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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC (UFABC)
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS (CCNH)
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOTECNOCIÊNCIA
VIVIAM MOURA DA SILVA
ESTUDOS DA ESTABILIDADE, FLEXIBILIDADE E
ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA β-MANANASE DA
BACTÉRIA HIPERTERMOFÍLICA THERMOTOGA
PETROPHILA
Santo André,
Junho de 2014
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOTECNOCIÊNCIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
VIVIAM MOURA DA SILVA
ESTUDOS DA ESTABILIDADE, FLEXIBILIDADE E
ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA β-MANANASE DA
BACTÉRIA HIPERTERMOFÍLICA THERMOTOGA
PETROPHILA
Trabalho apresentado como requisito parcial para obtenção
do titulo de Mestre em Biotecnociência, sob orientação do
Professor Doutor Wanius José Garcia da Silva.
Santo André,
Junho de 2014
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VIVIAM MOURA DA SILVA
ESTUDOS DA ESTABILIDADE, FLEXIBILIDADE E
ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA β-MANANASE DA
BACTÉRIA HIPERTERMOFÍLICA THERMOTOGA
PETROPHILA
Santo André,
Junho de 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC (UFABC)
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS (CCNH)
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOTECNOCIÊNCIA
ESTUDOS DA ESTABILIDADE, FLEXIBILIDADE E
ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA β-MANANASE DA
BACTÉRIA HIPERTERMOFÍLICA THERMOTOGA
PETROPHILA
Santo André,
Junho de 2014
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ESTUDOS DA ESTABILIDADE, FLEXIBILIDADE E
ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA β-MANANASE DA
BACTÉRIA HIPERTERMOFÍLICA THERMOTOGA
PETROPHILA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós graduação em
Biotecnociência da Universidade Federal do ABC, como
requisito parcial para obtenção do titulo de Mestre Ciências.
Área de concentração:
Biotecnociência
Oritentador:
Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva
Santo André,
Junho de 2014
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SUMÁRIO
RESUMO ...................................................................................................................................... 15
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................ 17
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................................ 18
1. Introdução ............................................................................................................................... 22
1.2 Celulose ............................................................................................................................. 23
1.3 Lignina ............................................................................................................................... 24
1.2 Hemicelulose ..................................................................................................................... 24
2. Hidrólise Enzimática ................................................................................................................ 25
2.1 Polissacarídeos de manana ............................................................................................... 25
2.2 Enzimas hidrolíticas: hemicelulases .................................................................................. 28
2.2.1 Enzimas termoestáveis com potencial biotecnológico .................................................. 28
2.2 A enzima β-Mananase ....................................................................................................... 29
3. Objetivos ................................................................................................................................. 32
4. Materiais e métodos ............................................................................................................... 33
4.1 Materiais ........................................................................................................................... 33
4.2 Métodos ................................................................................................................................ 33
4.2.1 Expressão e purificação da proteína TpMan e TpManGH5............................................ 33
4.2.1.1 Expressão da proteína TpMan e TpManGH5 .............................................................. 33
4.2.1.2 Purificação da proteína TpMan e TpManGH5 ......................................................... 34
4.2.2 Medidas de atividade enzimática................................................................................... 36
4.2.3 Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ............................................................................. 36
4.2.4 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) ......................................................... 37
4.2.5 SAXS - Análise de dados ................................................................................................. 38
4.2.6 Modelos de baixa resolução obtidos dos dados de SAXS .............................................. 38
4.2.7 Modelo de corpo rígido e modelagem por EOM ........................................................... 38
10
4.2.8 Modelagem molecular (por homologia) ........................................................................ 39
4.2.9 Métodos computacionais para predição de estrutura secundária ................................ 39
4.2.10 Espectroscopia por dicroísmo circular (CD) ................................................................. 40
5. Resultados e Discussão ........................................................................................................... 41
5.1.1 Perfil da atividade em função da temperatura .............................................................. 41
5.1.2 Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ............................................................................. 42
5.1.3 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) ......................................................... 45
5.1.4 Gráfico de Kratky e flexibilidade .................................................................................... 49
5.1.5 Modelagem molecular por homologia ........................................................................... 51
5.1.6 Espectroscopia por dicroísmo circular (CD) ................................................................... 54
5.1.7 Métodos computacionais para predição da estrutura secundária ................................ 57
5.1.8 Método de otimização em conjunto (EOM) .................................................................. 57
5.1.9 Modelo de corpo rígido (RBM) ....................................................................................... 60
5.2. Discussão .............................................................................................................................. 62
5.2.1 Dimensão e forma da enzima TpMan da bactéria hipertermoestável Thermotoga
petrophila a 20 ºC .................................................................................................................... 62
5.2.2 Modelo molecular por homologia para o linker ............................................................ 63
5.2.3 Estrutura secundária dos domínios estruturais da enzima TpMan ............................... 64
5.2.4 Gráfico de Kratky sugere que a enzima TpMan apresenta algum nível de flexibilidade a
20 ºC ........................................................................................................................................ 65
5.2.5 Modelo tridimensional para a enzima TpMan intacta a 20 ºC ...................................... 66
5.2.6 SAXS revela que mudanças conformacionais na enzima TpMan é dependente da
temperatura ............................................................................................................................ 67
6. Conclusões ............................................................................................................................... 69
7. Perspectivas futuras ................................................................................................................ 71
8. Referências .............................................................................................................................. 72
ANEXO ......................................................................................................................................... 79
11
Dedicatória
À Deus, minha família, amigos, colegas de trabalho e
orientadoras pelo apoio, força, incentivo, companheirismo e
amizade. Sem eles
nada disso seria possível.
“Se vi mais longe que os outros é porque estava sobre os
ombros de gigantes”
Issac Newton
12
Agradecimentos
“Cada pessoa que passa em nossa vida, passa
sozinha, é porque cada pessoa é única e nenhuma
substitui a outra! Cada pessoa que passa em nossa
vida passa sozinha e não nos deixa só porque deixa
um pouco de si e leva um pouquinho de nós. Essa é
a mais bela responsabilidade da vida e a prova de
que as pessoas não se encontram por acaso.”
Charles Chaplin
13
À agência de fomento FAPESP,
Pelo apoio financeiro do processo nº 2012/03503-0.
Ao Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva, agradeço a orientação nestes dois anos de mestrado que
com certeza nunca falhou em seus conselhos e ensinamentos, que sempre buscou estar presente em
nossos trabalhos para que tudo sempre estivesse sendo realizado com cautela e inteligência, para que
no futuro eu consiga crescer profissionalmente sem nenhuma dificuldade, agradeço todas as dicas
sobre carreira profissional como orientador e colega de trabalho, por sempre estar disponível quando
precisei em momento de dificuldades no trabalho de mestrado, por me mostrar todo o mundo
científico que não havia conhecido antes, por estar sempre preocupado em fazer sempre o melhor,
que, no entanto, graças a você, nosso trabalho hoje já é um sucesso.
A Dra. Francieli Colussi, amiga, mãe, irmã, professora, toda minha gratidão por todo conhecimento e
experiências passados com toda “delicadeza” que só nós duas entendemos e todo carinho e respeito
durante nossos dias de trabalho. Pelo privilégio de tê-la ao meu lado e poder chegar todas segundas
feiras e compartilharmos nosso bom ou mau humor do final de semana, por estar sempre disponível
para sanar minhas dúvidas (que sempre são muitas), por fazer deste sonho um caminho mais florido
do que imaginei, você foi essencial para tudo ter dado tão certo em meu trabalho de mestrado,
obrigada Fran, por fazer parte de minha vida acadêmica e vida pessoal, que levo com certeza essa
amizade para a vida toda, afinal, você é do tipo de pessoa que passa em iluminada nossas vidas com
toda sua alegria e paz de espírito, sendo inevitável esquecer você, serei eternamente grata por tudo
que fez por mim.
A Professora Dra. Marcia Sperança, por todo companheirismo e amizade durante minha pesquisa, que
foi essencial para o ponta pé inicial dos primeiros dias de experimentos em nosso laboratório que
havia acabado de “nascer”, por ser a minha companheira de viagem e uma “roommate” muito especial,
obrigada Marcia por tudo que faz e fez para me ajudar, serei grata sempre a você, você é uma pessoa
muito especial para todos que a conhecem.
Ao Prof. Dr. Fabio Marcio Squina,
Por ceder os plasmídeos para o início de toda minha pesquisa de mestrado.
Ao Laboratório Nacional de Luz Síncontron (LNLS) e ao Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia
do Bioetanol (CTBE) e ao Laboratório de Física da Universidade de São Paulo (IFUSP), pela feliz
vivência, experiência e aprendizado.
14
As minhas amigas de republica, Amália Batista e Thais da Silva, que sem vocês tudo seria muito mais
difícil, morar com vocês foi a melhor experiência que consegui ter, mudar de uma cidade como
Campinas para Santo André, só nós três sabemos que não é fácil, mas com vocês ao meu lado consegui
me sentir em casa como uma família, vocês são muito especial para mim, adorei passar esses dois anos
conhecendo melhor cada uma, os stresses, os “siricuticos”, as manias. Obrigada meninas por me
deixarem fazer parte desse período de minha vida perto de vocês.
Aos meus amigos de pós-graduação, Daniele Ishihara, Samyr Machado e Mabel Uehara por todos os
momentos de desespero em busca dos novos aprendizados na UFABC.
A Juliana Sato, colega e amiga, agradeço a companhia dos longos dias no laboratório tomando zilhares
café para aguentar a jornada que às vezes era longa, mas também por ótimos momento de almoços
juntas, de preferência em um dia de “japonês”. Obrigada Ju por toda ajuda e por me ouvir nos
momentos de stress.
Ao Alex Sandro da Cruz Silva, por toda paciência no mundo comigo nos momentos de stress, nos finais
de semanas estudando e me ajudando a escrever e resolver listas de exercícios, por sempre me
incentivar para continuar em busca de meus sonhos, por sempre colocar para “cima” em momento de
tristeza, por estar ao meu lado em todos os melhores momento de minha vida e se deixar envolver
com todo o meu trabalho, minha rotina de vida sem em momento algum reclamar de qualquer coisa,
obrigada por ser essa pessoa companheira e muito paciente, você fez parte dessa minha caminhada,
você chegou comigo até aqui, você sempre será muito especial para mim.
Aos meus pais, Cleusa Regina B. Moura da Silva e Jaime Moura da Silva Filho, às minhas irmãs, Valéria
Moura da Silva, Valquiria Moura da Silva e Vanessa Moura da Silva, e grande amiga Maria Regina da
Cruz Silva, pela paciência, compreensão, apoio e incentivo na busca de um sonho.
15
RESUMO
A proteína endo-β-1,4-mananase da bactéria Thermotoga petrophila (TpMan) é
uma enzima hipertermoestável que catalisa a hidrólise de ligações β-1,4-manosídicas
em vários polissacarídeos contendo manana. Um recente estudo mostrou que a enzima
TpMan é composta de um domínio catalítico GH5 e um domínio de ligação ao
carboidrato CBM27 conectados através de um linker, entretanto, até o momento, a
estrutura tridimensional cristalográfica não foi determinada para a enzima completa.
Pouco se sabe sobre a conformação da enzima TpMan intacta como também o papel do
comprimento e flexibilidade do linker sobre o arranjo espacial dos domínio
constitutivos. Neste estudo, nós reportamos a primeira caracterização estrutural da
enzima TpMan completa utilizando a técnica de espalhamento de raios-X a baixos
ângulos (SAXS) combinada com a estrutura tridimensional dos domínios individuais
para elucidar o modelo de baixa resolução, as dimensões globais, e a flexibilidade desta
enzima modular em diferentes temperaturas. Nossos resultados são consistentes com um
linker que apresenta uma estrutura compacta e que ocupa um pequeno volume quando
comparado com seu grande número de resíduos de aminoácidos (102 resíduos de
aminoácidos). Além disso, a 20 ºC os resultados são consistentes com um modelo onde
a enzima TpMan é um monômero composto de três domínios e que apresenta nível de
flexibilidade molecular em solução. Mesmo a enzima intacta apresentando algum grau
de flexibilidade, existe uma conformação preferível, a qual pode ser descrita pelo
procedimento de modelagem de corpo rígido. Finalmente, os resultados indicam que a
enzima TpMan sofre uma transição dependente da temperatura entre estados
conformacionais de sua estrutura secundária regular. Nossos resultados sugerem que o
linker pode otimizar a geometria entre os outros dois domínios com respeito ao
substrato a altas temperaturas. Os estudos apresentados aqui devem proporcionar uma
base útil para futuros estudos biofísicos da enzima TpMan intacta.
Palavras chaves: β-mananase, manana, Thermotoga petrophila, hipertermoestável,
espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS).
16
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABF – Tampão acetato, borato e fosfato
CbhA - celobiohidrolase A de Clostridium thermocellum
CD – Dicroísmo circular
cDNA - DNA complementar
DAM – Modelo atômico dummy
DLS – Espalhamento dinâmico de luz
Dmax – Dimensão máxima
EOM - método de otimização em conjunto
IPTG - isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo
LB - meio de cultura Luria Bertani
P(r) - Função de distribuição de distância
PDB – Banco de dados de proteínas
RBM – Modelo de corpo rígido
Rg – Raio de giro
RS – Raio hidrodinâmico
SAXS – Espalhamento de raios-X a baixo ângulo
SDS- PAGE - Gel de poliacrilamida contendo duodecil sulfato de sódio
T. petrophila - Thermotoga petrophila
TmMan - endo-β-1,4-mananase de Thermotoga marítima
TpMan - endo-β-1,4-mananase de T. petrophila
TpManCBM27 – Módulo de ligação ao carboidrato da TpMan
TpManGH5 – Domínio catalítico da TpMan
UV - Ultra-violeta
17
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Raio de giro (Rg) calculado por aproximação de Guinier em diferentes
concentrações roteicas.....................................................................................................47
Tabela 2. Resultados Gerais de SAXS para TpMan.......................................................49
Tabela 3. Modelos selecionados por HHPRED e PHYRE2 para os domínios central e
C-erminal.........................................................................................................................52
Tabela 4. Deconvolução do espectro de CD e predição da estrutura secundária...........56
18
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática da disposição das moléculas de celulose, lignina e
hemicelulose na parede celular das plantas e apresentação da estrutura da celulose
(fonte: www.genomics.energy.org). ............................................................................... 22
Figura 2. Estrutura da celulose formada pela união de moléculas de glicose através de
ligações β-1,4-glicosídicas. ............................................................................................ 23
Figura 3. Estrutura da hemicelulose. Fonte: biofueloutlook ......................................... 25
Figura 4. Estruturas de diferentes formas de mananas e as enzimas necessárias para a
sua hidrólise. A) Estrutura típica da manana linear, (C) galactomanana ramificada, (D)
glicomanana linear, e (F) galactoglicomanana ramificada. A cadeia de manana é
hidrolisada pela enzima β-mananase. Os produtos gerados pela ação da enzima β-
mananase: (B) manobiose, e (E) glicomanose, são em seguida hidrolisados pelas
enzimas: β-manosidase e β-glicosidase, respectivamente, para finalmente gerarem
monossacarídeos de manose, glicose e galactose 21
....................................................... 27
Figura 5. Enzima β-mananase de T. petrophila (TpMan). A) Sequência de aminoácidos
da enzima TpMan (Gene Bank: ABQ47550). Em laranja: peptídeo sinal (aminoácidos
de 1 a 20). Em vermelho: domínio catalítico (TpManGH5) (aminoácidos de 32-392).
Em verde: linker de 102 resíduos de aminoácidos. Em azul: domínio CBM27
(aminoácidos de 495 a 667). B) Estrutura cristalográfica do domínio catalítico da
enzima TpMan (TpManGH5) mostrando um enovelamento clássico tipo barril (β/)8
(PDB 3PZ9) 24
. ................................................................................................................ 31
19
Figura 6. Gel SDS-Page. TpMan e TpManGH5. Linha 1: Marcador de massa molecular
(KDa). Linha 2: Dominio catalítico (TpManGH5) 42 KDa. Linha 3: TpMan 73KDa. . 35
Figura 7. Atividade enzimática. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática da
enzima TpMan e de seu domínio catalítico (TpManGH5). ............................................ 41
Figura 8. Caracterização da enzima TpMan por espalhamento dinâmico de luz (DLS) a
pH6. (A) O raio hidrodinâmico (RS) da TpMan (em 20 ºC) em função da concentração
da proteína. (B) O raio hidrodinâmico (RS) da TpMan (8 mg/mL) em função da
temperatura. .................................................................................................................... 43
Figura 9. Caracterização da enzima TpMan e de seu domínio catalítico (TpManGH5)
por espalhamento dinâmico de luz (DLS) a pH 6. (A) O raio hidrodinâmico (RS) da
TpMan (a 0,5 mg/mL) em função da temperatura. (B) O raio hidrodinâmico (RS) do
TpManGH5 (a 0,5 mg/mL) em função da temperatura. ................................................. 44
Figura 10. Dados de SAXS coletados para TpMan a pH 6 em diferentes temperaturas.
Curvas experimentais de SAXS da enzima TpMan a 20 ºC (círculo aberto), 50 ºC
(triângulo aberto) e 65 ºC (quadrados aberto) sobreposta nas curvas de espalhamento
baseado no modelo de baixa resolução (DAMs, linhas sólidas). As curvas foram
deslocadas para melhor visualização. ............................................................................. 45
Figura 11. Gráfico de Guinier e curva experimental da função de distribuição de
distância. (A) Gráfico de Guinier (ln I versus q2) para o TpMan a 20 ºC (circulo aberto),
50 ºC (triângulo aberto) e 65 ºC (quadrados aberto). As curvas foram deslocadas para
melhor visualização. (B) P(r) experimental da TpMan a 20 ºC (linha vermelha), 50 ºC
(linha preta) e 65 ºC (linha azul). As curvas estão em escala para um máximo de 1,0
para uma pronta comparação. ......................................................................................... 46
20
Figura 12. Modelos de baixa resolução. (A) Envelope molecular da TpMan em solução
a 20 ºC obtido pelo programa DAMMIN (dammy átomos). As estruturas central e da
direita foram rotacionadas 90º no eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da
esquerda. (B) Envelope molecular da TpMan em solução a 50 ºC obtido pelo programa
DAMMIN (dammy átomos) As estruturas central e da direita foram rotacionadas 90º
no eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da esquerda. (C) Envelope molecular da
TpMan em solução a 65 ºC obtido pelo programa DAMMIN (dammy átomos) As
estruturas central e da direita foram rotacionadas 90º no eixo y e 90º no eixo x em
relação a estrutura da esquerda. ...................................................................................... 48
Figura 13. Gráfico de Kratky dos dados de SAXS para TpMan transformado como q2.I
vs q. (A) Medida a 20ºC (B) Medida a 50ºC (C) G Medida a 65ºC .............................. 50
Figura 14. Método de threading e modelagem molecular. Todos os modelos obtidos
pelo método de threading são de carboidrases de bactéria termofílica. O domínio central
(TpManIg-like) foi diretamente modelado pelo domínio X1 de CbhA. 27
TpManCBM27
foi diretamente modelado pelo CBM27 de TmMan. 26
.................................................. 53
Figura 15. Espectroscopia dicroísmo circular. (A) Espectro de CD coletado para
enzima TpMan a 20 ºC (linha preta), 50 ºC (linha tracejada) e 85 ºC (linha cinza). (B)
Espectro de CD para o TpManGH5 (linha preta) e TpMan (linha cinza) a pH 6 a 20 ºC.
........................................................................................................................................ 55
Figura 16. Modelagem por EOM. (A) As linhas tracejadas são as distribuições (Rg e
Dmax) produzidas pelo programa por dados experimentais de SAXS a 20ºC, enquanto as
linhas sólidas são as distribuições finais de parâmetros estruturais por modelos
selecionados pelo método de otimização em conjunto (EOM). 28
(B) As linhas
21
tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas pelo programa por dados
experimentais de SAXS a 50ºC, enquanto as linhas sólidas são as distribuições finais de
parâmetros estruturais por modelos selecionados pelo método de otimização em
conjunto (EOM). 28
(C) As linhas tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas
pelo programa por dados experimentais de SAXS a 65ºC, enquanto as linhas sólidas são
as distribuições finais de parâmetros estruturais por modelos selecionados pelo método
de otimização em conjunto (EOM). 28
............................................................................ 58
Figura 17. Ajuste para RBM e EOM. (A) Curvas experimentais de SAXS para TpMan
a 20 ºC (circulo aberto), 50 ºC (triângulos abertos) e 65 ºC (quadrados abertos)
sobreposto as curvas de espalhamento baseado no modelo de corpo rígido (RBMs, linha
sólida). (B) Ajuste (linha sólida) do melhor perfil determinado pela modelagem de
EOM dos dados de SAXS a pH 6 e 20 ºC (círculos abertos), 50 ºC (triângulos abertos) e
65 ºC (quadrados abertos). .............................................................................................. 59
Figura 18. Modelo de EOM. Modelo selecionado (cartoon) que obteve a mais alta
frequência na população otimizada sobreposta na nuvem de modelos. A estrutura
mostrada esta rotacionada 90º sobre o eixo longitudinal do modelo para produzir duas
orientações. ..................................................................................................................... 60
Figura 19. Modelo de mais alta frequência (EOM) e modelo de corpo rígido (RBM).
Sobreposição do modelo EOM (azul claro, verde claro e rosa) e RBM obtido utilizando
o programa CORAL (azul escuro, verde escuro e vermelho). ....................................... 61
22
1. Introdução
A biomassa lignocelulósica é a principal fonte de energia renovável disponível
na natureza, sendo composta de celulose, hemicelulose e lignina com uma proporção
aproximada de 2:1:1. 1-2
A figura 1 ilustra a disposição das moléculas de celulose,
hemicelulose e lignina na parede celular das plantas como também a estrutura da
celulose.
Figura 1. Representação esquemática da disposição das moléculas de celulose, lignina e hemicelulose na
parede celular das plantas e apresentação da estrutura da celulose (fonte: www.genomics.energy.org).
23
1.2 Celulose
A celulose (C6H10O5) é o biopolímero mais abundante na natureza com uma
produção estimada de 1014
toneladas por ano e de grande importância econômica, sendo
constituída por polissacarídeos lineares unidos por ligações glicosídicas β-1,4 entre
resíduos de D-glicose, conforme ilustrado na figura 2. 3 Todos os anos as plantas
produzem aproximadamente 180 bilhões de toneladas de celulose 4.
Figura 2. Estrutura da celulose formada pela união de moléculas de glicose através de ligações β-1,4-
glicosídicas.
Na parede celular, a celulose é produzida na forma de microfibrilas, onde cada
microfibrila corresponde em média a 36 cadeias lineares de glicose.5 Na estrutura
microfibrilar da celulose existem diferentes graus de ordenação, as regiões cristalinas,
muito ordenadas e as de menor ordenação, denominadas de regiões amorfas. A
cristalinidade é resultado da linearidade das moléculas de celulose, devido às ligações
de hidrogênio.6 As regiões de elevada cristalinidade são pouco acessíveis por solventes
e reagentes, e as regiões amorfas, no entanto, são mais acessíveis e mais susceptíveis a
reagentes químicos. Na estrutura da celulose, dois monômeros de glicose adjacentes são
ligados por ligações glicosídicas, onde a quebra da ligação química dá origem a uma
molécula de celobiose, a qual corresponde a duas unidades de glicose.
24
1.3 Lignina
A lignina é um dos principais componentes do tecido vegetal, fazendo parte da
lamela média e parede celular.7
É caracterizada por ser um polímero amorfo, de natureza
aromática e muito complexa. As ligninas possuem grande importância no transporte de
água, nutrientes e metabólitos, sendo responsável pela resistência mecânica dos
vegetais.7 A presença de ligninas em plantas superiores permite o crescimento vertical
acima do solo, pois ela proporciona o reforço estrutural necessário a isso, enquanto, por
exemplo, briófitas não conseguem atingir esse crescimento estrutural devido à falta de
lignina em sua parede celular.8 Além disso, as ligninas contribuem na defesa vegetal
contra diferentes tipos de estresses bióticos e abióticos, tais como o ataque de
microrganismos, deficiência mineral, déficit hídrico, radiação ultra-violeta (UV-B),
vento e baixas temperaturas.9 Por outro lado, as ligninas representam um problema no
aproveitamento agroindustrial de inúmeras espécies vegetais, por exemplo, com
impacto negativo na digestibilidade de gramíneas, produção de biocombustíveis de
segunda geração e na manufatura do papel.10
1.2 Hemicelulose
As hemiceluloses são heteropolissacarídeos lineares ou ramificados (Figura 3),
derivados de açúcares tais como D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, e L-
arabinose.11
As hemiceluloses são classificadas de acordo com sua unidade de açúcar
principal, e a maioria dos açúcares de suas cadeias principais no polímero de
hemicelulose estão conectados através de ligações glicosídicas β-1,4.
O teor de hemicelulose é variável para cada vegetal, tendo um valor médio de 25
a 30% do peso seco.12-13
A hemicelulose está localizada de forma intercalada nas
25
microfibrilas de celulose, em um estágio anterior à lignificação, o que promove a planta
elasticidade e flexibilidade impedindo que a microfibrilas de celulose se toquem, assim
as hemiceluloses fazem ligações fortes entre si, para manter ligações cruzadas através
de pontes de hidrogênio, em uma rede complexa.14
A distribuição de polissacarídeos na hemicelulose é variável para gimnospermas
e angiospermas. Em hardwoods, sua principal composição é de xilanas, no entanto
existe uma pequena porcentagem (3-5%) de glicomanana (glicose e manose), numa
proporção de 1:2. Em softwoods, a composição em sua maioria são de mananas, 15-16
principalmente galactoglicomanana, que contém resíduos de glicose, manose, galactose
numa proporção de 3:1:1 e glicomanana, com resíduos de manose e glicose na
proporção de 3:1.17
Figura 3. Estrutura da hemicelulose. Fonte: biofueloutlook
2. Hidrólise Enzimática
2.1 Polissacarídeos de manana
Comparado com xiloglicanos, pouco se conhece sobre o papel das mananas na
parede celular, assim, as mananas são raramente mencionadas ou são referidas como
26
"outros polissacarídeos". As mananas são estruturalmente mais diversas do que os
xiloglicanos, que são polissacarídeos relativamente homogêneos feitos de uma estrutura
de glicano substituídos com cadeias laterais que são ocasionalmente xilose estendidos
com resíduos de galactose. Polissacarídeos de mananas são classificados em quatro
categorias com base em sua estrutura de ligação e na presença de cadeias laterais de
galactose. 18
As mananas são estruturalmente importantes em paredes espessas e pode
desempenhar um papel na determinação da firmeza e flexibilidade do tecido vegetal, no
entanto, estão presentes apenas em quantidade mínimas em paredes de células de
parênquima de fruta. 18
A diversidade estrutural de mananas permite uma ampla gama de propriedades
físico-químicas, que por sua vez contribui para a funcionalidade da planta. A manana
pura é insolúvel em água fria e pH neutro. Quando alguns dos resíduos de manose são
substituídos por resíduos de glicose, como nas glicomananas, ou substituído por
galactose, como no galactomananas, a solubilidade em água aumenta.
Os padrões de resíduos de manose e glicose são geralmente aleatórios, e o grau
de substituição, bem como a distribuição dos substituintes galactosil varia
acentuadamente. 18
As mananas na parede celular da planta têm como função armazenagem de
polissacarídeos estruturais. Os polissacarídeos de armazenamento depositados no
interior da parede celular primária, mananas pura, galactomananas (em sementes) e
glicomananas (em bulbos ou tubérculos) são mais comuns. Eles são degradados e
metabolizados pelo embrião em crescimento. Em sementes, esse processo ocorre em um
período definido de embebição. 18
Dada à complexidade estrutural das hemiceluloses,
uma variedade de enzimas são necessárias para a sua hidrólise de uma forma eficiente
27
(Figura 4). 19
Neste contexto, o complexo enzimático que degrada manana desempenha
um papel-chave no fornecimento de energia para os organismos que os produzem, no
crescimento, maturação das plantas, na bioconversão de resíduos lignocelulósicos e
diversas aplicações, incluindo as indústrias de alimentos, celulose e papel. 20
Figura 4. Estruturas de diferentes formas de mananas e as enzimas necessárias para a sua hidrólise. A)
Estrutura típica da manana linear, (C) galactomanana ramificada, (D) glicomanana linear, e (F)
galactoglicomanana ramificada. A cadeia de manana é hidrolisada pela enzima β-mananase. Os produtos
gerados pela ação da enzima β-mananase: (B) manobiose, e (E) glicomanose, são em seguida hidrolisados
pelas enzimas: β-manosidase e β-glicosidase, respectivamente, para finalmente gerarem monossacarídeos
de manose, glicose e galactose [21].
28
2.2 Enzimas hidrolíticas: hemicelulases
A degradação da hemicelulose envolve a ação de enzimas frequentemente
classificadas de acordo com os distintos substratos. As xilanases rompem ligações entre
unidades monoméricas de xilose, enquanto as mananases atuam sobre ligações entre
moléculas de manose, respectivamente. As principais enzimas envolvidas na
biodegradação de polissacarídeos de manana são β-mananase (EC 3.2.178), β-
manosidase (EC 3.2.1.25) e β-glicosidase (EC 3.2.1.21). 16-21
A enzima β-mananse é
responsável por clivar ligações internas β-1,4 de polímeros de manana para produção de
novas cadeias terminais, enquanto que a β-manosidase cliva ligações β-1,4 manosideas
e libera a manobiose (dímero de manose) a partir da extremidade não redutora de
manose e monooligossacarídeos. 16-21
A enzima β-glicosidase hidrolisa ligações β-1,4-
D-glicopiranose de cadeias não redutoras de oligossacarídeos, tais como glicomanana e
galactomanana. Enzimas suplementares como acetil manana esterase (EC 3.1.1.6) e α-
galactosidase (EC 3.2.1.22) são necessárias para remover grupos laterais que podem
estar ligados sobre o polímero de manana, criando assim mais locais para subsequente
hidrólise enzimática. 16-21
A biodegradação da manana representa um passo chave para
várias aplicações industriais incluindo a deslignificação da polpa Kraft, processamento
de alimento e produção de biocombustíveis de segunda geração. 9-14
2.2.1 Enzimas termoestáveis com potencial biotecnológico
Enzimas termoestáveis, de modo geral, apresentam vantagens para a aplicação na
indústria, uma vez que processos biotecnológicos conduzidos em elevadas temperaturas
sofrem menor risco de contaminação por microrganismos mesófilos, que são a maioria
em um ambiente industrial. 22
Por outro lado, temperaturas mais elevadas favorecem a
solubilidade dos substratos e de produtos, e aumentam as taxas de reação devido à
29
redução da viscosidade e por aumento do coeficiente de difusão dos substratos. 23
Outra
importante característica das enzimas termoestáveis é a sua maior resistência à ação de
proteases, uma vez que, quanto mais rígida for à molécula, menos sítios são expostos à
ação de proteólises. 24
A maior resistência à desnaturação por alguns solventes
orgânicos também é relatada como uma propriedade das enzimas termoestáveis. 25
A biodegradação de polímeros de celulose e hemicelulose envolve ação sinérgica de
uma variedade de enzimas hidrolíticas. Celulases e xilanases são enzimas que são
extensivamente estudadas devido a suas amplas aplicações industriais, principalmente
para o setor de biorrefinarias, contudo, enzimas que degradam manana tem recebido
menor atenção.
2.2 A enzima β-Mananase
Thermotoga petrophila RKU-1 (T. petrophila) é uma bactéria hipertermófila
isolada do reservatório de óleo Kubiki em Niigata (Japão). 23
O intervalo de temperatura
de crescimento é entre 47-88 ºC com um valor ótimo em 80 ºC. O intervalo de pH de
crescimento é entre 5-9 um valor ótimo em pH 7. Esta bactéria produz um repertório de
enzimas hipertermoestáveis de elevado potencial biotecnológico para aplicações
industriais, incluindo celulases, arabionofuranosidases, arabinases e mananases. 25-26
Para diversas aplicações industriais é necessário que as enzimas possuam alta atividade
e grande termoestabilidade. 22
A enzima hipertermoestável endo-β-1,4-mananase (EC 3.2.1.78), da bactéria
Thermotoga petrophila (TpMan) é composta por 667 resíduos de aminoácidos,
conforme figura 5A (Gene Bank: ABQ47550.1). Os primeiros 20 resíduos de
aminoácidos são um peptídeo sinal, o qual é removido depois da proteína ser exportada.
A enzima TpMan apresenta atividade ótima no intervalo de temperatura de 81-
30
93 ºC. 24
A enzima TpMan e seu domínio catalítico GH5, apresentam atividade máxima
em um intervalo de pH ácido entre 4,5-6,5. O domínio catalítico GH5 possui atividade
ótima em temperatura inferior quando comparado a TpMan. 24
Um recente estudo
reportou que a enzima TpMan consiste de um domínio catalítico GH5 (TpManGH5,
composto de 360 resíduos de aminoácidos) e um domínio de ligação ao carboidrato
(TpManCBM27, composto de 172 resíduos de aminoácidos) conectados através de um
linker (composto de 102 resíduos de aminoácidos). 24
Além disso, o mesmo estudo
apresenta a estrutura cristalográfica do domínio catalítico GH5 (Figura 5B).
Algumas estruturas de domínios catalíticos de β-mananases foram determinadas:
Thermobifida fusca KW3 (TfMan, PDB: 1BQC, 2MAN, 3MAN) 27
, Trichoderma reesei
(TrMAn, PDB: 1QNO, P, Q, R, S) 28
, Bacillus sp. JAMB-602 (PDB: 1WKY) 29
,
Lycopersicon esculentum (LeMan, PDB: 1RH9) 30
e Bacillus agaradhaerens (BaMan,
PDB: 2WHJ). 31
A enzima endo-β-1,4-mananase, geralmente denominada β-mananase,
catalisa a hidrólise de ligações β-1,4-manosideo em vários polissacarídeos contendo
manana, tais como glicomananas e galactomananas.32
A degradação deste
polissacarídeo representa um passo chave para várias aplicações industriais incluindo
deslignificação da polpa Kraft, processamento de alimento 33
e produção de
biocombustíveis de segunda geração.22
Em geral, esses processos biotecnológicos, como exemplo, o pré-tratamento da
biomassa, são realizados em condições extremas de pH, osmolaridade e temperatura.
Portanto, β-mananases que se mostram estáveis e funcionais a altas temperaturas
oferecem substancial vantagens tecnológicas e econômicas.
31
(A)
MRRFMFILSIVALSFVLFADEFVRVENGKFVLNGKEFRFIGSNNYYMHYKSNRMIDSVLESA
RDMGIKVLRIWGFLDGESYCRDKNTYMHPEPGVFGVPEGISNAQNGFERLDYTIAKAKEL
GIKLIIVLVNNWDDFGGMNQYVRWFGGTHHDDFYRDERIKEEYKKYVSFLINHVNVYTGV
PYREEPTIMAWELANELRCETDKSGNTLVEWVKEMSSYIKSLDPNHLVAVGDEGFFSNYEG
FKPYGGEAEWAYNGWSGVDWKKLLSIETVDFGTFHLYPSHWGVSPENYAQWGAKWIED
HIKIAKEIGKPVVLEEYGIPKSAPVNRTAIYRLWNDLVYDLGGDGAMFWMLAGIGEGSDRD
ERGYYPDYDGFRIVNDDSPEAELIREYAKLFNTGEDIREDTCSFILPKDGMEIKKTVEVRAG
VFDYSNTFEKLSVKVEDLVFENEIEHLGYGIYGFDLDTTRIPDGEHEMFLEGHFQGKTVKD
SIKAKVVNEARYVLAGKVDFSSPEEVKNWWNSGTWQAEFESPDIEWNSEVGNGALQLNVK
LPGKSDWEEVRAARKFEKLSECEILEYDIYIPDVEGLKGRLRPYAVLNPGWVKIGLDMNNT
SVESAEIVTFGGKEYRKFHVRIEFDKTAGVNELHIGIVGDHLKYNGPIFIDNVKLYTKEAE
(B)
Figura 5. Enzima β-mananase de T. petrophila (TpMan). A) Sequência de aminoácidos da enzima TpMan
(Gene Bank: ABQ47550). Em laranja: peptídeo sinal (aminoácidos de 1 a 20). Em vermelho: domínio
catalítico (TpManGH5) (aminoácidos de 32-392). Em verde: linker de 102 resíduos de aminoácidos. Em
azul: domínio CBM27 (aminoácidos de 495 a 667). B) Estrutura cristalográfica do domínio catalítico da
enzima TpMan (TpManGH5) mostrando um enovelamento clássico tipo barril (β/)8 (PDB 3PZ9) 24
.
32
3. Objetivos
Os objetivos do presente estudo são aumentar a compreensão da relação entre a
estabilidade, flexibilidade e atividade enzimática da proteína endo-β-1,4-mananase
(TpMan) da bactéria hipertermófila Thermotoga petrophila. A enzima TpMan será
analisada empregando-se técnicas biofísicas como também ferramentas de
bioinformática. Assim, pretende-se disponibilizar o primeiro modelo de baixa resolução
para a enzima TpMan empregando-se a técnica de espalhamento de raios-X a baixos
ângulos (SAXS).
33
4. Materiais e métodos
4.1 Materiais
No presente trabalho foi utilizado: coluna de resina de níquel ácido nitrilotriácetico
(Ni-NTA), imidazol, canamicina, meio de cultura Luria-Bertani (LB), indutor isopropil-
β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e galactomanana como substrato para teste de
atividade, todos adquiridos da empresa Sigma-Aldrich. Todos os reagentes químicos
usados neste estudo são de alto grau de pureza analítica.
4.2 Métodos
4.2.1 Expressão e purificação da proteína TpMan e TpManGH5
4.2.1.1 Expressão da proteína TpMan e TpManGH5
Plasmídeos pET28a(+) contendo o cDNA da enzima β-mananase de T. petrophila
(TpMan) e de seu domínio catalítico isolado (TpManGH5, resíduos de 32-393) foram
obtidos em colaboração com o Dr. Fabio Marcio Squina do Laboratório Nacional de
Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE, Campinas).26
Para a expressão das proteínas recombinantes, foi empregado à linhagem bacteriana
BL21(DE3), que possui a RNA polimerase do fago T7 sob controle do promotor lac,
induzido por IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo). Nessa linhagem, a adição de
IPTG leva à síntese da RNA polimerase, que reconhece o promotor do fago T7 e
transcreve o cDNA de interesse em grandes quantidades. A linhagem BL21(DE3)
competente foi transformada através de choque-térmico, na presença de cloreto de
cálcio, com o vetor de expressão contendo o cDNA da TpMan ou TpManGH5, onde
para as duas proteínas, o gene que codifica são precedidos por uma sequência
codificadora que permite a expressão da proteína fusionada a uma cauda de histidina
(6xHis) na região N-terminal.
34
Em ambos os casos, as bactérias foram plaqueadas em meio LB (1% triptona, 1%
NaCl, 0,5% extrato de levedura) contendo canamicina (50 g/mL) e incubadas a 37 ºC
de 16-18 horas. Em seguida, as colônias isoladas da placa foram inoculadas em meio
LB líquido contendo canamicina (50 g/mL), e os pré-inóculos foram incubados de 16-
18 horas a 37 ºC e agitação de 200 rpm. Posteriormente, os pré-inóculos foram diluídos
a 2% em 500 mL de meio LB líquido contendo canamicina (50 g/mL). As culturas
foram mantidas a 37 ºC e 200 rpm até que a densidade óptica a 600 nm atingiu um valor
de 0,5, quando foi realizado a indução com IPTG em concentração final de 0,5 mM.
Após a indução, as culturas foram mantidas a 37 ºC durante 4 horas.
4.2.1.2 Purificação da proteína TpMan e TpManGH5
Após a etapa de indução, as células foram coletadas por centrifugação (5,000xg, 10
minutos, 4 ºC) e em seguida ressuspensas em 20 mM de tampão ABF (Acetato/Borato/
Fosfato) ajustado no pH 7,4. Após a ressuspensão, as células foram sonicadas em gelo
(8 vezes, cada uma com 30 segundos e com intervalo de 1 minuto) e subsequentemente
centrifugados a 10,000xg durante 30 minutos a 4 ºC. Em seguida, o sobrenadante foi
separado da parte insolúvel.
Na primeira etapa de purificação, o sobrenadante obtido foi incubado a 70 ºC por 30
minutos, para eliminar por aquecimento grande quantidade de proteínas mesófilas
indesejáveis. Em seguida os extratos foram centrifugados a 10,000xg durante 30
minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi novamente separado da parte insolúvel, a qual
contém a proteína de interesse. Esta etapa de purificação é de grande importância, pois
conseguimos eliminar grande quantidade de proteínas que não são de interesse para o
estudo, pois a temperatura favorece apenas a TpMan e o TpManGH5 que são enzimas
hipertermoestáveis.
35
Na segunda etapa da purificação, o sobrenadante foi submetido a uma cromatografia
por afinidade em coluna imobilizada de níquel (His Trap). Em ambos os casos, as
proteínas foram eluídas com imidazol em concentrações de 150 e 500 mM em 20mM de
tampão ABF ajustado no pH 7,4. A pureza das frações obtidas no processo de
purificação foram analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
desnaturante corado com azul de coomassie (Figura 6).
Finalmente, as proteínas obtidas (TpMan e TpManGH5) foram dialisadas em 20
mM de tampão ABF ajustado no pH 7,4 e concentradas a 4 mg/mL e armazenadas no
freezer -80ºC. As concentrações das proteínas foram determinadas por absorção a 280
nm e utilizando-se o coeficiente de extinção molar baseado na composição dos
aminoácidos. Os coeficientes utilizados foram ε280nm = 156,900 M-1
cm-1
para TpMan e
ε280nm = 108,875 M-1
cm-1
para TpManGH5.
Figura 6. Gel SDS-Page. TpMan e TpManGH5. Linha 1: Marcador de massa molecular (KDa). Linha 2:
Dominio catalítico (TpManGH5) 42 KDa. Linha 3: TpMan 73KDa.
36
4.2.2 Medidas de atividade enzimática
A atividade da enzima endo-β-1,4-mananase foi determinada usando como
substrato galactomanana 1% dissolvido em tampão ABF. Os ensaios de atividade da
TpMan e do TpManGH5 foram realizados no intervalo de temperatura de 20 ºC até 85
ºC em tampão ABF ajustado para o pH 6. A reação para cada experimento foi realizado
em uma placa de ELISA contendo uma mistura de 20 μL de enzima diluída (1,5 μM)
com 80 μL de substrato por 10 minutos. A reação foi parada pela a adição do reagente
DNS (ácido 3,5-dinitro-salicílico) e em seguida foi fervido a 100 ºC por 5 minutos e
então a atividade foi quantificada por método de espectroscopia de luz a 540 nm. 30
Uma unidade de atividade da enzima endo-β-1,4-mananase foi definida com uma
quantidade de enzima necessária para hidrolisar o equivalente a 1 μmol de manose por
minuto. Todos os experimentos foram realizados em triplicata, e foi utilizado a média
dos valores obtido.
4.2.3 Espalhamento dinâmico de luz (DLS)
O tamanho das enzimas purificadas TpMan e TpManGH5 foram caracterizados
através de técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS) utilizando um equipamento
Nano-ZetaSizer (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK). Este sistema emprega um
laser com comprimento de onda de 633 nm a um ângulo fixo de 173°. As concentrações
de TpMan e TpManGH5 utilizadas estavam no intervalo de 0,5 e 8 mg/mL em 20mM
de tampão ABF ajustado em pH 6. As amostras foram filtradas com uma membrana de
poro 0,22 µm (Millipore, USA) e centrifugadas a 16,000xg por 10 minutos em
temperatura ambiente, e subsequentemente colocada na cubeta para medição. As medias
foram realizadas em um intervalo de temperatura de 20 ºC até 85 ºC e para cada
37
temperatura as amostras foram equilibradas por 2 minutos antes de cada medida. Foram
coletados para cada temperatura, múltiplos registros do perfil de DLS.
4.2.4 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS)
Para as medidas de SAXS, a proteína TpMan foi medida em várias concentrações
(2, 4 e 8 mg/mL em 20 mM tampão ABF ajustado em pH 6) e em três diferentes
temperaturas (T = 20, 50 e 65 ºC). As amostras foram centrifugadas por 10 minutos a
16,000xg (em temperatura ambiente) e filtradas em filtro 0,22 μm (Milipore, USA)
antes de cada medida, para remover possíveis agregados ou partículas. Não foi
detectado efeito de concentração nas amostras.
As medidas foram realizadas em um equipamento Bruker-NanostarTM
localizado no
Instituto de Física da Universidade de São Paulo. Este equipamento é adaptado com
fonte de microfoco Genix3D acoplada com óptica multicamadas Fox3D e dois
conjuntos de fendas de espalhamento todos fornecidos pela XenocsTM
. As amostras
foram mantidas em um capilar de quartzo em uma caixa de ácido inoxidável, o qual
permite a limpeza adequada e reaproveitamento do porta amostra, permitindo que a
subtração do tampão seja precisa.
O espalhamento medido para a água foi utilizado para normalizar os dados para uma
escala absoluta. A temperatura da amostra foi controlada pelo sistema Peltier. Vários
frames de 900 s foram coletados para cada amostra controlando os danos de radiação. O
comprimento de onda do feixe monocromático de raios-X utilizado foi λ = 1,54 Å
(Cukα) e a distância da amostra para o detector foi 0,67 m, fornecendo um intervalo de q
(vetor de espalhamento) de 0,008 a 0,35 Å-1
, onde q = 4 π sin (θ)/λ e θ é metade do
ângulo de espalhamento.
38
O espalhamento 2D das amostras foi coletado por um detector Vantec2000TM
e a
integração do padrão de SAXS foi realizada usando o software Bruker SAXS. O
tratamento dos dados, a normalização para escala absoluta e procedimentos para média
foram realizados usando o programa SUPERSAXS (Oliveira e Pedersen, unpublished).
4.2.5 SAXS - Análise de dados
Os raios de giro (Rg) das moléculas foram determinadas por dois procedimentos
independentes: i) empregando a equação de Guinier I(q) = I(0).exp[(-q2.Rg
2)/3], q <
1,3/Rg, e ii) através de transformada indireta de Fourier utilizando o programa GNOM
(http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/) [35]. A função de distribuição de distância P(r)
também foi avaliada com o programa GNOM, obtendo-se o diâmetro máximo (Dmax).
4.2.6 Modelos de baixa resolução obtidos dos dados de SAXS
Modelos de átomos dummy (DAMs) foram calculados a partir das curvas
experimentais de SAXS pelos procedimentos ab initio implementados no programa
DAMMIN (http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/). 36
Os modelos de baixa resolução
obtidos, para cada caso, foram comparados utilizando-se o programa DAMAVER [37] e
o modelo mais representativo foi utilizado. A resolução (R) foi estimada pela equação R
= 2π/qmax. O programa CRYSOL (http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/) foi utilizado
para gerar curvas de espalhamento teóricas para o DAMs [34]. O Rg e a Dmax foram
determinados com o mesmo programa.
4.2.7 Modelo de corpo rígido e modelagem por EOM
Os modelos de corpo rígido da TpMan foram determinados com o programa
CORAL (http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/) [38]. O programa CRYSOL foi usado
39
para gerar as curvas de espalhamentos teóricas para os modelos de corpo rígido. Os
modelos de corpo rígido e os modelos ab initio (DAMs) foram sobrepostos utilizado-se
o programa SUPCOMB. 39
Adicionalmente, modelagem estrutural foi realizada
empregando o método de otimização em conjunto (EOM) descrito por Bernardo et al. 40
A sobreposição das figuras foram geradas pelo programa PyMOL (www.pymol.org).
4.2.8 Modelagem molecular (por homologia)
Os programas de detecção de homologia HHPRED 41
e PHYRE2 42
foram utilizados
para realizar a pesquisa de homólogos para os últimos 274 resíduos de aminoácidos da
TpMan no sítio do Protein Data Bank (PDB) com parâmetros padrão. Modelos
moleculares por homologia para TpManCBM27 e TpManIg-like foram construídos
usando-se modelos homólogos através da metodologia implementada no programa
Modeller. 43
O alinhamento do TpManCBM27 contra a sequência do CBM27 da enzima
endo-beta-1,4-mananase de Thermotoga marítima foi inicialmente usada como entrada
para o programa Modeller, junto com as coordenadas atômicas da estrutura
cristalográfica (PDB 1OH4). O alinhamento da TpManIg-like contra a sequência do
domínio X1 da celobiohidrolase A de Clostridium thermocellum foi inicialmente usado
como entrada para o programa Modeller, juntos com as coordenadas atômicas da
estrutura cristalográfica (PDB 3PZ9).
4.2.9 Métodos computacionais para predição de estrutura secundária
O coeficiente de extinção teórico, baseado na composição de aminoácidos (Gene
Bank: ABQ47550.1), para TpMan e TpManGH5 foram obtidos utilizando-se a
ferramenta ProtParam disponível no servidor ExPasy (www.expasy.org). Os programas
40
utilizados para gerar a predição da estrutura secundária foram: PHD 44
, PSIPRED 45
,
BALDIG 46
e PORTER. 47
4.2.10 Espectroscopia por dicroísmo circular (CD)
Os espectros de dicroísmo circular foram coletados usando-se um
espectropolarímetro Jasco J-815 com um dispositivo de controle de temperatura Peltier.
As concentrações das proteínas TpMan e TpManGH5 foram 5 µM em tampão 20 mM
ABF ajustado em pH 6. Todos os dados foram coletados usando-se uma cubeta de
quartzo de 0,1 cm e os espectros foram obtidos no intervalo de comprimento de onda
entre 195 a 250 nm. Para a enzima TpMan, as medidas de CD foram coletadas em
diferentes temperaturas (T= 20, 65 e 85 ºC). Foi realizada uma média de oito
acumulações, utilizando um scanning de 100 nm min -1
, com uma linha espectral de 1
nm, e com um tempo de resposta de 0,5 s. A leitura foi realizada igualmente para o
tampão e os espectros coletados foram subtraídos para cada experimento. Espectros
foram transformados para elipticidade molar [] usando a massa molecular média dos
resíduos e a concentração. Para obter informação estrutural, o espectro de CD foi
deconvoluído usando-se os programas SELCON 48
, CONTIN 49
, CDS 50
, e K2D3 51
em
diferentes bases de dados.
41
5. Resultados e Discussão
5.1.1 Perfil da atividade em função da temperatura
A atividade de uma enzima é dependente do pH e da temperatura, condições que
envolve mudanças no enovelamento, conformação e protonação da enzima. Como
primeiro passo dos nossos estudos, a atividade da TpMan e do TpManGH5 foram
analisadas em função da temperatura utilizando-se como substrato galactomanana
(Figura 7). Nossos resultados mostram que, nas condições de nosso estudo (pH 6), a
atividade enzimática da TpMan aumenta com a elevação da temperatura. Um
comportamento similar foi também observado no caso do TpManGH5. Entretanto,
TpManGH5 mostrou uma redução significativa da atividade enzimática a 85 ºC quando
comparado com a TpMan (Figura 7). Assim, nossos resultados indicam que a TpMan é
mais termotolerante que o TpManGH5. Os resultados apresentados aqui são
consistentes com os resultados publicados recentemente para TpMan.24
Figura 7. Atividade enzimática. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática da enzima TpMan e
de seu domínio catalítico (TpManGH5).
42
5.1.2 Espalhamento dinâmico de luz (DLS)
Espalhamento dinâmico de luz (DLS) fornece uma rápida e conveniente forma
para monitorar o tamanho de proteínas em solução como também para investigar
possíveis agregações em altas temperaturas ou em altas concentrações.52
Como pode ser
observado na figura 8, o raio hidrodinâmico (RS) obtido para TpMan foi praticamente
independente da concentração de proteína no intervalo de 0,5 a 8 mg/mL a 20 ºC e pH 6
(Figura 8 A). Após a incubação em 85 ºC (0,5 mg/mL) não foi evidenciado precipitação
da enzima e a solução permaneceu límpida. O valor médio determinado para o RS da
enzima TpMan pelo método de DLS foi 36 ± 2 Å, o qual corresponde a uma massa
molecular de 68 ± 6 kDa, consistente com a massa molecular esperada de 73kDa.
Contudo, quando a TpMan em pH 6 e 8 mg/mL foi incubada em valores de temperatura
acima de 65 ºC o RS aumentou significativamente sugerindo uma tendência a formação
de agregados (Figura 8 B). 52
Após a incubação a 85 ºC (8 mg/mL) a solução da enzima
TpMan ficou visivelmente túrbida concluindo-se que agregados foram formados.
43
Figura 8. Caracterização da enzima TpMan por espalhamento dinâmico de luz (DLS) a pH6. (A) O raio
hidrodinâmico (RS) da TpMan (em 20 ºC) em função da concentração da proteína. (B) O raio
hidrodinâmico (RS) da TpMan ( 8 mg/mL) em função da temperatura.
Os valores de RS obtidos para o TpManGH5, foram praticamente independentes
da temperatura no intervalo de temperatura de 20 a 75 ºC em pH 6 a 0,5 mg/mL (Figura
9 B). A média para o RS determinado para TpManGH5 pelo método de DLS foi 28 ± 2
44
Å, o qual corresponde a uma massa molecular de 38 ± 5 kDa, totalmente consistente
com a massa molecular esperada de 42kDa. Assim, quando o TpManGH5 em pH 6 e
0,5 mg/mL foi incubado em temperaturas acima de 75 ºC o RS aumentou
significativamente, sugerindo a tendência de formação de agregados (Figura 9 B).
Novamente, após a incubação a 85 ºC (0,5 mg/mL) a solução do TpManGH5 ficou
visivelmente túrbida e concluindo-se que precipitados foram formados.
Figura 9. Caracterização da enzima TpMan e de seu domínio catalítico (TpManGH5) por espalhamento
dinâmico de luz (DLS) a pH 6. (A) O raio hidrodinâmico (RS) da TpMan (a 0,5 mg/mL) em função da
temperatura. (B) O raio hidrodinâmico (RS) do TpManGH5 (a 0,5 mg/mL) em função da temperatura.
45
5.1.3 Espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS)
Para obter informações sobre a forma da estrutura terciária, a enzima TpMan foi
submetida à análises empregando-se SAXS. A figura 10 mostra as curvas de
espalhamento de raios-X para TpMan a pH 6 medidas a 8 mg/mL em três diferentes
temperaturas (T = 20, 50 e 65 ºC) . As curvas de espalhamento obtidas a 80 ºC e a alta
concentração mostraram efeitos de agregação e não foram utilizadas para as análises.
Figura 10. Dados de SAXS coletados para TpMan a pH 6 em diferentes temperaturas. Curvas
experimentais de SAXS da enzima TpMan a 20 ºC (círculo aberto), 50 ºC (triângulo aberto) e 65 ºC
(quadrados aberto) sobreposta nas curvas de espalhamento baseado no modelo de baixa resolução
(DAMs, linhas sólidas). As curvas foram deslocadas para melhor visualização.
O gráfico de Guinier exibiu um comportamento linear, indicando excelente
monodispersividade da TpMan e que as partículas estão livres de agregados (Figura 11
A). Além disso, a variação entre os valores de raios de giro para diferentes
concentrações proteicas em temperatura igual, são insignificantes (Tabela 1). Os raios
de giro (Rg) determinados por aproximação de Guinier em 20, 50 e 65 ºC foram 32 ± 1
46
Å, 34 ± 1 Å e 36 ± 1 Å, respectivamente. A função de distribuição de distancia, P(r), foi
avaliada por transformada indireta de Fourier com o programa GNOM 35
como
mostrado na figura 11 B. Os perfis obtidos para 20, 50 e 65 ºC possuem forma similar e
dimensão máxima (Dmax) de 105 ± 5 Å, 110 ± 5 Å e 115 ± 5 Å, respectivamente. Os
valores de Rg determinados para TpMan a 20, 50 e 65 ºC usando o programa GNOM
foram 32,5 ± 0,1 Å, 34,9 ± 0,2 Å e 36 ± 0,2 Å, respectivamente.
Figura 11. Gráfico de Guinier e curva experimental da função de distribuição de distância. (A) Gráfico de
Guinier (ln I versus q2) para o TpMan a 20 ºC (circulo aberto), 50 ºC (triângulo aberto) e 65 ºC
(quadrados aberto). As curvas foram deslocadas para melhor visualização. (B) P(r) experimental da
TpMan a 20 ºC (linha vermelha), 50 ºC (linha preta) e 65 ºC (linha azul). As curvas estão em escala para
um máximo de 1,0 para uma pronta comparação.
47
Tabela 1. Raio de giro (Rg) calculado por aproximação de Guinier em diferentes concentrações
proteicas.
Conc. (mg/mL) Rg (Å) a 20°C Rg (Å) a 50°C Rg (Å) a 65°C
2 32 ± 1 33 ± 1 36 ± 1
4 33 ± 1 34 ± 1 35 ± 1
8 32 ± 1 34 ± 1 36 ± 1
A forma molecular de baixa resolução da TpMan foi determinada através dos
dados de espalhamento de raios-X utilizando-se o programa DAMMIN 36
para
visualizar a forma da enzima em solução em diferentes temperaturas. Os resultados dos
envelopes de baixa resolução para as temperaturas estudadas são mostrados na Figura
12. Para cada caso, dez independentes simulações ab initio foram realizadas sem impor
restrições de simetria e os modelos obtidos foram capazes de reproduzir as curvas
experimentais. Os resultados, em cada caso, foram todos comparados utilizando o
programa DAMAVER 37
e o modelo mais representativo é mostrado na Figura 12.
48
Figura 12. Modelos de baixa resolução. (A) Envelope molecular da TpMan em solução a 20 ºC obtido
pelo programa DAMMIN (dammy átomos). As estruturas central e da direita foram rotacionadas 90º no
eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da esquerda. (B) Envelope molecular da TpMan em solução
a 50 ºC obtido pelo programa DAMMIN (dammy átomos) As estruturas central e da direita foram
rotacionadas 90º no eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da esquerda. (C) Envelope molecular da
TpMan em solução a 65 ºC obtido pelo programa DAMMIN (dammy átomos) As estruturas central e da
direita foram rotacionadas 90º no eixo y e 90º no eixo x em relação a estrutura da esquerda.
A reconstrução do modelo de baixa resolução obtido para a TpMan a 20 ºC em pH
6, restaurado a 18 Å de resolução, mostra uma molécula alongada em forma de L, com
um Dmax de aproximadamente 105 Å. Contudo, o modelo de baixa resolução obtido para
TpMan a 65ºC e pH 6, restaurado a 18 Å de resolução, mostrou uma forma duas vezes
mais alongada que larga, com um Dmax de aproximadamente 115 Å. Um resumo de
todos os resultados de SAXS descritos neste trabalho estão mostrados na Tabela 2.
49
Tabela 2. Resultados Gerais de SAXS para TpMan
Parâmetros/amostra 20°C
Experimental DAM RBM EOM
Rg (Å)
32 ± 1 (Guinier)
32,50 ± 0,14 (GNOM) 32,97 32,30 31,14
Dmax(Å) 105 ± 5 103,90 104,70 102,70
Resolução (Å)
18
- - -
x/x2 - 1,6/2,6 1,8/3,2 1,9/3,36
50°C
Experimental DAM RBM EOM
Rg (Å)
34 ± 1 (Guinier)
34,87 ± 0,15 (GNOM)
35,26 33,99 33,22
Dmax(Å) 110 ± 5 110,60 111,20 105,17
Resolução (Å)
18
x/x2 - 1,1/1,2 1,3/1,7 2,4/5,8
65°C
Experimental DAM RBM EOM
Rg (Å)
36 ± 1 (Guinier)
35,98 ± 0,19 (GNOM)
36,41 34,95 34,31
Dmax(Å) 115 ± 5 116,20 118,20 108,63
Resolução (Å)
18
x/x2 - 1,3/1,7 1,5/2,3 2,1/4,4
5.1.4 Gráfico de Kratky e flexibilidade
Informações sobre a compactação global da enzima TpMan pode ser obtida
através de dados de SAXS utilizando-se o gráfico de Kratky (q2.I vs q.)
53-54 A figura 13
A mostra a curva para TpMan a 20 ºC (pH 6) que apresenta um máximo bem definido
(q < 0,15 Å-1
), entretanto, a curva não decai perto de zero em valores altos de q,
apresentando uma sutil linha de base elevada. Este resultado sugere que a TpMan deve
exibir algum grau de flexibilidade a 20 ºC e pH 6, provavelmente devido a flexibilidade
inerente entre os domínios. Os resultados para 50 ºC e pH 6, mostraram que a curva
apresenta também um máximo bem definido e uma diminuição sutil na linha de base
50
quando comparado com os resultados para a mesma enzima a 20 ºC (Figura 13 B).
Curiosamente, a 65 ºC e pH 6 (Figura 13 C) a curva para TpMan decai para zero para
elevados valores de q, sugerindo que a molécula é menos flexível em solução a 65 ºC
quando comparado com a mesma enzima a 20 ºC.
Figura 13. Figura 13. Gráfico de Kratky dos dados de SAXS para TpMan transformado como q2.I vs q. (A)
Medida a 20 °C (B) Medida a 50 °C (C) Medida a 65 °C.
51
5.1.5 Modelagem molecular por homologia
Um recente estudo reporta a estrutura cristalográfica do domínio catalítico 24
,
entretanto, até o momento, não existe uma estrutura tridimensional determinada por
métodos experimentais para TpMan intacta. Assim, para possibilitar a modelagem da
estrutura intacta, a estrutura tridimensional dos últimos 274 resíduos de aminoácidos da
enzima TpMan foi modelada a partir de ferramentas de bioinformática. Como ilustrado
na figura 14 e Tabela 3, ambos os métodos de threading utilizados (HHPRED e
PHYRE2) indicam dois domínios distintos. O domínio C-terminal (TpManCBM27)
possui alta identidade sequencial e confiabilidade, em ambos os programas utilizados,
quando comparados com CBM27 da enzima endo-β-1,4-mananase de Thermotoga
marítima (TmMan) (Tabela 3).
52
Modelos selecionados por HHPRED e PHYRE2 para os domino central e C-terminal
Domínio central
CATH 2.60.40 Topologia: imunoglobulina-like
SCOP b.1.2.1 Enovelamento: imunoglobulina-like beta-sanduíche
Super família: Fibronectin tipo III
PDBs 3TP4, 2X2Y, 2BVY, 2BVT HHPRED PHYRE2
Organismo Nome Score Ident % Prob E-value Conf Ident %
Celulomas fimi MAN26A 111.84 18 99,07 2,8 98,7 18
PDBs 3PE9, 3PDD, 3PDG
Organismo Nome HHPRED PHYRE2
Clostridium thermocelum Módulo X1 Score Ident % Prob E-value Conf Ident %
45,99 14 96,9 0,01 95,9 13
Domínio C-terminal
CATH 2.60.120.260 Topologia: imunoglobulina-like
SCOP b.18.1.18 Enovelamento: imunoglobulina-like beta-sanduíche
Super família: Fibronectin tipo III
PDBs 1OH4, 1OF3, 1OF4 HHPRED PHYRE2
Organismo Nome Score Ident % Prob E-value Conf Ident %
Thermotoga maritima MAN26A 111.84 18 99,07 2,8 98,7 18
PDBs
Organismo Nome HHPRED PHYRE2
Caldicelulosiruptor sacharoliticus Módulo X1 Score Ident % Prob E-value Conf Ident %
45,99 14 96,9 0,01 95,9 13
Tabela 3. Modelos selecionados pelos programas HHPRED e PHYRE2 para os dominios central e C-terminal
53
Portanto, TpManCBM27 foi diretamente modelado (figura 14) através da
estrutura cristalográfica resolvida 55
do CBM27 de TmMan que apresenta 88% de
identidade sequencial quando comparada com TpManCBM27. Entretanto, o domínio
central (linker) possui baixa identidade sequencial, em ambos os programas, quando
comparado com o domínio X1 da celobiohidrolase A de Clostridium thermocellum
(CbhA).56
Apesar dos resultados apresentarem baixos valores de identidade sequencial,
é evidente o alto nível de confiabilidade dos modelos selecionados (Tabela 3). Deste
modo, o domínio central foi modelado através da estrutura cristalográfica do domínio
X1 de CbhA (figura 14) que apresenta 14% de identidade sequencial e 97%
confiabilidade. O modelo molecular obtido para o domino central é estruturalmente
muito similar ao domínio immunoglobulin-like β-sandwich (Ig-like), portanto
adotaremos a nomenclatura TpManIg-like para este domínio.
Figura 14. Método de threading e modelagem molecular. Todos os modelos obtidos pelo método de
threading são de carboidrases de bactéria termofílica. O domínio central (TpManIg-like) foi diretamente
modelado pelo domínio X1 de CbhA. 27
TpManCBM27 foi diretamente modelado pelo CBM27 de
TmMan. 26
54
5.1.6 Espectroscopia por dicroísmo circular (CD)
A espectroscopia de dicroísmo circular (CD) foi usada para TpMan e TpManGH5
e avaliar seus enovelamentos em termos de estrutura secundária e realizar comparações
(figura 15). O espectro de CD para TpManGH5 coletado a 20 ºC (pH 6) é caracterizado
por ter uma banda positiva em 195 ± 1 nm e duas bandas negativas em 210 ± 1 nm e
220 ± 1 nm, e um cruzamento negativo para o positivo em 203 ± 1 nm (Figura 15 B).
Estas bandas são tipicamente encontradas em estruturas com grande quantidade de α-
hélice em sua estrutura secundária. Isto é diferente do observado para o espectro de CD
da TpMan, o qual não mostrou dois mínimos bem definidos. O espectro de CD para
TpMan coletado a pH 6 em três diferentes temperaturas são mostrados na figura 15 A.
Os dados indicam que a estrutura secundária da enzima não mudou significativamente
em resposta ao aumento de temperatura de 20 ºC para 85 ºC.
55
Figura 15. Espectroscopia dicroísmo circular. (A) Espectro de CD coletado para enzima TpMan a 20 ºC
(linha preta), 50 ºC (linha tracejada) e 85 ºC (linha cinza). (B) Espectro de CD para o TpManGH5 (linha
preta) e TpMan (linha cinza) a pH 6 a 20 ºC.
As porcentagens de α-hélice, folhas-β e coils (estruturas secundárias irregulares)
foram obtidas por deconvolução dos espetros experimentais usando quatro métodos
independentes e foi expresso como uma média e um desvio padrão. No caso do
TpManGH5, a deconvolução do espectro forneceu os seguintes valores médios para
56
estrutura secundária: 42 ± 4% α-hélice, 16 ± 2% folhas-β e 42 ± 5% coil (estruturas
irregulares) conforme tabela 4. Os resultados obtidos para TpMan foram: 21 ± 4% α-
hélice, 28 ± 3% folhas-β e 51 ± 5% coil (estruturas irregulares) (Tabela 4), indicando
um aumento do conteúdo de folhas-β e coil e uma redução na quantidade de α-hélice na
enzima completa.
Deconvolução do espectro de CD
Domínios α-hélice (%) Folhas-β (%) Coil (%)
TpManGH5 42 ± 4 16 ± 2 42 ± 5
TpMan 21 ± 4 28 ± 3 51 ± 5
Estrutura tridimensional**
Domínios α-hélice (%) Folhas-β (%) Coil (%)
TpManGH5 41 12 47
TpManIg-like 0 40 60
TpManCBM27 6 60 34
TpMan 25 29 46
Predição da estrutura secundária***
Domínios α-hélice (%) Folhas-β (%) Coil (%)
TpManGH5 31-40 11-17 45-57
TpManIg-like 0-9 42-51 43-57
TpManCBM27 0-11 36-60 34-65
TpMan 18-26 23-32 39-59
Tabela 4.Deconvolução do espectro de CD e predição da estrutura secundária
*As porcentagens de α-hélice, folhas-β e coils , foram obtidas por deconvolução do espectro
experimental usando quatro independentes métodos e expresso com um desvio médio
padrão.
**A estrutura secundária foi obtida da estrutura tridimensional do TpManGH5, TpManIg-like e
TpManCBM27.
***Os métodos computacionais comparados foram BALDIG, PHD, PSIPRED, e PORTER.
Os valores máximo e mínimo foram obtidos para cada tipo de estrutura secundária dada.
57
5.1.7 Métodos computacionais para predição da estrutura secundária
Os resultados de predição de estrutura secundária para a sequência completa da
TpMan (Gene Bank: ABQ47550.1) e seus domínios individuais são mostrados na
Tabela 4. Os resultados indicam que a TpMan é composta de porcentagens
aproximadamente iguais de estrutura secundária regular (α-hélice e folhas-β) e coil
(estruturas irregulares). A estrutura secundária regular do TpManGH5 é dominada por
α-hélice. Entretanto, a estrutura secundária regular para TpManCBM27 e TpManIg-like
são dominadas por folhas-β.
5.1.8 Método de otimização em conjunto (EOM)
Para entender melhor a flexibilidade sugerida pelo gráfico de Kratky, o método de
otimização em conjunto (EOM) foi empregado. 40
A distribuição dos valores de Rg e
Dmax das estruturas geradas pelo conjunto inicial e as distribuições das estruturas
selecionadas durante a otimização em conjunto são mostradas para 20, 50 e 65 ºC na
figura 16. As populações de estruturas selecionadas tornaram-se mais estreitas quando a
temperatura foi aumentada de 20 ºC para 65 ºC, sugerindo uma redução na flexibilidade
molecular com aumento da temperatura. A 20 ºC o Rg e o Dmax das estruturas
selecionadas durante o método de otimização estão centralizados o redor de 31 Å e 103
Å, respectivamente (Tabela 2). A 50 ºC o Rg e o Dmax das estruturas selecionadas são
centradas por volta de 33 Å e 105 Å, respectivamente. Finalmente, a 65 ºC o Rg e o Dmax
das estruturas selecionadas são centradas ao redor de 34 Å e 109 Å, respectivamente.
58
Figura 16. Modelagem por EOM. (A) As linhas tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas
pelo programa por dados experimentais de SAXS a 20ºC, enquanto as linhas sólidas são as distribuições
finais de parâmetros estruturais por modelos selecionados pelo método de otimização em conjunto
(EOM). 28
(B) As linhas tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas pelo programa por dados
experimentais de SAXS a 50ºC, enquanto as linhas sólidas são as distribuições finais de parâmetros
estruturais por modelos selecionados pelo método de otimização em conjunto (EOM). 28
(C) As linhas
tracejadas são as distribuições (Rg e Dmax) produzidas pelo programa por dados experimentais de SAXS a
65ºC, enquanto as linhas sólidas são as distribuições finais de parâmetros estruturais por modelos
selecionados pelo método de otimização em conjunto (EOM). 28
59
Os resultados de EOM indicam que a TpMan torna-se mais alongadas e menos
flexível quando a temperatura aumenta de 20 para 65 ºC. Os ajustes dos perfis
determinados pelo processo de modelagem de otimização em conjunto (EOM) são
mostrados na figura 17. A figura 18 mostra a estrutura com mais alta frequência na
população otimizada a 20 ºC sobreposta a nuvem de modelos. Foram considerados os
modelos que cobriram 80% do intervalo de frequência.
Figura 17. Ajuste para RBM e EOM. (A) Curvas experimentais de SAXS para TpMan a 20 ºC (circulo
aberto), 50 ºC (triângulos abertos) e 65 ºC (quadrados abertos) sobreposto as curvas de espalhamento
baseado no modelo de corpo rígido (RBMs, linha sólida). (B) Ajuste (linha sólida) do melhor perfil
determinado pela modelagem de EOM dos dados de SAXS a pH 6 e 20 ºC (círculos abertos), 50 ºC
(triângulos abertos) e 65 ºC (quadrados abertos).
60
Figura 18. Modelo de EOM. Modelo selecionado (cartoon) que obteve a mais alta frequência na
população otimizada sobreposta na nuvem de modelos. A estrutura mostrada esta rotacionada 90º sobre o
eixo longitudinal do modelo para produzir duas orientações.
5.1.9 Modelo de corpo rígido (RBM)
O programa CORAL 38
foi usado para realizar a modelagem de corpo rígido das
estruturas tridimensionais baseada nas curvas experimentais de SAXS obtida em
diferentes temperaturas. As estruturas tridimensionais do TpManGH5, TpManIg-like e
TpManCBM27 foram organizadas e suas posições e orientações relativas foram
otimizadas utilizando o programa CORAL. Como resultado o arranjo tridimensional dos
domínios forneceu o melhor ajuste para os dados experimentais de SAXS. O ajuste dos
perfis determinados por modelagem de corpo rígido são mostrados na figura 17 para as
temperaturas 20, 50 e 65 ºC. O modelo de corpo rígido (RBM) obtido a 20 ºC mostra
61
uma partícula com um Dmax de 104,70 Å e Rg = 32,30 Å. O RBM obtido a 50ºC mostra
uma partícula com um Dmax de 111,20 Å e Rg = 33,99 Å. Finalmente, o RBM obtido a
65ºC mostra uma partícula com um Dmax de 118,20 Å e Rg = 34,95 Å. A sobreposição
dos modelos de baixa resolução (DAMs) obtidos em diferentes temperaturas e os
respectivos modelos de corpo rígido (RBM) mostraram concordância (Figura 12). Além
disso, a sobreposição do modelo de mais alta frequência obtido por EOM e o RBM,
ambos obtidos a 20ºC e pH 6, estão também em concordância (Figura 19).
Figura 19. Modelo de mais alta frequência (EOM) e modelo de corpo rígido (RBM). Sobreposição do
modelo EOM (azul claro, verde claro e rosa) e RBM obtido utilizando o programa CORAL (azul escuro,
verde escuro e vermelho).
62
5.2. Discussão
Proteínas modulares em que os domínios globulares são conectados por linkers
são comumente encontradas na natureza. 57
É reconhecido que um grande número de
carboidrases bacterianas e fúngicas são compostas de um domínio catalítico e um
módulo de ligação ao carboidrato conectados por um linker. 58
Um recente estudo
relatou que a enzima TpMan tem uma estrutura modular, com um domínio catalítico e
um domínio de ligação ao carboidrato conectados por um longo linker (considerando-se
o grande número de aminoácidos). 24
Ainda, neste mesmo estudo foi apresentada a
estrutura cristalográfica do domínio catalítico a 1,5 Å de resolução, no entanto, não foi
possível a cristalização da enzima TpMan intacta, provavelmente devido à flexibilidade
inerente entre os domínios. 16
No presente estudo, a enzima TpMan intacta e seu
domínio catalítico isolado (TpManGH5), foram analisados por meio de técnicas
biofísicas e ferramentas de bioinformática. Os resultados apresentados neste trabalho
forneceram a caracterização da estrutura global da enzima TpMan e também a
influência do linker e da temperatura sobre a conformação estrutural e flexibilidade
desta enzima hipertermoestável.
5.2.1 Dimensão e forma da enzima TpMan da bactéria hipertermoestável
Thermotoga petrophila a 20 ºC
O valor calculado para o raio de giro da TpMan através da região de Guinier
(Rg=32 ± 1 Å) é muito próximo do valor obtido pela análise integral da curva de
espalhamento (Rg = 32,50 ± 0,14 Å) utilizando a metodologia implementada no
programa GNOM (Figura 11). Além disso, a reconstrução do envelope da TpMan
restaurado a 18 Å de resolução mostra uma partícula alongada com um Dmax de 103,9 Å
e Rg = 32,97 Å (figura 12). O raio hidrodinâmico obtido por DLS (RS = 36 ± 2 Å) é
63
consistente com o RS determinado para o modelo de baixa resolução da enzima TpMan
(RS = 38,3 Å) calculado a partir do programa HYDROPRO. 59
O modelo de baixa
resolução obtido através da técnica de SAXS indica uma estrutura monomérica
alongada em forma de L. Os valores para os raios de giro e dimensão máxima obtidos
para TpMan indicam que a dimensão do linker não é muito grande quando comparado
com sua massa. Portanto, nossos resultados sugerem a presença de um linker com uma
estrutura compacta e capaz de ocupar um pequeno volume mesmo considerando seu
grande número de resíduos de aminoácidos. Embora o envelope molecular apresentado
tenha uma resolução limitada, esta é a primeira visualização da estrutura intacta da
TpMan já reportada até o momento.
5.2.2 Modelo molecular por homologia para o linker
O modelo de baixa resolução obtido através das análises de SAXS para TpMan
indica que o linker tem uma estrutura compacta. Para investigar esta hipótese, foram
realizado estudos adicionais empregando-se a metodologia de threading e modelagem
molecular. Todos os modelos identificados pelos programas HHPRED e PHYRE2 são
de enzimas carboidrases de bactérias termofílicas. O domínio central (linker) apresenta
baixa identidade sequencial quando comparado com os modelos selecionados (Tabela
3). Entretanto, existe alto nível de confiabilidade dos modelos selecionados.
TpManCBM27 foi diretamente modelado usando como molde o domínio de ligação ao
carboidrato (CBM27) de TmMan 55
, o qual apresenta alta identidade sequencial e
confiabilidade (Tabela 3). Contudo, um modelo molecular consistente para o
TpManCBM27 pode ser também diretamente modelado usando-se um molde de baixa
identidade sequencial mas alta confiabilidade, como o domínio de ligação ao
carboidrato (CBM27) da bactéria Caldicellulosiruptor saccharolyticus. Assim,
64
similarmente foi possível obter um modelo molecular consistente para o domínio central
da enzima TpMan utilizando como molde o domínio X1 de CbhA 56
(Figura 14).
A região central (linker) da enzima TpMan é um domínio de função biológica
desconhecida. 55
O modelo molecular obtido para o domínio central é estruturalmente
muito similar ao domínio immunoglobulin-like-β-sandwich (Ig-like). Há evidências que
estas estruturas são apenas uma “forma de armazenamento” ou que tenha função de
conectar os domínios das enzimas que podem se estender quando necessário. 56
Alternativamente, eles podem simplesmente funcionar como espaçadores entre os
domínios. No caso do módulo X1 de CbhA foi proposto que um possível papel é a
termoestabilidade estrutural do complexo enzimático da CbhA. 56
No caso da enzima
TpMan, a deleção do linker mais o módulo de ligação ao carboidrato (TpManCBM27)
reduz a estabilidade térmica do TpManGH5 (Figura 9), e dados enzimáticos revelam
que o TpManGH5 sozinha perde significativamente mais a atividade catalítica a altas
temperaturas quando comparando com a TpMan intacta (Figura 7). Portanto, um
possível papel do domínio central é o aumento da estabilidade térmica da proteína
completa como proposto para o complexo CbhA. 56
5.2.3 Estrutura secundária dos domínios estruturais da enzima TpMan
A inspeção visual do espectro de CD do TpManGH5 indicou a presença de
estrutura secundária do tipo α-hélice que é evidenciado por elipticidades negativas ao
redor de 210 e 220 nm (Figura 15 B). A deconvolução dos espectros empregrando-se
quatro diferentes algoritmos resultou nos seguintes valores médios para a estrutura
secundária: 42 ± 4% α-hélice, 16 ± 2% folhas-β, e 42 ± 5% de coil (estrutura secundária
irregular). Por comparação, os resultados de deconvolução apresentam boa
65
correspondência com a estrutura cristalográfica do TpManGH5 (41% α-hélice, 12%
folhas-β, e 47% coil). 24
Como pode ser visto na figura 19, o espetro de CD para TpMan não mostra dois
mínimos bem definidos, mostrando um aumento nas elipticidades negativas entre 210 e
220 nm. Estas diferenças são sugestivas de um considerável aumento no conteúdo de
folhas-β para TpMan quando comparado com o TpManGH5, e esta diferença pode ser
apenas atribuída ao complexo TpManCBM27 e TpManIg-like. Isto é refletido por um
aumento do conteúdo de folhas-β de 16 a 28% na deconvolução (Tabela 4). Isto foi
prontamente confirmado através da análise dos modelos moleculares gerados para os
domínios TpManCBM27 e TpManIg (figura 14). O modelo molecular gerado para
TpManIg-like contém 40% folhas-β e 34% coil, e o modelo molecular para
TpManCBM27 contém 6% α-hélice, 60% folhas-β, e 34% coil, consistente com os
resultados de predição de estrutura secundária (Tabela 4). Quando considerados em
conjunto, TpManGH5, TpManIg-like e TpManCBM27 apresentam as seguintes
porcentagens de estruturas secundárias: 25% α-hélice, 29% folhas-β, e 46% coil, as
quais são totalmente consistentes com os resultados de deconvolução do espectro
experimental (Tabela 4).
5.2.4 Gráfico de Kratky sugere que a enzima TpMan apresenta algum nível de
flexibilidade a 20 ºC
Para um sistema com forma compacta, o gráfico de Kratky mostra uma curva
com forma de sino, onde uma porção inicial com valores crescentes é seguida por uma
descida acentuada formando um máximo bem definido. 53
No entanto, para um
polímero com uma conformação alongada ou conformações random coil (aleatória) a
curva esperada aumenta para grandes valores de q não apresentado um máximo bem
66
definido. 23
Moléculas com regiões compactas conectadas por linkers flexíveis podem
apresentar as duas características, um máximo bem definido seguido por regiões de
platô. A alta da região do platô é uma indicação do grau de flexibilidade molecular.
Assim, podemos utilizar o comportamento do gráfico de Kratky para avaliar
qualitativamente o grau de flexibilidade. 23
O gráfico de Kratky, na figura 13 A, mostra que a curva para a TpMan, em pH 6
a 20ºC, tem um máximo bem definido (q < 0,15 Å-1
), contudo apresenta uma leve
elevação da linha de base para valores grandes de q (q > 0,15 Å-1
). Este comportamento
para q > 0,15 Å-1
sugere que TpMan apresenta algum nível de flexibilidade molecular
intrínseca. Devido à sua arquitetura, as proteínas modulares podem muitas vezes adotar
diversas conformações em solução. O método de otimização em conjunto (EOM)
representa uma excelente estratégia para identificar movimentos entre os domínios
inequivocamente. 40
Assim, para investigar a hipótese de que a enzima TpMan apresenta
algum nível de flexibilidade em solução a 20ºC, foram realizados estudos adicionais
empregando modelagem por EOM. O Rg e Dmáx das estruturas selecionadas durante a
otimização em conjunto estão centradas em torno de 31 Å e 103 Å, respectivamente
(figura 16 A).
Os resultados obtidos usando EOM (em pH 6 a 20ºC) são consistentes com um
modelo no qual a enzima TpMan adota um conjunto de conformações limitadas
representadas pela nuvem de modelos na figura 18. Na figura 19 também pode ser visto
a estrutura com mais alta frequência na população otimizada.
5.2.5 Modelo tridimensional para a enzima TpMan intacta a 20 ºC
A modelagem de corpo rígido foi realizado para construir um modelo para a
enzima TpMan intacta pelo ajuste da curva de espalhamento experimental. As estruturas
67
tridimensionais do TpManGH5, TpManIg-like e TpManCBM27 foram organizadas em
suas posições e orientações relativas foram otimizadas. Os ajustes de corpo rígido das
estruturas tridimensionais resultaram em um excelente ajuste das curvas experimentais
de SAXS (Figura 17 A). A sobreposição do modelo de baixa resolução obtido por
SAXS e o modelo de corpo rígido (RBM) para TpMan, ambos obtidos a 20ºC a pH 6,
mostram uma excelente correspondência (figura 12 B) e é visivelmente claro que o
modelo da enzima TpMan obtido por SAXS é compatível com um monômero composto
de três domínios distintos. O modelo de corpo rígido construído mostra que TpManGH5
e TpManCBM27 ocupam as extremidades opostas do envelope molecular, enquanto
TpManIg-like ocupa a região central. Finalmente, a sobreposição do modelo de alta
frequência (EOM) com o modelo de corpo rígido obtido utilizando-se o programa
CORAL indicou que os resultados estão em excelente concordância (figura 19). Isto
indica que, embora a enzima intacta tenha algum grau de flexibilidade a 20ºC, pode
haver uma conformação preferível, o qual pode ser descrita pelo procedimento de
modelagem de corpo rígido.
5.2.6 SAXS revela que mudanças conformacionais na enzima TpMan é dependente
da temperatura
Para uma melhor compreensão da bioquímica e biofísica do processo de mudança
conformacional da TpMan como também a função da temperatura são muito
importantes para estudar a relação entre a estrutura, estabilidade, flexibilidade e
atividade enzimática da TpMan. Pouco se sabe sobre o quanto a mobilidade molecular
do domínio de ligação ao carboidrato com respeito ao domínio catalítico se correlaciona
com a atividade enzimática. Parece lógico assumir que mudanças na conexão entre
TpManCBM27 e TpManGH5 podem influenciar o acesso dos polissacarídeos no sitio
68
ativo da enzima e portanto ter um impacto sobre a atividade enzimática. No caso do
CBM27 de TmMan, foi proposto que a hidrólise de polissacarídeos é aumentada através
do direcionamento do substrato por meio do domínio de ligação. 55
O estudo de SAXS apresentado aqui, demonstra que a enzima TpMan sofre uma
transição dirigida pela temperatura através de estados conformacionais (Figura 11 e 12)
sem uma disrupção significativa da estrutura secundária (Figura 15), proporcionando
uma nova visão sobre a função da enzima. O aumento na separação média entre
TpManGH5 e TpManCBM27, com o aumento da temperatura de 20ºC para 65ºC é
relativamente sutil, mas pode ser visto nos dados e modelos nas figuras 11,12 e 16. Este
resultado indicou que o linker no caso da TpMan pode otimizar a geometria entre os
outros dois domínios em relação ao substrato a altas temperaturas.
69
6. Conclusões
O presente estudo estabeleceu um modelo composto de três domínios para a
enzima TpMan em solução, combinando dados de SAXS e modelagem com o
conhecimento das estruturas tridimensionais para cada domínio individual. Os nossos
resultados forneceram as conformações (modelo de baixa resolução) em solução da
enzima TpMan intacta como também o efeito do comprimento e flexibilidade do linker
sobre o arranjo espacial dos domínios constitutivos. Foi demonstrado que o linker ocupa
um pequeno volume em relação ao seu grande número de aminoácidos. Além disso, os
resultados também indicam que o linker é um domínio compacto e estruturalmente
muito semelhante ao domínio immunoglobulin-like β-sandwich. A 20ºC, apesar de a
enzima TpMan completa apresentar algum grau de flexibilidade, existe uma
conformação preferível, a qual pode ser descrita pelo procedimento de modelagem de
corpo rígido. Além disso, TpMan sofre uma transição dirigida pela temperatura entre
estados conformacionais sem a disrupção significativa de sua estrutura secundária.
Finalmente, os resultados de EOM indicam que TpMan torna-se mais alongada e menos
flexível quando a temperatura aumenta de 20ºC para 65ºC. Analisados em conjunto, os
resultados indicam que o linker no caso da TpMan pode otimizar a geometria entre os
outros dois domínios com respeito ao substrato a altas temperaturas.
Baseado em nossas observações, defendemos que o linker é muito importante para
garantir condições ótimas para atividade enzimática da TpMan devido a pelo menos três
fatores:
i) Termoestabilização da enzima completa;
ii) Adequado grau de flexibilidade molecular entre os domínios estruturais;
iii) Otimização da geometria entre os outros domínios com respeito ao
substrato a altas temperaturas.
70
Por fim, estes estudos proporcionarão bases úteis para futuros estudos biofísicos e
bioquímicos da enzima TpMan completa.
71
7. Perspectivas futuras
7.1 Determinar a estrutura tridimensional do domínio central (linker) da
enzima TpMan.
Conforme nosso trabalho publicado recentemente, o linker da enzima endo-1,4-
β-mananase da bactéria hipertemófila Thermotoga petrphila (TpMan) é um domínio
compacto e estruturalmente muito similar ao domínio imunoglobulina β-sanduiche.
Assim, como o primeiro objetivo deste projeto de pesquisa, será determinar a estrutura
tridimensional do linker da enzima TpMan através de cristalografia de raios-X. Também
é importante salientar que o domínio central (linker) da enzima TpMan apresenta apenas
14% de identidade sequencial quando comparado com proteínas disponíveis no PDB
(Protein Data Bank).
7.2 Comprovar que o linker da TpMan pode termoestabilizar a enzima
completa.
A região central (linker) da enzima TpMan é um domínio compacto de função
biológica desconhecida. O modelo molecular obtido para o linker é estruturalmente
muito similar ao domínio imunoglobulina β-sanduiche. No caso da enzima
celobiohidrolase de Clostridium thermocellum foi proposto que um possível papel de
um domínio similar (imunoglobulina β-sanduiche) foi estabilizar termicamente a
enzima completa [2]. No caso da enzima TpMan, a deleção do linker mais o domínio
CBM27 reduz a termoestabilidade do domínio catalítico GH5. A figura 7 mostra dados
de atividade enzimática onde o domínio catalítico (TpManGH5) perde
significativamente mais atividade catalítica do que a enzima completa (TpMan) a
elevadas temperaturas. Assim, como perspectivas para o futuro projeto de pesquisa para
doutorado é comprovar que o domínio central (linker) atua como um elemento
termoestabilizador da enzima completa.
72
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ANEXO