen) bem sucedidos. Nesse contexto, todo o pólen que migra de
um fragmento para outro deverá ser viável, pousar sobre o estigma de alguma flor, o qual
estará igualmente receptivo, vencer as barreiras de incompatibilidade e formar o tubo
70
polínico, para, na sequência, produzir uma semente viável que irá, posteriormente, em
condições ambientais favoráveis, germinar, emergir, crescer e se desenvolver; na maturidade,
contribuirá com seus genes para as gerações futuras. No caso de fluxo via semente, sua
viabilidade seria, também, condição primordial, além da sua obrigatoriedade em pousar em
um solo com condições adequadas para sua germinação, crescimento, desenvolvimento,
maturação e reprodução. Assim, a taxa de migração superestima a quantidade real de
movimento de pólen e semente, ao considerar que todos migrantes apresentam sucesso
reprodutivo.
Aliado à perda de alelos de autoincompatibilidade pela deriva genética, o baixo fluxo
terá resultado no aumento da taxa de endogamia, ratificando a classificação da espécie em
estudo, quanto ao modo de reprodução como mista, com predomínio de cruzamentos com
taxa de cruzamento situada entre 0,05 e 0,95. Além disso, o fluxo gênico é definido por um
modelo espacial de isolamento por distância, ocorrendo localmente entre populações vizinhas,
em uma distância média de dispersão de cerca de 10.000 m, justificando o aumento de
cruzamentos endogâmicos e biparentais pela limitação do movimento de agentes
polinizadores e dispersores de sementes. A distribuição geográfica dos fragmentos (Figura
4B) e as distâncias entre si sugerem que a troca de genes ocorre entre os fragmentos Canas e
Camboazinho (que distam 8.513 metros) e entre Inhatinhum, Cacequi e BR290 (Inhatinhum e
BR290 distam 2.200 m, Inhatinhum e Cacequi distam 16.084 m e, Cacequi e BR290 distam
18.063 m), limitando a maior parte dos cruzamentos ao interior de cada fragmento em função
do isolamento pela distância. Os demais pares de fragmentos estão separados por distancias
entre 36.224 m (Canas e BR290) e 56.167 (Camboazinho e Cacequi) (Nagel et al., 2015).
Essa análise está em concordância com o dendrograma obtido por Nagel et al. (2015) usando
dados microssatélites, o qual separou os fragmentos em dois grupos, o primeiro formado
pelos fragmentos Canas e Camboazinho e o segundo pelos fragmentos Inhatinhum, Cacequi e
BR290 .
No que se refere ao fenômeno de mutação, por se tratar de dados microssatélites, o
modelo de mutação de único passo SSM (perda ou ganho de uma única repetição por vez)
limitado a 45 estados alélicos é adequado, com ocorrência de eventos KAM na proporção de
0,1. Em outras palavras, 90% das mutações resultam em um estado alélico cujo tamanho
depende do anterior, sendo que, em 10% dos casos, resulta em um alelo de qualquer um dos
estados alélicos possíveis com igual probabilidade. O modelo de variabilidade máxima inicial
explica a redução da variabilidade genética ao longo das 400 gerações em função da
71
endogamia e da deriva genética ocasionados pela fragmentação. Apesar das mutações agirem
no sentido de aumentar a variabilidade, sua taxa muito baixa não foi suficiente para se
contrapor aos efeitos do isolamento e do consequente baixo fluxo de genes entre fragmentos.
5.3 Estrutura genética dos fragmentos
Com base nos parâmetros da estrutura genética (Tabela 5), os valores da riqueza
alélica e da variabilidade genética aumentam de acordo com o tamanho do fragmento, porém,
sem grande diferença entre si, o que é ratificado pelos respectivos valores da riqueza alélica. .
O fragmento Inhatinhum (com o maior tamanho) teve maior número de alelos e maior
heterozigosidade, ao passo que Cacequi (com o menor tamanho) teve a menor
heterozigosidade. Stefenon e Costa (2012) realizaram simulações para analisar o efeito da
fragmentação na riqueza alélica e no coeficiente de endogamia ao longo do tempo. Dessas
simulações resultou que, com o passar de gerações, as populações de menor tamanho tiveram
níveis maiores de redução na riqueza alélica e de aumento no coeficiente de endogamia,
comparado às populações mais numerosas. Essa constatação reforça a importância do
tamanho de uma população na preservação da variabilidade genética com vistas a minimizar o
seu risco de extinção.
Na Figura 7 está representado o comportamento do número de alelos no decorrer das
gerações, em que se observa uma acentuada taxa de perda de alelos nas primeiras gerações,
com uma tendência à estabilidade a partir da geração de número 100 (quando o número de
alelos cai para cerca de 18), terminando com cerca de oito alelos ao final de 400 gerações.
Devido à acentuada perda de alelos nas primeiras 100 gerações, foram observados também
níveis maiores de redução da heterozigosidade (observada e esperada), sendo que, a partir
desse momento, sua redução foi praticamente constante até a 400ª geração, atingindo os níveis
de 0,52 e 0,64, respectivamente (Tabela 8).
A reduzida diferenciação genética entre os fragmentos, avaliada pelos índices de
diferenciação genética (GST, FST e θ), indica que há similaridade em suas frequências alélicas.
Isso sugere que, apesar do isolamento reprodutivo, existe semelhança nos modelos evolutivos
dos fragmentos, nomeadamente, intensidade e direção da deriva genética, da seleção natural, e
72
taxas e modelos de mutação.
Tabela 5 – Número de indivíduos no fragmento (N), número de alelos (Na), riqueza alélica
(Ar), heterozigosidade esperada (HS), coeficiente de endogamia dentro do fragmento (FIS) e
taxa de cruzamento aparente ( ) de fragmento de Luehea divaricata Mart & Zucc., obtidos a
partir de dados de marcadores microssatélites e análises no programa FSTAT.
Camboazinho Canas Inhatinhum Cacequi BR290 Total
N 100 100 300 100 50 650
Na 5 5 6 5 5 5
Ar 5,27 5,31 5,52 5,24 5,18 6,24
HS 0,637 0,635 0,641 0,637 0,631 0,636
FIS 0,183 0,168 0,180 0,175 0,173 0,176
0,691 0,712 0,694 0,702 0,705 0,701
Fonte: o autor
Figura 7 – Evolução do número de alelos com o passar das 400 gerações de cinco fragmentos
de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do
Sul. Santa Maria, RS, 2015.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Nú
mer
o d
e al
elo
s
Número de gerações
73
Figura 8 – Comportamento da heterozigosidade observada (Ho) e esperada (Hs) ao longo das
gerações de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no
bioma Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015.
Com base nos índices de diversidade genética de Nei (Tabela 6), 94% da variabilidade
genética está distribuída dentro dos fragmentos, sendo que apenas 6% se encontra distribuída
entre eles. A grande variabilidade observada dentro dos fragmentos resulta da elevada taxa de
cruzamento, o ratifica os anteriores em relação ao modo de reprodução misto com predomínio
de cruzamentos. Resultado semelhante foi obtido por Conson (2012) na análise de nove
populações dessa mesma espécie efetuada, na Mata Atlântica com locos microssatélites, que
observou que 93,16% da variação está distribuída dentro de populações e, apenas 6,84%,
entre populações.
Tabela 6 – Índices de diversidade genética de Nei entre e dentro de cinco fragmentos de
Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul.
Fonte de Variação Diversidade absoluta Diversidade relativa
Entre populações (DST) 0,042 0,06
Dentro de populações (HS) 0,636 0,94
Total (HT) 0,678
Fonte: o autor.
0,4
0,46
0,52
0,58
0,64
0,7
0,76
0,82
0,88
0,94
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Het
ero
zigo
zid
ade
Número de gerações
Ho
Hs
74
As estatísticas de diferenciação entre fragmentos sob diferentes abordagens, a saber:
GST, θ, FST e RST, foram similares (Tabela 7), tendo-se verificado a mesma situação dentro das
populações (GIS, f e FIS). Isso sugere que os fragmentos estão evoluindo na mesma direção,
uma vez que a diferença entre as estimativas FST e RST deve-se ao processo de evolução
dessas populações, ou seja, o quanto elas estão divergindo no tempo, devido aos seus modelos
evolutivos (VALLE et al., 2011). Considerando-se que os locos microssatélites evoluem de
acordo com o modelo de mutação passo a passo, RST é a estimativa mais indicada para a
estimação da diferenciação genética entre populações. Segundo Slatkin (1995), é esperado
que a estimativa de RST seja mais similar ao valor de θ, por ambas serem baseadas em
componentes de variância interpopulacional. De fato, na presente simulação foram obtidos
valores de RST igual a 0,076 e de θ igual a 0,075. Esses valores revelam uma diferenciação
moderada entre as subpopulações (HARTL; CLARK, 2010). Comparando-se com os valores
obtidos por Nagel et al. (2015), apenas a endogamia dentro das subpopulações (FIS) se
equipara, pois essa estatística é dependente das heterozigosidades observada e esperada,
parâmetros usados nas simulações.
Seja qual for a abordagem usada, observa-se a ocorrência de algum nível de
endogamia, em função do sistema reprodutivo e da fragmentação da população. Usando
marcadores microssatélites para a caracterização genética de três populações naturais de
Theobroma grandium (Malvaceae) na floresta Amazônica, Alves (2002) obteve um índice de
fixação (f) igual a 0,161, um coeficiente de endogamia total (F) de 0,418 e uma divergência
genética (θ) de 0,303, indicando que a deriva genética decorrente da subdivisão foi a maior
responsável pela endogamia observada nesse caso. Já na caracterização genética de 24 acessos
da mesma espécie (Theobroma grandium) oriundos da Embrapa - CPAFRO (município de
Porto Velho – RO), Embrapa - CPAA (município de Manaus – AM) e Embrapa - CPATU
(município de Belém – PA), mediante marcadores microssatélites, por Alves et al. (2013), não
foi observada endogamia na população (f = 0,003), o valor médio de coancestria foi baixo (θ
= 0,0199) e o número de alelos foi de 45. Segundo Slatkin (1995), valores de FIS podem ser
superestimados devido às altas taxas de mutação dos locos microssatélites, existindo, assim,
maior probabilidade de os alelos serem idênticos por estado (mutações que resultam em um
tamanho igual de unidades de repetição) do que por descendência. Além disso, o tamanho
amostral desempenha papel importante na precisão da estimativa da endogamia devido a erros
de amostragem, haja vista que, com amostras pequenas, é menos provável de capturar todos
os genótipos possíveis de cada loco, resultando em superestimativa da endogamia.
75
Tabela 7 – Estatísticas de estrutura genética sob diversas abordagens, geradas pelo programa
FSTAT para cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no
bioma Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015.
Estatísticas de Nei
HO 0,524
HS 0,636
HT 0,678
DST 0,042
GST 0,061
GIS 0,176
Estatísticas de Cockerham
F 0,238
θ 0,075
f 0,176
Estatísticas F de Wright
FIT 0,226
FST 0,061
FIS 0,176
Estatística de diferenciação genética
adaptada para microssatélites RST 0,076
Fluxo gênico Nm 3,04
HO: heterozigosidade observada dentro de fragmentos; HS: heterozigosidade esperada dentro de fragmentos; HT:
heterozigosidade total; DST: diversidade genética entre fragmentos; GST: coeficiente de divergência genética
entre populações (diversidade relativa); GIS: diversidade relativa dentro de fragmentos; F: coeficiente de
coancestria total, θ: coeficiente de correlação de gametas entre fragmentos; f: coeficiente de coancestria dentro
dos fragmentos; FIT: coeficiente de endogamia total; FST: coeficiente de endogamia entre fragmentos; FIS:
coeficiente de endogamia dentro dos fragmentos. Fonte: o autor.
Em relação ao fluxo gênico estimado a partir do número médio de migrantes, esse
parâmetro foi estimado em 3,8, e, portanto, restrito a subpopulações vizinhas. Com base na
escala definida por Govindaraju (1989), que distingue três níveis de fluxo gênico, a saber: alto
(Nm > 1), intermediário (0,25 < Nm < 0,99) e baixo (Nm < 0,25), o fluxo gênico observado
no presente estudo é como alto e, teoricamente, seria suficiente para contrapor os efeitos da
endogamia, resultando em menor diferenciação entre aos fragmentos. Porém, a expressão
usada para estimar o número de migrantes por geração foi desenvolvida para um modelo de
ilhas idealizado por Wright, diferente do modelo de isolamento por distância do caso em
estudo. Por essa razão, esse valor é superestimado, pois a taxa de fluxo gênico obtida pelas
76
simulações é muito pequena (2%) e alguns fragmentos não trocam genes com os outros em
função do isolamento por distância.
A diferenciação par a par indica uma maior diferenciação entre os fragmentos Cacequi
e BR290 (resultado do menor fluxo de genes entre eles) (Tabela 8). Por outro lado, e em
resultado do maior fluxo entre si, os fragmentos Canas e Inhatinhum possuem a menor
diferenciação genética. Ainda que as diferenças não sejam significativas, esses dados
contrastam com a primeira lei da geografia (TOBBER, 1970), segundo a qual se espera menor
diferenciação entre os pares de fragmentos Canas e Camboazinho, e Inhatinhum e BR290, por
serem geograficamente mais próximos entre si, e maior diferenciação entre aqueles mais
distantes, como Cacequi e Camboazinho e entre Cacequi e Canas. Porém, aspectos como
autoincompatibilidade, ausência de fluxo gênico ou o insucesso reprodutivo de migrantes
contribuem negativamente para o cumprimento dessa lei, de tal maneira que proximidade
geográfica entre fragmentos não significa, obrigatoriamente, proximidade genética entre eles.
Outra possível razão para esse fato pode ser a ausência de diferença significativa entre as
coordenadas inseridas nas simulações, em uma escala que não teria permitido gerar diferenças
genéticas significativas entre as populações. Adicionalmente, foram, também, simuladas
apenas duas dimensões, ignorando-se o efeito da altitude e resultando em distâncias
subestimadas entre fragmentos. No trabalho de Conson (2012), citado anteriormente, também
não foi observada correlação significativa entre os dados de FST par a par e as distâncias
geográficas.
Tabela 8 – Estimativas de FST (diagonal superior) e fluxo gênico (diagonal inferior) par a par
de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma
Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015.
Camboazinho Canas Inhatinhum Cacequi BR290
Camboazinho – 0,078 0,065 0,077 0,081
Canas 2,974 – 0,061 0,076 0,078
Inhatinhum 3,610 3,853 – 0,064 0,058
Cacequi 2,976 3,041 3,666 – 0,082
BR290 2,826 2,950 4,055 2,793 –
Fonte: o autor
77
Os valores referentes ao número de migrantes por geração entre pares de fragmentos
são superestimados, uma vez que existem pares que não trocam genes entre si, em função das
distâncias entre eles. Além disso, conforme citado anteriormente, a estatística FST não é
adequada para análise genética de locos microssatélites devido ao fato de evoluírem de acordo
com o modelo de mutação passo a passo, sendo a estatística RST a mais indicada. Portanto,
devido à limitação do programa usado para a análise dos dados (programa FSTAT), que não
determina os valores de RST par a par, as taxas de fluxo entre os pares de fragmentos foram
estimadas mediante valores FST par a par. Ademais, a estimativa indireta do fluxo gênico com
base na estatística de diferenciação genética (FST ou RST) pressupõe estrutura genética sob o
modelo de Wright (o qual assume uniformidade e constância, no tempo e no espaço, do
tamanho populacional e da taxa de migração), não condizente com o modelo de migração
observado nesse trabalho, com fragmentos isolados por distância. Apesar do modelo de ilhas
ser o mais convencional, ele não reflete, segundo Sork et al. (1999), o movimento
contemporâneo dos genes ou as alterações no processo de dispersão entre populações (sendo
por isso o fluxo denominado histórico ou aparente), mas fornece informações valiosas sobre
efeitos cumulativos de fluxo gênico na estrutura genética de populações.
Dada a importância do fluxo gênico na prevenção da perda de variabilidade genética,
foram plotadas, para ilustração, as heterozigosidades em função do número de gerações,
considerando-se taxa de migração baixa (1%) e alta (90%) (Figuras 9 e 10 respectivamente).
Observa-se que, se a taxa de migração fosse igual a 1%, os valores da heterozigosidade atual
teriam sido atingidos mais cedo, na geração 360, ao passo que sob uma taxa de migração de
90%, até a geração 400 essa heterozigosidade ainda não teria sido alcançada e a variabilidade
genética teria sido maior. Esses dados ratificam, mais uma, vez o papel do fluxo gênico no
controle da perda de variabilidade genética em populações, contribuindo para sua viabilidade.
78
Figura 9 – Heterozigosidade observada e esperada considerando a taxa de migração de 1% de
cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa,
Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015.
Figura 10 – Heterozigosidade observada e esperada considerando a taxa de migração de 90%
de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma
Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015.
O estreitamento da área entre as curvas da heterozigosidade observada e esperada com
o passar das gerações, observado na Figura 10, motivou a plotagem das diferenças entre esses
parâmetros (HS–HO) e os coeficientes de endogamia para as taxas de migração de 2% e 90%,
0,4
0,46
0,52
0,58
0,64
0,7
0,76
0,82
0,88
0,94
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Het
ero
zigo
sid
ade
Número de gerações
Ho Hs
0,4
0,46
0,52
0,58
0,64
0,7
0,76
0,82
0,88
0,94
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Het
ero
zigo
sid
ade
Número de gerações
Ho Hs
79
com a finalidade de ilustrar o impacto do fluxo gênico sobre a endogamia (Figura 11). O
resultado foi uma estabilização do índice de fixação para ambas as taxas de migração, apesar
de uma ligeira tendência ascendente na taxa de migração de 2%, sobretudo nas gerações
iniciais. Com o passar das gerações, as heterozigosidades observadas tendem a se aproximar
das esperadas para o Equilíbrio, apesar de ser um processo demasiadamente demorado. No
entanto, com a taxa de migração de 2% existe a tendência de se atingir primeiro o equilíbrio
de Hardy-Weinberg (isto é, HS–HO = 0) em relação à taxa de 90%, sob os mesmos valores
iniciais de heterozigosidade. Isso acontece porque na taxa de migração de 2%, a perda da
heterozigosidade é mais rápida e a heterozigosidade esperada reduz com maior velocidade
que a observada, atingindo mais cedo o equilíbrio apesar do baixo fluxo gênico.
Figura 11 – Diferenças entre as heterozigosidades (Hs-Ho) e índices de fixação em função do
número de gerações de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em
desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015.
Ainda para efeitos de ilustração foram plotadas as estatísticas F considerando-se as
mesmas taxas de migração (Figuras 12 e 13), de modo a ilustrar a contribuição dos efeitos do
isolamento dos fragmentos e do sistema reprodutivo na endogamia total ou desvio de
panmixia da população total (FIT). Em função da ausência de diferenciação entre os
fragmentos, as curvas de FIS e FIT se sobrepõem na taxa de migração de 0,9. Assim, a
endogamia devido à subdivisão é insignificante, sendo o sistema reprodutivo praticamente o
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Fis (2%) Hs-Ho (2%) Fis (90%) Hs-Ho (90%)
80
único responsável por toda endogamia observada na população. Pelo contrário, a migração na
taxa de 0,02 concede espaço para a ocorrência de endogamia em função do isolamento, para
além do efeito do sistema reprodutivo.
Figura 12 – Plotagem das estatísticas F de Wright para uma taxa de migração de 0,02 de cinco
fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio
Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015.
Figura 13 – Plotagem das estatísticas F de Wright para uma taxa de migração de 0,9 de cinco
fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio
Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015.
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
0,24
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Número de gerações
Fis (2%) Fst Fit
-0,02
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Número de gerações
Fis (90%) Fst Fit
81
Com a finalidade de validar as estimativas geradas dos parâmetros, são apresentados,
na Tabela 9, os resultados de mil reamostragens e erro padrão, para as estatísticas de
correlação entre gametas que se unem, segundo Cockerham. O erro padrão foi obtido com
base na técnica de Jacknifing, ao passo que os limites de confiança foram obtidos com base na
técnica de Bootstraping. Devido ao baixo erro padrão, as estatísticas obtidas podem ser
consideradas confiáveis.
Tabela 9 – Validação das estatísticas de Cockerham com base em reamostragens e erro padrão
de cinco fragmentos de Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma
Pampa, Rio Grande do Sul. Santa Maria, RS, 2015.
F θ F
Valor da estatística 0,238 0,075 0,176
Erro padrão 0,015 0,010 0,014
Limite inferior (95%) 0,210 0,058 0,151
Limite superior (95%) 0,267 0,095 0,201
Limite inferior (99%) 0,201 0,053 0,143
Limite superior (99%) 0,275 0,101 0,209
F: coeficiente de coancestria total, θ: coeficiente de correlação de gametas entre fragmentos; f: coeficiente de
coancestria dentro dos fragmentos
5.4 Parâmetros para a Conservação Genética
Com vistas à conservação dos recursos genéticos, o Tamanho Mínimo Efetivo e a
Área Mínima Viável (Tabela 10) revestem-se de grande importância na medida em que
minimizam os efeitos dos fatores que conduzem à extinção de alelos e, consequentemente, à
extinção de espécies.
82
Tabela 10 – Parâmetros para conservação genética da população de cinco fragmentos de
Luehea divaricata Mart. & Zucc. em desenvolvimento no bioma Pampa, Rio Grande do Sul.
Santa Maria, RS, 2015.
Camboazinho Arroio Canas Fazenda Inhatinhum Rio Cacequi BR290
N 100 100 300 100 50
Fis 0,183 0,168 0,18 0,175 0,173
Ne 84,53 85,62 254,24 85,11 42,63
Ne/n 0,85 0,86 0,85 0,85 0,85
D 26,32 26,32 26,32 26,32 26,32
A 3,8 3,8 11,4 3,8 1,9
PMV(100) 118 117 118 117 117
D(100) -18 -17 182 -17 -67
PMV(1000) 1183 1168 1180 1175 1173
D(1000) -1083 -1068 -880 -1075 -1123
AMV(100) 4,5 4,4 4,5 4,5 4,5
AMV(1000) 45 44,4 44,8 44,6 44,6
n: tamanho do fragmento; Ne: Tamanho Efetivo Populacional; Fis: coeficiente de endogamia dentro dos
fragmentos; d: densidade populacional (indivíduos ha-1
); A: área do fragmento em hectares; PMV(100) e
PMV(1000): População Mínima Viável para conservação em curto e longo prazo, respectivamente; AMV(100)
e AMV(1000): Área Mínima Viável para conservação em curto e longo prazo, respectivamente; D(100) e
D(1000): diferença entre o tamanho e a PMV do fragmento em curto e longo prazo, respectivamente.
O Tamanho Efetivo para todas as populações é inferior ao número de indivíduos
amostrados, devido à ocorrência de endogamia dentro delas (valores de FIS superiores a zero).
O fragmento Inhatinhum, o qual possui maior tamanho e menor coeficiente de endogamia,
possui o maior Tamanho Efetivo. Os valores da Tabela 10 sugerem que uma amostra de 85
indivíduos selecionados de maneira aleatória representará a variabilidade genética existente
na população Camboazinho com 100 indivíduos. Já a população Canas, com o mesmo
número de indivíduos, porém com uma taxa de fixação ligeiramente inferior, é representada
geneticamente por 86 indivíduos. A diferença deve-se ao fato da endogamia reduzir a
variabilidade genética da população, estando concentrada em um tamanho populacional
inferior ao tamanho total. Em um extremo, se o índice de fixação ou coeficiente de endogamia
for igual a zero, a variabilidade genética total estará distribuída em todos os indivíduos da
população. No já citado trabalho de Alves (2002), ao estudar uma amostra média de 30,6
acessos coletados em sete populações, entre naturais, estabelecidas em Banco Ativo de
Germoplasma e um plantio comercial, foi observado um tamanho efetivo de 27, devido ao
83
efeito da endogamia (existe menor representatividade quando há excesso de homozigotos).
Por seu turno, amostrando 20 indivíduos de duas populações da espécie arbórea florestal
Calophyllum brasiliense, Botrel et al. (2006) obtiveram, usando a mesma expressão
empregada no presente trabalho, os tamanhos efetivos de endogamia de 18,24 e 19,59,
respectivamente, para fins de conservação.
A razão Ne/n é um importante parâmetro nas atividades de preservação do
germoplasma, coleção de sementes e conservação genética in situ (VIEIRA; CARVALHO,
2008). Uma vez que o índice de fixação teve valores semelhantes nos cinco fragmentos, a
razão Ne/n resultou, igualmente, em valores semelhantes, fazendo com que nenhuma
subpopulação tenha prioridade para conservação sobre as demais (fragmentos com menor
razão Ne/n são prioritários para conservação) ou estratégia diferente de coleta de sementes
(maior quantidade de amostragem é necessária em fragmentos com menor razão Ne/n para
garantir a manutenção da variabilidade genética e mínima endogamia nas sementes). De
qualquer maneira, devido aos elevados coeficientes de endogamia que resultaram em uma
baixa razão Ne/n, são necessárias estratégias para a conservação e a coleta de sementes, as
quais devem ser realizadas de maneira aleatória (não de sementes mas de árvores matrizes).
A População Mínima Viável, calculada para prevenir a depressão endogâmica (curto
prazo) e para manter o potencial evolutivo (longo prazo), foi determinada para os tamanhos
efetivos de referência de 100 e 1000, respectivamente, conforme recomendado por Nunney e
Campbell (1993). De acordo com Lynch (1998), a variância genética média (decorrente da
deriva genética) torna-se independente do tamanho populacional quando o tamanho efetivo
excede 1000 indivíduos, sendo esse o limite adequado para a conservação em longo prazo. No
presente trabalho, foi assumida a mesma densidade (d) em todas subpopulações, com base no
valor obtido no levantamento realizado por Figueiredo (2014), no município de São Martinho
da Serra, e os resultados mostraram que somente o fragmento da Fazenda Inhatinhum
apresentou possibilidades de manutenção da diversidade de equilíbrio genético em curto prazo
pois obteve um valor positivo do parâmetro D, a diferença entre o tamanho da população
estimada e a PMV. Porém, em longo prazo nenhum dos fragmentos se mostrou viável para
preservar seu potencial evolutivo (todos os valores de D são negativos), aumentando, assim, a
probabilidade de oscilações genéticas aleatórias que poderão levar ao seu declínio,
constituindo-se em mais um motivo da necessidade de intervenção. Estratégias que reduzam a
endogamia e a perda de alelos por deriva são necessárias, sendo uma das alternativas a criação
de corredores ecológicos para manter um fluxo gênico entre as subpopulações. Em um estudo
84
sobre a estrutura genética de cinco fragmentos de Protium spruceanum em Lavras-MG, Vieira
e Carvalho (2008) observaram valores de D entre –15 e 1252 para a conservação em curto
prazo (tamanho efetivo de referência de 150) e entre –1027 e 237 para conservação em longo
prazo (tamanho efetivo de referência de 1500).
A conversão da População Mínima Viável em termos territoriais (Área Mínima
Viável) em termos de área indica a necessidade, para cada fragmento, de um mínimo de 4,5 e
45 ha para a conservação em curto e longo prazo respectivamente. Condizente com o
parágrafo anterior, somente a Fazenda Inhatinhum possui uma área (11 ha) capaz de prevenir
a depressão endogâmica (curto prazo). Isso significa que, caso se mantenha assim e sem
fluxo, chegaria ao declínio. Conectando-se os fragmentos Canas e Camboazinho, que juntas
somam 7,6 ha, ter-se-ia um tamanho suficiente para sua viabilidade em curto prazo. Para as
restantes três subpopulações, dada a sua localização geográfica, seria necessário conectá-las
todas elas, permitindo um fluxo gênico intenso, de modo a que se comportem como única
população panmítica. Já para a manutenção do seu potencial evolutivo (em longo prazo), nem
a conexão das três subpopulações (somando 24,7 ha) atingiria a Área Mínima Viável (45 ha).
Porém, uma vez que a endogamia foi o efeito determinante na redução do tamanho efetivo,
com o consequente aumento da População Mínima Viável, a conexão dos cinco fragmentos
através de fluxo gênico, diminuiria a perda de alelos pela deriva e reduziria a endogamia,
resultando em uma população (e área) mínima viável ainda menor, tornando-a mais próxima
ou até inferior à área atual de 24,7 ha. À título de ilustração, se o coeficiente de endogamia no
primeiro fragmento (Camboazinho) fosse igual a zero, seu tamanho efetivo teria sido igual ao
tamanho populacional e a área mínima viável seria igual a 3,8 e 38 ha, para conservação em
curto e longo prazo, respectivamente.
Um exemplo da importância do fluxo na minimização dos efeitos da endogamia e
deriva foi observado por Vinson et al. (2015), quando estabeleceram duas parcelas de
amostragem intensiva para as espécies arbóreas Dipteryx odorata e Jacaranda copaia na
Floresta Nacional de Tapajós - Pará , tendo removido uma proporção de árvores dentro delas,
simulando um corte seletivo. Os autores observaram uma perda de alelos nas árvores adultas,
porém, um ganho de alelos em suas progênies devido à entrada de alelos vindos da
circunvizinhança mediante o fluxo gênico. Por seu turno, estudando três fragmentos de
Hymenaea courbaril L. na Amazônia Sul-Ocidental, Silva et al. (2014) obtiveram uma Área
Mínima Viável para conservação em longo prazo entre 3.565 e 25.963 ha (tamanho efetivo de
referência de 1000), sendo a diferença de valores atribuída ao coeficiente de endogamia nos
85
fragmentos. Os autores estimaram também a Área Mínima Viável usando o tamanho efetivo
de referência de 500, valor indicado por alguns autores para conservação em longo prazo,
resultando em valores entre 1.782 e 12.976 ha.
Traill et al. (2007) realizaram uma meta-análise, sumarizando os resultados da População
Mínima Viável registrados ao longo de 30 anos na literatura e observaram em plantas
(incluindo briófitas, pteridófitas, gimnospermas, monocotiledôneas e dicotiledôneas) um valor
médio de 4.824 indivíduos, com um intervalo de confiança 2.512 – 15.992. Trata-se de uma
base de dados de PMVs, levando em conta as diferenças na história de vida das espécies,
porém, serve como guia preliminar em programas de conservação.
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nesse trabalho foram utilizados aplicativos computacionais, comprovadamente
importantes na simulação de parâmetros genéticos populacionais, sendo uma ferramenta útil
para antecipar fenômenos futuros, e assim, permitir intervenções conducentes a conservação
da biodiversidade.
As simulações se basearam em dois parâmetros apenas, a saber, a heterozigosidade
observada e heterozigosidade esperada, independentemente da heterozigosidade total, número
de alelos, endogamia total (FIT) e o endogamia entre fragmentos de fixação (FST), tendo-se
registrado diferenças entre as estatísticas geradas no FSTAT e aquelas obtidas com o uso
marcadores microssatélites. Outro aspecto a realçar se relaciona com as distâncias e escalas
utilizadas na simulação, tendo-se limitado a apenas duas dimensões escaladas em uma
unidade, quer dizer, não foi incluída a terceira dimensão (altitude), que, apesar de se tratar de
um bioma plano, pode fornecer alguma influência nos resultados. Em função disso, serão
realizadas, na sequência, novas de simulações com vista a se encontrar um modelo que
satisfaça, simultaneamente, todos os parâmetros, de forma a obter estatísticas mais acuradas
para caracterizar os fragmentos.
Nas condições dessa simulação, foram observados elevados índices de endogamia
como resultado do isolamento reprodutivo dos fragmentos. O tamanho dos isolados não é
suficiente para preservar seu potencial evolutivo em longo prazo, a menos que sejam
conectados via fluxo gênico. Em curto prazo, somente o fragmento Inhatinhum possui um
tamanho suficiente para superar os efeitos da depressão endogâmica. Desse modo, propõe-se,
a construção de um corredor ecológico ligando os fragmentos Canas e BR290 e outro ligando
Inhatinhum e Cacequi, de forma que o fluxo dos genes passe sendo regido sob o modelo
stepping stone, cada um trocando genes com fragmentos adjacentes. Essa ação irá permitir o
fluxo gênico entre os fragmentos, minimizando os efeitos da deriva genética e da endogamia.
Além disso, o fluxo gênico permitirá a distribuição dos alelos, incluindo aqueles gerados por
mutações, e permitir recombinações com características presentes em fragmentos distantes,
aumentando assim a variabilidade genética e a capacidade adaptativa da população inteira em
função das alterações ambientais.
87
Outro aspecto a considerar está ligado ao valor da taxa de migração obtida de 0,02, a
qual representa o valor médio, que inclui valores iguais a zero entre fragmentos que não
trocam genes entre si. Isso significa que as taxas de migração entre os fragmentos que trocam
genes são variadas, incluindo valores superiores a 0,02, ratificando a importância de
simulações a serem realizadas na sequência com a inclusão de todos os pares de fragmentos
para estimar as respectivas taxas de fluxo gênico.
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Plantas) - Curso de Pós-graduação em Agronomia, ESALQ, Universidade de São Paulo.
APÊNDICES
Apêndice 1– Entrada de dados no software EASYPOP para as simulações
--------------------------------------------------------------------------------
EASYPOP (v. 2.0.1)
Author: F. Balloux
Available at: http://www.unil.ch/izea/softwares/easypop.html
--------------------------------------------------------------------------------
Ploidy level ? (0=haplo-diploid; 1=haploid; 2=diploid)
2
Two sexes?:y/n
n
Random mating?:y/n
n
Proportion of clonal reproduction (between 0 and 1)
0
Proportion of selfing (between 0 and 1)
of the individuals not born as clones
0.1
Number of populations ?
5
Same number of individuals in each populations ?:y/n
n
enter number of individuals of population 1
100
enter number of individuals of population 2
100
enter number of individuals of population 3
300
enter number of individuals of population 4
100
enter number of individuals of population 5
50
Same migration scheme over all simulation? (y/n)
y
migration model?
1 = 1-dimension stepping stone;
2 = 2-dimension stepping stone (only with a square
number of populations, e.g. 9, 16,..144..);
3 = island model;
4 = hierarchical stepping stone ('contact zone');
5 = hierarchical island ;
6 = spatial models;
6
proportion of migration?(between 0 and 1)
0.1
97
How many dimensions define the space (at least one)
2
enter mean dispersal distance
10000
Number of loci ?
10
Free recombination between loci?:y/n
y
Do all loci have the same mutation scheme?:y/n
y
Mutation rate ?(between 0 and 1, e.g. 0.0001)
0.0004
Mutation model
1= Kam,(same probability to mutate to any allelic state)
2= Ssm, (single step mutation model)
3= Mixed model of Ssm with a proportion of Kam mutation events)
4= Mixed model of Ssm with a proportion of double step mutation events)
3
Proportion of Kam mutation events
0.1
Number of possible allelic states ?(below 1000)
10
Variability of the initial population
1= Maximal, (randomly assigned alleles)
2= Minimal, (all individuals start with the same allele)
1
Number of generations ?
400
How many populations in the result files (less than simulated populations)
5
How many individuals in each population (less than simulated individuals)
50
Number of replicates? (between 1 and 999)
100
98
Apêndice 2 – Lista de aplicativos computacionais comumente usados em genética de
populações.
Programa Autor(es) Aplicação Link para baixar
Aladyn Katja
Schiffers
Permite estudar como padrões demográficos,
populações genéticas e condições abióticas
afetam a taxa de adaptação
www.katja-
schiffers.eu/resear
ch.html
Ms HUDSON, R.
R. (2002)
Um programa para simular diversos cenários
demográficos evolutivos neutros.
http://home.uchic
ago.edu/~rhudson
1/source/mksampl
es.html
Artificial
Life
Framework
(ALF)
DALQUEN
et al. (2001)
Visa simular toda a gama de forças evolutivas
que atuam sobre genomas: nucleotídeos, códon,
ou substituição de aminoácidos (sob modelos
simples ou mistos), indels, duplicação de
genes, perda de gene, fusão de genes, fissão
gene, genoma rearranjo, a transferência lateral
de genes, ou especiação.
www.cbrg.ethz.ch
/alf
PopG Joe
Felsenstein
Um programa de simulação genética para um
loco de dois alelos. Simula várias populações e
permite observar o efeito da seleção natural,
mutação, migração e deriva genética.
http://evolution.gs
.washington.edu/p
opgen/
PopGen Jouni Aspi Programa de simulação projetado para
esclarecer vários eventos genéticos
populacionais.
http://cc.oulu.fi/~j
aspi/popgen/popg
en.htm
PopGene
(Population
Genetic)
Francis Yeh,
Rong-Cai
Yang e
Timothy
Boyle
Executa as simulações comumente usados em
genética de populações.
http://www.ualber
ta.ca/~fyeh/popge
ne_info.html
EasyPop Francois
Balloux
(2001)
Permite simular conjuntos de dados genéticos
sob uma gama muito ampla de condições,
incluindo sistemas reprodutivos, modelos de
migração e mutação
http://www.unil.c
h/dee/en/home/m
enuinst/softwares-
-
dataset/softwares/
easypop.html
Fstat Jérôme Goud
et (1995)
Um programa para calcular estatísticas F, Nei e
Weir & Cockerham.
http://www2.unil.
ch/popgen/softwa
res/fstat.htm
Arlequim EXCOFFIER
et al. (2005)
um pacote de software integrado para análise
de dados de genética de populações
http://popgen.unib
e.ch/software/arle
quin35/Arl35Dow
nloads.html
BOTTLEN
ECK
Sylvain Piry,
Jean-Marie
Cornuet and
Gordon
Luikart
Um programa para detecção da redução recente
no tamanho efetivo populacional a partir de
dados de frequências alélicas
http://www1.mont
pellier.inra.fr/CB
GP/software/Bottl
eneck/
99
IBDsim LEBLOIS et
al. (2008)
Simulação de dados genotípicos sob modelos
gerais de isolamento por distância.
http://raphael.lebl
ois.free.fr/
SFS_COD
E
HERNANDE
Z (2008)
Simulações em genética populacional sob um
modelo geral de Wright-Fisher com efeitos
arbitrários de migração, demografia, seleção e
mutação.
http://sfscode.sour
ceforge.net/sfs_co
de/index/index.ht
ml
Vortex LACY e
POLLAK
(2014)
Modelo de simulação para análise de
viabilidade populacional (PVA).
http://www.vortex
9.org/vortex.html