Univerzita Palackého v Olomouci
Diplomová práce
Olomouc 2013 Bc. Dita Badalová
Univerzita Palackého v Olomouci
Přírodovědecká fakulta
Katedra buněčné biologie a genetiky
Analýza cukerné komponenty rekombinantního
gp120 proteinu pomocí průtokové cytometrie
s využitím fluorescenčních mikropartikulí a sady
vybraných lektinů
Diplomová práce
Bc. Dita Badalová
Studijní program: Biologie
Studijní obor: Molekulární a buněčná biologie
Forma studia: Prezenční
Olomouc 2013 Vedoucí práce: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.
Bibliografická identifikace:
Jméno a příjmení autora: Dita Badalová
Název práce: Analýza cukerné komponenty rekombinantního gp120 proteinu pomocí
průtokové cytometrie s využitím fluorescenčních mikropartikulí a sady
vybraných lektinů
Typ práce: diplomová
Pracoviště: Ústav imunologie, Lékařská fakulta, Olomouc
Vedoucí práce: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.
Rok obhajoby práce: 2013
Abstrakt: Diplomová práce byla zaměřena na analýzu cukerné komponenty
rekombinantního
glykoproteinu gp120 metodou průtokové cytometrie s využitím fluorescenčně
značených mikrosfér. Cukerná komponenta imobilizovaného gp120 byla
analyzována pomocí tří lektinů s odlišnou glykanovou specifitou: AAL, GNL,
PHA-L. Po nalezení optimální koncentrace lektinů byla studována změna
Reaktivity vybraných lektinů s gp120 před a po ošetřením enzymem PNGasa F.
Klíčová slova: gp120, glykany, Aleuria aurantia lektin (AAL), Galanthus nivalis lektin
(GNL), Phaseolus vulgaris leukoaglutinin (PHA-L), průtoková cytometrie,
fluorescenčně značené mikrosféry
Počet stran: 72
Počet příloh: 0
Jazyk: český
Bibliographical identification:
Author’s first name and surname: Dita Badalová
Title: The flow cytometry analysis of oligosaccharide moiety of recombinant gp120
protein
adsorbed on fluorescent microparticles using set of selected lectins
Type of thesis: master
Department: Department of Immunology, Faculty of Medicine, Olomouc
Supervisor: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.
The year of presentation: 2013
Abstract: This thesis was focused on the analysis of oligosaccharide moiety
of recombinant gp120 protein by flow cytometry using fluorescently labeled
microspheres. A sugar component of immobilized gp120 was analyzed using
three lectins with different glycan specificity: AAL GNL, PHA-L. After finding
the optimal concentration of lectins,there were studied the changes of the
reactivity of selected lectins with gp120 before and after treatment with the
enzyme PNGasa F.
Keywords: gp120, glycans, Aleuria aurantia lectin (AAL), Galanthus nivalis lectin
(GNL) Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L), flow cytometry,
fluorescently labeled microspheres
Number of pages: 72
Number of appendices: 0
Language: czech
Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala sama a že uvádím veškerou
použitou literaturu.
V Olomouci dne 3.5.2013 ................................................
Ráda bych poděkovala mému vedoucímu, panu Doc. MUDr. Mgr. Milanu Raškovi, Ph.D.,
a pracovnímu kolektivu na Ústavu imunologie LF za jejich cenné rady. Dále bych ráda
poděkovala Studentské grantové soutěži na Univerzitě Palackého v Olomouci
(2012 - 2013) LF_2012_011, za materiální podporu ve studiu.
SOUHRN
Syndrom získané imunodeficience (AIDS), patří k jednomu z nejrozšířenějších
onemocnění na světě. Jedná se o fatální virové onemocnění, jehož původcem je virus
lidské imunodeficience (HIV). V současnosti již existují medikamenty, které dokáží
významně prodloužit život HIV infikovaných pacientů. Bohužel, dosud nebyl nalezen lék,
který by umožnil jejich úplné uzdravení. Proto, ale také z důvodu finanční náročnosti
dostupné léčby, probíhá intenzivní výzkum usilující o vývoj HIV vakcíny, sloužící jako
prevence šíření HIV viru.
Konstrukce efektivní vakcíny je závislá na znalosti virových komponent a jejich vlivu
na proces infekce. Glykoprotein gp120, který společně s glykoproteinem gp41 vytváří
obalový protein Env, se jeví jako slibný adept pro sestrojení účinné vakcíny založené
na indukci neutralizačních protilátek. Pro vytvoření funkční vakcíny je však nezbytné
nalézt vhodnou variantu Env antigenu, indukujícího tvorbu účinných neutralizačních
protilátek.
V této diplomové práci byla zavedena metoda analýzy gp120 proteinů, imobilizovaných
na fluorescenčně značené polystyrenové mikrosféry, které umožní charakterizovat některé
vlastnosti gp120 pomocí průtokové cytometrie. Hlavním cílem diplomové práce byla
analýza cukerné komponenty rekombinantního glykoproteinu gp120 pomocí lektinů
z Aleuria aurantia (AAL), Galanthus nivalis (GNL) a Phaseolus vulgaris (PHA-L).
SUMMARY:
Acquired immune deficiency syndrom (AIDS) belongs to one of the most frequent cause
of the death worlwide. It is a disease caused by the human immunodeficiency virus (HIV).
At present there are drugs that can significantly extend survival of HIV-1-infected patients.
Unfortunately, full recovery of patients was not still achieved. Therefore extensive
research is focused on development of a prophylactic vaccine that would prevent spreading
of the HIV virus.
The design of an effective vaccine depends on the knowledge of viral biology
and structural components and their involvement in the course of infection. The viral
envelope glycoprotein Env consists of trimers of gp120 plus p41 subunites. Env appears
to be a promising candidate for construction of an effective vaccine. To create a functional
Env-based vaccine, it is necessary to identify an appropriate Env variant, which could
induce effective neutralizing antibodies.
In this thesis, a method analyzing glycosylation of gp120 protein was introduced. It
is based on immobilization of gp120 on fluorescently labeled polystyrene microspheres
followed by determination of gp120 reactivity with selected lectins using flow cytometry.
The main aim of the thesis was to analyze oligosaccharide components of recombinant
gp120 using lectins Aleuria aurantia lectin (AAL), Galanthus nivalis lectin (GNL),
and leukoagglutinin from Phaseolus vulgaris (PHA-L).
OBSAH
1 ÚVOD .............................................................................................................................. 11
2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY ..................................................... 12
2.1 VIRUS LIDSKÉ IMUNODEFICIENCE
(HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS; HIV) .................................................................... 12
2.1.1 GENOM VIRU HIV ....................................................................................................... 14 2.1.2 BUNĚČNÝ TROPIZMUS HIV VIRU .......................................................................... 15 2.1.3 SYNDROM ZÍSKANÉ IMUNODEFICIENCE
(ACQUIRED IMMUNE DEFICIENCY SYNDROM; AIDS) ............................................... 17 2.1.3.1. PRŮBĚH CHOROBY ................................................................................................ 17 2.1.4 ANTI-RETROVIRÁLNÍ TERAPIE .............................................................................. 18
2.2 OBALOVÝ GLYKOPROTEIN gp120 ................................................................................. 20
2.2.1. STRUKTURA gp120 .................................................................................................... 20 2.2.1.2 V3 OBLAST ............................................................................................................... 22 2.2.1.3 GLYKOSYLACE GP120............................................................................................ 23 2.2.2 IN VITRO EXPRESE gp120........................................................................................... 25
2.3 ANALÝZA GLYKOPROTEINŮ POMOCÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE ..................... 28
2.3.1 PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE ..................................................................................... 28 2.3.1.1 SLOŽENÍ PRŮTOKOVÉHO CYTOMETRU ............................................................ 28 2.3.1.2 PRINCIP PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE .................................................................. 29 2.3.1.3 ANALYZOVANÉ PARAMETRY ............................................................................. 30 2.3.1.4 VÝHODY A NEVÝHODY PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE, JEJÍ APLIKACE ....... 32 2.3.2 LEKTINY ....................................................................................................................... 33
3 CÍLE PRÁCE .................................................................................................................. 35
4 MATERIÁL A METODIKA ......................................................................................... 36
4.1 BIOLOGICKÝ MATERIÁL ................................................................................................. 36
4.1.1 GLYKOPROTEIN gp120 .............................................................................................. 36 4.1.2 LEKTINY ....................................................................................................................... 36 4.1.3 OSTATNÍ BIOLOGICKÝ MATERIÁL ........................................................................ 37
4.2 ROZTOKY A CHEMIKÁLIE ............................................................................................... 37
4.3 MIKROSFÉRY ...................................................................................................................... 38
4.4 LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ .................................................................... 39
4.5 PŘÍPRAVA MIKROPARTIKULÍ S KONJUGOAVNÝM REKOMBINANTNÍM gp120
PROTEINEM NAVÁZANÝM PŘES pentaHIS PROTILÁTKU (1000 μl SUSPENZE) .......... 40
4.5.1 PŘÍPRAVA MIKROSFÉR............................................................................................. 40 4.5.2 MODIFIKACE pentaHIS PROTILÁTKY ..................................................................... 40 4.5.3 VÝMĚNA PUFRU PRO ODSTRANĚNÍ NEZREAGOVANÝCH KOMPONENT ... 40 4.5.4 VAZBA pentaHIS PROTILÁTKY NA MIKROPARTIKULE ..................................... 41 4.5.5 NAVÁZÁNÍ REKOMBINANTNÍHO gp120 PROTEINU
NA MIKROSFÉRY AKTIVOVANÉ pentaHIS PROTILÁTKOU ........................................ 41
4.6 OPTIMALIZACE ŘEDĚNÍ LEKTINŮ A CHARAKTERIZACE JEJICH REAKTIVITY
S gp120 PROTEINEM ................................................................................................................ 42
4.7 DEGLYKOSYLACE gp120 PROTEINU VÁZANÉHO NA MIKROSFÉRY POMOCÍ
PNGasy F ..................................................................................................................................... 45
5 VÝSLEDKY .................................................................................................................... 46
5.1 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEKTINU
ALEURIA AURANTIA (AAL) .................................................................................................. 49
5.1.1 ANALÝZA REAKTIVITY AAL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM
(293T, RD) .............................................................................................................................. 49 5.1.2 ANALÝZA REAKTIVITY AAL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM
(293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F ............................................... 51
5.2 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEKTINU
GALANTHUS NIVALIS (GNL) ................................................................................................ 53
5.2.1 ANALÝZA REAKTIVITY GNL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM
(293T, RD) .............................................................................................................................. 53 5.2.2 ANALÝZA REAKTIVITY GNL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM
(293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F ............................................... 55
5.3 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ
LEUKOAGLUTININU Z PHASEOLUS VULGARIS (PHA-L) ............................................... 57
5.3.1 ANALÝZA REAKTIVITY PHA-L S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM
(293T, RD) .............................................................................................................................. 57 5.3.2 ANALÝZA REAKTIVITY PHA-L S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM
(293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F ............................................... 59
6 DISKUZE ........................................................................................................................ 61
7 ZÁVĚR ............................................................................................................................ 65
8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .......................................................................... 66
9 SEZNAM ZKRATEK .................................................................................................... 72
11
1 ÚVOD
Od objevení viru lidské imunodeficience (HIV), uplynulo třicet let. Za tuto krátkou
dobu si onemocnění vyvolané HIV virem, zvané AIDS, vybralo asi třicet milionů lidských
životů. V současnosti je na naší planetě nakaženo asi třicet čtyři milionů lidí a asi osm tisíc
lidí se každodenně HIV virem nově infikuje (UNAIDS, 2012). Přestože jsou v dnešní době
známa léčiva, která dočasně oddálí rozvoj stádia AIDS u HIV pozitivních pacientů, dosud
není známa vakcína, která by předcházela vzniku infekce (Levinson a kol., 2006).
AIDS je choroba rozšířená po celém světě a její léčba je vysoce finančně náročná.
Proto je nalezení účinné vakcíny velmi důležité. Přes všechny snahy se však doposud
nepodařilo najít účinnou a bezpečnou vakcínu. Důležitým krokem při konstrukci úspěšné
vakcíny je nalezení vhodného imunogenu, který bude indukovat tvorbu účinných
neutralizujících protilátek a efektivní buněčnou obranu. Jedním z virových proteinů, který
bude ve vakcíně obsažen je glykoprotein Env nebo jeho podjednotka gp120 (Mascola
a Montefiori, 2010).
Glykoprotein gp120 vytváří společně s glykoproteinem gp41 obalový protein HIV viru
(Env), prostřednictvím kterého dochází k vazbě HIV na receptory a ko-receptory
hostitelské buňky. Gp120 je tedy důležitým proteinem, umožňujícím vstup HIV do buňky
(Janeway a kol., 1999). Gp120 je silně glykosylovaný. Asi polovinu molekulové hmotnosti
glykoproteinu gp120 vytváří N-vázané glykany. Glykosylace gp120 významně ovlivňuje
jeho antigenicitu i imunogenicitu, a proto se stává předmětem mnoha studií (Go a kol.,
2008; Kong a kol., 2010; Leonard a kol., 1990; Raška a kol., 2010).
Tato diplomová práce je zaměřena na analýzu cukerné komponenty glykoproteinu
gp120 navázaného na fluorescenčně značené mikrosféry pomocí průtokové cytometrie.
Výhodou použité metody je zachování nativní konformace analyzovaného proteinu, díky
čemuž se studie interakcí gp120 více přibližují podmínkám in vivo.
12
2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
2.1 VIRUS LIDSKÉ IMUNODEFICIENCE (HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS; HIV)
Virus lidské imunodeficience (human immunodeficiency virus, HIV) spadá do čeledi
Retroviridae, podčeledi Lentivirinae. Podčeleď Lentivirinae zahrnuje kromě virů Visna,
Maedi, virů imunologické nedostatečnosti opic (SIV) a virů imunologické nedostatečnosti
koček (FIV), také dva typy viru HIV, HIV-1 a HIV-2. Jedná se o výrazně antigenně
a biologicky odlišné typy HIV viru. Infekce virem HIV setrvává dlouhodobě v latentním
stádiu, po kterém dojde k její aktivaci. Aktivace infekce vede k cytopatickému efektu a lýzi
napadené buňky (Bednář a kol., 1996).
Původ HIV-1 je odvozen od viru SIV, který infikoval několik geograficky izolovaných
šimpanzích populací v jižním Kamerunu. SIV byl pravděpodobně přenesen z šimpanze
na člověka, a to krevní cestou. Fylogenetická analýza HIV-1 prokázala, že tři na sobě
nezávislé přenosy na počátku dvacátého století daly vznik třem skupinám viru HIV-1,
a to hlavní (major; M), vedlejší (outlier; O) a ne-hlavní (nonmajor; nonoutlier; N) skupině
(Taylor a kol., 2008). Nejrozšířenější skupina mezi infikovanými jedinci, skupina M, je
dále členěna na subtypy (A-K). V Americe, Asii, Austrálii a Evropě převládá infekce
subtypem B, zatímco v Africe jsou rozšířeny především subtypy A, C, D a E (Janini a kol.,
1998). Jednotlivé subtypy viru HIV se vyznačují rozdílnými charakteristikami
a interakcemi s hostitelskými buňkami. Odlišné vlastnosti virových subtypů zapříčiňují
rozlišnou účinnost přenosu HIV viru a průběh onemocnění (Taylor a kol, 2008).
Z morfologického hlediska patří HIV mezi obalené viry. Velikost virové částice
se pohybuje v rozmezí od 100 nm do 120 nm. Na povrchu virionu se nachází lipidový obal,
který virus získává z membrány hostitelské buňky během pučení. V lipidovém obalu je
ukotven obalový protein Env tvořený trimerem podjedntotek gp120 a gp41. Pod lipidovým
obalem se nachází membránový protein p18. Nukleoid je ohraničen zevní kapsidou,
tvořenou proteinem p24. Vnitřní, helikoidální kapsida, je tvořena polypeptidy p7 a p9,
které se váží na virovou nukleovou kyselinu. Genom HIV viru sestává ze dvou identických
vláken RNA, s pozitivní polaritou. Genom viru, polypeptidy p7 a p9, virové enzymy
integráza (p32), reverzní transkriptáza (p66, p51) a proteáza (p12) a další proteiny, vytváří
13
tzv. dřeň nukleokapsidu (Bednář a kol., 1996). Schéma HIV viru je uvedeno
na obrázku č. 1.
Obrázek č. 1: Morfologie HIV viru
(Upraveno podle Rubbert a kol., 2011)
Přenos viru z jedince na jedince je zprostředkován krevní cestou, spermatem,
vaginálním sekretem a mateřským mlékem. V populaci se HIV nejčastěji šíří pohlavním
stykem, méně frekventní cestu přenosu představují kontaminované injekční jehly, krevní
transfúze, či transplacentární nebo perinatální přenos z matky na dítě. V těle jedince jsou
následně virem HIV infikovány CD4+ T-lymfocyty a makrofágy (Krejsek a Kopecký.,
2004).
14
2.1.1 GENOM VIRU HIV
Jak již bylo uvedeno, genom viru HIV je tvořen dvěma jednořetězcovými molekulami
RNA s pozitivní orientací, které jsou vzájemně spojeny vodíkovou vazbou. Genom HIV
nese tři typické retrovirální strukturní geny (gag, pol a env) a dále šest genů regulačních
(tat, rev, nef, vif, vpr a vpu). Zmíněné geny jsou ohraničeny dlouhými koncovými
repeticemi (long terminal repeats; LTR), které umožňují integraci virové nukleové
kyseliny do genomu hostitelské buňky (Janeway a kol., 1999).
Gen gag kóduje proteiny vnitřního jádra, mezi něž patří proteiny p24, p17, p7 a p6
(Greene, 1991). Detekce protilátek vůči antigenu p24, gp41 a gp120 nebo gp160
při sérologických testech poukazuje na expozici testovaného jedince HIV (Krejsek
a Kopecký, 2004).
Mezi proteiny, kódované genem pol, patří reverzní transkriptáza, integráza a proteáza.
Reverzní transkriptáza je bifunkční enzym, jak s ribonukleázovou, tak polymerázovou
aktivitou. Po vstupu viru do buňky a jeho rozbalení dochází k přepisu molekuly RNA
do molekuly DNA za vzniku hybridní molekuly RNA-DNA. V tomto kroku má reverzní
transkriptáza funkci RNA-dependentní DNA polymerázy. V přítomnosti hybridní
molekuly RNA-DNA vykazuje reverzní transkriptáza aktivitu ribonukleázy H a štěpí RNA
vlákno (Simons a Snustad, 2009). Tento krok je esenciální pro následnou syntézu
dvouvláknové virové DNA. Integráza následně slouží k zabudování virové DNA do
hostitelského genomu za vzniku tzv. proviru. Funkcí proteázy je štěpení virových
prekurzorových polyproteinů na funkční polypeptidy.
Produktem genu env je prekurzorový glykoprotein gp160. Ten je dále pomocí proteázy
rozštepen na dva obalové glykoproteiny gp120 a gp41 (Borrow a kol., 1997). Podrobnější
informace o gp120 a gp41 jsou uvedeny v následujících kapitolách.
Produkt genu tat zesiluje transkripci virové (a možná také buněčné) DNA a společně
s produktem genu nef reprimují syntézu MHC molekul I. třídy, čímž redukují schopnost
cytotoxických (CD8+) T-lymfocytů rozpoznávat a následně likvidovat HIV-infikované
buňky.
Protein vzniklý expresí genu rev zodpovídá za kontrolu transportu zralé virové mRNA
z jádra do cytoplazmy. Poslední zmíněný gen, gen vif, zesiluje infekčnost HIV viru inhibicí
apolipoprotein B RNA-editujícího enzymu (APOBEC3G), jehož úlohou je deaminace
cytosinů virových nukleových kyselin (Levinson, 2006).
15
2.1.2 BUNĚČNÝ TROPIZMUS HIV VIRU
Schopnost viru infikovat pouze některé typy buněk je označován, jako buněčný
tropizmus. Buněčný tropizmus je determinován expresí specifických buněčných receptorů,
které jsou rozpoznávány příslušnými viry. Oba typy HIV, HIV-1 a HIV-2, mají selektivní
tropizmus k buňkám, které na svém povrchu nesou antigen CD4. Molekula CD4 slouží
jako specifický buněčný receptor, který viru umožňuje vstup do buňky. Vazba HIV
na CD4+ buňky je zprostředkována nekovalentně vázanými, asociovanými proteiny gp120
a gp41, které jsou umístěny ve virovém obalu. Fúzi a následnému vstupu HIV do buňky
předchází vazba glykoproteinu gp120 na chemokinový ko-receptor, který se nachází
v membráně hostitelské buňky (Levinson a kol., 2006).
Chemokinové ko-receptory patří mezi G-proteiny, rozsáhlou skupinu membránových
proteinů, pro něž je charakteristická přítomnost sedmi transmembránových alfa helixů, čtyř
extracelulárních a čtyř intracelulárních domén (Krambovitis a kol., 2005). Hlavními
ko-receptory, které jsou využívány HIV virem pro vstup do buňky, jsou dva typy
chemokinových ko-receptorů, a to CCR5 a CXCR4 ko-receptory. CCR5 ko-receptor je
exprimován na dendritických buňkách, makrofázích a CD4+
T-lymfocytech, zatímco
CXCR4 ko-receptor je exprimován pouze T-lymfocyty včetně subpopulace nativních
T-lymfocytů (Janeway a kol., 1999).
Ve výjmečných případech mohou být virem HIV-1 infikovány též buňky, které na svém
povrchu CD4 receptor nenesou. Jedná se o astrocyty (Liu a kol., 2004), B-lymfocyty
(De Silva a kol. 2001), CD8+ T-lymfocyty (Livingstone a kol., 1996), thymocyty (Kitchen
a kol., 1997), trofoblasty (Al-Harthi a kol., 2002) a dendritické buňky (Gummuluru a kol.,
2003).
Za hlavní molekulární determinantu, která předurčuje buněčný tropizmus, je
považována třetí variabilní oblast (V3) virového obalového glykoproteinu gp120. Bohužel,
jak již název napovídá, V3 oblast je vysoce variabilní, a to jak v sekvenci aminokyselin,
tak v jejich počtu. Díky této skutečnosti je obtížné využívat V3 oblast při určování
buněčného tropizmu viru (Dybowski a kol., 2010). Podrobnější informace o V3 oblasti
a úloze, kterou zastává v buněčném tropizmu viru, je pojednáno v podkapitole 2.2.1.2 (V3
oblast).
Na základě skutečnosti, jaké buňky HIV-1 infikuje, jsou rozlišovány kmeny
X4 (T-lymfotropní) a R5 kmeny. T-lymfotropní kmeny napadají T-lymfocyty, zatímco R5
16
kmeny mají zvýšený tropizmus k makrofágům. Jmenované kmeny se liší ve vazbě na
chemokinové ko-receptory, prostřednictvím kterých dochází ke vstupu HIV-1 do buňky.
Zatímco X4 kmeny využívají pro vstup do buňky ko-receptor CXCR4, R5 kmeny do
buňky vstupují pomocí ko-receptoru CCR5. Existují taktéž kmeny, které mají takzvaný
„dvojí“ tropizmus a jsou tedy schopny využívat jak ko-receptor CXCR4, tak CRR5 (Koot
a kol., 1993). Znalost buněčného tropizmu našla své využití v antiretrovirální léčbě. Léčivo
s názvem Maraviroc vytváří vazbu s CCR5 ko-receptorem, čímž znemožňuje navázání
gp120 proteinu viru HIV. Bohužel, CCR5 inhibitory jsou v případě X4 kmenů neúčinné
(Dybowski a kol., 2010).
Infekce hostitele je zahájena R5 kmenem HIV-1, tedy kmenem s tropizmem
k makrofágovým buňkám. V průběhu období latence dochází ke genetickému
rozrůzňování jednotlivých kmenů viru HIV-1. Kmeny s tropizmem k makrofágům jsou
postupně nahrazovány T-lymfotropními kmeny. T-lymfotropní kmeny napadají CD4+
lymfocyty infikovaného jedince, které cytopaticky ničí. Úbytek T-lymfocytů je příčinou
vzniku syndromu lidské imunodeficience (acquired immune deficiency syndrom, AIDS)
(Krejsek a Kopecký, 2004).
17
2.1.3 SYNDROM ZÍSKANÉ IMUNODEFICIENCE (ACQUIRED IMMUNE DEFICIENCY SYNDROM; AIDS)
AIDS lze charakterizovat, jako pomalu rozvíjející se chorobu, při níž dochází
k progresivnímu úbytku obranyschopnosti organismu. AIDS propuká u naprosté většiny
jedinců infikovaných virem HIV. Důvodem je existence mnoha mechanizmů, díky nimž
HIV úspěšně uniká dozoru imunitního systému. Mezi hlavní mechanizmy patří integrace
virové DNA do hostitelského genomu a vznik perzistentní infekce. Dále také produkce Tat
a Nef proteinů, které snižují expresi MHC molekul I. třídy, nutných pro správnou funkci
cytotoxických T-lymfocytů (Levinson, 2006). V neposlední řadě je to vysoká variabilita
Env proteinu, který je zodpovědný za vstup HIV do buňky. Protein Env je taktéž výrazně
glykosylován, díky čemuž jsou neutralizační epitopy nepřístupné pro většinu potenciálně
neutralizačních protilátek (Taylor a kol., 2008). Díky jmenovaným skutečnostem virus
odolává imunitnímu systému svého hostitele, v němž se pomalu ale jistě šíří. Výsledkem je
dříve či později úmrtí infikovaného jedince.
2.1.3.1. PRŮBĚH CHOROBY
Asi u poloviny jedinců se dva až tři týdny po infekci virem HIV objevuje tzv.
primární syndrom. Primární syndrom je charakteristický projevy podobnými chřipce, může
se objevit únava, či zvětšené lymfatické uzliny. Během několika týdnů příznaky infekce
ustávají. Zhruba polovina infikovaných jedinců příznaky primárního syndromu nemá
(Bednář a kol., 1996).
Ať už se infekce HIV virem projeví či neprojeví rozvojem primárního syndromu,
u všech infikovaných osob následuje latentní období, při němž se infekce u nakažených
jedinců nikterak neprojevuje. Latentní období trvá u každého pacienta různě dlouhou dobu,
nakonec však přechází v tzv. perzistentní generalizovanou lymfadenopatii, která
se projevuje pocením, únavou, průjmy a lehce zvýšenou teplotou. Tento stav může trvat
i po několik let, po kterých přechází do stadia označovaného jako ARC (AIDS-related
complex). ARC stádium je typické výskytem lymfadenopatie, horečkou, průjmy,
hubnutím, kožními problémy, kandidózami sliznic a častými aktivacemi herpesvirů
a papilomavirů (Krejsek a Kopecký, 2004).
18
Posledním stádiem infekce je stádium rozvinutého syndromu imunitní nedostatečnosti
(AIDS). (Bednář a kol., 1996). V posledním stádiu infekce HIV virem je nakažený jedinec
vystaven vysokému riziku nákazy oportunními patogeny, často také dochází k propuknutí
zhoubných nádorových onemocnění, jako např. B-buněčný lymfom nebo Kaposiho
sarkom. Kaposiho sarkom je nádorové onemocnění způsobené lidským herpesvirem
HHV-8. Zdravý organismus je schopen virus potlačit, nemoc propuká teprve u jedinců
s vážně narušenou imunitou. Kaposiho syndrom je charakterizován houbovitými
hnědočervenými uzly, které se nachází typicky na bércích, později je lze nalézt také
na horních končetinách a na sliznicích (Janeway a kol., 1999).
V dnešní době hovoříme o tzv. celosvětové pandemii AIDS, jejíž příčinou je infekce
virem HIV, nejčastěji typem HIV-1. Vyjímkou je západní Afrika a Indie, v nichž je
mnoho nemocných infikováno typem HIV-2. Přestože typ HIV-2 vyvolává podobné
symptomy, jako typ HIV-1, rozvoj onemocnění je pomalejší (Levinson, 2006).
2.1.4 ANTI-RETROVIRÁLNÍ TERAPIE
V současné době jsou v klinické praxi využívány tři základní druhy anti-retrovirálních
léčiv, a to nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy, ne-nukleosidové inhibitory
reverzní transkriptázy a inhibitory virové proteázy (De Luca a kol., 2013).
Nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy jsou antiretrovirové látky, které
postrádají 3´-OH skupinu. Díky nepřítomnosti 3´-OH skupiny nedochází ke vzniku
3´-5´fosfodiesterové vazby mezi 5´ nukleosid trifosfátem a prodlužujícím se řetězcem
virové DNA. Začlenění antiretrovirového nukleosidu do nově vznikajícího řetězce virové
DNA tudíž vede k ukončení jeho syntézy (Krejsek a Kopecký, 2004).
Jako nenuklesidové inhibitory reverzní transkriptázy je označována pestrá škála
polycyklických sloučenin, jejichž funkce je založena na přímé vazbě na virovou reverzní
transkriptázu a tím omezení její mobility a aktivity. (Richman, 2001).
Inhibitory virové proteázy fungují jako syntetické analogy štěpných míst virových
peptidů. Na rozdíl od virových peptidů však nejsou virovými proteázami rozložitelné.
Naopak, po vazbě virové proteázy na zmíněné inhibitory dochází k blokování její funkční
aktivity. Inhibitory HIV proteázy tak znemožňují štěpení gag a gag-pol bílkovinných
prekurzorů v infikovaných buňkách, čímž blokují infekčnost vznikajících virionů.
(Flexner, 1998).
19
Pacienti jsou nejčastěji léčeni kombinací alespoň dvou rozličných antiretrovirálních
terapeutik. Tento léčebný přístup je označován jako vysoce aktivní antiretrovirální terapie
(Highly Active AntiRetroviral Therapy, HAART). HAART léčba však sebou nese určitá
úskalí, ať už se jedná o její mimořádně vysoké náklady nebo vážné vedlejší zdravotní
komplikace pacientů. Mezi vedlejší účinky HAART patří např. útlum krvetvorby, vznik
inzulinové intolerance nebo poruchy v metabolizmu lipidů (Krejsek a Kopecký, 2004).
Díky vědeckému pokroku jsou však objevována nová, efektivnější či méně toxická léčiva,
jako např. enfuvirtid, raltegravir, či maraviroc. Funkce medikamentu enfuvirtid je založena
na vazbě léčiva na obalový glykoprotein gp41. Tímto krokem dochází k inhibici fúze HIV
viru a hostitelské buňky (Robertson, 2003). Účinek léku raltegravir je zaměřen vůči
virovému enzymu integráze (Grinsztejn a kol., 2007). Funkcí léčiva Maraviroc je blokace
CCR5 ko-receptoru, jak je již popsáno v předchozí podkapitole (2.1.2. Buněčný tropizmus
HIV viru).
Bohužel, použití jednotlivých antiretrovirálních terapeutik, ani jejich kombinace, není
schopna HIV infekci zcela vyléčit. Proto je nalezení efektivní vakcíny vůči viru HIV
jedním z hlavních úkolů, kterého se snaží soudobá medicína dosáhnout. Konstrukce
vakcíny by se měla řídit několika zásadními požadavky, mezi něž patří dlouhodobá
ochrana vůči všem genotypům viru HIV-1 a cenová dostupnost umožňující plošnou
aplikaci i v zemích třetího světa (Taylor a kol., 2008). Současné snahy, o konstrukci účinné
vakcíny vůči viru HIV, jsou založeny na poznatcích o struktuře HIV a jeho biologii. Cílem
je vývoj imunogenů, jež jsou schopny vyvolat vznik neutralizujících protilátek, tedy
specifické imunitní odpovědi (Joyce a Meulen, 2010). Existuje však řada problémů, které
brání dosažení stanoveného cíle. Jedním z nich je vysoká frekvence mutací HIV viru.
Mutace vznikají při přepisu RNA do virové DNA, a to díky reverzní transkriptáze, která
postrádá opravnou (proof-reading) aktivitu (Hedestam a kol, 2008). V důsledku toho
dochází ke vzniku vysoké diverzity v rámci HIV. Sekvence HIV viru se mezi jedinci může
lišit až 30%, genetická diverzita existuje taktéž v rámci jednoho jedince, a to až 10%
(Mascola a Montefiori, 2010). Výsledkem je únik HIV jak před imunitním systémem
hostitele, tak před antiretrovirovou terapií (Taylor a kol., 2008).
20
2.2 OBALOVÝ GLYKOPROTEIN gp120
Vstup HIV-1 do buňky je zprostředkován glykoproteiny virového obalu, gp120 a gp41.
Jedná se o nekovalentně vázané podjednotky, vnější gp120 a transmembránovou gp41,
které společně utváří protein virového obalu (Env). Proteinové komplexy gp120-gp41 jsou
na povrchu virionu přítomny ve formě trimerů a jsou schopny vazby na receptory
a koreceptory hostitelské buňky. Vazba komplexu gp120-gp41 na CD4 glykoprotein
a chemokinový ko-receptor CCR5 nebo CXCR4, které se nachází na povrchu hostitelské
buňky, je prvním krokem při vstupu HIV-1 do buňky (Kwong a kol., 1998).
Po vazbě gp120 na buněčný receptor a ko-receptor dochází k fúzi virového obalu
a cytoplazmatické membrány buňky. Fúze je zprostředkována N-terminálním fúzním
peptidem glykoproteinu gp41. Po vsunutí N-terminálního fúzního peptidu gp41
do buněčné membrány dochází k rozbalení gp41 glykoproteinu a následně k přímé fúzi
virionu a plasmatické membrány. Do hostitelské buňky jsou uvolněny enzymy
a genomická RNA HIV viru (Wyatt a Sodroski., 1998). Jelikož gp120 hraje důležitou roli
při vstupu HIV do buňky a interakcích s neutralizačními protilátkami, je informace o jeho
struktuře důležitá pro pochopení průběhu HIV infekce a vývoj terapeutických
a profylaktických strategií (Mascola a Montefiori, 2010).
2.2.1. STRUKTURA gp120
Glykoprotein gp120 je tvořen 484 - 543 aminokyselinami a obsahuje pět
konzervovaných (C1 - C5) a pět variabilních oblastí (V1 – V5) (Korber a kol., 2001).
Oblasti V1 – V4 jsou zformovány do podoby smyček. Konzervované oblasti gp120 vytváří
diskontinuální struktury, které hrají hlavní úlohu při interakci s vnější
doménou glykoproteinu gp41. Jak konzervované, tak variabilní oblasti glykoproteinu
gp120 jsou silně glykosylovány (Leonard a kol., 1990).
Pomocí rentgenové krystalografie byla stanovena struktura nativního gp120
glykoproteinu tvořící komplex s CD4 molekulou. Krystalizace nativního gp120
v nevazebné konformaci je dosud obtížně překonatelnou překážkou. Z toho důvodu byly
provedeny kroky, jako deglykosylace glykoproteinu gp120, odstranění V1/V2 a V3
domény a zkrácení N a C konců proteinu. Deglykosylovaný a jinak upravený gp120
protein byl konjugován s CD4 molekulou. Po krystalizaci komplexu gp120-CD4 bylo
21
možné analyzovat strukturu gp120 technikou rentgenové krystalografie (Rizzuto a kol,
1998).
V tomto stavu je gp120 tvořen třemi doménami, vnitřní doménou, vnější doménou
a tzv. „bridging sheet“ neboli spojující list. Vnitřní doména zahrnuje C- a N- konec
glykoproteinu gp120 a je složena ze dvou helixů, dvouřetězcového svazku na terminálně-
distálním konci a pětiřetězcového β-sendviče na terminálně-proximálním konci. Vnější
doména je tvořena skládaným dvojitým soudkem, jehož osa leží rovnoběžně s osou
dvouřetězcového svazku na terminálně-distálním konci vnitřní domény. Dvojitý soudek
vnější domény se skládá z proximální a distální části. Proximální část zahrnuje β-list
obtáčející se kolem α-šroubovice. Distální část je tvořena sedmiřetězcovým antiparalelním
β-soudkem. „Bridging sheet“ je doména vznikající po vazbě molekuly CD4 na gp120
protein (Kwong a kol., 1998). „Bridging sheet“ je tvořen dvěma páry antiparalelních
β-skládaných listů, které spojují vnitřní a vnější doménu. Vnitřní doména interaguje
s proteinem gp41, vnější doména tvoří povrch proteinu Env. (Rizzuto a kol., 1998).
Struktura proteinu gp120 je znázorněna na obrázku č. 2.
Obrázek č. 2: Struktura glykoproteinu gp120
(Obrázek upraven dle Kwong a kol., 1998)
22
2.2.1.2 V3 OBLAST
Ze zmíněných pěti variabilních oblastí hraje při infikování hostitelské buňky stěžejní
roli V3 oblast, na níž se nachází epitopy pro neutralizující protilátky. Tyto epitopy jsou
pojmenovány jako hlavní neutralizační doména (Krejsek a Kopecký, 2004). V3 oblast
se účastní přímé vazby na buněčný ko-receptor a stává se tak jedním z nejdůležitějších
článků, které rozhodují o buněčném tropizmu HIV-1. Výzkumy prokázaly, že V3 smyčka
působí jako elektrostatický modulátor, ovlivňující celkovou strukturu a diverzitu vnější
domény gp120 proteinu. Z uvedeného tvrzení vyplývá, že V3 smyčka ovlivňuje vazbu
neutralizačních protilátek na HIV-1 a je tedy důležitým článkem při modulování
biologických a imunologických fenotypů viru HIV-1 (Yokoyama a kol., 2012).
V3 oblast viru HIV-1 je obvykle tvořena třiceti pěti aminokyselinami, které vytváří
smyčce podobnou strukturu na vnější doméně glykoproteinu gp120. V3 oblast je bohatá
jak na bazické, tak aromatické aminokyseliny (Yokoyama a kol., 2012). Jak již bylo
řečeno, V3 oblast je zformována do podoby smyčky. V3 smyčka je kladně nabitá a je
uzavřená disulfidovým můstkem, který se vytváří mezi dvěma molekulami cysteinu. V3
smyčka je složena ze tří vzájemně oddělených částí a to svrchní, středové a spodní části
(Dybowski a kol., 2010).
V současnosti je V3 smyčka považována za jednoho z možných imunogenů
využitelných pro konstrukci vakcíny. Na rozdíl od konzervovaných oblastí gp120, je
variabilní V3 oblast v průběhu různých stádií infekce alespoň krátkodobě vystavena
na povrchu viru HIV, je imunogenní u všech HIV pozitivních jedinců a je schopna
indukovat tvorbu neutralizačních protilátek. Současné výzkumy ukazují, že anti-V3
protilátky z HIV infikovaných jedinců vykazují křížovou reaktivitu s různými molekulami
gp120 a jsou tedy schopné neutralizovat široké spektrum primárních izolátů (Zolla-Pazner,
2005).
Nejlepším způsobem studia specifity a funkce jednotlivých protilátek je studium
monoklonálních protilátek. Výzkum zaměřený na široké spektrum monoklonálních
lidských protilátek prokázal, že monoklonální anti-Env protilátky rozpoznávají jedenáct
Env oblastí HIV viru (Nabel a kol., (2005). Nicméně, pouze protilátky specifické ke třem
oblastem na gp120 a jedné oblasti na gp41 jsou schopné široké neutralizace HIV-1. Jedná
se o membránovou externální proximální oblast (MPER) gp41, CD4 vazebnou oblast,
vazebnou oblast pro chemokinový receptor a glykany na povrchu gp120.
23
Vazebná oblast pro chemokinový receptor je rozpoznávána nejméně dvěma odlišnými
sadami monoklonálních protilátek. Jedná se o CD4 indukované (CD4i) protilátky
rozpoznávající „bridging sheet“ gp120 a protilátky, které interagují s V3 smyčkou. Oba
zmíněné typy protilátek jsou přítomny u většiny HIV pozitivních jedinců a inhibují vazbu
gp120 na chemokinový receptor buňky. Na rozdíl od CD4i jsou však protilátky
interagující s V3 smyčkou gp120 schopné neutralizovat primární izoláty HIV jako
kompletní IgG molekuly. Na základě těchto poznatků se jeví V3 oblast gp120 jako jeden
z možných cílů pro vývoj HIV vakcíny. Profylaktická vakcína však musí indukovat tvorbu
vyšší koncentrace anti-V3 protilátek se širší specifitou, než je tomu u přirozené infekce.
(Zolla-Pazner, 2005).
2.2.1.3 GLYKOSYLACE GP120
Glykosylace patří mezi jednu z nejdůležitějších kotranslačních a posttranslačních
modifikací proteinů. V živých systémech existují tři hlavní typy glykosylace, a to N-, O-
a C- glykosylace (Varki, Cummings a kol., 2009).
Zhruba polovinu molekulové hmotnosti glykoproteinu gp120 tvoří N-vázané glykany
(Huskens a Schols, 2012). Jádro N-glykanů sestává ze dvou molekul N-acetylglukosaminu,
tří molekul manózy a variabilního počtu přídatných glykanů (manóza, N-acetylglukosamin,
fukóza, galaktóza, kyselina sialová) (Zhu a kol., 2000). N-glykany jsou připojeny
k proteinové kostře, a to v pozicích, které jsou předurčeny krátkými aminokyselinovými
motivy (N-X-S/T). Jako X je označena jakákoliv aminokyselina kromě prolinu (Huskens
a Schols, 2012). Tyto motivy jsou označovány jako potencionální N-glykosylační místa
(PNGS) a jsou kódována virovým genomem. Zatímco určitá PNGS lze najít u většiny
kmenů HIV-1, přítomnost jiných může být vysoce variabilní. Variabilní PNGS jsou
lokalizována na variabilních doménách gp120. Vyjímkou je V3 smyčka,
na níž se variabilní PNGS nenachází (Mascola a Montefiori, 2010).
N-glykany jsou k nově syntetizovanému polypetidovému řetězci ko-translačně
připojovány v endoplazmatickém retikulu (Helenius a Aebi., 2001). Glykosylace peptidů
v endoplazmatickém retikulu hraje stěžejní roli při skládání proteinu. Správně složený
peptid migruje do Golgiho aparátu, kde dochází k další úpravě glykanů pomocí glykosidáz
a glykosyltransferáz. Výsledkem procesu glykosylace dochází ke vzniku třech typů
glykanů, a to glykanů s vysokým obsahem manózy, hybridních glykanů a komplexních
24
glykanů. N-glykany s vysokým obsahem manózy obvykle obsahují pět až devět
manózových zbytků, připojených k N-glykanovému jádru. Typickou součástí komplexních
N-glykanů je sialyllactosaminová sekvence. Hybridní oligosacharidy obsahují jak prvky
N-glykanů s vysokým obsahem manózy, tak komplexních N-glykanů (Kornfeld
a Kornfeld, 1985). Struktura high-mannose, hybridních a komplexních N-glykanů je
znázorněna na obrázku č. 3.
Obrázek č. 3: Schematické znázornění struktury N-glykanů
(Upraveno dle Varki a kol., 2009)
Heterotrimery virového obalu HIV-1 jsou vysoce glykosylovány. Povrchové proteiny
HIV-1 jsou typické vysokým obsahem glykanů s vysokým obsahem manózy, zatímco
lidské buňky exprimují proteiny s obsahem high-mannose glykanů jen velmi zřídka (Weis
a kol., 1998). K připojení cukerné struktury může u Env proteinu docházet nejméně
na 24 PNGS, které se nachází jak na konzervovaných, tak na variabilních oblastech
(Leonard a kol., 1990). Např. u transmembránové podjednotky gp41, umožňující fúzi viru
a hostitelské buňky, je lokalizováno na extravirální doméně 4-5 PNGS (Johnson a kol.,
25
2001). Přestože je informace o PNGS zapsána v nukleové kyselině viru, finální podoba
glykanu je určena biosyntetickými pochody hostitelské buňky (Raška a kol., 2010).
Glykosylace hraje významnou roli v množství biologických procesů, mezi něž patří
např. skládání proteinů a jejich stabilita, buněčná adheze, či buněčná signalizace. (Varki,
Freeze a kol., 2009). Znalost glykosylace proteinů je taktéž vysoce důležitá při výrobě
bioterapeutik. Glyskosylační profily proteinů poskytují nezbytné informace o jejich
efektivitě a bezpečnosti (Jefferis, 2007). V neposlední řadě hraje glykosylace klíčovou roli
v HIV patogenezi. Glykosylace zajišťuje správné skládání a funkční konformaci obalového
proteinu Env, čímž ovlivňuje antigenicitu a imonogenicitu proteinu. Glykosylace Env
proteinu je však virem využita také jako mechanismus úniku před imunitním systémem.
Tento mechanismus zahrnuje konformační maskování epitopů a krytí glykanů indukujících
neutralizační protilátky. V současné době jsou Env glykany považovány za jeden
z nejslibnějších cílů pro indukci anti-HIV-1 neutralizačních protilátek (Go a kol., 2008).
Jako příklad široce neutralizující protilátky vážící se ke glykanům lze uvést monoklonální
protilátku 2G12. 2G12 je schopná výměny svých těžkých řetězců za účelem tvorby
zvětšeného vazebného povrchu, jehož součástí jsou tři vazebná místa. Jedná se o vysoce
účinnou strategii při vazbě glykanů (Calarese a kol., 2003). Mezi další molekuly
rozpoznávající glykany patří například široce neutralizující protilátky specifické vůči
N-glykanům s vysokým obsahem manózy nebo různé typy lektinů (např. konkavalin A)
(Pashov a kol., 2009). Jako další strategie neutralizace gp120, obsahující různé
glykosylační profily, mohou být využity také polyreaktivní protilátky na bázi lektinů (Pope
a kol., 1995).
2.2.2 IN VITRO EXPRESE gp120
Veškeré glykoproteiny, stejně jako gp120, mají strukturu, složení a různorodost
připojených glykanů závislou na buněčném systému, který je využit pro jejich expresi.
Glykosylace gp120 je tedy ovlivněna orgánovým původem a metabolickou aktivitou
buněk, v nichž je produkován. Rozdílná glykosylace též aminokyselinové kostry
signifikantně ovlivňuje vazbu Env na polyklonální protilátky, které se nachází v séru
HIV-1 infikovaných pacientů. Tato skutečnost potvrzuje existenci vztahu mezi glykosylací
gp120 a imunologickou odpovědí jedince (Raška a kol., 2010).
T-lymfocyty, přirozené hostitelské buňky HIV, patří mezi buňky s nízkou rychlostí
syntézy proteinů. Z tohoto důvodu jsou pro produkci rekombinantních gp120 proteinů
26
častěji využívány jiné buněčné systémy, jako CHO (vaječníky křečka čínského)
(Lu a kol.,, 2008), 293/HEK (buňky lidských embryonálních ledvin), či hmyzí buněčné
kultury SF9 (Spodoptera fugiperda) (Kong a kol., 2010). Nevýhoda jmenovaných
buněčných systémů tkví v glykosylaci gp120, která se liší od jeho glykosylace
v T-lymfocytech (Raška a kol., 2010). Jak již bylo řečeno, odlišně glykosylované
glykoproteiny gp120 vyvolávají různou imunologickou odpověď. Použití nevhodného
imunogenu tak může vést k výrobě nefunkčních vakcín (Robinson., 2007).
Ve výzkumu Raška a kol., (2010) byl studován vliv exprese glykoproteinu gp120
v různých buněčných liniích na jeho glykosylaci. Předmětem experimentu byl
rekombinantní glykoprotein gp120, produkovaný různými buněčnými liniemi: 293T/HEK
(lidskou embryonální ledvinnou buněčnou línií), Jurkat (buňkami lidské T-leukémie),
Molt4 (buňkami lidské akutní T-lymfoblastické leukémie), Dakiki (lidskou
EBV-imortalizovanou B-buněčnou linií), RD (buňkami lidského rhabdomyosarkomu),
HepG2 (buňkami lidského hepatocelulárního karcinomu), Ht1080 (buňkami lidského
fibrosarkomu) a CHO (buňkami vaječníků křečka čínského). Experiment prokázal,
že glykoprotein gp120 produkovaný v různých buněčných liniích vykazuje různou míru
glykosylace. Různá glykosylace gp120 koreluje s jejich rozdílnou molekulovou hmotností
(viz. obrázek č. 4). Nejnižší Mr byla zjištěna u gp120 produkovaného linií CHO a Dakiki,
a to zhruba 125 kDa. Naopak, nejvyšší relativní molekulová hmotnost byla prokázána
u gp120 produkovaného linií HepG2, a to asi 145 kDa.
Obrázek č. 4: Analýza relativní molekulové hmotnosti glykoproteinu gp120
exprimovaného v různých buněčných liniích
(upraveno dle Raška a kol., 2010)
27
Rozdílné glykosylační profily rekombinatních proteinů samozřejmě ovlivňují i jejich
biologické vlastnosti. Vliv různých expresních systémů na antigenicitu a imunogenicitu
proteinu gp120 byl testován výzkumnou skupinou Kong a kol., 2010. Mezi prověřované
expresní systémy byly zahrnuty dvě hmyzí linie (SF9 a SF9 MimicTF
) a jedna linie savčí
(293 FreeStyleTM
bez kifunensinu a 293 FreeStyleTM
v přítomnosti kifunensinu). Linie
293F produkuje glykany s vysokým obsahem manózy, hybridní i komplexní glykany
s kyselinou sialovou. 293F v přítomnosti kifunensinu vytváří glykoproteiny obsahující
pouze glykany s vysokým obsahem manózy. Glykoproteiny exprimované v hmyzí buněčné
linii SF9 obsahuje především tzv. paucimanózový typ glykanů. SF9 MimicTF
produkuje
glykany s vysokým obsahem manózy, hybridní i komplexní glykany, avšak bez kyseliny
sialové. Analýza rekombinantních gp120 proteinů prokázala, že gp120 exprimovaný
v systému inkorporujícím kyselinu sialovou vykazoval, oproti systému neinkorporujícím
kyselinu sialovou, nižší imunogenicitu i antigenicitu. Získané poznatky podporují v rámci
strukturně-funkčních a vakcinačních studií využívání expresních systémů neinkorporující
kyselinu sialovou.
28
2.3 ANALÝZA GLYKOPROTEINŮ POMOCÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE
Cílem této diplomové práce byla analýza cukerné komponenty glykoproteinu gp120
pomocí lektinů metodou průtokové cytometrie. Důležitým kritériem pro výběr analytické
metody byla nutnost zachování nativní konformace proteinu. Průtoková cytometrie se jeví
jako vysoce efektivní, přesná metoda umožňující detekci proteinů imobilizovaných
na fluorescenčně značené mikropartikule. Analyzované proteiny, jejichž konformace je
srovnatelná s konformací, kterou zaujímají in vivo, umožňují jejich přesnější
a efektivnější studie. Z důvodu využití metody průtokové cytometrie v této diplomové
práci se v dalších podkapitolách pokusím objasnit princip a význam průtokové cytometrie
a možnost uplatnění lektinů v analýze glykoproteinů.
2.3.1 PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE
Průtoková cytometrie představuje moderní, vysoce efektivní metodu, která umožňuje
současné měření a analýzu fyzikálních a chemických vlastností buňky nebo biologických
částic v roztoku. Analýza je založena na sbírání signálů po ozáření částic laserovým
paprskem.
2.3.1.1 SLOŽENÍ PRŮTOKOVÉHO CYTOMETRU
Průtokový cytometr je tvořen z části fluidní, optické a elektronické. Fluidika zahrnuje
kapiláru, přivádějící vzorek do průtokové komůrky, průtokovou komůrku a samotnou
unášecí kapalinu, jíž může být destilovaná voda nebo slabý roztok solí (Shapiro, 2003).
Optická část průtokového cytometru je tvořena zdrojem excitačního záření a sběrnými
optickými cestami. U starších průtokových cytometrů lze nalézt jako zdroj excitačního
záření rtuťové lampy, modernější přístroje již disponují lasery, které jsou zdrojem
monochromatického záření. V praxi je nejčastěji využívaný vzduchem chlazený argonový
laser emitující záření o vlnové délce 488 nm. Jedná se o vlnovou délku vhodnou k excitaci
velké škály dnes používaných fluorochromů. Sběrné optické cesty jsou tvořeny čočkami,
zrcadly a filtry. Funkcí čoček je usměrňování fotonů emitovaného záření, zrcadla a filtry
slouží k rozdělení světelných paprsků na jednotlivé detektory (Roubalová, 2012).
29
Elektronickou část průtokového cytometru prezentují fotodetektory a počítačový
software, zobrazující distribuci hodnoty zkoumaného parametru. Fotodetektory slouží
k přijímání částicemi rozptýlených a emitovaných fotonů. Energie fotonů je následně
transformována na energii elektronů, které jsou z fotodetektorů uvolňovány. Vzniklý signál
je poté převeden do digitální podoby. V praxi jsou nejčastěji využívány dva typy
fotodetektorů, fotodiody a fotonásobiče. Mezi nesporné výhody fotodiod patří jejich
rychlost a levná pořizovací cena. Fotodiody však neumožňují měření fluorescence,
což patří mezi jejich hlavní nevýhody. Fotonásobiče jsou však na rozdíl od fotodiod
mnohonásobně sensitivnější. Intenzita signálu může být prostřednictvím fotonásobičů
až milionkrát zvýšena. Využití fotonásobičů je proto velmi vhodné při analýze malých
nebo slabě fluoreskujících částic, poskytujících signál nízké intenzity (Robinson a Grégori,
2007).
2.3.1.2 PRINCIP PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE
Úspěšnost cytometrické analýzy spočívá v dodržení několika základních podmínek.
Veškeré vzorky analyzované metodou průtokové cytometrie musí mít podobu suspenze.
V jednom mililitru analyzované suspenze by mělo být přítomno 105 – 10
6 částic.
Pro analýzu jsou nejvhodnější částice o průměru 1 – 30 μm (Givan, 2004).
Připravená suspenze částic je nasávána tenkou kapilárou, která suspenzi usměrňuje
do tzv. průtokové komůrky, jíž proudí unášecí kapalina. Unášecí kapalina zajišťuje
separaci jednotlivých částic a jejich uspořádání. Vzniká proud oddělených částic, které
se pohybují jedna za druhou. Jedná se o proces nazvaný jako hydrodynamická fokusace.
Každá z částic je následně ozářena (laserovým) paprskem (Robinson a Grégori, 2007).
Vznikající signály jsou dále zpracovávány a převáděny do digitální podoby. Získané
informace jsou ukládány do počítače, jako datové soubory v LIST MODE FILE
a zobrazovány v tzv. formátu cytometrického standardu (FCS).
Vizualizace distribuce hodnot vybraného parametru je zabezpečena počítačovým
softwarem, který je k cytometru dodáván. Výsledkem cytometrické analýzy mohou být
jednoparametrové histogramy, dvouparametrové histogramy a trojrozměrné izometrické
grafy. Jednoparametrový histogram zobrazuje frekvenci distribuce částic pro vybraný
parametr. Dvouparametrový histogram podává záznam o distribuci dvou různých
parametrů. Trojrozměrné izometriecké grafy zobrazují korelaci tří různých parametrů
(Givan, 2004).
30
Obrázek č. 5: Schéma průtokové cytometrie
(Upraveno dle http://biomedicina.prf.jcu.cz/wordpress/wp-
content/uploads/2011/12/Vyuzitiprutokovecytometrievimunologii.pdf)
2.3.1.3 ANALYZOVANÉ PARAMETRY
Poté, co jsou částice ozářeny světelným paprskem, jsou získávána data, která jsou dále
využívána při stanovování studovaných vlastností částic. Mezi parametry, které jsou
při průtokové cytometrii analyzovány, patří rozptyl světla a emise fluorescence.
ROZPTYL SVĚTLA
Při analýze průtokovým cytometrem jsou získávány dva typy rozptylu světla,
a to přímý rozptyl světla (FSC) a boční rozptyl světla (SSC). Zatímco při přímém rozptylu
je paprsek sbírán pod malým úhlem vůči vektoru dopadajícího světla (2º - 13º), při bočním
rozptylu je paprsek vůči vektoru dopadajícího světla sbírán pod úhlem 90º. Příslušné
fotodetektory poté převádí zachycenou energii rozptýleného záření na elektrický signál.
Elektrický signál je dále přetransformován v signál digitální. Zatímco přímý rozptyl je
indikátorem velikosti částice, pravoúhlý rozptyl poskytuje údaje o její granularitě
(Ormerod, 2009).
31
FLUORESCENCE
Fluorescence vzniká po ozáření fluorochromů excitačním zářením. Excitační záření je
světlo o konkrétní vlnové délce, která způsobí excitaci elektronů fluorochromů a jejich
přechod na vyšší energetickou hladinu. Jelikož je tento stav nestabilní, elektrony se vrací
zpět do základního stavu za současné emise světla o vyšší vlnové délce a tudíž nižší
energii, než tomu bylo u záření excitačního. Tento proces nazýváme jako fluorescence
(Shapiro, 2003). Fluorochromy mohou být na cílovou molekulu vázány přímo, nebo
mohou být konjugovány na protilátku, sloužící k detekci konkrétního proteinu. Pro analýzu
lze využít i kombinaci několika různých fluorochromů s nepřekrývajícími se emisními
spektry. Množství použitých typů fluorochromů je taktéž limitováno počtem fotodetektorů,
které jsou v průtokovém cytometru instalovány (Ormerod, 2009). Přehled
nejpoužívanějších fluorochromů v průtokové cytometrii je zaznamenán v tabulce I.
Tabulka I: Nejběžnější fluorochromy používané v průtokové cytometrii
(dle Roubalová, 2012)
Název fluorochromu Zkratka
fluorochromu
Excitační vlnová
délka [nm]
Emisní vlnová
délka [nm]
Samostatné fluorochromy
Allophycocyanin APC 630 661
Fluorescein isothiocyanate FITC 488 530
Peridinin-chlorophyl-protein compex PerCP 488 675
Phycoerythrin PE 488 580
Fluorochromy v tandemu
Allophycocyanin – Cyanin 5.5 APC – Cy5.5 633 695
Allophycocyanin – Cyanin 7 APC – Cy7 633 785
Phycoerythrin – Cyanin 5 PE – Cy5 488 670
Phycoerythrin – Cyanin 7 PE – Cy7 488 780
Phycoerythrin – Texas Red PE – Texas Red 488 615
32
2.3.1.4 VÝHODY A NEVÝHODY PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE, JEJÍ APLIKACE
V dřívějších dobách byla průtoková cytometrie využívána k analýze buněk.
V současnosti lze analyzovat částice o různé velikosti, ať už se jedná o viry, chromozómy,
fragmenty DNA a další (Roubalová, 2012). Průtoková cytometrie nalezla své využití
v mnoha rozličných oborech, jako v buněčné a molekulární biologii, imunologii, genetice
a enviromentálních vědách (Robinson a Grégori, 2007). V klinické praxi je průtoková
cytometrie nejčastěji využívána v klinické imunologii (např. pro detekci autoprotilátek,
imunofenotypizaci lymfocytů, testování alergií, či určení viability spermatu),
hematoonkologii (např. imunofenotypizace leukémií) a nádorové a molekulární biologii
(např. pro analýzu buněčného cyklu, stanovení ploidie, sledování vzniku lékových
rezistencí a další) (Eckschlager a Bartůňková, 1999).
Průtoková cytometrie poskytuje svým uživatelům dvě nesporné výhody. První z nich je
možnost analýzy obrovského množství částic ve velmi krátkém čase. Získané údaje jsou
dostatečně reprezentativní a statisticky hodnotitelné. Z každé částice lze i při rychlosti sto
tisíc událostí za sekundu získat a analyzovat až dvacet parametrů. Druhou výhodou
průtokové cytometrie je možnost separovat jednotlivé částice ze směsi, procesem zvaným
třídění (sorting). Částice určené k separaci jsou sbírány do zkumavek, misek
nebo na podložní sklíčka (Robinson a Grégori, 2007).
Technika průtokové cytometrie nabízí vědeckým pracovníkům značnou mírů pozitiv
a aplikací. Při užívání průtokové cytometrie k rozmanitým analýzám se však mohou
objevit také jisté problémy, které je nutné překonat. Zmiňované problémy se týkají např.
analyzovaných vzorků, které obsahují organické materiály. Mezi vlastnosti organických
materiálů patří přilnavost ke kovovým, skleněným a plastovým materiálům, které jsou
samozřejmě také součástí průtokového cytometru (Shapiro, 2003). Jak již bylo řečeno,
technikou průtokové cytometrie lze analyzovat pouze částice ve formě suspenze. Pokud
jsou zkoumány buňky pevných tkání, musí být před samotnou analýzou jednotlivé buňky
separovány. Separace však může způsobit změnu nebo dokonce ztrátu zkoumaných
vlastností buněk (Givan, 2004).
33
2.3.2 LEKTINY
Lektiny, dříve nazývané jako fytohemaglutininy (na základě schopnosti aglutinovat
červené krvinky), vytváří heterogenní skupinu glykoproteinů, která se vyznačuje
schopností vytvářet nekovalentní vazbu s cukernými zbytky komplexních
glykokonjugantů. Jedná se o proteiny, které vykazují specifickou afinitu vůči konkrétním
sacharidům.
Lektiny jsou syntetizovány bezpočtem druhů organizmů. Nalezneme je u živočichů,
rostlin, ale také hub a mikrooganismů (Vodrážka, 2007). Lektiny z jednotlivých druhů
organismů se liší aminokyselinovou sekvencí, molekulovou hmotností, počtem
podjednotek, glykanovou specifitou, termostabilitou a pH stabilitou (Wang a kol. 1995).
Lektiny jsou zapojeny v mnoha biologických procesech, jako např. v mezibuněčné
komunikaci, indukci apoptózy, interakci patogena a hostitele, šíření a diferenciace
rakovinných buněk a dalších dějích (Huskens a Schols, 2012). Pro svůj vysoký biologický
potenciál jsou lektiny také využívány v různých biomedicínských výzkumech
(Nascimento-Neto a kol., 2012). Lektiny vykazují proti-nádorové, insekticidní,
antinematodní, antifungální a antibakteriální vlastnosti, působí jako modulátory imunitního
systému a také jako inhibitory reverzní transkriptázy viru HIV-1.
Lektiny mohou být klasifikovány na základě glykanové specifity, jež vykazují
nebo na základě jejich všeobecné struktury. Podle struktury jsou lektiny členěny
na merolektiny, hololektiny a chimerolektiny. (Lam a kol., 2011). Merolektiny lze
definovat, jako lektiny nesoucí pouze jednu sacharid vazebnou doménu. Hololektiny jsou
charakteristické přítomností dvou či více stejných nebo podobných glykan-vazebných
domén. Chimerolektiny obsahují jednu nebo více glykan-vazebných domén, dále však také
domény s odlišnou biologickou funkcí (Peumans a Van Damme, 1995). Jak již bylo
řečeno, lektiny mohou být dále členěny na základě afinity k jednotlivým monosacharidům.
Většina lektinů vykazuje glykanovou specifitu vůči manóze, glukóze, galaktóze, fukóze,
N-acetylglukosaminu (GlcNAc), N-acetylgalaktosaminu (GalNAc)
a/nebo N-acetylneruraminidové (sialové) kyselině (Auwerx a kol., 2008).
Lektiny lze získávat dvěma způsoby, a to produkcí lektinů expresními systémy,
využívajících technologii rekombinatní DNA nebo jejich izolací z přírodních zdrojů
chromatografickými metodami. Mezi chromatografické techniky využívané k izolaci
lektinů patří iontově-výměnná chromatografie, afinitní chromatografie, gelová
chromatografie a hydrofóbní chromatografie (Lam a kol., 2011). V současné době bylo
34
blíže prostudováno přes 50 různých lektinů. Komerčně dostupné lektiny se využívají jako
ligandy v afinitní chromatografii a v biochemickém výzkumu, kde své uplatnění nachází
jako sondy vhodné pro mapování buněčných povrchů (Vodrážka, 2007). Lektiny, ale také
protilátky, slouží jako vhodné nástroje pro identifikaci glykanů. Přestože monoklonální
protilátky mohou vykazovat vyšší specifitu vůči cukerným determinantám, u rostlinných
i živočišných lektinů je lépe charakterizována vazebná specifita, jsou stabilnější a levnější
(Varki a kol., 2009).
35
3 CÍLE PRÁCE
1) Seznámení se s průtokovou cytometrií.
2) Optimalizace podmínek adsorpce pomocných protilátek na mikrosféry.
3) Optimalizace podmínek vazby gp120 proteinu na mikropartikule potažené vaznou
protilátkou.
4) Charakterizace navázaného gp120 proteinu pomocí vybraných lektinů.
36
4 MATERIÁL A METODIKA
4.1 BIOLOGICKÝ MATERIÁL
4.1.1 GLYKOPROTEIN gp120
Reaktivita lektinů byla testována s rekombinantním glykoproteinem gp120,
produkovaným buněčnou linií 293T a RD. Jednotlivé gp120 se liší svými glykosylačními
profily. Oba rekombinantní proteiny nesou peptidové značky HIS Tag a V5 Tag.
Koncentrace gp120 byla stanovena srovnáním denzity proužku gp120 proteinu s denzitou
proužků odpovídajících titrační řadě kalibračního proteinu po SDS-PAGE a obarvení
proteinů Coomassie Brilliant Blue R-250.
Charakterizace gp120:
293T (1 mg/ml)
- gp120 produkovaný stabilně transfekovanou buněčnou linií lidských
embryonálních ledvin (HEK) obsahující T antigen
RD (3,3 mg/ml)
- gp120 produkovaný stabilně transfekovanou buněčnou lini lidského
rhabdomyosarkomu; před použitím byl protein naředěn v PBS na koncentraci
1mg/ml
4.1.2 LEKTINY
Charakteristika glykosylačních profilů vybraných gp120 proteinů byla provedena
pomocí tří lektinů s rozdílnou karbohydrátovou specifitou: AAL, GNL a PHA-L lektinu.
Lektiny nesou biotynylovou značku, díky čemuž mohou být detekovány pomocí
streptavidinu konjugovaného s fykoerytrinem.
Charakterizace lektinů:
Galanthus nivalis lectin (GNL) (2 mg/ml) (Vector)
- jedná se o tetramerní aglutinin, vykazující afinitu vůči (α-1,3) D-manóze. Relativní
molekulová hmotnost tohoto tetramerního glykoproteinu je 50 kDa (Hester a kol.,
1995).
37
Aleuria aurantia lectin (AAL) (2 mg/ml) (Vector)
jedná se o dimerní lektin, tvořený ze dvou identických podjednotek. Každá
podjednotka má velikost asi 36 kDa. AAL vytváří vazbu s fukózou, připojenou
(α-1,6) na N-acetylglukosamin nebo s fukózou připojenou (α -1,3) na struktury
podobné N-acetyllactosaminu.
Phaseolus vulgaris leucoagglutin (PHA-L) (2 mg/ml) (Vector)
- PHA-L je tetramerní fytohematoglutin o velikosti 126 kDa. Díky schopnosti
aglutinovat leukocyty a indukovat mitogenní aktivitu T-lymfocytů dostal své
označení L. Vykazuje afinitu vůči terminálním reziduúm manózy, galaktózy
a N-acetylglukosaminu komplexních glykanů savčích glykoproteinů (Liener a kol.,
1986).
4.1.3 OSTATNÍ BIOLOGICKÝ MATERIÁL
- Monoklonální protilátka pentaHis (Quiagen)
- Monoklonální protilátka Mouse anti-V5 – TAG FITC (AbD Serotec)
- Streptavidin – PE (eBioscience)
- N-Glycanase (Peptide N-Glycosidase F; PNGasaF)* (Prozyme)
______________________________________________________________________
* Společně s enzymem byl dodán také 5 x Tris N-glycanase reakční pufr
38
4.2 ROZTOKY A CHEMIKÁLIE
- Blokační pufr (4% FBS v 1x PBS)**
- PBS, Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (Invitrogen)
- Konjugační pufr (BD Biosciences (BDTM
CBA))
- Uskladňovací pufr (BD Biosciences (BDTM
CBA))
- Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyklohexan-1-karboxylát
(Sulfo-SMCC) (Thermo Scientific)
- N-Ethylmaleimid (NEM) (Thermo Scientific)
- Deionizovaná voda (dH2O)
- Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich)
- Dithiothreitol (DTT) (Duchefa)
______________________________________________________________________
** Příprava blokačního pufru:
- Ke 2 ml fetálního bovinnního séra (FBS) přidat 48 ml 1 x PBS. Roztok přefiltrovat
a skladovat při 4 ºC.
4.3 MIKROSFÉRY
K analýze reaktivity lektinů s rekombinantním gp120 proteinem, byly použity
polystyrenové mikrosféry (BDTM
CBA Functional Bead A6) značené dvěma
fluorochromy: APC a APC-Cy7. Na trhu jsou mikrosféry k dostání v různých velikostech,
a to s negativně nabitými sulfoskupinami nebo pozitivně nabitými aminoskupinami, které
jsou lokalizovány na jejich povrchu. Pro účely mé diplomové práce byly vybrány
mikrosféry s navázanými sulfoskupinami.
Za účelem vazby proteinu na povrch mikropartikulí je nutné zredukovat sulfoskupiny
(S-S) na povrchu mikrosfér, pomocí redukčního činidla dithiothreitolu (DTT). Konjugace
proteinu na mikrosféry je umožněna pomocí heterobifunkčního kross-linkeru
sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyklohexan-1-karboxylátu (sulfo-SMCC), který
kovalentně konjuguje molekulu proteinu obsahující volnou aminoskupinu
se sulfhydrylovou skupinou mikropartikule. Aby v dalších krocích nedocházelo
k nespecifickým vazbám jiných proteinů na povrch mikropartikulí, musí být nezreagované
sulfhydrylové skupiny mikrosfér zablokovány pomocí N-ethylmaleimidu (NEM). NEM je
39
alkylační činidlo, které reaguje se sulfhydrylovými skupinami za vzniku stabilních
thioeterických vazeb. Takto připravené mikrosféry je možné dále využívat k testování
reaktivity požadovaných molekul. Schéma přípravy mikrosfér s konjugovaným proteinem
je zobrazeno na obrázku č. 6.
Obrázek č. 6: Schéma přípravy mikrosfér s konjugovaným proteinem. (Upraveno dle BD
manual)
4.4 LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ
Analytické váhy (Metter AE 240)
Bio-Spin 30 Tris kolona (BioRad)
Flow box (LC 212)
Malá stolní centrifuga (Mikro 22R)
Mikropipeta 0,5 μl – 10 μl (Labsystems)
Mikropipeta 5 μl – 40 μl (Labsystems)
Mikropipeta 20 μl – 200 μl (Labsystems)
Mikropipeta 100 μl – 1000 μl (Eppendorf)
Průtokový cytometr (BD FACS Canto II)
Sonikační lázeň (Transsonic T460)
Termostat (BT 120M LabMet)
Třepačka (bioSan)
Velká laboratorní centrifuga (CR 322)
Vortex (IKA® MS3 basic)
40
4.5 PŘÍPRAVA MIKROPARTIKULÍ S KONJUGOVANÝM REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM NAVÁZANÝM PŘES pentaHIS PROTILÁTKU (1000 μl SUSPENZE)
4.5.1 PŘÍPRAVA MIKROSFÉR
1. 150 μl roztoku zvortexovaných, fluorescenčně značených mikrosfér bylo přeneseno
do mikrocentrifugační zkumavky o objemu 1,5 ml. Zkumavka byla z důvodu
ochrany mikrosfér před světlem zabalena do alobalu.
2. Zkumavka s mikrosférami byla ponořena do sonikační lázně po dobu 1 min.
3. K mikrosférám bylo přidáno 3,8 μl 1M DTT. Následovala inkubace na třepačce
(1h, 200 otáček/min, tma).
4. K mikrosférám byl přidán 1ml konjugačního pufru.
5. Roztok byl zcentrifugován (3 min při 900 x g). Po centrifugaci byl odstraněn
supernatant.
6. Kroky 5 a 6 byly 3x zopakovány.
7. Mikrosféry byly resuspendovány v 40 μl konjugačního pufru.
4.5.2 MODIFIKACE pentaHIS PROTILÁTKY
Ke 180μl pentaHIS protilátky (1 mg/ml) byly přidány 4 μl čerstvě připraveného
roztoku sulfo-SMCC (2 mg rozpustit v 1 ml dH2O). Roztok byl inkubován na třepačce
(200 otáček/min) po dobu 1h.
4.5.3 VÝMĚNA PUFRU PRO ODSTRANĚNÍ NEZREAGOVANÝCH KOMPONENT
1. Bio-Rad Spin kolona byla 3x promyta konjugačnim pufrem.
2. Kolona byla přenesena do zkumavky a centrifugována po dobu 2 min při 1000 x g.
Tímto krokem byl z kolony odstraněn veškerý zbylý konjugační pufr.
3. Kolona byla přenesena do nové zkumavky. Na kolonu byl nanesen roztok obsahující
modifikovanou pentaHIS protilátku. Kolona byla centrifugována po dobu 2 min 15
s při 1000 x g. Tímto krokem byl přenesen modifikovaný protein do zkumavky.
41
4.5.4 VAZBA pentaHIS PROTILÁTKY NA MIKROPARTIKULE
1. PentaHIS protilátka byla přenesena do mikrocentrifugační zkumavky obsahující
připravené funkční mikrosféry. Roztok byl inkubován na třepačce
(1h, 200 otáček/min, tma).
2. Do mikrozkumavky obsahující funkční částice s konjugovanou pentaHIS
protilátkou bylo přidáno 4 μl NEM (2 mg NEM rozpustit v 1 ml DMSO). Suspenze
byla inkubována na třepačce (15 min, 200 otáček/min, tma).
3. K roztoku byl přidán 1 ml uskladňovacího pufru.
4. Roztok byl centrifugován 3 min při 900 x g. Po centrifugaci byl odstraněn
supernatant.
5. Kroky 8 a 9 byly 3x zopakovány.
4.5.5 NAVÁZÁNÍ REKOMBINANTNÍHO gp120 PROTEINU NA MIKROSFÉRY AKTIVOVANÉ pentaHIS PROTILÁTKOU
1. Pelet obsahující mikrosféry s konjugovanou pentaHIS protilátkou byl
resuspendován v 1 ml blokačního roztoku (4% FBS v 1x PBS). Blokace mikrosfér
probíhala ve tmě po dobu 1h. Blokace slouží k zabránění nespecifického vázání
gp120 na povrch mikrosfér.
2. Po hodinové blokaci byl roztok centrifugován 5 min při 1000 x g. Supernatant byl
odstraněn.
3. K peletu bylo přidáno 180 μl gp120 proteinu (1 mg/ml). Po vortexování následovala
inkubace na třepačce (1,5h, 200 otáček/min, tma).
4. Po inkubaci byl k roztoku přidán 1 ml uskladňovacího pufru. Roztok byl
centrifugován 5 min při 1000 x g. Po centrifugaci byl odstraněn supernatant.
5. Pelet byl resuspendován v 1 ml uskladňovacího pufru (koncentrace mikrosfér
odpovídá 6 x 106 mikrosfér v 1 ml). Takto připravené mikrosféry byly skladovány
ve tmě při 4 ºC a byly dále používány pro další práci.
42
4.6 OPTIMALIZACE ŘEDĚNÍ LEKTINŮ A CHARAKTERIZACE JEJICH REAKTIVITY S gp120 PROTEINEM
Po přípravě mikrosfér s navázaným gp120 proteinem (293T, RD) bylo testováno
optimální ředění sady vybraných lektinů (AAL, GNL a PHA-L). Lektiny byly před
použitím 100 x naředěny v PBS na koncentraci 0,02 mg/ml. Reaktivita lektinů
s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) byla testována v následujících
ředěních: AAL – 5 000 x, 10 000 x, 20 000 x, 40 000 x, 60 000 x a 80 000 x;
GNL – 50 000 x, 80 000 x, 100 000 x; PHA-L – 200 x, 300 x, 400 x, 500 x, 1000 x,
2000 x, 4000 x.
Reakční směs o objemu 500 μl, obsahující blokační pufr (4% FBS v 1x PBS),
mikrosféry s konjugovaným gp120 (293T, RD) a lektin (AAL, GNL nebo PHA-L) byla
inkubována ve tmě na třepačce (200 otáček) po dobu 1,5h. Reakční směs byla následně
zcentrifugována (6 min, 1000 g). Po odsátí 400 μl supernatantu bylo zbylých 100 μl
reakční směsi vortexováno a rozděleno po 50 μl do dvou zkumavek. Jedna zkumavka
prezentuje negativní kontrolu 1 (NK1), do druhé bylo přidáno 2 μl detektoru
(streptavidin – PE (0,2 mg/ml)).
Kromě NK1 byla připravena také negativní kontrola 2 (NK2). NK2 byla připravena
následujícím způsobem: do 47,5 μl blokačního pufru bylo přidáno 2,5 μl připravených
mikrosfér s konjugovaným gp120 proteinem a 2 μl detektoru (streptavidin-PE).
NK2 neosahuje lektin.
43
Do všech zkumavek bylo následně napipetováno 0,5 μl anti-V5 protilátky značené
fluorochromem FITC (fluorescein isothiokyanát), 10 x naředěné v PBS.
Anti-V5 – FITC ověřuje vazbu gp120 na pentaHIS protilátku, konjugovanou
na mikrosféry. Reakční směs byla inkubována ve tmě na třepačce (160 otáček) po dobu
1h. Po inkubaci byl do zkumavek přidán 1 ml PBS. Po centrifugaci (6 min, 1000g) byl
odstraněn supernatant a pelet byl resuspendován ve 150 μl PBS. Reaktivita lektinů byla
prověřována pomocí průtokového cytometru. Složení vlastního vzorku, NK1 a NK2 je
graficky znázorněno v tabulce II.
Tabulka II: Grafické znázornění komponent jednotlivých vzorků
NK1 NK2 Vlastní vzorek
44
Optimální ředění lektinů bylo stanoveno na základě nejvyšší dosažené reaktivity
s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD). Rozpis množství konkrétních reagencií
u optimalizovaných ředění je zaznamenán v tabulce.
Tabulka III: Složení reakční směsi obsahující optimalizované ředění lektinů
Gp120 Lektin
[0,02 mg/ml ]
Ředění Reagencie Množství
[μl]
293T
GNL
80 000 x
Mikrosféry 5,0
Lektin 0,6
4% FBS v 1x PBS 494,4
AAL
10 000 x
Mikrosféry 5
Lektin 5
4% FBS v 1x PBS 490
PHA-L
2 000 x
Mikrosféry 5
Lektin 25
4% FBS v 1x PBS 470
RD
GNL
80 000 x
Mikrosféry 5
Lektin 0,6
4% FBS v 1x PBS 494,4
AAL
10 000 x
Mikrosféry 5
Lektin 5
4% FBS v 1x PBS 490
PHA-L
300 x
Mikrosféry 5
Lektin 167
4% FBS v 1x PBS 328
45
4.7 DEGLYKOSYLACE gp120 PROTEINU VÁZANÉHO
NA MIKROSFÉRY POMOCÍ PNGasy F
Mikrosféry s konjugovaným gp120 proteinem (293T, RD) byly 5 x promyty v 1x PBS.
Tento krok slouží k odstranění azidu sodného, jež je součástí uskladňovacího pufru.
K mikrosférám s gp120 byl přidán 5x Tris reakční pufr, destilovaná voda
a enzym peptid N-glykosidasa F (PNGasa F), jejíž aktivitou dochází k odstranění
N-glykanů. Jako kontrola sloužily vzorky, do nichž enzym přidán nebyl. Reakční směs
byla inkubována v termostatu (37 ºC) po dobu 36 h. Přesný rozpis množství jednotlivých
reagencií je uveden v tabulce IV.
Tabulka IV: Složení reakční směsi u vlastního (deglykosylovaného) vzorku a kontroly
Bez enzymu
(kontrola)
S enzymem
(vlastní vzorek)
Mikrosféry 5 μl 5 μl
Destilovaná voda 19 μl 17 μl
5 x Tris pufr 6 μl 6 μl
PNGasa F ---- 2 μl
Celkový objem 30 μl (1 test) 30 μl (1 test)
Po inkubaci byl roztok s mikrosférami 5 x promyt, aby došlo k odstranění enzymu.
Následně byla testována reaktivita jednotlivých lektinů o optimalizovaném ředění (dle
modifikovaného postupu viz. 4.6). Modifikace spočívá ve vynechání přípravy NK1 a NK2.
Po zcentrifugování 500 μl reakční směsi bylo odpipetováno 450 μl. Do zbylých 50 μl bylo
přidáno 0,5 μl anti-V5-FITC protilátky a 2 μl streptavidinu – PE.
46
5 VÝSLEDKY
Součástí analýzy cukerné komponenty rekombinantního gp120 proteinu pomocí sady
vybraných lektinů byly dva experimenty. Cílem prvního experimentu, bylo nalezení ředění
lektinů (AAL, GNL, PHA-L) poskytující optimální reaktivitu s rekombinantním gp120
proteinem (293T a RD). Druhý experiment byl zaměřen na analýzu reaktivity
optimalizované koncentrace lektinu (AAL, GNL, PHA-L) s gp120 proteinem (293T, RD)
po ošetření enzymem PNGasou F.
Vazba lektinů (AAL, GNL a PHA-L) na rekombinantní gp120 protein (293T, RD) byla
ověřována pomocí streptavidinu značeného fykoerytrinem. Detekce lektinů pomocí
streptavidinu je možná díky přítomnosti biotynylové značky, která je součástí komerčně
dodávaných lektinů, používaných v této diplomové práci. Jako negativní kontroly byly
použity vzorky NK1 a NK2, které určovaly hladinu pozadí. Na základě srovnání
s negativními kontrolami byly v rámci histogramu stanoveny oblasti pozitivní reaktivity:
G1 (gate 1) - vymezuje populaci mikrosfér s navázaným lektinem, který je detekován
pomocí streptavidinu; G2 (gate 2) - vymezuje populaci mikrosfér s konjugovaným gp120
proteinem, který je detekován pomocí anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru.
Reaktivita lektinů byla vypočítána jako rozdíl hodnoty získané měřením vlastního
vzorku (% událostí v G1) a nejvyšší hodnoty pozadí (% událostí v G1), získané v rámci
jednoho experimentu. Změna reaktivity lektinů s rekombinantním gp120 proteinem (293T,
RD) po deglykosylaci byla vztahována ke kontrolnímu vzorku, který deglykosylaci
podroben nebyl. Hodnotě kontrolního vzorku bylo ve vztahu ke vzorku podrobenému
deglykosylaci přisouzeno 100 %.
47
Vazba rekombinantního gp120 proteinu (293T, RD) na pentaHIS protilátku, která je
konjugována na mikropartikule, byla při každé průtokově-cytometrické analýze ověřena
pomocí mouse anti-V5-TAG Ig detektoru značeného fluorescein isothiokyanátem (FITC).
Příklad výstupu z průtokového cytometru je uveden na obrázku č. 7 a 8. Populace
mikrosfér, u níž došlo k navázání mouse anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru
na rekombinantní gp120 protein, je lokalizována v rámci gate 2 (G2). Jednotlivé výsledky
určující úspěšnost vazby mouse anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru na gp120
rekombinantní protein jsou uvedeny v příslušných tabulkách.
Obrázek 7: Mikrosféry před ověřením vazby gp120 pomocí
anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru
48
Obrázek č. 8: Ověření vazby gp120 na vaznou pentaHIS protilátku konjugovanou
na mikrosféry pomocí anti-V5-TAG – FITC Ig detektoru
Legenda k tabulkám V, VII a IX:
Vlastní vzorek - mikrosféry s navázaným gp120 po inkubaci s lektinem,
streptavidin-PE a anti-V5-TAG Ig detektorem; NK1 - mikrosféry s navázaným gp120
po inkubaci s mouse anti-V5 – TAG – FITC Ig detektorem a lektinem
(bez streptavidin - PE); NK2 - mikrosféry s navázaným gp120 po inkubaci s mouse
anti-V5 – TAG FITC Ig detektorem a streptavidin-PE (bez lektinu);
G1 (gate 1) - vymezuje populaci mikrosfér s navázaným lektinem, který je detekován
pomocí streptavidinu; G2 (gate 2) - vymezuje populaci mikrosfér s navázaným gp120,
který je detekován anti-V5-TAG – FITC Ig detektorem
Legenda k tabulkám VI, VIII a X:
kontrola – mikrosféry s navázaným gp120 proteinem (293 / RD), který nebyl podroben
deglykosylaci; PNGasa F – mikrosféry s navázaným gp120 proteinem (293T / RD), který
byl po navázání podroben deglykosylaci PNGasouF; G1 (gate 1) - vymezuje populaci
mikrosfér s navázaným lektinem, který je detekován pomocí streptavidinu; G2 (gate 2) -
vymezuje populaci mikrosfér s navázaným gp120, který je detekován anti-V5-TAG –
FITC Ig detektorem
49
5.1 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEKTINU ALEURIA AURANTIA (AAL)
5.1.1 ANALÝZA REAKTIVITY AAL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD)
Reaktivita lektinu AAL s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) byla testována
v následujících ředěních AAL lektinu: 5 000 x, 10 000 x, 20 000 x, 40 000 x, 60 000 x
a 80 000 x. Ředění AAL lektinu, při němž bylo dosaženo nejlepších výsledků bylo ředění
10 000 x. Výsledky průtokově-cytometrické analýzy jsou zaznamenány v tabulce V.
Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny na obrázku č. 9.
Procentuální zastoupení mikrosfér v gate 2 (G2) se pohybovalo od 99,3 % do 99,9 %.
Získané výsledky potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního gp120 proteinu (293T,
RD) na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry. Reaktivita AAL s gp120 byla
stanovena jako rozdíl procentuálního zastoupení mikrosfér v gate 1 (G1) u vlastního
vzorku a nejvyšší hodnoty pozadí, které prezentují negativní kontroly. Při ředění
poskytujícím nejlepší výsledky (ředění 10 000 x) byla reaktivita AAL s 293T 83,3 %
a s RD 84,6 %.
Tabulka V: Stanovení reaktivity lektinu Aleuria aurantia (AAL) s rekombinantním gp120
proteinem (293T, RD)
Lektin Rekombinantní
gp120
Typy vzorků Vazba
streptavidin – PE
(% událostí v G1)
Vazba mouse anti-
V5-TAG – FITC
(% událostí v G2)
AAL
293T
NK1 0,4 99,3
NK2 0,1 99,7
Vlastní vzorek 83,7 99,6
RD
NK1 0,6 99,8
NK2 0,1 99,9
Vlastní vzorek 85,2 99,4
50
Obrázek 9: Průtokově-cytometrická analýza reaktivity lektinu Aleuria aurantia (AAL)
s rekombinantním gp120 proteinem (293T a RD)
51
5.1.2 ANALÝZA REAKTIVITY AAL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F
Po nalezení optimálního ředění AAL lektinu byly mikrosféry s navázaným gp120
proteinem (293T, RD) podrobeny deglykosylaci. Výsledky průtokově-cytometrické
analýzy jsou zaznamenány v tabulce VI. Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny
na obrázku č. 10 a 11.
Procentuální zastoupení mikrosfér v gate 2 (G2) se pohybovalo od 96,9 % do 99,6 %.
Získané výsledky potvrzují, že došlo k navázání gp120 proteinu (293T, RD) na pentaHIS
protilátku konjugovanou na mikrosféry a že během inkubace nedošlo k jeho ztrátám.
Reaktivita AAL s rekombinantním gp120 proteinem byla stanovena na základě
procentuálního zastoupení mikrosfér v gate 1 (G1).
Reaktivita AAL s 293T, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 98,1 %.
Reaktivita AAL s 293T, který byl ošetřen PNGasou F, byla 52,9 %. Pokud bereme
reaktivitu kontroly ve vztahu k reaktivitě vzorku podrobenému deglykosylaci jako 100%,
došlo po ošetření vzorku PNGasou F k poklesu reaktivity AAL s 293T o 46,1 %.
Reaktivita AAL s RD, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 81,6 %.
Reaktivita AAL s RD, který byl ošetřen PNGasou F, byla 0,5 %. Po enzymatickém
ošetření gp120 exprimovaného buněčnou linií RD PNGasouF došlo ve vztahu ke kontrole
k poklesu reaktivity AAL s RD o 81,0 %.
Tabulka VI: Stanovení reaktivity lektinu Aleuria aurantia (AAL) s rekombinantním gp120
proteinem (293T, RD) po deglykosylaci
Lektin Rekombinantní
gp120
Typy vzorků Vazba
streptavidin – PE
(% událostí v G1)
Vazba mouse anti-
V5-TAG – FITC
(% událostí v G2)
AAL
293T
Kontrola 98,1 96,9
PNGasa F 52,9 99,6
RD
Kontrola 81,6 99,0
PNGasa F 0,5 99,2
52
Obrázek 10: Analýza reaktivity lektinu AAL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,
RD) u kontrolních vzorků
Obrázek 11: Analýza reaktivity lektinu AAL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,
RD) po ošetření enzymem PNGasouF
53
5.2 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEKTINU GALANTHUS NIVALIS (GNL)
5.2.1 ANALÝZA REAKTIVITY GNL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD)
Reaktivita lektinu GNL s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) byla testována
v ředěních 50 000 x, 80 000 x a 100 000 x. Ředění GNL lektinu, při němž bylo dosaženo
nejlepších výsledků, bylo ředění 80 000 x u obou proteinů (293T, RD). Výsledky
průtokově-cytometrické analýzy jsou zaznamenány v tabulce VII. Výstupy z průtokového
cytometru jsou uvedeny na obrázku č. 12.
Procentuální zastoupení mikrosfér v gate 2 (G2) se pohybovalo od 99,1 % do 100 %.
Naměřené hodnoty potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního gp120 proteinu (293T,
RD) na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry.
Při ředění poskytujícím nejlepší výsledky (ředění 80 000 x) byla reaktivita GNL
s 293T 98,7 % a s RD 97,3 %. Reaktivita byla vypočítána jako rozdíl hodnoty získané
měřením vlastního vzorku (% událostí v G1) a nejvyšší hodnoty pozadí (% událostí v G1),
získané v rámci jednoho experimentu.
Tabulka VII: Stanovení reaktivity lektinu Galanthus nivalis (GNL) s rekombinantním
gp120 proteinem (293T, RD)
Lektin Rekombinantní
gp120
Typy vzorků Vazba
streptavidin – PE
(% událostí v G1)
Vazba mouse anti-
V5-TAG – FITC
(% událostí v G2)
GNL
293T
NK1 0,6 99,6
NK2 0,1 99,6
Vlastní vzorek 99,3 100,0
RD
NK1 0,1 99,1
NK2 0,1 99,1
Vlastní vzorek 97,4 99,4
54
Obrázek 12: Průtokově cytometrická analýza reaktivity lektinu Galanthus nivalis (GNL)
s rekombinantním gp120 proteinem (293T a RD)
55
5.2.2 ANALÝZA REAKTIVITY GNL S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F
Po nalezení optimálního ředění GNL lektinu byly mikrosféry s navázaným gp120
proteinem (293T, RD) podrobeny deglykosylaci. Výsledky průtokově cytometrické
analýzy jsou zaznamenány v tabulce VIII. Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny
v obrázku č. 13 a 14.
Procentuální zastoupení mikrosfér v gate 2 (G2) se pohybovalo od 94,9 % do 98,7 %.
Získané výsledky potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního gp120 proteinu (293T,
RD) na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry a že během inkubace nedošlo
k jeho ztrátám. Reaktivita GNL na gp120 byla stanovena na základě procentuálního
zastoupení mikrosfér v gate 1 (G1). Změna reaktivity GNL s rekombinantním gp120
proteinem (293T, RD) po deglykosylaci byla stanovena ve vztahu ke kontrolnímu vzorku,
jehož naměřené hodnotě bylo přiřazeno 100 %.
Reaktivita GNL s 293T, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 98,4 %.
Reaktivita GNL s 293T, který byl ošetřen PNGasouF, byla 61,1 %. Pokles reaktivity GNL
s glykosylovaným 293T a deglykosylovaným 293T byl 36,3 %.
Reaktivita GNL s RD, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 97,9 %.
Reaktivita GNL s RD, který byl ošetřen PNGasouF, byla 49,5 %. Pokles v reaktivitě GNL
s kontrolou a vzorkem podrobeným deglykosylaci činí 47,4 %.
Tabulka VIII: Stanovení reaktivity lektinu Galanthus nivalis (GNL) s rekombinantním
gp120 proteinem (293T, RD) po deglykosylaci
Lektin Rekombinantní
gp120
Typy vzorků Vazba
streptavidin – PE
(% událostí v G1)
Vazba mouse anti-
V5-TAG – FITC
(% událostí v G2)
GNL
293T
kontrola 98,4 98,2
PNGasa F 61,1 94,9
RD
kontrola 97,9 98,7
PNGasa F 49,5 97,1
56
Obrázek 13: Analýza reaktivity lektinu GNL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,
RD) u kontrolních vzorků
Obrázek 14: Analýza reaktivity lektinu GNL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,
RD) po ošetření PNGasouF
57
5.3 ANALÝZA CUKERNÉ KOMPONENTY gp120 (293T, RD) POMOCÍ LEUKOAGLUTININU Z PHASEOLUS VULGARIS (PHA-L)
5.3.1 ANALÝZA REAKTIVITY PHA-L S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD)
Reaktivita lektinu PHA-L s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) byla
testována v ředěních 200 x, 300 x, 400 x, 500 x, 1000 x, 2000 x a 4000 x. Ředění PHA-L
lektinu, při němž bylo dosaženo nejlepších výsledků bylo ředění 300 x u proteinu RD
a 2000 x u proteinu 293T. Optimální ředění lektinu PHA-L se tedy pro jednotlivé proteiny
(293T, RD) výrazně lišilo. Výsledky průtokově-cytometrické analýzy jsou zaznamenány
v tabulce IX. Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny na obrázku č. 15.
Procentuální zastoupení mikrosfér v gate 2 (G2) se pohybovalo od 99,6 % do 99,8 %.
Získané údaje potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního gp120 proteinu (293T, RD)
na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry. Reaktivita PHA-L byla vypočítána
jako rozdíl hodnoty získané měřením vlastního vzorku (% událostí v G1) a nejvyšší
hodnoty pozadí (% událostí v G1), získané v rámci jednoho experimentu. Reaktivita
lektinu PHA-L s 293T při ředění 2000 x byla 84,7 %. Reaktivita PHA-L s RD při ředění
300 x byla 79,2 %.
Tabulka IX: Stanovení reaktivity lektinu Phaseolus vulgaris leucoagglutin (PHA-L)
s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD)
Lektin Rekombinantní
Gp120
Typy vzorku Vazba
streptavidin – PE
(% událostí v G1)
Vazba mouse anti-
V5-TAG – FITC
(% událostí v G2)
PHA – L
293T
NK1 0,0 99,8
NK2 0,1 99,6
Vlastní vzorek 84,8 99,7
RD
NK1 0,2 99,7
NK2 0,0 99,6
Vlastní vzorek 79,4 99,9
58
Obrázek 15: Průtokově-cytometrická analýza reaktivity lektinu Phaseolus vulgaris
(PHA-L) s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD)
59
5.3.2 ANALÝZA REAKTIVITY PHA-L S REKOMBINANTNÍM gp120 PROTEINEM (293T, RD) PO ENZYMATICKÉM OŠETŘENÍ PNGasou F
Po nalezení optimálního ředění PHA-L lektinu byly mikrosféry s navázaným gp120
proteinem (293T, RD) podrobeny deglykosylaci. Výsledky průtokově cytometrické
analýzy jsou zaznamenány v tabulce X. Výstupy z průtokového cytometru jsou uvedeny
v obrázku č. 16 a 17.
Naměřené hodnoty procentuálního zastoupení mikrosfér v gate 2 (G2) se pohybovaly
od 88,5 % do 99,6 %. Naměřené hodnoty potvrzují, že došlo k navázání rekombinantního
gp120 proteinu (293T, RD) na pentaHIS protilátku konjugovanou na mikrosféry
a že během inkubace nedošlo k jeho výrazným ztrátám.
Reaktivita PHA-L s gp120 byla stanovena na základě procentuálního zastoupení
mikrosfér v gate 1 (G1). Změna reaktivity PHA-L s rekombinantním gp120 proteinem
(293T, RD) po deglykosylaci byla stanovena ve vztahu ke kontrolnímu vzorku, jehož
naměřená hodnota odpovídala 100 %. Reaktivita PHA-L s 293T, který nebyl podroben
deglykosylaci (kontrola), byla 96,9 %. Reaktivita PHA-L s 293T, který byl ošetřen
PNGasouF, byla 0,3 %. Rozdíl reaktivit PHA-L u kontroly a vzorku, který byl podroben
deglykosylaci, činí 96,6 %.
Reaktivita PHA-L s RD, který nebyl podroben deglykosylaci (kontrola), byla 85,8 %.
Reaktivita PHA-L s RD, který byl ošetřen PNGasouF, byla 3,6 %. Pokud bereme kontrolu
ve vztahu ke vzorku podrobenému deglykosylaci jako 100 %, došlo po ošetření vzorku
PNGasou F k poklesu reaktivity PHA-L o 81,6 %.
Tabulka X: Stanovení reaktivity lektinu Phaseolus vulgaris (PHA-L) s rekombinantním
gp120 proteinem (293T, RD) po deglykosylaci
Lektin Rekombinantní
gp120
Typy vzorků Vazba
streptavidin – PE
(% událostí v G1)
Vazba mouse anti-
V5-TAG – FITC
(% událostí v G2)
PHA-L
293T
Kontrola 96,9 99,6
PNGasa F 0,3 99,9
RD
Kontrola 85,8 93,8
PNGasa F 3,6 88,5
60
Obrázek č. 16: Analýza reaktivity lektinu PHA-L s rekombinantním gp120 proteinem
(293T, RD) u kontrolních vzorků
Obrázek č. 17: Analýza reaktivity lektinu GNL s rekombinantním gp120 proteinem (293T,
RD) po ošetření PNGasou F
61
6 DISKUZE
Cílem této diplomové práce byla optimalizace analytické metody, umožňující studium
proteinu gp120 za nativních podmínek. Analýza protein metodou průtokové cytometrie
pomocí fluorescenčně značených mikropartikulí poskytuje několik výhod. Mikrosféry
disponují velkým vazebným povrchem, díky čemuž dochází k omezení sterického bránění
mezi navázanými proteiny. Fluorescenčně značené mikropartikule umožňují taktéž
současné měření několika odlišných parametrů, a to pomocí proteinů nesoucích různou
fluorescenční značku, tzv. multiplexní analýzu. V neposlední řadě lze mikrosféry využít ke
studiu cukerných komponent glykoproteinů – deglykosylačním studiím. Díky možnosti
centrifugace vzorků v jakémkoliv stádiu experimentu je možné používat velmi malé
objemy jednotlivých reagencií. Jelikož inkubační podmínky ani enzymatické působení
nezpůsobují degradaci mikrosfér, ani ztrátu analyzovaných proteinů, lze analyzované
glykoproteiny navázat na povrch mikrosfér před samotným enzymatickým ošetřením. To
je pro vyhodnocení efektu deglykosylace klíčové. Na rozdíl od metody ELISA (Enzyme-
Linked ImmunoSorbent Assay) tak nedochází ke změně množství enzymaticky ošetřeného
antigenu, který je předmětem analýzy.
Využití fluorescenčně značených mikrosfér tedy nachází mnohá použití a nabízí oproti
dnes konvenčně používaným metodám mnoho výhod. Hlavní nevýhodu fluorescenčně
značených mikropartikulí představuje jejich pořizovací cena, která omezuje jejich použití
v klinické praxi.
V rámci této diplomové práce byly analyzovány cukerné komponenty rekombinantního
gp120 proteinu, exprimovaného savčí buněčnou linií 293T (buněčná linie lidských
embryonálních ledvin) a RD (buněčná linie rhabdomyosarkomu) metodou průtokové
cytometrie pomocí tří vybraných lektinů s rozdílnou karbohydrátovou specifitou: Aleuria
aurantia lektinu (AAL) s afinitou k fukóze, připojené (α-1,6) na N-acetylglukosamin nebo
(α -1,3) na struktury podobné N-acetyllactosaminu (Yamashita a kol., 1985), Galanthus
nivalis lektinu (GNL) se specifitou vůči (α-1,3) D-manóze (Hester a kol., 1995)
a Phaseolus vulgaris leukoaglutininu (PHA – L), který se specificky váže na terminální
rezidua manózy, galaktózy a N-acetylglukosaminu komplexních glykanů savčích
glykoproteinů (Liener a kol., 1986).
V rámci prvního experimentu byla testována reaktivita jednotlivých lektinů
s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD). Jako optimální ředění lektinů, při němž
62
bylo dosaženo nejvyšší reaktivity s gp120 proteinem (293T, RD), bylo vytestováno ředění
10 000 x pro AAL a 80 000 x pro GNL. Lektiny AAL i GNL reagovaly při jmenovaných
ředěních přibližně stejně s oběma rekombinantními gp120 proteiny – 293T a RD. Množství
navázaného gp120 proteinu bylo vždy normalizovánu reakcí gp120 navázaného
na mikrosféry s V5 specifickou protilátkou. Reakce s V5 byla použita jako kontrolní
a může bsloužit k normalizaci navázaného proteinu v případě testování velkého množství
variant gp120. Reaktivita AAL s 293T odpovídala 83,3 % a 84,6 % s RD. Nejvyšší
reaktivity s rekombinantím gp120 proteinem (293T, RD), bylo ze všech testovaných
lektinů dosaženo u lektinu GNL, a to 98,7 % s 293T a 97,3 % s RD. Vysoká reaktivita
GNL při nízkých koncentracích lektinu s gp120 proteinem koresponduje s výsledky
výzkumu Yee a kol., (2011), v němž byla prokázána schopnost GNL inhibovat Env
zprostředkovanou buněčnou fúzi při relativně nízkých koncentracích lektinu. Reaktivita
GNL byla též ověřována ve studii Akashi a kol., (1998), v níž byla vyhodnocena reaktivita
GNL imobilizovaného na nanočástice (0,5 mg/ml) s gp120 proteinem, a to na 82 %.
U lektinu PHA-L byla rovněž stanovena optimální ředění pro vazbu lektinu na gp120
produkovaný buněčnou linií 293T a RD. Hodnoty optimální koncentrace se lišily. Nejvyšší
reaktivity s 293T bylo u PHA-L dosaženo při ředění 2000 x, a to 84,7 %. Nejlepší
výsledky při reakci s RD byly získány u PHA-L při ředění 300 x, tzn. při 10 x nižším
ředění než u 293T, a to 79,2 %. Z výsledků lze vyvodit, že rekombinantní gp120 protein
exprimovaný buněčnou linií RD obsahuje nižší počet triantenárních/tetraantenárních
komplexních N-glykanů, než gp120 produkovaný linií 293T. Získané výsledky
korespondují s výsledky výzkumu Raška a kol., (2010), v němž byla analyzována cukerná
komponenta gp120 pomocí metody Western blott s využitím lektinů. Studie prokázala,
že gp120 produkovaný savčí buněčnou linií RD nese méně komplexních/hybridních
glykanů ve srovnání s obsahem glykanů s vysokým obsahem manózy. Výsledky získané
metodou Western blott byly následně potvrzeny metodou hmotnostní spektrometrie.
Různorodost glykosylačních profilů rekombinantního gp120, produkovaného různými
buněčnými liniemi (293T a CHO), byla taktéž prověřována metodou hmotnostní
spektrometrie v rámci výzkumu Go a kol., (2013). Výsledky studie prokázaly, že gp120
produkovaný dvěma různými buněčnými liniemi, vykazuje různé glykosylační profily.
Na základě uvedených poznatků lze konstatovat, že glykosylace téhož proteinu je přímo
závislá na buněčném typu, v němž je glykoprotein syntetizován. Různá glykosylace téhož
proteinu hraje důležitou roli na jeho biologické vlastnosti, jako jsou antigenicita
a imunogenicita, které jsou hlavním předmětem výzkumu v rámci vakcinačních studií.
63
Získaná data v rámci této diplomové práce jsou v souladu s výsledky výzkumu Akashi a
kol., (1998), Raška a kol., (2010), Yee a kol., (2011) a jsou ve shodě s očekávanými
výsledky.
V rámci druhého experimentu byla studována reaktivita optimalizovaných ředění
lektinů s rekombinantním gp120 proteinem (293T, RD) po ošetření PNGasou F, která
odštěpuje N-glykany. Reaktivita lektinů (AAL, GNL a PHA-L) s deglykosylovaným gp120
(293T, RD) byla porovnávána s jejich reaktivitou s tzv. kontrolou, tedy vzorkem,
ke kterému nebyla přidána PNGasa F. Naměřená hodnota reaktivity lektinů s kontrolním
vzorkem byla ve vztahu k reaktivitě lektinů se vzorkem ošetřeným PNGasou F počítána
jako 100 %.
U všech testovaných lektinů došlo ke snížení reaktivity s oběma deglykosylovanými
rekombinantními proteiny (293T, RD). Získané výsledky částečně korespondují s výsledky
výzkumné práce Raška a kol., (2010), v níž byl studován vliv deglykosylace
rekombinantních gp120 proteinů (293T, RD, Jurkat, HepG2, Dakiki a CHO) na změnu
reaktivity lektinů (AAL, GNL a PHA-L) pomocí metody Western blott. Po ošetření gp120
enzymem PNGasa F nebyla s gp120 dříve pozorována žádná reaktivita ani jednoho
z testovaných lektinů. V případě této diplomové práce však byla i po deglykosylaci
zaznamenána reaktivita lektinu s deglykosylovaným gp120 u většiny testovaných vzorků.
Pozorovaný fakt je možné vysvětlit podmínkami deglykosylace. V práci Raška a kol.,
(2010) byla deglykosylace provedena na denaturovaném proteinu gp120. Zde byla naopak
volena deglykosylace za nativních podmínek. To je stěžejní pro zachování nativní
konformace gp120, jež je klíčová pro reakci proteinu s faktory imunitního systému,
zejména neutralizačními a vaznými protilátkami.
Reaktivita AAL s deglykosylovaným 293T poklesla o 46,1 %, s deglykosylovaným RD
o 81,0 %. Z výsledku lze usuzovat, že gp120 produkovaný linií 293T nese více
N-vázaných karbohydrátů obsahující rezidua fukózy, které jsou rezistentní vůči PNGase F,
oproti gp120 exprimovanému linií RD.
Naměřená hodnota reaktivity GNL s deglykosylovaným gp120 (293T, RD) nebyla příliš
odlišná. Po enzymatickém ošetření 293T došlo ke snížení reaktivity GNL o 36,3 %.
Pokles reaktivity GNL s deglykosylovaným RD oproti kontrole činí 47,4 %. Z uvedených
výsledků vyplývá, že 293T i RD obsahují velký počet glykanů s vysokým obsahem
manózy rezistentních vůči účinku PNGasy F. Výsledek opět nekoresponduje s výsledky
výzkumu Hong a kol., (2002), v němž byla testována reaktivita GNL s gp120-Fc (gp120
64
z klonu JRCSF) po deglykosylaci enzymem PNGasa F metodou ELISA. ELISA prokázala
stoprocentní pokles reaktivity GNL s deglykosylovaným gp120-Fc. V citované práci však
nebyly podmínky deglykosylace uvedeny a v případě provedení za denaturačních
podmínek není pozorovaný pokles překvapující. V nedávné době bylo publikováno několik
prací, které jasně potvrdily, že nativní a optimálně složený multimerní gp120 a zejména
pak Env na povrchu virionu je poměrně rezistentní k deglykosylaci PNGaseF. Významný
závěr z předložené diplomové práce je, že analýza vlastností rekombinantnícho gp120
pomocí fluorescenčních kuliček je biologicky velmi relevantní postup a rovněž fakt,
že použité rekombinantní gp120 proteiny jsou biologicky do jisté míry velmi podobné Env
proteinu vystavenému na povrchu virionu. Toto tvrzení však vyžaduje další experimentální
dúkazy.
Rozdíl reaktivit PHA-L u kontroly a vzorku, který byl podroben deglykosylaci, činil
96,6 % u 293T a 81,6 % u RD. Z uvedených dat lze usuzovat, že RD i 293T obsahují velmi
málo triantenálních / tetraantenálních komplexních sacharidů, rezistentních k činnosti
PNGasy F.
Výsledky získané v rámci této diplomové práce se mohou lišit od výsledků získaných
metodou ELISA nebo metodou Western blott. Zatímco při metodě ELISA dochází
ke sterickému bránění navázaných proteinů, při metodě Western blott jsou proteiny
analyzovány za denaturujících podmínek. Důvodem odlišných výsledků, získaných
v rámci této diplomové práce, tak mohou být redukce sterického bránění proteinů,
navázaných na povrchu mikrosfér a analýza za nedenaturujících podmínek. Z těchto
důvodů se jeví metoda analýzy proteinů imobilizovaných na fluorescenčně značené částice
jako optimální detekční metoda.
65
7 ZÁVĚR
V rámci této diplomové práce byla analyzována cukerná komponenta rekombinantního
gp120 metodou průtokové cytometrie pomocí fluorescenčně značených mikrosfér. První
experiment byl založen na nalezení optimálního ředění lektinů Aleuria aurania (AAL),
Galanthus nivalis (GNL) a leukoaglutininu z Phaseolus vulgaris (PHA-L), poskytující
vysokou reaktivitu s gp120 rekombinantním proteinem, produkovaným savčí buněčnou
linií 293T a RD. Nejvyšší reaktivita s oběma rekombinantními gp120 proteiny byla
zjištěna u lektinu GNL při ředění 80 000 x, a to 98,7% s 293T a 97,3% s RD.
Druhý experiment byl zaměřen na sledování změny reaktivity lektinů
o optimalizovaném ředění po enzymatickém ošetření rekombinantního gp120 proteinu
(293T, RD) enzymem PNGasa F, který odštěpuje N-vázané glykany. Analýza reaktivity
lektinů s deglykosylovaným gp120 proteinem (293T a RD) prokázala pokles reaktivity
u všech testovaných lektinů. Nejvyšší pokles reaktivity byl zaznamenán u lektinu PHA-L,
a to 96,6 % při inkubaci s 293T a 81,6 % při inkubaci s RD.
66
8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Akashi, M., Niikawa, T., Serizawa, S., Hayakawa, T., Baba, M. (1998): Graft copolymers
having hydrophobic backbone and hydrophilic branches part XIV - Capture of HIV-1 gp120
and Virions by Lectin-Immobilized Polystyrene Nanospheres. Bioconjugate Chemistry.
Vol. 9: 50-53. ISSN: 1043-1802. DOI: 10.1021/bc970045y
Al-Harthi, L., Guilbert, L. J., Hoxie, J. A., Landay, A. (2002): Trophoblasts
are productively infected by CD4-independent isolate of HIV type 1. AIDS research
and human retroviruses. Vol. 18: 13 – 17. PMID: 11804552.
DOI:10.1089/088922202753394673
Auwerx, J., François, K. O., Covens, K., Van Laethem, K., Balzarini, J. (2008): Glycan
deletions in the HIV-1 gp120 V1/V2 domain compromise viral infectivity, sensitize
the mutant virus strains to carbohydrate-binding agents and represent a specific target
for therapeutic intervention. Virology. Vol. 382: 10 – 19. ISSN: 0042-6822. DOI: 10.1016/j.virol.2008.09.010
Bednář, M., Fraňková, V., Schindler, J., Souček, A., Vávra, J. (1996): Lékařská mikrobiologie.
Marvil, Praha. ISBN-10: 80-2380-297-6
Borrow, P., Lewicki, H., Wei, X., Horwitz, M. S., Peffer, N., Meyers, H., Nelson, J. A., Gairin,
J. E., Hahn, B. H., Oldstone, M. B. A., Shaw, G. M. (1997): Antiviral pressure exerted by
HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) during primary infection demonstrated by
rapid selection of CTL escape virus. Nature Medicine. Vol. 3: 205-211. ISSN: 1078-8956.
DOI: 10.1038/nm0297-205
Calarese, D. A., Scanlan, C.N., Zwick, M. B., Deechongkit, S., Mimura, Y., Kunert, R., Zhu, P.,
Wormald, M. R., Stanfield, R. L., Roux, K. H., Kelly, J. W., Rudd, P. M., Dwek, R. A., Katinger,
H., Burton, D. R., Wilson, I. A. (2003) Antibody domain exchange is an immunological solution
to carbohydrate cluster recognition. Science. Vol. 300: 2065–2071. ISSN: 0036-8075.
DOI: 10.1126/science.1083182
De Silva, F. S., Venturini, D. S., Wagner, E., Shank, P. R., Sharma, S. (2001): CD4-
independent infection of human B cells with HIV type 1: detection of unintegrated viral DNA.
AIDS Res. Hum. Retroviruses. Vol. 17: 1585 – 1598. ISSN: 0889-2229.
DOI: 10.1089/088922201753341997
De Luca, A., Dunn, D., Zazzi, M., Camacho, R., Torti, C., Fanti, I., Kaiser, R., Sonnerborg, A.,
Codoner, F. M., Van Laethem, K., Vandamme, A. M., Bansi, L., Ghisetti, V., van de Vijver, D. A.
M. C., Asboe, D., Prosperi, M. C. F., Di Giambenedetto, S. (2013): Declining Prevalence of HIV-1
Drug Resistance in Antiretroviral Treatment-exposed Individuals in Western Europe. Journal
of infectious diseases. Vol. 207: 1216-1220. ISSN: 0022-1899. DOI: 10.1093/infdis/jit017
Dybowski JN, Heider D, Hoofman D. (2010): Prediction of co-receptor usage of HIV-1 from
genotype. PLOS Computational Biology. Vol. 6: Article Number: e1000743.
ISSN: 1553-734X. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1000743
Eckschlager, T., Bartůňková, J. (1999): Průtoková cytometrie v klinické praxi. Praha, Grada
Publishing. ISBN: 80-7169-279-4
67
Flexner, Ch. (1998): HIV-protease inhibitors. New England Journal
of Medicine. Vol. 338: 1281 – 1292. ISSN: 0028-4793.
DOI: 10.1056/NEJM199804303381808
Givan, A. L. (2004): Flow Cytometry: An Introduction. Edited by Hawley, T. S., Hawley, R.
G. (2004): Flow Cytometry Protocols, Second Edition. Humana Press.
ISSN: 1064-3745. E-ISBN: 1-059259-773-4
Go, E. P., Irungu, J., Zhang, Y., Dalpathado, D. S., Liao, H., Sutherland, L. L., Alam, S. M.,
Haynes, B. F., Desaire, H. (2008): Glycosylation Site-Specific Analysis of HIV Envelope
Proteins (JR-FL and CON-S) Reveals Major Differences in Glycosylation Site Occupancy,
Glycoform Profiles, and Antigenic Epiptopes‘ Accessibility. Journal of Proteome Research.
Vol. 7: 1660 – 1674. PMID: 18330979. DOI: 10.1021/pr7006957
Go, E. P, Liao, H. X., Alam, S. M., Hua, D., Haynes, B. F., Desaire, H. (2013):
Characterization of Host-Cell Line Specific Glycosylation Profiles of Early
Transmitted/Founder HIV-1 gp120 Envelope Proteins. Journal of proteome research.
Vol. 12: 1223-1234. ISSN: 1535-3893. DOI: 10.1021/pr300370
Greene, W. C. (1991): Mechanisms of disease – The molecular biology of human
immunodeficiency virus type 1 infection. New England Journal of Medicine.
Vol. 324: 308-317. ISSN: 0028-4793. DOI: 10.1056/NEJM199101313240506
Grinsztejn, B., Nguyen, B. Y., Katlama, C., Gatell, J. M., Lazzarin, A., Vittecoq, D., Gonzales,
C. J., Chen, J., Harvey, C. M., Isaacs, R. D. (2007): Safety and efficacy of the HIV-1 integrase
inhibitor raltegravir (MK-0518) in treatment-experienced patients with multidrug-resistant
virus: a phase II randomised controlled trial. Lancet. Vol. 369: 1261 – 1269. ISSN: 0140-6736.
DOI: 10.1016/S0140-6736(07)60597-2
Gummuluru, S., Rogel, M., Stamatatos, L., Emerman, M. (2003): Binding of human
immunodeficiency virus type 1 to immature dendritic cells can occur independently
of DC-SIGN and mannose binding C-type lectin receptors via a cholesterol-dependent
pathway. Journal of Virology. Vol. 77: 12865 – 12874. PMCID: PMC262553.
DOI: 10.1128/JVI.77.23.12865-12874.2003
Hedestam, G. B. K., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T.
(2008): The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus.
Nature Reviews Microbiology. Vol. 6: 143–155. ISSN: 1740-1526.
DOI: 10.1038/nrmicro1819
Helenius, A., Aebi, M. (2001): Intracellular functions of N-linked glycans. Science.
Vol. 291: 2364 – 2369. PMID: 11269317. DOI: 10.1126/science.291.5512.2364
Hester, G., Kaku, H., Goldstein, I. J., Wright, Ch. S. (1995): Structure of mannose-specific
snowdrop (Galanthus nivalis) lectin is representative of a new plant lectin family. Nature
Structural Biology. Vol. 2: 472 – 479. ISSN: 1072-8368. DOI:10.1038/nsb0695-472
Hong, P. W. P., Flummerfelt, K. B., de Parseval, A., Gurney, K., Elder, J. H.,
Lee, B. (2002): Human immunodeficiency virus envelope (gp120) binding to DC-SIGN and
primary dendritic cells is carbohydrate dependent but does not involve 2G12 or cyanovirin
binding sites: Implications for structural analyses of gp120-DC-SIGN binding. Journal of
68
virology. Vol. 76: 12855-12865 ISSN: 0022-538X.
DOI: 10.1128/JVI.76.24.12855-12865.2002
Huskens, D., Schols, D., (2012): Algal Lectins as Potential HIV Microbicide Candidates. Mar
Drugs. ISSN: 1660-3397. DOI: 10.3390/md10071476
Janeway, Ch. A., Travers, P., Walport, M., Capra, J. D. (1999): Immunobiology:
The immune systém in health and disease, Fourth edition. Garland Publishers, New York.
ISBN: 0-8153-3217-3
Janini, L. M., Tanuri, A., Schechter, M., Peralta, J. M., Vicente, A. C., Dela Torre, N.,
Pieniazek, N. J., Luo, C. C., Ramos, A., Soriano, V., Schochetman, G., Rayfield, M. A.,
Pieniazek, D. (1998): Horizontal and vertical transmission of human immunodeficiency virus
type 1 dual infections caused by viruses of subtypes B and C. The Journal of Infectious
Diseases. Vol. 177: 227 – 231. ISSN: 0022-1899. DOI: 10.1086/517360
Jefferis, R. (2007): Antibody therapeutics:
isotype and glycoform selection. Expert opinion on biological therapy. Vol. 7: 1401-1413.
ISSN: 1471-2598. DOI: 10.1517/14712598.7.9.1401
Johnson, W. E., Sauvron, J. M., Desrosiers, R. C. (2001): Conserved, N-linked carbohydrates
of human immunodeficiency virus type 1 gp41 are largely dispensable for viral replication.
Journal of Virology. Vol. 75: 11426 – 11436. ISSN: 0022-538X.
DOI: 10.1128/JVI.75.23.11426-11436.2001
Joyce, J. G., ter Meulen, J. (2010): Pushing the envelope on HIV-1 neutralization. Natural
Biotechnology. Vol. 28: 929–931. ISSN: 1087-0156. DOI: 10.1038/nbt0910-929
Kitchen, S. G., Uittenbogaart, C. H., Zack, J. A. (1997): Mechanism of human
immunodeficiency virus type 1 localization in CD4-negative thymocytes: differentiation from
a CD4-positive precursor allows productive infection. Journal of Virology.
Vol. 71: 5713 – 5722. ISSN: 0022-538X
Kong, L., Sheppard, N. C., Stewart-Jones, G. B. E., Robson, C. L.., Chen, H., Xu, X.,
Krashias, G., Bonomelli, C., Scanlan, C. N., Kwong, P. D., Jeffs, S. A., Jones, I. M., Sattentau,
Q. J. (2010): Expression-System-Dependent Modulation of HIV-1 Envelope Glycoprotein
Antigenicity and Immunogenicity. Journal of Molecular Biology. Vol. 403: 131 – 147.
ISSN: 0022-2836. DOI: 10.1016/j.jmb.2010.08.033
Koot, M., Keet, I. P., Vos, A. H., de Goede R. E., Roos, M. T., Coutinho, R. A., Miedema, F.,
Schellekens, P. T., Tersmette, M. (1993): Prognostic value of HIV-1 syncytium-inducing
phenotype for rate of CD4+ cell depletion and progression to AIDS. Annals of internal
medicine. Vol. 118: 681-688. PMID: 8096374
Korber, B., Gaschen, B., Yusim, K., Thakallapally, R., Kesmir, C., Detours, V. (2001):
Evolutionary and immunological implications of contemporary HIV-1 variation. British
Medical Bulletin. Vol. 58: 19–42. ISSN: 0007-1420. DOI: 10.1093/bmb/58.1.19
Kornfeld, R., Kornfeld, S. (1985): Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Annual
Review of Biochemistry. Vol. 54: 631-664. ISSN: 0066-4154.
DOI: 10.1146/annurev.bi.54.070185.003215
69
Krambovitis, E., Porichis, F., Spandidos, D. A. (2005): HIV-1 cell entry inhibitors: a new
generation of antiretroviral drugs. ACTA Pharmacologica Sinica. Vol. 26: 1165–1173.
ISSN: 1671-4083. DOI: 10.1111/j.1745-7254.2005.00193.x
Krejsek, J., Kopecký, O. (2004): Klinická imunologie. 1. vydání. Nucleus HK®.
ISBN: 80-86225-50-X
Kwong, P., D., Wyatt, R., Robinson, J., Sweet, R., W., Sodroski, J., Hendrickson, W., A.
(1998): Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor
and a neutralizing human antibody. Nature. Vol. 393: 648 – 659. PMID: 9641677
Lam, S. K., Ng, T. B. (2011): Lectins: production and practical applications. Appl Microbiol
Biotechnol. 89 (1): 45 – 55. PMCID: PMC3016214. DOI: 10.1007/s00253-010-2892-9
Leonard, C. K., Spellman, M. W., Riddle, L., Harris, R. J., Thomas, J. N.,
Gregory, T. J. (1990): Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization
of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus
envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.
Journal of Biological Chemistry. Vol. 265: 10373 – 10382. ISSN: 0021-9258
Levinson, W. (2006): Review of Medical Microbiology and Immunology, ninth edition.
The McGraw-Hill Companies. ISBN: 0-07-110438-0
Liener I. E., Sharon N., Goldstein I. J. (1986): The Lectins – Properties, Functions and
Applications in Biology and Medicine. Academic Press. ISBN: 0-12-449945-7
Liu, Y., Liu, H., Kim, B. O., Gattone, V. H., Li, J., Nath, A., Blum, J., He, J. J. (2004): CD4-
independent infection of astrocytes by human immunodeficiency virus type 1: requirement for
the human mannose receptor. Journal of Virology. Vol. 78: 4120 – 4133. ISSN: 0022-538X.
DOI: 10.1128/JVI.78.8.4120-4133.2004
Livingstone, W. J., Moore, M., Innes, D., Bell, J. E., Simmonds, P. (1996): Frequent infection
of peripheral blood CD8-positive T-lymphocytes with HIV-1. Edinburgh Heterosexual
Transmission Study Group, Lancet. Vol. 348: 649 – 654. ISSN: 0140-6736. DOI:
10.1016/S0140-6736(96)02091-0
Lu, S. (2008): Immunogenicity of DNA vaccines in humans: it takes two to tango.
HumanVaccines. Vol. 4: 449–452. PMID: 18443427. DOI: 10.4161/hv.4.6.6179
Mascola, J. R., Montefiori, D. C. (2010): The role of antibodies in HIV vaccines. Annual
Review of Immunology. Vol. 28: 413 – 444. ISBN: 978-0-8243-3028-6. ISSN: 0732-0582.
DOI: 10.1146/annurev-immunol-030409-101256
Nabel, G. J. (2005): Close to the edge: neutralizing the HIV-1 envelope. Science.
Vol. 308: 1878-1879. ISSN: 0036-8075. DOI: 10.1126/science.1114854
Nascimento-Neto, G. L., Carneiro, R. F., Da Silva, S. R., Da Silva, B. R., Francisco Arruda, V.
S., Carneiro, V. A., Do Nascimento, K. S., Saker-Sampaio, S., Da Silva Jr., V. A., Porto, A. L.
F., Cavada, B. S., Sampaio, A. H., Teixeira, E. H., Nagano, C. S. (2012): Characterization of
Isoforms of the Lectin Isolated from the Red Algae Bryothamnion seaforthii and Its Pro-
Healing Efect. Mar Drugs. Vol. 10: 1936–1954. PMCID: PMC3475265.
DOI:10.3390/md10091936
70
Ormerod, M. G. (2009): Flow Cytometry: A Basic Introduction. By Michael G. Ormerod.
2009. ISBN 978-0-9559812-0-3
Pashov, A., Garimalla, S., Monzavi-Karbassi, B., Kieber-Emmons, T. (2009): Carbohydrate
targets in HIV vaccine research: lessons from failures. Imunnotherapy. Vol. 1: 777-794.
ISSN: 1750-743X. DOI: 10.2217/IMT.09.44
Peumans, W. J., Van Damme, E. J. (1995): Lectins as plant defense proteins. Plant physiology.
Vol. 109: 347 – 352. ISSN: 0032-0889. DOI: 10.1104/pp.109.2.347
Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. (1995): Low levels of HIV-1
infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to
memory CD4+ T cells. J Exp Med 182: 2045–2056. ISSN: 0022-1007.
DOI: 10.1084/jem.182.6.2045
Raška, M., Takahashi, K., Czernekova, L., Zachova, K., Hall, S., Moldoveanu, Z., Elliott, M.
C., Wilson, L., Brown, R., Jancova, D., Barnes, S., Vrbkova, J., Tomana, M., Smith, P. D.,
Mestecky, J., Renfrow, M. B., Novak, J. (2010 a): Glycosylation patterns of HIV-1 gp120
depend on the type of expressing cells and affect antibody recognition. The journal of
biological chemistry. Vol. 285: 20860 – 20869. PMCID: PMC2898351.
DOI: 10.1074/jbc.M109.085472
Richman, D. D. (2001): HIV chemotherapy. Nature. Vol. 410: 995 – 1001.
ISSN: 00280836. DOI: 10.1038/35073673
Rizzuto, C. D., Wyatt, R., Hernandez-Ramos, N., Sun, Y., Kwong, P. D., Hendrickson, W. A.,
Sodroski, J. (1998): A conserved HIV gp120 glycoprotein structure involved
in chemokine receptor binding. Science. Vol. 280: 1949 – 1953.
DOI: 10.1126/science.280.5371.1949
Robertson, D. (2003): US FDA approves new class of HIV therapeutics. National
Biotechnology. Vol. 21: 470 – 471. PMID: 12721558. DOI:10.1038/nbt0503-470
Robinson, H. L. (2007): HIV/AIDS vaccines: 2007. Clinical Pharmacology
& Therapeutics. Vol. 82: 686-693. ISSN: 0009-9236. DOI: 10.1038/sj.clpt.6100408
Robinson, J. P., Grégori, G. (2007): Principles of Flow Cytometry. Edited by Doležel, J.,
Greilhuber, J., Suda, J. (2007): Flow Cytometry with Plant Cells. WILEY-VCH Verlag GmbH
& Co. KGaA. ISBN: 978-3-527-31487-4
Roubalová, L. (2012): Průtoková cytometrie. FONS. roč. 22, č. 2, s. 5-9. ISSN: 1211-7137
Rubbert, A., Behrens, G., Ostrowski, M. (2011): Pathogenesis of HIV-1 infection. Edited
by Hoffmann, Ch., Rockstroh, J. K. http://hivbook.com/category/part-1-the-basics/3-
pathogenesis-of-hiv-1-infection/
Shapiro, H. M. (2003): Practical Flow Cytometry, 4th edition. Wiley-Liss, New York, NY,
USA. ISBN: 0-471-41125-6
Snustad, D. P., Simmons, M. J. (2009): Genetika. Nakladatelství Masarykovy univerzity, Brno.
ISBN 978-80-210-4852-2
71
Taylor, B. S., Sobieszczyk, M. E., McCutchan, F. E., Hammer, S. M. (2008):
The Challenge of HIV-1 Subtype Diversity. New England Journal
of Medicine. Vol. 359: 1965-1966. ISSN: 0028-4793. DOI: 10.1056/NEJMc086373
Unaids report on the global AIDS epidemic. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data.
ISBN: 978-92-9173-592-1
Varki, A., Cummings, R., Esko, J., Freeze, H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler,
M. E. (2009): Essentials of Glycobiology, Second Edition. ISBN: 978-087969770-9
Varki, A., Freeze, H., Manzi, A. E. (2009): Overview of Glycoconjugate Analysis. Current
Protocols in Protein Science. Vol. 57:12.1.1-12.1.10.
PMCID: PMC2749716. DOI: 10.1002/0471140864.ps1201s57
Vodrážka, Z. (2007): Biochemie. Academia. Kap. 5: 9-179. ISBN 978-80-200-0600-4
Wang, H. X., Ng, T. B., Liu, W. K., Ooi, V. E., Chang, S. T. (1995): Isolation and
characterization of two distinct lectins with antiproliferative activity from the cultured
mycelium of the edible mushroom Tricholoma mongolicum. Int J Pept Protein Res.
Vol. 46: 508–513. DOI: 10.1111/j.1399-3011.1995.tb01606.x
Weis W. I., Taylor M. E., Drickamer K. (1998): The C-type lectin superfamily in the immune
system. Immunol. Rev. Vol. 163:19–34. DOI: 10.1111/j.1600 065X.1998.tb01185.x
Wyatt, R., Sodroski, J. (1998): Envelope glycoproteins: fusogens, antigens,
and immunogens. Science. Vol. 280: 1884–1888. ISSN: 0036-8075.
DOI: 10.1126/science.280.5371.1884
Yee, M., Konopka, K., Balzarini, J., Düzgüneş, N. (2011): Inhibition of HIV-1 Env-Mediated
Cell-Cell Fusion by Lectins, Peptide T-20, and Neutralizing Antibodies. Open Virology
Journal. Vol. 5: 44–51. PMCID: PMC3109660. DOI: 10.2174/1874357901105010044
Yokoyama, M., Naganawa, S., Yoshimura, K., Matsushita, S., Sato, H. (2012): Structural
Dynamics of HIV-1 Envelope Gp120 Outer Domain with V3 Loop. PLoS ONE 7(5): e37530.
doi:10.1371/journal.pone.0037530.
Zhu, X., Borchers, C., Bienstock, R. J., Tomer, K. B. (2000): Mass spectrometric
characterization of the glycosylation pattern of HIV-gp120 expressed in CHO cells.
Biochemistry. Vol. 39: 11194–11204. DOI: 10.1021/bi000432m.
Zolla-Pazner, Improving on nature: Focusing the immune response on the V3 loop. Human
Antibodies. Vol. 14: 69-72. PMID:16720976
Internetové zdroje:
http://biomedicina.prf.jcu.cz/wordpress/wpcontent/uploads/2011/12/Vyuzitiprutokovecytometr
ievimunologii.pdf
http://hivbook.com/category/part-1-the-basics/3-pathogenesis-of-hiv-1-infection/
72
9 SEZNAM ZKRATEK
AAL Aleuria aurantia lectin
AIDS Acquired immunodeficiency syndrom
ARC AIDS-related comlex
CD4 Cluster of differentiation 4
CD4i CD4-induced
DNA Deoxyribonucleic acid
DMSO Dimethylsulfoxid
DTT Dithiothreitol
EBV Epstein-Barr virus
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
FCS Flow cytometry standard format
FSC Forward scatter
FITC Fluorescein isothiocyanate
G1 Gate 1
G2 Gate 2
GNL Galanthus nivalis lectin
HAART Highly Active AntiRetroviral Therapy
HEK Human embryonal kidney
HIV Human immunodeficiency virus
LTR Long terminal repeats
mRNA Ribonucleic acid messenger
MPER Membrane-proximal external region
NEM N-ethylmaleimid
NK1 Negativní kontrola 1
NK2 Negativní kontrola 2
PHA-L Phaseolus vulgaris leucoagglutin
PNGasa F Peptide N-Glycosidase F
PNGS Potential N-glycosylation site
RNA Ribonucleic acid
SSC Side scatter
Sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyklohexan-1-carboxylate