1

Univerzita Palackého v Olomouci

Diplomová práca

Olomouc 2011 Bc. Lucia Gallová

2

Univerzita Palackého v Olomouci

Přírodovědecká fakulta

Katedra buněčné biologie a genetiky

Mapovanie agronomicky dôležitých génov u

pšenice

Diplomová práca

Bc. Lucia Gallová

Študijný program: Biologie

Študijný odbor: Molekulární a buněčná biologie

Forma štúdia: Prezenční

Olomouc 2011 Vedúci práce: Mgr. Miroslav Valárik, Ph.D.

3

Prehlasujem, že som túto diplomovú prácu vypracovala samostatne v priebehu

magisterského štúdia pod vedením Mgr. Miroslava Valárika, Ph.D. s použitím uvedených

literárnych zdrojov.

V Olomouci, 2.8.2011

Bc. Lucia Gallová

4

Súhrn

Pšenica siata (Triticum aestivum L.) je jednou z najdôležitejších plodín na svete, preto

je predmetom mnohých cytogenetických, genetických a šľachtiteľských štúdií.

Jej allohexaploidný genóm (2n = 6x = 42, AABBDD) síce poskytuje veľkú mieru flexibility

so schopnosťou prispôsobovať sa širokému rozsahu podmienok, no schopnosť

homoeológnych chromozómov sa vzájomne kompenzovať komplikuje štúdium dedičnosti

znakov a šľachtenia. Jednou z možností zníženia komplexity pšeničného genómu, v dôsledku

relatívne dobre zachovanej synténie poradia génov, je využiť ako model príbuzný diploidný

druh.

Pšenica jednozrnová (Triticum monococcum L.), blízky diploidný príbuzný donora

A genómu kultivovaných pšeníc, je ideálnym modelom pre genetické mapovanie

a klonovanie. Vzhľadom k tomu, že jej domestikácia prebiehala nezávisle od hexaploidnej

pšenice, si pšenica jednozrnová zachovala genetickú diverzitu, ktorá môže byť v súčasnosti

použitá na obohatenie genómu pšenice siatej.

Predložená práca sa skladá z teoretickej a praktickej časti. Prvá polovica teoretickej

časti je zameraná na obilniny, najmä na pšenicu jednozrnovú, ako objekt môjho štúdia.

V druhej polovici je predostretá podstata mapovania genómu s prehľadom a využitím

molekulárnych markrov. Cieľom praktickej časti práce bolo zamapovaním ďalších DNA

markov zahustiť existujúcu väzbovú mapu T. monococcum L. a na dopestovanej RIL

mapovacej populácii T. monococcum L. generácie F10 previesť kontrolný genotyping

a následne fenotypovanie vybratých agronomicky a morfologicky dôležitých znakov.

Zozbierané a spracované dáta z roku 2010 boli použité na zamapovanie a následné overenie

polohy lokusov detekovaných na základe fenotypovaných údajov z predchádzajúcej sezóny

2009. Údaje z oboch sezón potvrdili pozíciu dvoch lokusov, pre priemernú hmotnosť zrna na

chromozóme 2Am a pre chlpatosť listov na chromozóme 3Am. Taktiež bol rozšírený počet

fenotypovaných znakov a identifikovaných lokusov na mape T. monococcum L. o hustotu

klasu (2Am) a počet odnoží u rastliny (1Am, 4Am, 6Am), čím bolo celkovo zamapovaných 15

QTLs.

5

Summary

Wheat (Triticum aestivum L.) is one of the most important crops in the world,

therefore it is a subject of many cytogenetic, genetic and breeding studies. Although its

allohexaploid genome (2n = 6x = 42, AABBDD) provides enormous flexibility with ability

to adapt to a wide range of conditions, competence of homoeologous chromosomes

to compensate (make up) for each other complicates studying the heritability and breeding

traits. One way of decreasing the complexity of wheat genome is the use of related diploid

species as a model due to its relatively well-conserved syntheny in sequence.

Einkorn wheat (Triticum monococcum L.) is a close diploid relative to a donor

of A genome for cultivated wheats. This wheat is an ideal model for genetic mapping

and cloning. The domestication of einkorn wheat was independent from hexaploid wheat. In

this matter the einkorn wheat could be used for enrichment of hexaploid genome due to its

genetic diversity.

This thesis consists of theoretical and practical part. The first half of the theoretical

section is focused on crops, mainly einkorn wheat that was the object of my study. Second

part of the theoretical section includes the basis of genome mapping, an overview

of molecular markers and their utilization. The aim of the practical part was to saturate

existing linkage map of T. monococcum L. through mapping of additional DNA markers,

and perform phenotyping of selected agronomic and morfological traits on the T.

monococcum L. RIL mapping population. Collected and processed phenotypic data of 2010

season were used for mapping and validation of loci detection from phenotyped data of

previous season 2009. Data from both seasons confirmed location of two loci, the thousand

grain weight on chromosome 2Am and the hairy leaf on chromosome 3Am. Also, number of

phenotyped traits and identificated loci was expanded to the spikle density (2Am) and the

tiller number (1Am, 4Am, 6Am) on the map T. monococcum L. Overall 15 QTLs were mapped.

6

Rada by som poďakovala Mgr. Miroslavovi Valárikovi, Ph.D. za jeho čas, trpezlivosť

a odborné rady, ktoré mi poskytol pri spracovaní mojej diplomovej práce. Ďalej by som

chcela poďakovať Ing. Tiborovi Sedláčkovi, za štatistické analýzy zo zozbieraných dát

a kolektívu pracovníkov a študentom z ÚEB v Olomouci, najmä Mgr. Barbore Klocovej,

za pomoc pri príprave poľného experimentu a fenotypizácií rastlín. Taktiež ďakujem Centru

regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum Ústavu experimentální botaniky

AV ČR, v. v. i. (projekt č.: CZ.1.05/2.1.00/01.0007) za poskytnutie podmienok k prevedeniu

diplomovej práce.

7

OBSAH

1. ÚVOD.................................................................................................................................9

2. LITERÁRNY PREHĽAD ................................................................................................10

2.1 Obilniny....................................................................................................................10

2.2 Pšenica (Triticum L.) ................................................................................................11

2.3 Pšenica jednozrnová (Triticum monococcum L.) .....................................................16

2.4 Mapovanie genómu, väzbová mapa .........................................................................17

2.5 Mapovacie populácie pre väzbové mapovanie.........................................................18

2.6 Genetické markry .....................................................................................................20

2.6.1 DArT markry (Diversity arrays technology) ....................................................21

2.6.2 SNP markry (Single Nucleotide Polymorphisms)............................................24

2.6.3 SSR markry (Simple Sequence Repeats)..........................................................25

2.6.4 CAPS markry (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) ...........................25

2.6.5 STS markry (Sequence-Tagged Site) ...............................................................26

2.6.6 IRAP markry (Inter-Retrotranspozon Amplified Polymorphism)....................27

2.7 Využitie molekulárnych markrov.............................................................................28

2.8 Lokusy ovplyvňujúce kvantitatívne znaky (Quantitative Trait Loci, QTLs) ...........29

2.9 Výnos pšenice...........................................................................................................30

2.10 Ochlpenie listov pšenice (pubescence, hairy leaf)....................................................31

3. CIELE PRÁCE.................................................................................................................33

4. MATERIÁL A METODIKA ...........................................................................................34

4.1 Biologický materiál ..................................................................................................34

4.2 Chemikálie a roztoky................................................................................................34

4.3 Prístrojové vybavenie ...............................................................................................36

4.4 Metodika...................................................................................................................36

4.4.1 Založenie poľného pokusu ...............................................................................36

4.4.2 Vysokovýkonná extrakcia DNA.......................................................................37

4.4.3 Agarózová gélová elektroforéza a vizualizácia DNA ......................................37

4.4.4 Polymerázová reťazová reakcia (PCR) ............................................................38

4.4.5 Nedenaturujúca polyakrylamidová gélová elektroforéza .................................38

4.4.6 Doplnenie genetickej mapy ..............................................................................39

4.4.7 Fenotypovanie ..................................................................................................40

4.4.8 Analýza QTLs ..................................................................................................44

8

4.4.9 Použité programy..............................................................................................44

5. VÝSLEDKY.....................................................................................................................45

5.1 Analýza QTL ............................................................................................................45

5.2 Molekulárne markry pre zahustenie T. monococcum L. mapy.................................56

5.3 Genetická väzbová mapa ..........................................................................................57

6. DISKUSIA .......................................................................................................................63

7. ZÁVER.............................................................................................................................70

8. LITERATÚRA .................................................................................................................71

9. ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK A SYMBOLOV .................................................81

9

1. ÚVOD

Pšenica patrí medzi významné poľnohospodárske plodiny. Vďaka vysokej výživovej

hodnote, nenáročným podmienkam na pestovanie, jednoduchej skladovateľnosti a dlhej

trvanlivosti zŕn, sa stala najrozšírenejšou obilninou na svete. Používa sa na kŕmenie zvierat,

ako potravina z ktorej sa vyrába chlieb, pečivo, sušienky, cestoviny a v priemysle našla

využitie napríklad pri výrobe liehu, škrobu, piva.

S rastúcou spotrebou tejto obilniny je potrebné buď zvýšiť rozlohu pestovania

alebo jej výnos. Vzhľadom k obmedzenému množstvu osevných plôch, zvyšujúcemu

sa zaľudneniu planéty a prítomnosti biotických i abiotických stresov, je jediným možným

riešením znásobenie výnosu pšenice pomocou šľachtenia.

Pšenica siata (Triticum aestivum) je allohexaploidný druh s tromi homoeológnymi

genómami (AABBDD). Veľkosť genómu (17 Gb) a jeho zloženie na jednej strane poskytujú

schopnosť prispôsobovať sa širokému rozpätiu podmienok, avšak komplexita genómu

je hlavnou prekážkou jeho detailného štúdia. Preto sa pri šľachtení pšenice využívajú

príbuzné diploidné druhy pšeníc s menším genómom, u ktorých je relatívne dobre zachovaná

synténia poradia génov. Diploidná pšenica jednozrnová (Triticum monococcum L.) sa vďaka

dostupnosti kultivovaných a divokých foriem, a s tým spojenou veľkou mierou diverzity,

stala ideálnym modelom pre genetické mapovanie a klonovanie dôležitých génov.

10

2. LITERÁRNY PREHĽAD

2.1 Obilniny

Počiatok poľnohospodárstva sa datuje do obdobia pred vyše 10 000 rokmi, kedy sa

jednou z hlavných zložiek potravy stali práve obilniny. Vďaka ich nutričnej hodnote, relatívne

vysokým výnosom, bezproblémovému uskladňovaniu a preprave, bol zahájený proces

domestifikácie (Hopf et Zohary, 2000). Najstarší farmári sveta tak prispeli k rozšíreniu

rozsiahlej botanickej skupiny Triticeae (Tabuľka č.1).

Tabuľka č.1: Zaradenie tribusu Triticeae do taxonomického systému a jeho vybraní zástupcovia (www.ncbi.nim.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi, Červenka et al., 1978)

Taxonomické kategórie

Ríša Rastliny

(Plantae)

Oddelenie Krytosemenné rastliny

(Magnoliophyta)

Trieda Jednoklíčnolistové

(Liliopsida)

Rad Lipnicotvaré

(Poales)

Čeľaď Lipnicovité = trávy

(Poaceae = Gramineae)

Tribus Triticeae

Rod jačmeň (Hordeum L.) kukurica (Zea L.) ovos (Avena L.)

pšenica (Triticum L.) raž (Secale L.) ryža (Oryza L.)

tritikale (Triticosecale Wittmack)

Tribus Triticeae je rôznorodou skupinou rastlín. Medzi najznámejších zástupcov patrí

ryža, pšenica, kukurica, jačmeň, raž či ovos. Tieto plodiny sú zdrojom potravinovej produkcie

pre väčšinu ľudskej populácie. Ich zrná obsahujú škrob, lepok, lipidy, proteíny a ďalšie

nutričné látky s vysokou výživovou hodnotu. Sú dôležitým zdrojom potravy pre ľudí

i zvieratá (Hopf et Zohary, 2000, Ware et Stein, 2003).

11

V súčasnosti sa zástupcovia spomínaného tribusu podieľajú vyše tretinovým podielom

na svetovej produkcii obilnín (Feuillet et al., 2007). V európskej spotrebe majú však najväčšie

zastúpenie práve plodiny rodu Triticum L. Najvýznamnejším zástupcom je pšenica siata

(Triticum aestivum L.), využívaná najmä pri výrobe chleba a sušienok, pšenica tvrdá

(Triticum durum Desf.), vďaka nízkemu podielu lepku ideálna na výrobu cestovín a pšenice

špaldová (Triticum spelta L.), používaná pre vysoký obsah proteínov a vlákniny v racionálnej

a špeciálnej výžive.

Vzhľadom na poľnohospodársku dôležitosť rodu Triticum L., došlo v priebehu

posledných 100 rokov k zintenzívneniu šľachtenia rastlín najmä v oblasti výnosu a kvality.

Intenzívne šľachtenie je však spojené s redukciou genetickej diverzity v rámci genetických

zdrojov rastlín. Vnášanie nových génov z geneticky vzdialených zdrojov má obyčajne

za následok nežiaduci genetický drift. Pre intenzívne šľachtenie, s efektívnym využitím

génového potenciálu obilnín a príbuzných druhov, je nevyhnutné detailne poznať štruktúru

genómu obilnín. Šľachtitelia tak budú môcť použitím vhodných alel, génov alebo génových

komplexov jednoduhšie vyvíjať odrody s vyšším výnosom a s lepšou schopnosťou

prispôsobiť sa zmenám prostredia (Keller et Feuillet, 2000, Ware et Stein, 2003, Feuillet et

al., 2007).

2.2 Pšenica (Triticum L.)

Pojem „pšenica“ je používaný na popísanie viacerých príbuzných obilnín. Diverzita

medzi jednotlivými druhmi pšenice sa prejavuje nielen v stupni ploidie, ale aj v schopnosti

prispôsobiť sa rôznym typom pôd a klimatickým podmienkam Tieto výhodné vlastnosti

boli vytvorené vďaka anatómii rastlín, mechanizmu ich reprodukcie a genetickej variabilite

(Keller et Feuillet, 2000, Feuillet et al., 2007).

Rastlinný rod Triticum L. je zastúpený diploidnými, tetraploidnými aj hexaploidnými

jedincami (Tabuľka č.2). Štúdium fylogenetickej príbuznosti pšenice medzi diploidnými

a polyploidnými druhmi bolo zamerané na identifikáciu donorov čiastkových genómov

a výskum ich druhovej špecifity (Golovnina et al., 2009).

Každý druh z rodu Triticum L. môže byť, vo vzťahu ku kultivovaným druhom,

začlenený do určitej skupiny. V závislosti od miery genetickej príbuznosti, sú genetické

zdroje delené do 3 skupín: primárny, sekundárny a terciárny genetický zdroj (Feuillet et al.,

2007).

12

Bolo zistené, že primárnym genetickým zdrojom sú druhy divoké a skoršie

domestifikované, ktoré sú schopné hybridizovať priamo s kultivovanými typmi.

Ich chromozómy sú homológne ku kultivovaným typom a obecne majú možnosť zúčasňovať

sa homológnej rekombinácie. Tá môže byť využitá pri šľachtení a selekcii. Preto je primárny

genetický zdroj najčastejšie využívaný na zlepšovanie vlastností plodín. K tomuto typu

genetického zdroja sú priradené polyploidné druhy (napríklad T. turgidum L.) a diploidné

donory A a D genómu (Feuillet et al., 2007). Analýzy Brandoliniho et al. (2006) a Golovninu

et al. (2009) potvrdili záver, že diploidné druhy Triticum urartu Tumanian ex Gandilyan boli

darcom A genómu všetkým polyploidným druhom pšenice (Obrázok č.1).

Obrázok č.1: Dendrogram založený na genetickej vzdialenosti ukazujúci príbuznosť medzi A genómami 8 druhov rodu Triticum (upravené podľa Ehtemam et al., 2010)

Za sekundárny genetický zdroj sú považované pšenice, zdieľajúce najmenej jeden

homológny genóm s kultivovanými typmi. Génový transfer z týchto druhov je možný

prostredníctvom homológnej rekombinácie len vtedy, ak je cieľový gén lokalizovaný

na homológnom genóme (Feuillet et al., 2007).

Terciárny genetický zdroj je reprezentovaný vzdialene príbuznými diploidmi

a polyploidmi, medzi ktorými nedochádza ku homológnej rekombinácii (Feuillet et al., 2007).

Širokú variabilitu v ploidii a v zložení genómu jednotlivých zástupcov rodu

Triticum L. je možné zreteľne pozorovať práve na klasoch (Obrázok č.2). Výskyt osín, počet

kvetov v klásku, množstvo kláskov na klase, krehkosť klasového vretena, prítomnosť

ochranných obalov u zrna a ďalšie charakteristiky vypovedjú o vlastnostich a pôvode rastlín.

Pre primitívnejšiu formu pšeníc (diploidná einkorn, tetraploidný emmer, hexaploidná spelta)

je typická prítomnosť lámavého klasového vretena a zrno s plevou. Po vymlátení sa klas

rozbije na jednotlivé klásky, ktoré musia byť ďalej spracované, aby došlo k uvoľneniu zŕn

od pliev. U vyspelejších kultivovaných pšeníc (tetraploidné typy T. durum Desf.

tetrapolidi AuAu BB

tetrapolidi AuAu BB

diploidi AmAm AbAb

hexaploid AuAu BBDD

diploid AuAu

13

a hexaploidná pšenica) po vymlátení zostane klasové vreteno väčšinou vcelku, plevy sú

z neho ľahko oddeliteľné a vypadnú holé zrná (Padulosi et al., 1996, Hopf et Zohary, 2000).

Obrázok č.2: Vizuálne porovnanie klasov vybraných druhov rodu Triticum L. (upravené podľa: Feuillet et al., 2007)

Aby sa zvýšil výnos a kvalita zŕn, je nevyhnutné získať schopnosť odolávať

abiotickým aj biotickým stresom. Divo žijúce druhy rastlín majú často vysokú prispôsobivosť

k zmenám vonkajších podmienok (odolnosť voči zime, rezistencia k suchu, tolerancia

k zasoleniu či k nutričnému deficitu). Takéto vlastnosti by mohli byť využité v pestovateľskej

praxi. Zmenou genotypu by sa zlepšila možnosť prispôsobiť sa, a tým by sa zvýšila

ich genetická diverzita (De Pace et al., 2001).

Prítomnosť troch homoeológnych genómov u hexaploidnej pšenice, s celkovým

rozsahom približne 17 Gb, poskytuje veľkú mieru flexibility genómu so schopnosťou

prispôsobovať sa širokému rozsahu podmienok. Vďaka tomu je pestovanie pšenice rozšírené

takmer od rovníku až po polárny kruh. Na druhej strane, veľkosť a komplexita pšeničného

genómu sú hlavnými obmedzeniami detailného štúdia pšeničného genómu a jeho využitia

pri šľachtení pšenice. Jednou z možností zníženia komplexity pšeničného genómu, v dôsledku

relatívne dobre zachovanej kolinearite poradia génov, je využite príbuzného diploidného

druhu ako modelu (Jing et al., 2007, Kilian et al., 2009). Takto boli vďaka T. monococcum L.

klonované napríklad gény Vrn1 a Vrn2, ktoré u hexaploidnej pšenice z dovodu funkčnosti alel

génu zo všetký troch homológnych genómov, nie možné ani zamapovať (Yan et al., 2003,

2004).

T. urartu T. monococcum L. T. dicoccoides T. durum Desf. T. aestivum L. Tum. ex Gan. subsp. (Korn. ex Asch. & Graeb.) monococcum Schweinf.

14

Tabuľka č.2: Stručný prehľad vybraných divokých a domestifikovaných zástupcov druhu Triticum L., počet chromozómov a stupeň ploidie. Podľa Mangelsdorf, 1966, Dvořák et al., 1990, 1993, Padulosi et al., 1996, Heun et al., 1997, Brandolini et al., 2006, Feuillet et al., 2007, Barkworth et Bothmer, 2009, Kilian et al., 2009, http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/splist.pl?12442.

Divoký predok Domestifikovaná forma Počet

chromozómov

Stupeň

ploidie

Taxonomický názov

Obecný názov

Genóm

Taxonomický názov

Obecný názov

Genóm

T. boeoticum Boiss.

= T. monococcum subsp. aegilopoides

(Link) Thell.

AbAb

T. monococcum L.

= T. monococcum L. subsp. monococcum

pšenica jednozrnová, einkorn wheat

AmAm

T. urartu Tumanian ex Gandilyan

= Crithodium urartu (Tumanian ex

Gandilyan) Á. Löve

AuAu

-

Aegilops speltoides var. speltoides

= T. speltoides (Tausch) Gren. ex K. Richt.

BB

-

2n = 2x = 14

diploid

Aegilops tauschii Coss.

= T. tauschii (Coss.) Schmalh.

DD

-

15

Tabuľka č.2 (pokračovanie)

Divoký predok Domestifikovaná forma Počet

chromozómov

Stupeň

ploidie

Taxonomický názov

Obecný názov

Genóm

Taxonomický názov

Obecný názov

Genóm

T. durum Desf.

= T. turgidum subsp.

durum (Desf.) Husn.

pšenica tvrdá,

macaroni (hard) wheat

AuAu BB 2n = 4x = 28

tetraploid

T. dicoccoides (Korn. ex Asch.&

Graebner) Schweinf.

= T. turgidum L. subsp. dicoccoides

(Korn. ex Asch. & Graebner) Thell.

wild emmer wheat

AuAu BB

T. dicoccum Schrank ex

Schübler

= T. tugidum L. subsp.

dicoccum (Schrank ex

Schübl.) Thell.

emmer wheat

AuAu BB

T. turgidum L.

= T. turgidum L.

subsp. turgidum pasta

wheat

AuAu BB

T. turgidum L.

AuAu BB

x

Aegilops tauschii Coss.

DD

T. aestivum L.

= T. aestivum L. subsp. aestivum

pšenica siata, bread wheat

AuAu BBDD 2n = 6x = 42

hexaploid

zatiaľ nejednoznačný

pôvod

T. spelta L.

= T. aestivum subsp. spelta (L.) Thell.

pšenica špaldová, spelt wheat

AuAu BBDD

16

2.3 Pšenica jednozrnová (Triticum monococcum L.)

Z výsledkov poľnohospodárskeho výskumu vyplynulo, že domestikácia starovekej

diploidnej pšenice, prebiehala na Blízkom východe, v „Krajine úrodného polmesiaca“

pred viac ako 10 000 rokmi nezávisle na tetraploidnej a hexaploidnej pšenici (Heun et al.,

1997). Územie úrodného polmesiaca sa rozkladalo od údolia Nílu a Jordánu cez Sýriu,

Turecko, iracké a iránske pohoria (Obrázok č.3, podľa Karagöz et al., 2009). Hlavným

prirodzeným prostredím výskytu divokej formy jednozrnky T. boeoticum Boiss. bola severná

a východná časť úrodného polmesiaca (Padulosi et al., 1996, Heun et al., 1997, Barkworth

et Bothmer, 2009). Pôsobením selekcie vznikol z tejto planej jednozrnky jej domestifikovaný

príbuzný Triticum monococcum L. subsp. monococcum (Sharma et Waines, 1994, Heun et al.,

1997).

Vnútrodruhovým krížením domestifikovanej a divokej formy pšenice jednozrnovej

sú produkovaní fertilní jednici (Hopf et Zohary, 2000). Avšak pri medzidruhovom krížení

(T. monococcum L. x T. urartu Tumanian ex Gandilyan) vznikajú sterilní potomkovia

vplyvom imunochemickej odlišnosti a separačnej sterilnej bariéry (Johnson et Dhalival, 1976,

Hopf et Zohary, 2000, Feuillet et al., 2007).

Obrázok č.3: Zelene zvýraznená oblasť na blízkom východe, označovaná ako „Krajina úrodného polmesiaca“, kde sa našli najstaršie archeologické pozostatky jačmeňa, einkorn a emmer (prevzaté od Feuillet et al., 2007)

Jednotlivé poddruhy jednozrnky sú zlúčené do spoločného druhu pšenice jednozrnovej

(Triticum monococcum L.) na základe obecných vlastností. Triticum monococcum L.

je jednoročná žltozelená tráva dorastajúca do výšky 80-150 cm. Je charaktrizovaná tenkými

17

pevnými steblami s chlpatými kolienkami a úzkymi listami. Klas je splošený, hustý,

pozostávajúci z dvojradového usporiadania krehkých kláskov. Typická je samoopelivosť

ako charakteristická vlastnosť divokého predka. V závislosti od odrody sa tvorí väčšinou

jedno zrnko na klások, pretože z dvoch kvetov je len jeden plodný. Semená sú okôrené (tesne

obalené plevicou a plievočkou). Výnos je relatívne malý, ale pšenici jednozrnovej postačujú

pôdy chudobné na živiny. Získaná múka je síce výživná, ale nevhodná na prípravu kysnutého

pečiva. Preto bola táto pšenica primárne používaná na prípravu kaše alebo ku konzumácii

celých varených zŕn. V súčasnosti sa používa len sporadicky na kŕmenie zvierat (Hopf

et Zohary, 2000, Feuillet et al., 2007, http://botany.cz/cs/triticum-monococcum/).

Oveľa väščie využite má pšenica jednozrnová v genetike a genomike. Ako diploidný

blízky príbuzný donora A genómu kultivivaných pšeníc je ideálnym modelom pre genetické

mapovanie a klonovanie, ako už bolo vyššie spomenuté. Vzhľadom k tomu, že jej

domestikácia prebiehala nezávisle od hexaploidnej pšenice, bola schopná si zachovať

genetickú diverzitu, ktorá môže byť v súčasnosti použitá na obohatenie genómu pšenice siatej

(Hopf et Zohary, 2000, Jing et al., 2007, Klocová et al., 2011). Na lepšie porozumenie

evolúcie a využitie dostupnej diverzity, je potrebné kombinovať poznatky z cytogenetických

analýz, evolučnej príbuznosti medzi druhmi a mapovania chromozómov (Kuspira et al., 1989,

Tanksley et al., 1992, Duran et al., 2009).

2.4 Mapovanie genómu, väzbová mapa

Najstarším spôsobom skúmania organizácie genómu je jeho mapovanie, pri ktorom

sú za pomoci mapovacích populácií umiestňované na chromozómy rôzne typy markrov.

Výsledkom procesu je mapa genómu. Dĺžka mapy a taktiež vzdialenosť medzi susednými

markrami, prípadne génmi, závisí od templátu a spôsobu mapovania. Táto hodnota môže byť

udávaná v centimorganoch (cM) pre väzbové mapy, v mikrometroch (µm) alebo percentách

chromozómu pre cytogenetické mapy, v chromozomálnych intervaloch - binoch pre delečné

mapy či v pároch bázií (bp) pre sekvenčné a fyzické mapy.

Väzbové mapy sú najstaršie a najčastejšie využívané mapy v rastlinnej i živočíšnej

ríši. Slúžia na identifikáciu, analýzu a manipulovanie s génmi, ktoré sú predpokladom

pre tvorbu jednoduchých i komplexných znakov organizmov, s kvantitatívnym

aj kvalitatívnym účinkom (Tanksley et al., 1992, Duran et al., 2009). Pre efektívne využitie

týchto znakov je potrebné dosiahnuť dostatočné rozlíšenie máp, ktoré závisí od množstva

zamapovaných markrov a druhu i veľkosti mapovacej populácie (Duran et al., 2009).

18

2.5 Mapovacie populácie pre väzbové mapovanie

Mapovacia populácia pre väzbové mapovanie je súbor línií jedincov pochádzajúcich

z kontrolovaného kríženia kontrastných rodičovských jedincov. Jednotlivé línie a ich

potomkovia sú samostatne analyzované, na základe čoho je možné stanoviť genetickú

vzdialenosť mapovaných lokusov. Tá odpovedá pravdepodobnosti rekombinácie medzi dvomi

porovnávanými lokusmi počas meiózy. Typ populácie je volený v závislosti od spôsobu

rozmnožovania (Schneider, 2005, Hittalmani et al., 2008). Vzhľadom k tomu, že pšenica

je samoopelivá, je možné použiť nasledujúce 4 typy mapovacích populácií (Hopf et Zohary,

2000, Schneider, 2005): Najčastejšie sa používa F2 mapovacia populácia, s jednoduchou

prípravou najmä pre samosprašné rastliny. Pre špeciálne použite alebo imortalizáciu F2

mapovacej populácie sa využívajú jej deriváty - populácia rekombinantných inbredných línií

(RILs) alebo populácia dihaplodných linií (DH). Štvrtou možnosťou je použiť populácie línií,

vzniknutých spätným krížením (BC) s jedným alebo oboma rodičovkými líniami.

F2 populácie

Krížením rodičov s kontrastnými znakmi je vytvorená F1 populácia. Jej jedinci

sú samosprášení za produkcie F2 populácie, správajúcej sa podľa mendelovských pravidiel

klasickej genetiky. F2 populácia je výsledkom jednej meiózy, počas ktorej je genetický

materiál zrekombinovaný a dochádza k segregácii protikladných rodičovských znakov

(Schneider, 2005).

- výhody - časovo nenáročná príprava, segregácia všetkých možných kombinácií

genotypu

- nevýhody - nemožnosť premnožovania, nemožnosť opakovania experimentu

=> nevhodné pre QTL mapovanie (každý F2 jedinec geneticky unikátny),

limitované použitie pre experimenty vysokohustotného mapovania

(obmedzené množstvo DNA) (Hittalmani et al., 2008)

Rekombinantné inbredné línie (Recombinant Inbred Lines = RILs)

RILs sú pripravené samosprášením jedincov z F2 generácie. Samosprášenie

sa prevádza aspoň do siedmej generácie, pokým nie sú línie zafixované do homozygotnej

mozaiky rodičovských genómov. Keďže zdrojom ďalšej generácie je práve jedno semienko

z predchádzajúcej generácie, má táto metóda aj synonymný názov - „Single-Seed Descent

lines“ (SSD, Schneider, 2005, Hittalmani et al., 2008).

19

- výhody - finančne nenáročné, potreba genotypingu len raz pre každé RIL,

možné opakovanie experimentu, možnosť neobmedzeného premnožovania,

väčšie rozlíšenie pri mapovaní, vhodné pre štúdium QTL

- nevýhody - časová náročnosť, obtiažne získanie RIL populácie z kríženia

druhov s vysokou inbrednou depresiou, podliehanie niektorých

medzidruhových RI populácii náhodnej selekcii => tvorba skresleného

segregačného pomeru (Hittalmani et al., 2008)

Populácie spätných krížencov (Backcross Populations = BC)

Mapovacia populácia je využívaná na skúmanie úsekov DNA odvodených z jedného

rodiča (donor DNA fragmentu) na pozadí genómu druhého rodiča (recipient DNA

fragmentu). Krížením oboch rodičov je vyprodukovaná F1 hybridná rastlina, ktorá je následne

krížená s rodičom-recipientom a v sledovanom lokuse sa selektuje na heterozygota.

V spätnom krížení s recipientným rodičom sa pokračuje niekoľko generácií. Počas procesu

dochádza k odseparovaniu fragmentov DNA z donorového organizmu, ktoré neboli vo väzbe

na selekčné markry a súčasne ku skracovaniu selektovaného donorového fragmentu.

Pri pokročilej redukcii počtu a veľkosti fragmentov z donora spätným krížením môže nastať

situácia, kedy sú získané línie identické s recipientom, okrem jedného fragmentu z donora.

Vtedy sú získané línie nazývané „takmer izogénne línie“ (Nearly Isogenic Lines, NILs)

(Schneider, 2005).

- výhody - vnášanie jednotlivých znakov do kultivarov, bližšie priblíženie sa

ku žiadanému génu, zníženie genetického driftu

- nevýhody - možnosť slabšej rekombinácie u hybridov vzniknutých

medzidruhovým krížením, časová náročnosť, nutná prítomnosť detekovateľnej

genetickej diverzity medzi recipientom a donorom (Schneider, 2005,

Hittalmani et al., 2008)

Dihaploidné línie (Doubled Haploid lines = DH)

Populácia dihaploidných línií je generovaná z haploidných línií a obsahuje v každej

bunke dve rovnaké sady chromozómov. Vplyvom procesu haploidizácie a následného

zdvojenia chromozómov sú produkované úplne homozygotné línie bez prítomnosti

akejkoľvek heterozygotnosti (Schneider, 2005, Hittalmani et al., 2008).

20

- výhody - rýchlo dosiahnutý fixovaný homozygotný stav, stále mapovacie

populácie bez genotypických zmien, jednoduchšie skórovanie dát pomocou

markrov, vhodné pre mapovanie QTLs

- nevýhody - nákladná príprava, často potreba tvorby pletivových kultúr,

u niektorých rastlín problematické tvorba DH línií, nemožnosť sledovania

účinku génov u špecifických QTLs vplyvom homozygotnosti (Schneider,

2005, Hittalmani et al., 2008)

2.6 Genetické markry

Genetické markry sú jednoducho skórovateľné „značky“, ktore sa dedia podľa

mendelistických pravidiel. Týmito markrami sú polymorfizmy vo fenotype, v expresii

a funkcii génových produktov či v molekule DNA. Podľa typu detekcie môžu byť genetické

markry zadelené do troch kategórií: fenotypové (výskyt variability na fenotypovej hladine),

biochemické (rôznorodosť génových produktov alebo ich aktivity) a DNA markry (rôzne

varianty alel v DNA). Biochemické a DNA markry sú často spoločne nazývané

molekulárnymi markrami. U rastlín sa obecne markry využívajú najmä na konštrukciu

genetických máp ale i na šľachtenie, produkciu odrôd s lepšími vlastnosťami,

ku charakterizácii a izolácii dôležitých génov, markrom-asistovanú introgresiu výhodných

alel či na získanie informácií o genetickej rôznorodosti medzi populáciami (podľa Doveri et

al., 2008).

Počas posledných dvadsať rokov, vplyvom potreby zvýšenia svetovej produkcie

potravín a s vývojom nových technológií, vzrástlo množstvo dostupných DNA markrov.

Základom štúdia DNA sa stali techniky založené na hybridizácii DNA a technika Southern

blottingu, ktoré umožnili detekciu dĺžkového polymorfizmu restrikčných fragmetov (RFLP)

a zahájili tvorbu genetických väzbových máp. Nevýhodou metódy je však časová náročnosť

procedúry a práca s rádioaktívnym materiálom. Ďalším „míľnikom“ v konštrukcii

a zahusťovaní genetických máp sa stal vývoj metódy PCR, ktorý priniesol výhody oproti

tradičným RFLP markrom v potrebe len malého množstva DNA a v jednoduchosti skórovania

polymorfizmov (podľa Landjeva et al., 2007). Rôzne derivácie vo využití polymerázovej

reťazovej reakcie priniesli širokú paletu typov PCR markrov (napríklad AFLP, CAPS, IRAP,

ISSR, RAPD, REMAP, SCAR, SNP, SSR, STS, Nguyen et Wu, 2005). Ako bolo spomenuté,

do tejto rozsiahlej skupiny patria aj markry detekujúce polymorfizmus v dĺžke

amplifikovaných fragmentov (AFLP), CAPS markry využívajúce k objaveniu polymorfizmu

21

kombináciu PCR a detekcie mutácie v restrikčnom mieste (Konieczny et Ausubel, 1993)

či RAPD markry s náhodne amplifikovanou polymorfnou DNA. Ďalej je možné nájsť

polymorfizmus v počte jednoduchých sekvenčných repetícií (Simple Sequence Repeats, SSR)

či v oblastiach medzi retrotranspozónmi (IRAP, Kalendar et. al., 1999). Po spojení

technológii molekulárnych markrov a sekvenovania DNA, sa najviac využívaným typom

markru stal jednonukleotidový polymorfizmus (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP),

vďaka jednoduchosti detekcie a častému výskytu (podľa Landjeva et al., 2007). Problém však

nastal pri objavovaní sekvenčného polymorfizmu u nemodelových organizmov

s komplexnými polyploidnými genómami, medzi ktoré partia aj obilniny, zatiaľ

s nedostupnou sekvenciou genómu. čiastočné riešenie tohto problému poskytuje

vysokohustotná analýza genómu, Diversity Arrays Technology (DArT), založenej

na hybridizácii genomických DNA reprezentácií k mikroarray s vopred vybratými

polymorfnými markrami (Jaccoud et al., 2001, Wenzl et al., 2004)

2.6.1 DArT markry (Diversity arrays technology)

DArT je sekvenčne nezávislá metóda založená na hybridizácii mikro-array

markrového systému. Primárne bola vyvinutá pre výskum genómu ryže a diploidných obilnín

s malým genómom do 430 Mb. Neskôr sa zistilo, že ani veľké genómy, ako má napríklad

jačmeň (5 Gb) či hexaploidná pšenica (17 Gb), nepredstavujú problém, lebo metóda

umožňuje zistiť rozdiely v DNA u niekoľko stoviek genomických lokusov súčasne (Wenzl et

al., 2004, Akbari et al., 2006, Jing et al., 2009). Pri jednom overení je tak možné určiť stovky

až tisíce polymorfných lokusov. Výsledkom je reprodukovateľný sken genómu

s nasledovným skórovaním prítomnosti či neprítomnosti fragmentov DNA vo vzorke DNA.

Rýchla dostupnosť veľkého počtu markrov uľahčuje klonovanie a lokalizáciu dôležitých

génov, štúdium organizácie genómu, porovnávacie mapovanie, umožňuje určovať stupeň

diverzity génových zdrojov a napomáha objasňovať evolúciu genómu nie len medzi

starovekými odrodami pšenice. Sken genómu je tiež použiteľný na markrom asistovanú

selekciu v molekulárnom šľachtení či v ďalších aplikáciach genomiky (Akbari et al., 2006,

Jing et al., 2009).

Ďalšou veľkou výhodou metódy je časová nenáročnosť. Príprava analýzy trvá

maximálne tri dni. Pozostáva z prípravy DArT knižnice, DArT arraye a následného

genotypovania vzoriek DNA pomocou hybridizácie. DArT array predstavuje genomickú

reprezentáciu zmesi odrôd skúmanej rastliny. V prvom kroku tvorby arraye sa štiepi zmes

DNA dvomi restrikčnými endonukleázami (vzácne a často štiepiaci enzým). Nasleduje ligácia

22

adaptéru ku koncu fragmentu DNA naštiepeného vzácne štiepiacim enzýmom a PCR

amplifikácia časti DNA s primermi komplementárnymi k týmto adaptérom. Tým dôjde

ku zníženiu komplexnosti (zložitosti) vzorky. Naamplifikované produkty sú zaklonované

do kompetitívnych baktérií, čím sa vytvorí knižnica genomických reprezentácií. Následne sú

klonované inzerty amplifikované použitím vektor-špecifických primerov, prečistené

a otlačené na mikrokopické sklíčko. Po denaturácií je DArT array pripravená na hybridizáciu

s cieľovou DNA (Obrázok č.4 A). Pre DArT analýzu sa pripravujú dva typy arrayí - objavná

array, popísaná vyššie a následne array obohatená o polymorfné markry. Array obohatená

o polymorfizmy je pripravovaná z kandidátnych polymorfných klonov na sklíčku spolu

s kontrolnými klonmi (Jaccoud et al., 2001, Wenzl et al., 2004, Akbari et al., 2006).

Vzorky DNA, určené na detekciu, je potrebné taktiež špecificky upraviť, zmenšiť

ich komplexnosť. Postup je zhodný s prípravou DArT knižnice, ale úseky DNA sú označené

fluorescenčnou farbičkou (cy3 - zelená). Vzniknú tzv. cieľové fragmenty (targets).

Prípadne druhou fluorescenčnou farbičkou (cy5 - červená) môže byť označená druhá vzorka

genomickej DNA (Obrázok č.4 B). V ďalšom kroku nasleduje hybridizácia cieľových,

prípadne referenčných fragmentov s arrayou a odmytie nenaviazaných častí.

Detekcia a analýza nahybridizovaných úsekov DNA sa prevádza prostredníctvom

konfokálneho laserového skenera a počítačového programu. Software porovnáva relatívnu

intenzitu pomeru zeleného signálu k červenému pre každý individuálny klon naprieč

mikroskopickým sklíčkom. Ak je intenzita červeného a zeleného signálu pre určitý klon

rovnaká, na hybridizačnom skene je detekovaná žltá farba. Rozdiel v pomere zeleného

a červeného signálu vypovedá o odlišnosti DNA fragmentov porovnávaných vzoriek.

V závislosti od pravdepodobnosti výskytu polymorfizmu je klonom priradená v skórovacej

tabuľke hodnota 0 alebo 1 (Jaccoud et al., 2001, Wenzl et al., 2004, Akbari et al., 2006).

23

Obrázok č.4: Postup prípravy DArT arraye a analýza vzoriek (upravené podľa: Jaccoud et al., 2001). (A) Hromadná študovaná genomická DNA je naštiepená restrikčnými enzýmami. Pomocou naligovania adaptérov ku vzniknutým „vzácnym“ fragmentom a následnej PCR z adaptérov sa zníži komplexnosť genómu vzoriek. Amplifikované fragmenty sú zaklonované do vektora, čím sa vytvorí knižnica genomickej reprezentácie. Inzerty sú použitím vektor-špecifických primerov amplifikované, prečistené a nanesené na mikroskopické sklíčko (B) Z porovnávaných vzoriek sú vytvorené genomické reprezentácie - postup ako v (A), značené červenou a zelenou fluorescenčnou farbičkou, zmišané a hybridizované na array. Pomer intenzity farbičiek (červená:zelená) vypovedá o odlišnosti DNA fragmentov porovnávaných vzoriek. Výskyt žltej farby na hybridizačnom skene je dôsledkom rovnakého pomeru intenzity červenej a zelenej farby, a teda aj zhodného množstva naviazaných fragmentov z oboch vzoriek. .

24

2.6.2 SNP markry (Single Nucleotide Polymorphisms)

Jednonukleotidové polymorfizmy (SNP) sú najčastejšou genetickou variáciou

v genóme. Odhaduje sa, že v genóme človeka je SNP každých 300-1000 bp čo znamená

asi 10 mil. SNP na genóm (International Human Genome Sequencing Consortium 2004). SNP

sú charakterizované jednobázovou zmenou na určitej pozícii v genóme medzi dvomi

jedincami (Obrázok č.5), kde frekvencia výskytu tejto alely v populácií sa pohybuje od 1 %

do 95 %. Podľa pôvodu vzniku sú delené do 3 skupín: transície, transverzie a malé

inzercie/delécie (Brookers, 1999, Duran et al., 2009). Pri detekcii sa môžu použiť techniky

využívajúce hybridizáciu či ligáciu značených oligonukleotidov s variantami SNPs,

schopnosť nukleázy štiepiť dvojvláknotú DNA v mieste sekvenčného nesúladu (mismatch),

vzniknutého vplyvom hybridizácie dvoch fragmentov s výskytom polymorfizmu, ďalej

predlžovanie fragmentu DNA v mieste výskytu SNP pomocou primeru, štiepením DNA

restrikčnou endonukleázou v mieste výskytu SNP či priamym sekvenovaním tohto miesta

(Gut, 2001). Výhodou jednonukleotidových polymorfizmov je dobrá evolučná stabilita

a relatívny nadbytok naprieč genómom, čo zabezpečuje vysokú hustotu výskytu v okolí

sledovaného lokusu (Syvänen, 2001). SNP markre sa využívajú na skúmanie vývoja

organizmov, ich reakcie k prostrediu i na detekciu komplexných ľudských chorôb (Duran et

al., 2009).

Obrázok č.5: Príklad jednobázovej zmeny v DNA medzi jedincami Čierna šípka poukazuje na miesto výskytu štyroch variant jednonukleotidového polymorfizmu (SNP) na molekule DNA (upravené podľa http://learn.genetics.utah.edu/content/health/pharma/snips/).

25

2.6.3 SSR markry (Simple Sequence Repeats)

Po objave PCR sa mikrosatelitové alebo tiež SSR markry stali najrozšírenejšími

molekulárnymi markrami. SSR dosahujú vysoký stupeň polymorfizmu, sú kodominantné,

dobre reprodukovateľné s hojným výskytom v celom genóme. SSR markry sú odvodzované

zo sekvencie DNA obsahujúcej krátke tandemové repetície mono-, di-, tri-, tetra-, penta-

a hexa-nukleotidov. Tieto repetitívne elementy sú úplne rozptýlené po celom genóme,

no zvyčajne nepresahujú dĺžku 100 bp. Úseky SSR sú obyčajne lemovené unikátnymi

oblasťami DNA, čo umožňuje nájsť primery, špecificky amplifikujúce SSR lokusy. PCR

technika tak priamo dovoľuje z genomickej DNA amplifikovať definované mnohonásobné

SSR alely ako jeden lokus (Obrázok č.6, Tautz et al., 1989, Schlötterer, 2000).

Jednoduché sekvenčné repetície sa vyskytujú u eukaryot, prokaryot aj eubaktérií.

Využívajú sa na analýzu prítomnosti väzby medzi génmi, na mapovanie genómu,

na populačné štúdie pri testovaní príbuznosti jedincov v rámci ale i medzi populáciami (Tautz

et al., 1989, Schlötterer, 2000).

Obrázok č.6: Schématické znázornenie polymorfizmu v počte mikrosatelitovej DNA medzi jedincam a miesta na hybridizáciu SSR markrov Modré šípky znázorňujú vyskytujúcu sa variabilitu v počte tandemových repetícií medzi jedincami A, B a C. Čierne šípky predstavujú navrhnuté PCR primery k oblastiam lemujúcim mikrosatelitový región v DNA (ružovo zvýraznené úsečky, upravené podľa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechSTS.shtml)

2.6.4 CAPS markry (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)

CAPS markry sú kodominantné molekulárne markry, ktoré amplifikujú krátku

genomickú sekvenciu okolo polymorfného miesta, rozoznávaného DNA restrikčnou

endonukleázou. Polymorfizmus v restrikčnom mieste môže vzniknúť alebo zaniknúť

v dôsledku mutácie. Napríklad ako na obrázku č.7, kde pomocou unikátnych sekvencií

primerov a PCR reakcie, dôjde k amplifikácii mapovanej DNA sekvencie u dvoch rôznych

ekotypov (A/A, B/B) a heterozygota (A/B). Amplifikované fragmenty z jedincov A/A a B/B

majú pre restrikčnú endonukleázu (RE) dve a tri rekogničné miesta. V prípade heterozygota

A/B, sa získajú dva rôzne produkty, jeden zhodný s rodičom A/A - dvakrát štiepiteľný RE

a druhý produkt je získaný z rodičovského genómu B/B - trikrát štiepiteľný RE. Pri delení

26

PCR produktov z jednotlivých rastlín, naštiepených RE, sa na agarózovom

alebo akrylamidovej géli detekujú jednoducho rozlíšiteľné schémy bandov (Konieczny

et Ausubel, 1993). V porovnaní s tradičnými RFLP markrami, pri PCR-generovaných

markroch nie je na detekciu používaná rádioaktivita, je postačujúca malá vzorka DNA

a výhodou je aj časová nenáročnosť či dostatok polymorfizmu (Nguyen et Wu, 2005, Doveri

et al., 2008). Derivátom techniky CAPS sú markry nazývané dCAPS (derived Cleaved

Amplified Polymorphic Sequence), ktoré sú navrhnuté pre alely neobsahujúce rekogničné

miesto pre RE ale obsahujú aspoň jeden SNP. Pomocou kombinácie existujúceho SNP

a špeciálne navrhnutých primerov, ktorých súčasťou je jeden alebo viac mismatchov,

sa vytvorí restrikčné miesto špecifické pre jednu alelu mapovacej sekvencie. Po PCR

amplifikácii sa polymorfizmus detekuje rovnakým spôsobom ako pri CAPS markroch (Neff et

al., 1998).

Obrázok č.7: Amplifikácia, štiepenie a gélová separácia CAPS markrov Unikátne sekvencie primerov (čierne šípky) sú použité na amplifikáciu a mapovanie DNA sekvencií z dvoch blízko príbuzných jedincov A/A, B/B a z heterozygota A/B. Červené vertikálne čiary v amplifikovaných fragmentoch znázorňujú restrikčné miesta (A/A - 2, B/B - 3). U heterozygota po štiepení restrikčnou endonukleázou (RE) jeden PCR produkt bude štiepený 2x a druhý 3x. Po gélovej separácii sa zviditeľní rozdiel v počte a dĺžke naštiepenývh PCR fragmentov medzi rodičmi a heterozygotom. U heterozygota sú detekované fragmenty od oboch rodičov (kodominancia). (Upravené podľa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechCAPS.shtml).

2.6.5 STS markry (Sequence-Tagged Site)

Miesto so sekvenčnou adresou (STS) je krátka, unikátna sekvencia určujúca špecifický

lokus. Každý STS je charakterizovaný párom alelovo-špecifických oligonukleotidov

(primerov), ktoré sú navrhnuté osekvenovaním napríklad RFLP a RAPD prób,

AFLP fragmentov či iných polymorfných markrov (podľa Gupta et al., 1999). V kontraste

s AFLP a SSR markrami, primer viažuce miesta pre STS markry odvodené z cDNA RFLP

27

klonov sú medzi druhmi konzervované. STS markry tak môžu poskytnúť spoľahlivý systém

na mapovanie ortológnych lokusov medzi vzdialenými príbuznými druhmi,

a tým umožniť porovnávanie genetických väzbových máp z odlišných druhov (Taylor et al.,

2001) Detekcia prítomnosti markrov sa prevádza pomocou PCR a amplifikované fragmenty

sú následne elektroforeticky separované (Obrázok č.8, podľa Gupta et al., 1999).

Obrázok č.8: Detekcia výskytu STS Miesto so sekvenčnou adresou je charakterizované zvyčajne 200-500 bp dlhou sekvenciou nukleotidov, ktorá sa v genóme vyskytuje len raz. Detekcia STS vo vzorke DNA pozostáva z amplifikácie krátkeho úseku pomocou špecifických primerov (čierne šípky), gélovej elektroforézy a vizualizácie amplifikovaného fragmentu na géli (červená šípka, upravené podľa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/).

2.6.6 IRAP markry (Inter-Retrotranspozon Amplified Polymorphism)

IRAP technika je založená na vytváraní PCR produktov medzi

susednými retrotranspozónmi, ktoré sa v hojom počte vyskytujú aj v genómoch tráv (Nguyen

et Wu, 2005). Ich vysokú hustotu v genóme zabezpečuje proces retrotranspozície -

transkripcia retrotranspozónovej DNA do RNA, reverzná transkripca a inzerciou nových

cDNA kópií späť do genóm. Vďaka hustému rozptýleniu retrotranspozónov naprieč

jadrovému genómu a možnosti premiestňovať sa, sú dobrým zdrojom tvorby DNA markrov.

IRAP primery sú navrhované k segmentom dlhých terminálnych repetícií (LTRs),

ohraničujúcich z vonkajších strán mobilné elementy (Obrázok č.9). U každého

retrotranspozónu sú LTRs rozlišované na ľavý (L, left) a pravý (R, right) segment.

Vďaka tomu je možné určiť orientáciu retrotranspozónov začlenených do genomickej DNA

a použitím jedného alebo oboch typov primerov súčasne amplifikovať úsek medzi susednými

retrotranspozónmi v troch rôznych orientáciach (Obrázok č.9, Kalendar, 1999).

Výhodou retrotranspozónov je prítomnosť dlhých, konzervovaných sekvencií,

ktoré môžu byť použité na tvorbu špecifických kodominantných markrov. Vďaka replikačne

28

aktívnym členovm rodiny retrotranspozónov sú produkované nové inzercie v genóme,

ktoré vedú k vytváraniu polymorfizmu medzi genómami (podľa Kalendar, 1999, Nguyen et

Wu, 2005)

Obrázok č.9: Amplifikačná stratégia IRAP markrov Retrotranspozóny sú z obidvoch strán ohraničené dlhými terminálnymi repetíciami (LTR), označenými L (left, ľavá) a R (right, pravá). Pomocou nich je stanovená orientácia retrotranspozónov vo vnútri kódujúcej DNA (vlnovky). Zelené šípky označujú PCR primery nasadajúce na 5´konce a červené šípky na 3´konce LTRs. Použitím jedného (A, B) alebo oboch typov primerov (C) súčasne umožňuje amplifikovať úsek medzi susednými retrotranspozónmi v troch rôznych orientáciach (vytvorené podľa Kalendar et. al., 1999).

2.7 Využitie molekulárnych markrov

Molekulárne markre predstavujú jeden z významných nástrojov používaných

k analýze genómu. Umožňujú porozumieť vzťahu medzi dedičnosťou fenotypových znakov

a informácii o sekvencii (Duran et al., 2009).

Využitie markrov je bohaté - od šľachtenia rastlín až k predpovedaniu rizika vzniku

ľudských chorôb a ich diagnostike. Medzi hlavné výhody DNA markrov patrí spoľahlivá

dedičnosť, jednoduchá analýza, žiadny vplyv okolitého prostredia, možnosť

vysokohustotného genotypovania (high-throughput). Aplikácie možno nájsť aj pri šľachtení

obilnín, kde je možné skúmať prítomnosť génov kontrolujúcich sledovaný znak

prostredníctvom markrom asistovanej selekcie (MAS). Požadovaný znak je tak možno

detekovať v ranom štádiu rastu, ešte pred fenotypový prejavom, čím sa urýchli proces

šľachtenia. K ďalším prednostiam molekulárnych markrov patrí možnost simultánne

selektovať viac rôznych znakov a taktiež identifikovať gény rezistencie bez potreby

vystavenia rastlín patogénom či škodcom (Duran et al., 2009).

Dostupnosť markrov a nimi podmienená rozlišovacia schopnosť, genetického

mapovania a tvorby vysokohustotných väzbových máp, má zásadný vplyv na využitie

markrom asistovanej selekcie a evolučné štúdie. Taktiež umožňuje lepšie porozumieť

genetickej architektúre kvantitatívnych znakov, dôležitých v poľnohospodárstve

a pri šľachtení (Tanksley et al., 1992, Mantovani et al., 2008, Zeng et al., 2008).

29

2.8 Lokusy ovplyvňujúce kvantitatívne znaky (Quantitative Trait Loci, QTLs)

Väčšina agronomicky dôležitých znakov u pšenice vykazuje kvantitatívnu dedičnosť

(Börner et al., 2002). Tá je výsledkom segregácie komplexných polygénnych znakov,

ktorých expresia je modifikovaná účinkami prostredia. Prejavom kvantitatívne dedených

znakov je kontinuálna variácia fenotypu (Paterson et al., 1988, Lander et Botstein, 1989,

Nelson, 2005).

Lokusy prispievajúce k variabilite kvantitatívnych znakov (QTLs) ovplyvňujú

rezistenciu voči abiotickým i biotickým stresom, agronomické a morfologické vlastnosti

rastlín. Detekcia QTLs je štatisticky náročná a môže prebiehať len v prípade, ak rodičia nesú

rôzne varianty (alely) odlišujúce sa v kvantitatívnom znaku. (Lander et Botstein, 1989,

Börner et al., 2002). Prostredníctvom kríženia týchto rodičov sa získa relatívne veľký počet

fenotypovo rôznych jedincov. Následne je v takto vzniknutej populácii, pomocou rovnomerne

rozložených markrov v genóme, skórovaný výskyt lokusov podmieňujúcich skúmaný znak

(Lander et Botstein, 1989, Nelson, 2005).

Štatistická analýza je prevádzaná pomocou počítačových programov, ktoré priraďujú

pravdepodobnosti prejavu fenotypového znaku vo väzbe k výskytu alely markru v určitom

lokuse na väzbovej mape. Pravdepodobnosť ovplyvnenia fenotypu určitým lokusom

je počítaná metódou maximálnej pravdepodobnosti (maximum likelihood) a jej výstupom

sú tzv. LOD skóra (Limit Of Detection, Lander et Botstein, 1989). LOD skóre je v podstate

dekadický logaritmus násobku pravdepodobnosti, že daný znak je lokusom ovplyvnený

ako že nie je. Pôvodne bolo zaužívané, že ak je LOD skóre nižšie ako 3, je považované

za menej významné.

Súčasné štatistické nástroje (napr. R/Qtl, Broman et al., 2003) umožňujú vypočítať

okrem LOD skóra aj vhodnú hodnotu LOD tresholdu. Hodnota LOD tresholdu je závislá na

veľkosti genómu a rozostupe zamapovaných markrov. Na určenie LOD tresholdu slúži odhad

pravdepodobnosti, že LOD skóre prekročí LOD treshold niekde v genóme, v prípade,

ak nebude segregovať žiadny QTL. Z toho vyplýva, že ak LOD skóre prekročí predurčený

LOD treshold, potvrdí sa v genóme výskyt lokusu s kvantitatívnym znakom. Ak LOD skóre

prekročí LOD treshold = 0,05 je zaručená maximálne 5 % pravdepodobnosť výskytu

falošných pozitív kdekoľvek v genóme (Lander et Botstein, 1989, Nelson, 2005).

Hlavnou úlohou mapovania QTLs je určiť ich umiestnenie v genóme a stanoviť mieru

vplyvu na fenotyp (Zeng et al., 2008). Pomocou týchto poznatkov je možné zefektívniť

šľachtenie organizmov voči biotickým a abiotickým stresom, a taktiež zvýšiť produktivitu

rastlín.

30

2.9 Výnos pšenice

Výnos je komplexný kvantitatívny znak kontrolovaný velkým počtom génov, ktoré

významne ovplyvňuje prostredie, a preto má tento znak malú dedivosť. Výnos ako celok

je súčet komponentov ktoré ho ovplyvňujú. Hlavnými komponentmi výnosu sú: priemerná

hmotnosť zrna, tiež uvádzaná ako hmotnosť tisícich zŕn, počet zŕn na klas a počet klasov

na m2. Jednotlivé komponenty výnosu naopak vykazujú veľmi dobrú dedivosť (Cuthbert et

al., 2008). Výnos ovplyvňujú aj ďalšie znaky vrátane výšky rastliny, rezistencíí k biotickým

a abiotickým stresom, účinnosti fotosyntézy alebo translokácie metabolitov z rastliny do

semien a podobne.

Vplyv výšky rastliny na výnos má väčšinou nepriamy účinok. Zistilo sa,

že polotrpaslíčie rastliny majú síce krátke stonky, ale silné, čím znižujú pravdepodobnosť

políhania rastliny, a tým sa zvyšuje plocha asimilácie. Asimilanty sa ukladajú do zŕn,

výsledkom čoho je zvýšenie výnosu a úrody. Výška rastliny je kontrolovaná okrem

mendelistických génov aj kvantitatívnymi a expresia génov má dynamický charakter počas

vývoja rastlliny (Wang et al., 2010). Na hexaploidnej pšenici bol lokus pre výšku rastliny

zamapovaný na takmer všetky chromozómy A, B aj D genómu (Araki et al., 1999, Kato et al.,

1999, Huang et al., 2004, Verma et al., 2005, Sadeque et Turner, 2010, Wang et al., 2010).

Klas je pokladaný za najviac variabilnú časť pšenice. Medzi druhmi je možné nájsť

rozdiel v tvare, veľkosti (šírke i dĺžke) a „hustote“ klasu (podiel počtu kláskov ku dĺžke

klasu). Odlišnosť medzi morfológiou klasu je najčastejšie používaným kritériom

pre rozlišovanie druhov a je častým objektom skúmania. Zvýšením dĺžky klasu, by mohla byť

zvýšená úrodnosť klasu a tiež výnos zŕn (Sourdille et al., 2000). QTL pre dĺžku klasu

bol skúmaný v mnohých prácach. Lokus bol zamapovaný u T. monococcum L.

na chromozómoch 3Am a 4Am (Hori et al., 2007) u T. aestivum L. na 1BS, 2D, 4AL, 4AS, 4D,

5A (Kato et al., 1999, Börner et al., 2002, Verma et al., 2005). Lokusu určujúci počet kláskov

na klas bol mapovaný na chromozómoch 2B, 4A, 5A a 6A (Araki et al., 1999, Kato et al.,

2000, Verma et al., 2005). S klasmi súvisí aj veličina určujúca počet odnoží u rastlín.

Keďže ovplyvňuje počet klasov na rastlinu, partí taktiež medzi dôležité komponenty výnosu.

V prácach výskumných skupín Arakiho (1999) a Kata (2000) bol lokus na T. aestivum L.

umiestený na chromozómy 4A a 5A.

Ďalším komponentom výnosu je veličina stanovujúca priemernú hmotnosť zrna.

Lokus pre tento znak bol zamapovaný u hexaploidnej pšenice na chromozómoch 1A, 1B, 1D,

2A, 2B, 2D, 3A, 3B, 3D, 4B, 5A, 6A, 7A, 7D (Araki et al., 1999, Kato et al., 2000, Börner et

31

al., 2002, Huang et al., 2004, Verma et al., 2005, Kumar et al., 2006, Cuthbert et al., 2008)

a u diploidnej pšenice T. monococcum L. na chromozóm 2A (Hori et al., 2007).

Pri šľachtení pšenice je dôležitým cieľom zabezpečiť stabilnú expresiu génov

riadiacich vysoký výnos zŕn. Študovaním jednotlivých komponent výnosu a ďalších znakov

vplývajúcich na úrodu zŕn, kvantitatívne sa meniacich na rôznych genetických pozadiach,

umožňuje objasňovať funkcie génov, ktoré s výnosom zŕn priamo súvisia (Quarrie et al.,

2006).

2.10 Ochlpenie listov pšenice (pubescence, hairy leaf)

Na povrchu ratlinných orgánov možno často pozorovať výrastky epidermis, nazývané

tiež chlpy alebo trichómy. Výskyt chlpov na listoch je považovaný za morfologický znak,

zvyšujúci fitness rastliny (Roy et al., 1999).

Trichómy na listoch rastlín sú fyziologicky aj ekologicky dôležité. Často sú schopné

zabezpečiť ochranu rastliny pred abiotickými stresmi (napríklad tolerancia k suchu znížením

prúdenia vzduchu v okolí rastliny, redukcia záťaže vplyvom tepelného a UV žiarenia,

zbavovanie sa toxínov, tolerancia k chladu) ale tiež pred biotickými nástrahami (ocharna

pred herbivormi, zníženie rozširovania patogénov zmenšením zmáčivosti listov, redukcia

populácie byľomora obilného - Mayetiola destructor a ďalšie). Avšak výskyt chlpatosti

na listoch neposkytuje ochranu voči všetkým nepriateľom (napríklad trichómy uľahčujú vstup

patogénnej huby Discula sp. do listového tkaniva) (Roberts et al., 1979, Brown et al., 1994,

Roy et al., 1999, Taketa et al., 2002, podľa Dobrovolskaya et al., 2007).

Na výskyt trichómov nemajú vlpyv len enviromentálne a genetické faktory,

ale sú dôležité aj nepriame efekty dané spolupôsobením zmien v ďalších znakoch rastliny

(napríklad zmena veľkosti listu vplýva na zmenu hustoty ochlpenia). Hustota ochlpenia

na listoch je závislá od miesta výskytu rastliny, počtu založených chlpov na liste ale aj

od vývojového štádia rastliny. Ochlpenie listov v jednotlivých štádiach rastu je kontrolované

rôznymi génmi. Expresia týchto génov je ovplyvnená viacerými modifikáciami, čím dochádza

k rozdielnej génovej expresii u semenáčika aj u dospelej rastliny. Iniciácia ochlpenia listov

vykazuje taktiež variabilitu, ktorá je z väčšej časti podmienená zložením genómu. Čo sa týka

veľkosti listu, tento znak je primárne kontrolovaný vonkajším prostredím.

Genetická variabilita pre hustotu chlpov na listoch je tak rôzna medzi rodmi aj v rámci druhov

(Roberts et al., 1979, Roy et al., 1999, Taketa et al., 2002, podľa Dobrovolskaya et al., 2007).

Kuspira et al. (1989) popísali jeden hlavný génový lokus s mnohonásobnými

alelickými sériami, ktorý určuje ochlpenie listov. Medzi lokusmi platí nasledujúci vzťah.

32

Špecifický lokus pre veľmi chlpaté listy (HlVP) je úplne dominantný k ďalším dvom lokusom

pre chlpaté listy (HlP) a listy bez chlpov (hl). Lokus Hl

P je dominantný len ku lokusu hl.

Kolektív vedcov predpokladal, že Hl lokus identifikovaný u T. monococcum L.

na chromozóme 4Am zodpovedá pozícii génu pre chlpatosť na chromozóme 4A u T. aestivum.

Jing s kolektívom (2007) zamapovali gén pre chlpatosť u T. monococcum L. na chomozóm

5Am. Analýza Hori et al. (2007) na mapovacej populácií vzniknutej krížením T.

monococcum L. a T. boeoticum Boiss. taktiež potvrdila výskyt génu pre chlpatosť listov na

chromozóme 5A.

U hexaploidnej pšenice boli zamapované na chromozómoch 4B (Hl1 gén) a 7BS

(Hl2Aesp) dva gény ovplyvňujúce prítomnosť ochlpenia listov (Taketa et al., 2002,

Dobrovolskaya et al, 2007). K výskytu génu pre chlpatosť na chromozóme 7B mohlo dôjsť

vplyvom druhovo špecifických štrukturálnych zmien medzi chromozómami 4A, 5A a 7B

u hexaploidnej pšenice (Devos et al., 1995).

33

3. CIELE PRÁCE

1. Dopestovanie mapovacej populácie a jej genotypovanie.

2. Navrhnutie pokusu pre QTL mapovanie v sezóne 2010

3. Zozbieranie dát a vyhodnotenie.

4. Zahustenie existujúcej genetickej mapy

5. Vypracovanie diplomovej práce.

34

4. MATERIÁL A METODIKA

4.1 Biologický materiál

Semená generácie F10 použité v tejto práci boli odvodené z 87 línií F8 RIL mapovacej

populácie poskytnutej Prof. J. Dubcovským (University of California, Davis, USA).

Mapovacia populácia bolo odvodená z kríženia línií kultúrnej formy pšenice jednozrnovej cv.

DV92 (T. monococcum L. subsp. monococcum, Titograd, Montenegro, Taliansko) a divokej

formy pšenice jednozrnovej cv. G3116 (T. monococcum L. subsp. aegilopoides, Libanon).

4.2 Chemikálie a roztoky

4.2.1 Chemikálie a roztoky pre vysokovýkonnú extrakciu DNA

Základ lyzačného pufra (pH 7,2)

- 0,5M NaCl

- 100 mM This-HCl

- 50 mM EDTA

Lyzačný pufor

- 100 ml základu lyzačného pufra, pH 7,2

- 0,5 g hydrogénsiričitanu sodného

- 0,1g kyseliny askorbovej

- 0,1 ml merkaptoetanolu

4.2.2 Chemikálie a roztoky pre agarózovú gélovú elektroforézu

0,5x TBE (pH 8,0)

- 45 mM Tris bázy

- 45 mM kyseliny boritej

- 1 mM EDTA

6x Stop C (pH 8,0)

- 100 mM EDTA

- 1% SDS

- 0,05 % bromfenolová modrá

- 0,05 % xylenecyanol

- 50 % glycerol

35

- agaróza (SERVA)

- deionizovaná voda (dH2O)

- veľkostný marker, Gene RulerTM 100bp, Plus DNA Ladder (Fermentas, Kanada)

- 10% etidium bromid (Sigma Aldrich, USA)

4.2.3 Chemikálie a roztoky pre polymerázovú reťazovú reakciu

10 x PCR pufor (pH 8,2)

- 500 mM KCl

- 100 mM Tris-HCl

- 1% Triton X-100

- 15 mM MgCl2

5x Cresol Red

- 7,5% sacharóza

- 0,05% Cresol Red (Aldrich, USA)

- rozpustiť v dH2O

Nukleotidy (Fermentas, Litva)

- dATP (100 mM)

- dGTP (100 mM)

- dCTP (100 mM)

- dTTP (100 mM)

- primery (Invitrogen, USA)

- Taq polymeráza (Fermentas, Litva)

4.2.4 Chemikálie a roztoky pre nedenaturujúcu polyakrylamidovú elektroforézu

5x TBE (pH 8,0)

- 450 mM Tris bázy

- 450 mM kyseliny boritej

- 10 mM EDTA

- peroxodisulfát amónny (APS, Fluka BioChemika, USA)

- deionizovaná voda (dH2O)

36

- N, N, N´, N´- tetrametylénetyléndiamín (TEMED, Fluka BioChemika, USA)

- veľkostný marker, Gene RulerTM 100bp, Plus DNA Ladder (Fermentas, Kanada)

- 10% etidium bromid (Sigma Aldrich, USA)

- 40% akrylamid: N, N´- metylénbisakrylamid 19:1 (Fluka analytical, USA)

4.3 Prístrojové vybavenie

- binokulárna lupa (Carl Zeiss, Jena)

- centrifuga Jouan GR2022 (Thermo, USA)

- dokumentačný systém pre analýzu ELFO gélov ChemiGenius BioImaging System

s transiluminátorom GVM20 (Syngene, GB)

- elektroforetický zdroj napätia, MP-500V Power Supply (Major Science, USA)

- homogenizačný oscilačný mlyn MM301 (Retsch, Nemecko)

- horizontálna elektorforetická komôrka Owl B2 (Thermo Scientific, USA)

- hybridizačný inkubátor, 1000 Hybridization Oven (Robbins Scientific, USA)

- chladená centrifuga Jouan CR4i (Thermo, USA)

- magnetická doštička, 96 direct Inject Magnet (Beckman Couter, USA)

- mikrovlnná rúra, Daewoo KOR 6C2B (Daewoo, ČR)

- semimikro váhy, SBC 21 (Scaltec, Nemecko)

- spektrometer Nicolet ANTARIS II FT (Thermo, USA)

- stereomikroskop, SZX16 Research Stereomicroscope (Olympus, USA)

- termostat BT 120M (Laboratórne prístroje Praha, ČR)

- termocyklér, C-1000TM Thermal Cycler (Bio-Rad, Kanada)

- vertikálna elektroforetická aparatúra Dual Adjustable Mega-Gel Kit C-DASG-400-

50 (C. B. S. Scientific, USA)

4.4 Metodika

4.4.1 Založenie poľného pokusu

Z každej línie mapovacej populácie bolo 5.2.2010 sterilizovaných 12-15 semien 5 %

SAVO/1 minútu a po premytí vodou boli semená umiestnené na navlhčenú buničitú vatu

do Petriho misiek. Misky so semenami boli najskôr inkubované 6 dní pri 4 °C a následne

cez noc pri 25 °C. Naklíčené semená boli zasadené do rašelinových jiffy kvetináčov (5x5 cm),

obsahujúcich pestovateľský substrát s hnojivom Cererit (Lovo Chemie a.s., ČR) 1:70

37

a 1 % Agrisorbu (Stockhausen GmbH & Co.KG, Nemecko). Jarovizácia prebiehala v skleníku

za prirodzeného osvetlenia a teplote do 10 °C. 31. marca a 1. apríla bolo päť opakovaní

mapovacej populácie vysadené do pripravených vonkajších parcel v areáli ÚEB Olomouc

metódou latinských štvorcov. Znáhodnenie bolo generované použitím programu Scientific

Randomizer (http://randomizer.org/form.htm). Počas rastu a dozrievania boli skórované

sledované znaky. Tvar rastliny bol hodnotený po 30 a 50 dňoch výsadby do vonkajších parciel

a ostatné znaky v období mliečnej zrelosti a po zbere.

4.4.2 Vysokovýkonná extrakcia DNA

Časti mladých listov (3 x 3 cm) z jednotlivých línii T. monococcum L. bolo

zozbieraných do 96 jamkových misiek a sušených v termostate BT 120M (Laboratórne

prístroje Praha, ČR) dva dni pri 37 °C. Následne bola prevedená homogenizácia

v oscilačnom mylne MM301 (Retsch, Nemecko) 4 min/27 Hz s dvoma sklenenými guličkami

(0,5 cm) na jamku. Po pridaní 1 ml lyzačného pufra k homogenizátu boli vzorky za občasného

pretrepania inkubované (1000 Hybridization Oven, Robbins Scientific, USA) 45 min

pri 65 °C a lyzát bol scentrifugovaný pri 3000 rpm/10 min/4 °C (Jouan CR4i, Thermo, USA).

Do novej 96 jamkovej PCR misky bolo napipetovaných 10 µl magnetických guličiek

(GeneFind 2.0, Immunotech), 1 µl RNázy (10 mg/ml), 100 µl supernatantu z lyzátu a 70 µl

izopropanolu (Lachema, ČR). Aby sa DNA naviazala na magnetické guličky, zmes bola

inkubovaná 5 minút pri izbovej teplote. Guličky s naviazanou DNA boli imobilizované

inkubáciou 5 min na magnete a supernatant bol odpipetovaný do odpadu. Guličky boli mimo

magnet prepláchnuté 100 µl 70 % etanolu (Lachema, ČR). Miska bola znovu umiestená

na magnet a po 5 minútach bol supernatant odstránený. Tento postup prečistenia DNA bol

zopakovaný ešte dvakrát. Miska bola sušená 10 min pri izbovej teplote. Extrahovaná

a purifikovaná DNA bola eluovaná do 40 µl vody a po inkubácii 2 min pri izbovej teplote

bola miska na 10 min umiestnená na magnet a 38 µl roztoku purifikovanej DNA bolo

prenesených do novej misky.

4.4.3 Agarózová gélová elektroforéza a vizualizácia DNA

Zmes 4,5g agarózy (SERVA) a 300 ml 0,5x TBE bola privedená do varu

v mikrovlnnej rúre (Daewoo KOR 6C2B, ČR) a po ochladení na približne 60 °C vliata

do pripravenej elektroforetickej komôrky s vloženými hrebienkami (Owl B2, Thermo

38

Scientific, USA). Po stuhnutí (približne 30 min) bola agaróza zaliata 0,5 % TBE pufrom.

Do gélu boli nanášané vzorky vyizolovanej DNA s farbičkou (5 µl DNA + 1 µl 6xSTOP C)

a 5 µl markra (20 ng/ µl, Gene Ruler, 100 bp Plus DNA Ladder, Fermentas).

Elektroforetická separácia DNA prebiehala 30 min pri 150 V. Časť gélu so separovanou DNA

bola umiestnená na 45 min do misky s roztokom 0,05 % etidium bromidu (Sigma-Aldrich,

USA). Následne bola DNA na géli vizualizovaná pomocou dokumentačného zariadenia

(GVM20, ChemiGenius Bioimaging System, Syngene, GB).

4.4.4 Polymerázová reťazová reakcia (PCR)

Polymerázová reťazová reakcia prebiehala v objeme 20 µl na jamku. Reakčná zmes

pre PCR obsahovala 200 µM každého nukleotidu, 1x PCR pufor, 1x Cresol Red, 1U Taq

polymerázy, po 1 µM z oboch primerov, 3 ng/ µl DNA.

PCR reakcia bola prevedená v nasledujúcich krokoch (teplota a čas hybridizácie a extenzie

pre jednotlivé primery, vybrané na základe databázy Grain.Genes 2.0,

http://wheat.pw.usda.gov/GG2, sú uvedené v Tabuľke č.4):

1) denaturácia 95 °C - 5 min

2) 40 cyklov: denaturácia 95 °C - 30 s

hybridizácia primerov viď. Tabuľka č.4

extenzia 72 °C - 30s - 1 min

3) záverečná extenzia 72 °C - 10 min

4.4.5 Nedenaturujúca polyakrylamidová gélová elektroforéza

Príprava gélu (4%, 6%)

Gél bol pripravený zmiešaním 5x TBE pufra, 40 % akrylamidu

s metylenbisakrylamidom v pomere 19:1, deionizovanej vody, TEMEDu a 10 % APS.

Pomer jednotliých zložiek závisel od hustoty gélu (Tabuľka č.3). Roztok bol naliaty medzi 2

sklá (500 x 220 mm) a po nasadení hrebienka tuhol gél hrúbky 1 mm 30-45 minút.

Prečistenie gélu a jeho nasýtenie etidium bromidom

Stuhnutý gél bol aj so sklami prenesený do vertikálnej elektroforetickej komôrky

(Dual Adjustable Mega-Gel Kit C-DASG-400-50, C. B. S. Scientific, USA),

naplnenej v katódovej aj anódovovej vaničke 0,5x TBE pufrom (cca 900 ml).

39

Následne bol z gélu odstránený hrebienok. V spodnej anódovej vaničke elektroforetickej

komôrky bolo k pufru pridaných 10 µl etidium bromidu (10 %, výsledná koncentrácia

v roztoku 0,001 %), ktorý vplyvom elektrického napätia nasýtil gél. Prerun prebiehal 45 - 60

min pri 300 V.

Tabuľka č.3: Pomer jednotlivých zložiek na prípravu 4% a 6% gélu (150 ml)

Chemikálie a roztoky

Objem pre 4% gél

Objem pre 6% gél

40% akrylamid : N, N´- metylenbisakrylamid (19:1)

15 ml 22,5 ml

5x TBE pufor 15 ml 15 ml TEMED 110 µl 110 µl 10% APS 1 ml 1 ml dH2O doplniť do 150 ml doplniť do 150 ml

Elektroforetická separácia a vizualizácia DNA

Do prvej a poslednej jamky bolo napipetované po 5 µl markra (20 ng/µl, Gene Ruler,

Fermentas) a do ostatných jamiek v objeme 1-8 µl jednotlivé naamplifikované vzorky DNA.

Elektroforéza prebiehala 0,5-2h pri napätí 350 V (v závislosti od dĺžky delených fragmentov

DNA). Následne bol gél vyfotený v dokumentačnom zariadení ChemiGenius BioImaging

System (Syngene, GB).

4.4.6 Doplnenie genetickej mapy

Genetická mapa poskladaná v diplomovej práci Mgr. Klocovej (2009) a bakalárskej

práci Bc. Vanžurovej (2010) bola doplnená o ďalsie SSR a génové markry (Tabuľka 4).

Genotypy línií mapovacej populácie pre jednotlivé markry boli porovnané s mapovacím

martixom jednotlivých chromozómov a predpokladaná pozícia markeru bola odhadnutá

na základe minimálneho počtu možných rekombinácií. Získané pozície boli verifikované

programom JoinMap 4 (Van Ooijen, 2006). Ak frekvencia rekombinácií bola menšia

ako 0,4 a LOD skóre väčšie ako 1, bola potvrdená prítomnosť väzby medzi markrami.

Prepočítanie veličín bolo prevedené po pridaní každého markra s ohľadom na tri priľahlé

markre (ripple). S využitím funkcie Kosambi (Kosambi, 1943) bola medzi markrami

odhadnutá genetická vzdialenosť a na identifikovanie väzbových skupín bola použitá metóda

regresného mapovania.

40

Tabuľka č.4: Markry s primermi (Grain.Genes 2.0, http://wheat.pw.usda.gov/GGG2), podmienky PCR reakcie (teplota a čas nasadania)

Marker Sekvencia primeru Forward (F), Reverse (R)

Teplota a čas nasadania primerov

Abc 156 F: TTA CGG GAT CAA AGC TGA GGC R: GAC AAG CAA CAC CAA CCA AGC

50°C - 30s

Abc 261 F: AGG AAG CTC AAG AAG GTG AA R: AAA GTC AAG AGT TGC ATC AA

45°C - 1,5 min

Abg 387.2 F: GCA CTG GCA TAG TCT CAC AA R: CGA TGC TGG TTC GGT CAT AC

50°C - 30s

Bcd 98.1 F: CCGTTTGGACAAAGCAACTT R: CTTGCTTCTTAGGCCTGGTG

50°C - 30s

Bcd 98.2 F: TCACCAAGACTTTCGCACAG R: GGCTTGCACAAAAACTGC

50°C - 30s

Ksu D23 F: AGG CAG TGA AGA AGA AGA ACC R: TTG AAA TCG ACA GGA TTA GGA

50°C - 30s

Ksu E18 F: TGA GCC GGT TGC TGT TCG TC R: AAG CAC CGA CAT GGT CAC CC

50°C - 30s

Ksu G34 F: GTC TCA GGA AGG TGA TGA TC R: GAG CAG TAG GGT AAA GTA AG

45°C - 1,5 min

Mwg 584 F: GTA TTC TTG GAG GAG AGC GG R: CGA GGT TTA CCC TGG AGA CG

50°C - 30s

Rpg F1R3 F: GGC CAA AGA GGA GAA GAA GG R: GTC TAG AGA AAC CAA AAC CTC CAA

55°C - 30s

Rpg F1R4 F: GGC CAA AGA GGA GAA GAA GG R: TGC AAG ATT ATG ACA CCC AGA

55°C - 30s

Rpg F1R5 F: GGC CAA AGA GGA GAA GAA GG R: GGC TTC CTC GTT GCA TGT AT

55°C - 30s

Rpg F4R5 F: TGC CAC CAG AAT ACA TCA GTA AA R: GGC TTC CTC GTT GCA TGT AT

55°C - 30s

Rpg F5R5 F: GGG AGT GTT GGA CAA TGG AG R: GGC TTC CTC GTT GCA TGT AT

55°C - 30s

4.4.7 Fenotypovanie

Hodnotenie fenotypov bolo prevedené na 87 líniach generácie F10 z mapovacej

populácie RILs. Bolo sledovaných desať fenotypových znakov, funkčne zadelených do troch

kategórií: agronomicky významné znaky (obsah proteínov v zrne, rozpadavosť klasu,

výška rastliny), morfologické znaky (chlpatosť listov, rozkladitosť trsu), znaky pre výnos

(dĺžka klasu, počet kláskov na dĺžku klasu, počet kláskov na klas, počet odnoží, priemerná

hmotnosť zrna).

Agronomicky významné znaky

a) obsah proteínov v zrne - pre každú líniu spektrometrické meranie obsahu

dusíka v 1g sušiny semien prístrojom Nicolet ANTARIS II FT (Thermo

Scientific, USA)

41

b) rozpadavosť klasu - zrelé klasy z každej rastliny boli najskôr zozbierané do

papierových vreciek a sušené 1 týždeň pri izbovej teplote. Následne boli klasy

prehlásené za rozpadavé alebo nerozpadavé, ak k oddeleniu kláskov od

centrálneho vretena klasu došlo buď samovoľne už počas zbierania alebo

vplyvom slabého mechanického ťahu kláskov od vretena klasu.

Znaky pre výnos

a) dĺžka klasu - meranie od bázy klasu po posledný kvietok (bez ostí) u piatich

najstarších klasov u každej rastliny s presnosťou na 5 mm

b) hustota klasu - podiel počtu kláskov a dĺžky klasu u jednotlivých línií

c) počet kláskov na klas - počítanie u piatich najstarších klasov pre každú

rastlinu, namerané hodnoty boli pre jednotlivé línie spriemerované

d) počet odnoží (klasov) - stanovenie počtu stebiel vo výške 20-30 cm

nad zemou

e) priemerná hmotnosť zrna - váženie 100 vylúpaných zŕn zbavených pliev

z každej línie s presnosťou na mg, bol stanovený podiel hmotnosti zŕn

k ich počtu, čiže priemerná hmotnosť jedného zrna z konkrétnej línie

Morfologické znaky

Z morfologických znakov bola podrobená fenotypizácii výška rastliny, rozkladitosť

trsu a chlpatosť listov. Analýza pre jednotlivé hodnotené znaky je detailnejšie popísaná nižšie.

Výška rastliny - meranie v dobe mliečnej zrelosti od povrchu zeme po posledný kvietok

najvyššieho klasu s presnosťou do 5 mm

Rozkladitosť trsu (tvar rastliny) - vizuálne hodnotenie trsov listov rastlín ešte

pred vyrastením stebiel s klasmi - hodnotenie podľa päťstupňovej škály (Obrázok č.10):

1) kompaktný trs len so vzpriamenými listami a steblami (Obrázok č.10 A)

2) trs kompaktný len pri bázy rastliny, so zvyšujúcou sa vzdialenosťou od bázy

rastliny kompaktnosť trsu klesá (tvar písmena V, Obrázok č.10 B)

3) málo kompaktný trs s viditeľným rozložením listov a stebiel rôzne v priestore

(Obrázok č.10 C)

4) trs s väčšinou vodorovne ležiacich listov (Obrázok č.10 D)

5) plochý trs len s listami ležiacimi na zemi (Obrázok č.10 E)

42

Obrázok č. 10: Porovnanie piatich typov rozkladitosti trsu vyskytujúcich sa u rastlín T. monococcum L. A) Kompaktný trs len so vzpriamenými listami a steblami, charakteristický pre T. monococcum L. subsp. monococcum cv. DV92 B) Trs kompaktný len pri bázy rastliny, so zvyšujúcom sa vzdialenosťou od bázy rastliny kompaktnosť trsu klesá (tvar písmena V) C) Málo kompaktný trs s viditeľným rozložením listov a stebiel rôzne v priestore D) Trs s väčšinou ležiacich listov E) Plochý trs len s listami ležiacimi na zemi, typický pre T. monococcum L. subsp. aegilopoides cv. G3116

Analýza ochlpenia listov pšenice

Z každej rastlinnej línie boli náhodne vzaté 3 posledné listy (flag leaves). Na každom

liste z adaxiálnej strany boli počítané chlpy na 3 plochách, každá o rozlohe 8 mm x šírka listu.

Oblasti na počítanie chlpov pozdĺž listu boli síce umiesťované náhodne, ale vždy

do vzdialenosti 1/3 až 1/2 listu od jeho bázy. V týchto miestach sa šírka listu ešte nezačínala

výrazne zužovať a dosahovala približne rovnakú veľkosť. Týmto systémom fenotypovania

A)

D) E)

C) B)

43

sa zaručilo získanie dát z približne rovnakých plôch pre konkrétny list. Počet chlpov

na jednotku plochy sa stanovoval pod lupou (Carl Zeiss, Jena) manuálnym počítaním.

Aby sa predošlo skresleniu výsledkov do počítania neboli zahrnuté trichómy vyskytujúce

sa na čepeli listu, pretože sú náchylnešie k vylomeniu, v porovnaní s chlpmi vyskytujúcimi

sa na ploche listu. Taktiež neboli započítané drobné chĺpky tvoriace súvislý porast,

vyskytujúci sa rovnako u oboch rodičov. Príklad rôznorodosti ochlpenia listov je ukázaný

na Obrázku č.11.

Obrázok č.11: Porovnanie chlpatosti listov u vybraných línií T. monococcum L. Listy sú fotené pri zväčšení 1x (stereomikroskop SZX16, Olympus, USA). A) Na výseku z listu RIL č. 113 sú viditeľné krátke husté chlpy. B) Husté ochlpenie s dlhými chlpmi sa vyskytuje napríklad u línie č. 180. C) Obrázok znázorňujúci dlhé chlpy s nízkou hustotou u rodičovskej rastliny T. monococcum L. subsp. aegilopoides cv. G3116. D) Pre T. monococcum L. subsp. monococcum cv. DV92 je charakterirtická bezchlpovosť.

A)

D) C)

B)

44

4.4.8 Analýza QTLs

Údaje o fenotype rastlín T. monococcum L. boli zozbierané a prevedené do tabuliek

v programe Microsoft Office Excel 2007, kde boli v prípade potreby počítané jednoduché

matematické operácie, v závislosti od typu zozbieraných údajov. Následne boli dáta

podrobené analýze, ktorú previedol Ing. Tibor Sedláčkek pomocou programu R/Qtl (Broman

et al., 2003). Na detekciu lokusov s kvantitatívnymi znakmi bolo použité jednoduché

mapovanie pomocou intervalu.

4.4.9 Použité programy

Namerané a experimentálne získamé údaje na vytvorenie genetickej väzbovej mapy

a prevedenie QTL analýzy boli spracované s použitím nasledujúcich počítačových

programov:

- tvorba genetickej väzbovej mapy - JoinMap 4 (Van Ooijen, 2006)

- spracovanie fenotypických údajov, jednoduché štatistické metódy - Microsoft

Office Excel 2007

- detekcia výskytu lokusov s kvantitatívnymi znakmi - R/Qtl (Broman et al.,

2003)

45

5. VÝSLEDKY

S náväznosťou na diplomovú prácu Mgr. Klocovej (2010) boli pridané výsledky

fenotypovania ďalšej sezóny, aby verifikovali identifikované lokusy ovplyvňujúce sledované

kvantitatívne znaky na mapovacej populácii z kríženia kultivovanej formy T. monococcum L.

subsp. monococcum cv. DV92 s divokou formou T. monococcum L. subsp. aegilopoides cv.

G3116. Taktiež bola na tejto populácii optimalizovaná metodika hodnotenia chlpatosti na

„flag“ listoch a rozšírené spektrum sledovaných znakov o počet odnoží na rastlinu a hustotu

klasu.

5.1 Analýza QTL

Boli hodnotené 3 agronomicky (obsah proteínov v zrne, rozpadavosť klasu, výška

rastliny), 2 morfologicky (chlpatosť listov, rozkladitosť trsu) významné znaky a 5 prvkov

výnosu (dĺžka a hustota klasov, počet kláskov na klas, počet odnoží, priemerná hmotnosť

zrna). Zozbierané dáta boli pre každý kvantitatívny znak samostatne spracované programom

R/Qtl (Broman et al., 2003). Výstupom z programu bol graf, určujúci hodnotu LOD skóra

pre jednotlivé píky a ich umiestnenie na chromozómoch s tabuľkou troch markrov

s najsilnejšou asociáciou k danému znaku. Následne boli na chromozómoch porovnané

polohy píkov, so štatisticky významným LOD skóre, zo zberu dát medzi rokmi 2009

(Klocová, 2010) a 2010 pre jednotlivé QT lokusy. Celkovo bolo na 7 chromozómoch

A genómu zamapovaných 15 QT lokusov, najviac na chromozóme 2Am (4 QTLs).

Umiestnenie jednotlivých mapovaných lokusov pre hodnotené kvantitatívne znaky

je zakreslené v Obrázku č.21. Jedine fenotypovanie rozkladitosi trsu v oboch rokoch

neprinieslo údaje umožňujúce zamapovanie tohto znaku do genómu T. monococcum L.

Lokus ovplyvňujúci obsah proteínov v zrne (QGpc) bol na základe analýzy

zo zozbieraných dát v roku 2010 (DArT markry 348882 a 469420) detekovaný približne

v druhej tretine chromozómu 5Am, v oblasti 66,7 - 68,7 cM (markry 348882 a 469420,

Obrázok č.21). I keď v grafe z roku 2009 neboli dáta pre pík v tejto polohe na chromozóme

5Am signifikantné, v roku 2010 už boli štatisticky významné, len s 5% pravdepodobnosťou

výskytu falošných pozitív (Obrázok č.12 B).

Rozpadavosť klasu (QSh), ako ďalší z agronomicky významných znakov,

bola zamapovaná na chromozóm 3Am a 7Am v oblastiach 38-45,1 cM (DArT markry 861753,

470263) a 84,7 cM (DArT marker 469732, Obrázok č.21) len s 5 % pravdepodobnosťou

výskytu falošných pozitív pre oba chromozómy (Obrázok č.13 B). Na základe údajov z roku

46

2009 píky v uvedených oblastiach na chromozóme 3Am a 7Am neprekročili hodnotu LOD

tresholdu (Obrázok č.13 A).

Lokus vplývajúci na výšku rastliny (QHt) bol na základe signifikantných výsledkov

z roku 2010 zamapovaný na chromozóm 2Am v oblasti 52,3-56,0 cM (DArT markry 376273-

861777, Obrázok č.21) a 3Am v oblasti okolo 43,8 cM (DArT marker 377119, Obrázok č.21).

Dáta získané v roku 2009 neurčili lokalizáciu QHt so štatistickou významnosťou v rovnakej

časti chromozómu 2Am ani 3Am (Obrázok č.14, Obrázok č.21).

QTL pre dĺžku klasu (QEl) bol tiež zamapovaný na dva chromozómy, 2Am (52,3-56,0

cM, DArT markry 376273-861777, Obrázok č.21) a 4Am (38,4-38,9 cM, DArT markry

345359-861787, Obrázok č.21). V grafe pre rok 2010 dáta preukázali štatistickú významnosť

prekročením LOD tresholdu (Obrázok č.15 B), čím bol potvrdený výskyt QTL pre dĺžku

klasu na oboch chromozómoch. V grafe pre rok 2009 sa síce sledované píky vyskytovali len v

podobnej oblasti chromozómu 4Am, ale dáta neboli signifikantné (Obrázok č.15 A).

Na základe hodnotenia fenotypu z roku 2010 bol zamapovaný výskyt lokusu

určujúceho počet kláskov na klas (QSpn) na chromozóm 1Am v oblasti 115,6 cM

(SSR marker Mwg503_180bp, Obrázok č.21). Sledovaný píky v grafe z roku 2009

na chromozóme 1Am vykazoval rozdielnu polohu oproti grafu z roku 2010 (Obrázok č.16

A, B).

Ďalší kvantitatívny znak, ovplyvňujúci výnos, bol zamapovaný na dvoch

chromozómoch - 2Am a 5Am. Lokus pre priemernú hmotnosť zrna (QTgw) bol na základe

signifikantných dát z oboch rokov (Obrázok č.17 A, B) pre oblasť okolo 34 cM (DArT

marker 470029, Obrázok č.21) zamapovaný na chromozóm 2Am. Zozbierané fenotypové

údaje naznačili v grafe pre rok 2009 výskyt píku na chromozóme 5Am (Obrázok č.17 A),

ale zamapovanie QTL pre priemernú hmotnosť zrna bolo potvrdené až na základe štatisticky

významných dát z roku 2010 (Obrázok č.17 B , 114,4-114,5 cM, DArT markry 469467,

470190, Obrázok č.21) .

Počet odnoží u rastlín (QTn), ako jeden z významných znakov pre výnos v sledovanej

mapovacej populácii, odpovedá počtu klasov na rastlinu. Odnože, ktoré by neprodukovali

klas, neboli u pšenice jednozrnovej pozorované. Tento znak bol zatiaľ hodnotený len v roku

2010. U zozbieraných dát hodnota LOD skóre prekročila hodnotu LOD tresholdu na troch

chromozómoch (Obrázok č.18 A). Lokus ovplyvňujúci počet odnoží bol tak mapovaný

na chromozómy 1Am (30,5-30,7 cM, DArT markry 348257, 372403, 372720, 377654,

Obrázok č.21), 4Am (začiatok chromozómu až 8,4 cM, DArT markry 120684, 470366,

Obrázok č.21) a 6Am (73,8 cM, DArT marker 862073, Obrázok č.21).

47

Podobne aj hustota klasu (QSd), bola hodnotená len pre rok 2010. Dáta boli štatisticky

významné len pre chromozóm 2Am, s pravdepodobnsťou výskytu chyby do 5 % (Obrázok

č.18 B). Lokus pre hustotu klasu bol tak zamapovaný na chromozóme 2Am v oblasti približne

40,1 - 43,7 cM (DArT markry 119873, 469293, Obrázok č.21).

Posledným detekovaným lokusom s kvantitatívnym znakom je lokus ovplyvňujúci

chlpatosť listov (QHl). Vzhľadom z vytvoreniu novej metodiky fenotypovania je výsledok

popísaný detailnejšie. V roku 2009 bol tento fenotyp hodnotený len na základe vizuálneho

pozorovania a zaznamenávaná ako kvalitatívny znak = prítomnosť či neprítomnosť chlpov.

Fenotypizácia v roku 2010 bola presnejšia a pozostávala z počítania jednotlivých chlpov

v určených oblastiach listu. V grafe hodnotiacom zozbierané údaje z roku 2009 (Obrázok č.19

A) prekročilo LOD skóre LOD treshold len u dvoch chromozómov, 3A a 6A,

s pravdepodobnosťou výskytu falošných pozitív v dátach do 63%. Na základe fenotypizácie

z roku 2010 (Obrázok č.19, B) boli stanovené síce 4 píky prekračujúce LOD treshold,

ale len poloha píku na chromozóme 3A sa zhodovala s umiestnením píku v grafe z roku 2009.

Navyše údaje, umožňujúce vytvorenie tohto píku, sa preukázali ako štatisticky veľmi

významné, s pravdepodobnosťou výskytu chyby maximálne 5%. Tým bol stanovený výskyt

lokusu ovplyvňujúceho chlpatosť listov na chromozóme 3Am v oblasti 53,3 cM (DArT

markry 119686, 860851, Obrázok č.21).

48

Obrázok č.12: Grafy (A, B) popisujúce hodnoty LOD skóra pre obsah proteínov v zrne prislúchajúce jednotlivým genetickým markrom na chromozómoch Modré šípky poukazujú v oboch grafoch na píky s rovnakou polohou na chromozóme 5Am. V grafe pre rok 2010 dáta preukázali štatistickú významnosť prekročením LOD tresholdu, čo naznačuje výskyt QTL pre obsah proteínov v zrne na chromozóme 5Am. A) Údaje z roku 2009 pre kvantitatívny znak - obsah proteínov v zrne.

B) Údaje z roku 2010 pre kvantitatívny znak - obsah proteínov v zrne.

49

Obrázok č.13: Grafy (A, B) popisujúce hodnoty LOD skóra pre rozpadavosť klasu prislúchajúce jednotlivým genetickým markrom na chromozómoch Modré šípky poukazujú v oboch grafoch na píky s rovnakou polohou na chromozóme 3Am. V grafe pre rok 2010 dáta preukázali štatistickú významnosť prekročením LOD tresholdu, čo naznačuje výskyt QTL pre rozpadavosť klasu na chromozóme 3Am. Červené šípky ukazujú na píky, ktoré vďaka zhodnej lokalizácii na chromozóme 7Am a aj prekročením LOD tresholdu v grafe pre rok 2010, čo naznačuje umiestnenie ďalšieho QT lokusu pre rozpadavosť klasu. A) Údaje z roku 2009 pre kvantitatívny znak - rozpadavosť klasu.

B) Údaje z roku 2010 pre kvantitatívny znak - rozpadavosť klasu.

50

Obrázok č.14: Grafy (A, B) popisujúce hodnoty LOD skóra pre výšku rastliny prislúchajúce jednotlivým genetickým markrom na chromozómoch Modré šípky poukazujú v oboch grafoch na píky s rovnakou polohou na chromozóme 2Am. Štatistická významnosť však bola preukázaná len u dát získaných v roku 2010 prekročením LOD tresholdu, čo naznačuje výskyt QTL pre výšku rastliny na chromozóme 2Am. Červená šípka v grafe pre rok 2010 ukazuje na pík, ktorý prekročením 0,05 LOD tresholdu stanovili s vysokou štatistickou významnosťou umiestnenie ďalšieho QT lokusu pre výšku rastliny na chromozóme 3Am. V grafe pre rok 2009 na chromozóme 3Am sa síce vyskytoval pík potvdzujúci signifikantnisť dát (červená šípka), ale jeho lokalizácia nebola zhodná s polohou lokusu v grafe pre rok 2010. A) Údaje z roku 2009 pre kvantitatívny znak - výška rastliny.

B) Údaje z roku 2010 pre kvantitatívny znak - výška rastliny.

51

Obrázok č.15: Grafy (A, B) popisujúce hodnoty LOD skóra pre dĺžku klasu prislúchajúce jednotlivým genetickým markrom na chromozómoch Modré šípky poukazujú v oboch grafoch na píky s rovnakou polohou na chromozóme 2Am. V grafe pre rok 2010 dáta preukázali štatistickú významnosť prekročením LOD tresholdu, čo naznačuje výskyt QTL pre dĺžku klasu na chromozóme 2Am. Červené šípky ukazujú na píky, ktoré vďaka zhodnej lokalizácii na chromozóme 3 a 4 a prekročením LOD tresholdu v grafe pre rok 2010, naznačujú prítomnosť ďalších QT lokusov ovplyvňujúcich dĺžku klasu. A) Údaje z roku 2009 pre kvantitatívny znak - dĺžka klasu.

B) Údaje z roku 2010 pre kvantitatívny znak - dĺžka klasu.

52

Obrázok č.16: Grafy (A, B) popisujúce hodnoty LOD skóra pre počet kláskov na klase prislúchajúce jednotlivým genetickým markrom na chromozómoch Modré šípky poukazujú v oboch grafoch na píky s približne rovnakou polohou na chromozóme 1Am. Štatistická významnosť bola preukázaná u dát získaných z roku 2010 prekročením LOD tresholdu, čo naznačuje výskyt QTL pre počet kláskov na klas na chromozóme 1Am. A) Údaje z roku 2009 pre kvantitatívny znak - počet kláskov na klas.

B) Údaje z roku 2010 pre kvantitatívny znak - počet kláskov na klas.

53

Obrázok č.17: Grafy (A, B) popisujúce hodnoty LOD skóra pre priemernú hmotnosť zrna prislúchajúce jednotlivým genetickým markrom na chromozómoch Modré šípky poukazujú v oboch grafoch na píky s rovnakou polohou na chromozóme 2Am. V grafoch pre oba roky dáta preukázali štatistickú významnosť prekročením LOD tresholdu, čím bol potvrdený výskyt QTL pre priemernú hmotnosť zrna na chromozóme 2. Červené šípky ukazujú na píky, ktoré vďaka zhodnej lokalizácii na chromozóme 5Am a aj prekročením LOD tresholdu v grafe pre rok 2010, stanovili umiestnenie ďalšieho možného QT lokusu ovplyvňujúceho priemernú hmotnosť zrna. A) Údaje z roku 2009 pre kvantitatívny znak - priemerná hmotnosť zrna

B) Údaje z roku 2010 pre kvantitatívny znak - priemerná hmotnosť zrna

54

Obrázok č.18: Grafy (A, B) popisujúce hodnoty LOD skóra pre počet odnoží a hustotu klasu prislúchajúce jednotlivým genetickým markrom na chromozómoch Modré šípky ukazujú v oboch grafoch na píky, na základe ktorých, vďaka signifikantným dátam, bola stanovená poloha QT lokusov na chromozómoch 1Am, 4Am, 6Am pre počet odnoží a na chromozóme 2Am lokus ovplyvňujúci hustotu klasu. A) Údaje z roku 2010 pre kvantitatívny znak - počet odnoží

B) Údaje z roku 2010 pre kvantitatívny znak - hustota klasu

55

Obrázok č.19: Grafy (A, B) popisujúce hodnoty LOD skóra pre chlpatosť listov prislúchajúce jednotlivým genetickým markrom na chromozómoch Modré šípky poukazujú v oboch grafoch na píky s približne rovnakou polohou na chromozóme 3Am. Štatistická významnosť bola preukázaná u dát získaných z oboch rokov prekročením LOD tresholdu, čím bol potvrdený výskyt QTL pre chlpatosť listov na chromozóme 3Am. A) Údaje z roku 2009 pre kvantitatívny znak - chlpatosť listov.

B) Údaje z roku 2010 pre kvantitatívny znak - chlpatosť listov.

56

5.2 Molekulárne markry pre zahustenie T. monococcum L. mapy

Na zahustenie genetickej mapy T. monococcum L. bolo použitých 28 STS markrov

z toho 8 úspešne (Tabuľka č.5). Tieto zamapované markry vykazovali na 4% prípadne 6%

polyakrylamidovom géli od jedného do päť polymorfných fragmentov (Obrázok č.20).

Všetky detekované polymorfizmy boli dominantné. Zvyšných 10 markrov nebolo

zamapovaných dôsledkom monomorzifmu alebo nejednoznačného polymorfizmu

(výskyt artefaktov) medzi rodičovskými líniami.

Obrázok č.20: Príklad multilokusového polymorfizmu STS markra Mwg 584 na 6% polyakrylamidovom géli M - veľkostný marker Gene RulerTM100bp, Plus DNA Ladder (Fermentas, Kanada), A - rodič Dv92, B - rodič G3116, H - heterozygot (vznik zmiešaním DNA z oboch rodičov), K - negatívna kontrola. Na pravej strane je šípkami označených 5 polymorfných dominantných fragmentov a ich veľkosť (bp). Šípky naľavo zvýrazňujú veľkostné fragmenty použitého markra.

90 bp

110 bp

140 bp

270 bp

380 bp

500 bp 400 bp

300 bp

200 bp

100 bp

M A B H K

57

5.3 Genetická väzbová mapa

Na vytvorenie genetickej mapy T. monococcum L. bolo k výsledkom z diplomovej

práce Mgr. Klocovej (2010) a bakalárskej práce Bc. Vanžurovej (2011) doplnených ďalších

8 SSR markrov (Tabuľka č.6), po jednom na chromozómy 2Am a 3Am, dva na chromozóm

5Am a štyri na chromozóm 7Am. Multilokusový marker Rpg F1R5 mapoval na dvoch

chromozómoch 5Am a 7Am, zvyšné markry boli zamapované vždy len na jednom

chromozóme. Na usporiadanie markrov na chromozómy bol použitý program JoinMap 4

(Van Ooijen, 2006) s použitím vyššej presnosti na zamapovanie markrov oproti mape z roku

2010 (Klocová, 2010).

Celková dĺžka mapy T. monococcum L. na siedmych chromozómoch dosiahla hodnotu

841,7 cM (Tabuľka č.5). Celkovo bolo zamapovaných 648 markrov z toho 537 DArT,

56 STS, 16 SSR, 28 IRAP, 7 markrov odvodených z BAC koncových sekvencií a 4 gény

zo pšenice (Br-A1, Vrn 1,2,3). Priemerná vzdialenosť medzi susednými markrami bola

1,3 cM (Tabuľka č.5). Najkratší chromozóm 4Am bol z tohto priemerovania vyradený,

z dôvodu prítomnosti medzery (Obrázok č.21). U ostatných 6 chromozómov boli určené

väzbové skupiny bez medzier, no orientácia chromozómov a poloha centroméry nebola zatiaľ

stanovená. Najdlhším chromozómom s najväčším počtom zamapovaných markrov (152)

bol chromozóm 7Am (Tabuľka č.5, Obrázok č.21).

Tabuľka č.5: Dĺžka chromozómov [cM], počet zamapovaných molekulárnych markrov a ich priemerná vzdialenosť na gentickej väzbovej mape T. monococcum L. (pridané výsledky z diplomovej práce Klocovej, 2010)

Dĺžka [cM] Počet zamapovaných

markrov

Priemerná vzdialenosť medzi susednými markrami [cM]

Chromozóm T. monococcum

Dosiahnuté výsledky

Klocová (2010)

Dosiahnuté výsledky

Klocová (2010)

Dosiahnuté výsledky

Klocová (2010)

1Am 117,7 121,526 90 102 1,3 1,2 2Am 130,3 157,085 79 93 1,7 1,7 3Am 123,6 114,73 99 111 1,3 1,0 4Am 65,9 83,46 56 49 - 1,7 5Am 158 117,685 98 89 1,6 1,3 6Am 80,5 124,945 74 69 1,1 1,8 7Am 165,7 108,607 152 115 1,1 0,9

Spolu 841,7 828,038 648 628 1,3 1,3

58

Tabuľka č.5: Markry, sekvencie primerov s podmienkami a časom nasadania, prípadná lokalizácia na chromozómoch T. monococcum L. Zamapované markry majú v názve určenú aj veľkosť polymorfného fragmentu v bp (názov markru_dĺžka polymorfného fragmentu), ostatné markry neboli zamapované na T. monococcum L. v dôsledku vyskytujúceho sa monomorfizmu alebo nejednoznačného polymorfizmu. Sekvencie primerov sú získané z Grain.Genes 2.0 (http://wheat.pw.usda.gov/GGG2).

Marker Sekvencia primeru

Forward (F), Reverse (R)

Teplota a čas nasadania primerov

Chromozóm

Ksu G34_350 F: GTC TCA GGA AGG TGA TGA TC R: GAG CAG TAG GGT AAA GTA AG

45°C - 1,5 min 2Am

Rpg F1R3_170 F: GGC CAA AGA GGA GAA GAA GG R: GTC TAG AGA AAC CAA AAC CTC CAA

55°C - 30s 3Am

Ksu E18_230 F: TGA GCC GGT TGC TGT TCG TC R: AAG CAC CGA CAT GGT CAC CC

50°C - 30s

Rpg F1R5_370 F: GGC CAA AGA GGA GAA GAA GG R: GGC TTC CTC GTT GCA TGT AT

55°C - 30s 5Am

Mwg 584_140 F: GTA TTC TTG GAG GAG AGC GG R: CGA GGT TTA CCC TGG AGA CG

50°C - 30s

Rpg F1R5_550 F: GGC CAA AGA GGA GAA GAA GG R: GGC TTC CTC GTT GCA TGT AT

55°C - 30s

Rpg F5R5_260 F: GGG AGT GTT GGA CAA TGG AG R: GGC TTC CTC GTT GCA TGT AT

55°C - 30s

Rpg F4R5_1100 F: TGC CAC CAG AAT ACA TCA GTA AA R: GGC TTC CTC GTT GCA TGT AT

55°C - 30s

7Am

Abc 156 F: TTA CGG GAT CAA AGC TGA GGC R: GAC AAG CAA CAC CAA CCA AGC

50°C - 30s

Abc 261 F: AGG AAG CTC AAG AAG GTG AA R: AAA GTC AAG AGT TGC ATC AA

45°C - 1,5 min

Abg 387.2 F: GCA CTG GCA TAG TCT CAC AA R: CGA TGC TGG TTC GGT CAT AC

50°C - 30s

Bcd 98.1 F: CCGTTTGGACAAAGCAACTT R: CTTGCTTCTTAGGCCTGGTG

50°C - 30s

Bcd 98.2 F: TCACCAAGACTTTCGCACAG R: GGCTTGCACAAAAACTGC

50°C - 30s

Ksu D23 F: AGG CAG TGA AGA AGA AGA ACC R: TTG AAA TCG ACA GGA TTA GGA

50°C - 30s

Ksu E18 F: TGA GCC GGT TGC TGT TCG TC R: AAG CAC CGA CAT GGT CAC CC

50°C - 30s

Ksu G34 F: GTC TCA GGA AGG TGA TGA TC R: GAG CAG TAG GGT AAA GTA AG

45°C - 1,5 min

Mwg 584 F: GTA TTC TTG GAG GAG AGC GG R: CGA GGT TTA CCC TGG AGA CG

50°C - 30s

Rpg F1R3 F: GGC CAA AGA GGA GAA GAA GG R: GTC TAG AGA AAC CAA AAC CTC CAA

55°C - 30s

Rpg F1R4 F: GGC CAA AGA GGA GAA GAA GG R: TGC AAG ATT ATG ACA CCC AGA

55°C - 30s mon

omor

fné

aleb

o ne

repr

oduk

ovat

eľné

T. monoco

ccum L

.

59

Chromozóm 1Am

Chromozóm 4Am - 1. časť

Obrázok č.21: Genetická väzbová mapa T.

monococcum L. Mapa T. monococcum L. je tvorená 7 chromozómami, s celkovou dĺžkou 841,7 cM, so 648 zamapovanými markrami a 15 QTLs. Vzdialenosti medzi markrami (cM) sú zobrazené na ľavej strane a ich názvy na pravej strane každého chromozómu. Začiatok názvu markrov súvisí s ich pôvodom. IRAP markry sú označené IRAP (identifikačné číslo)_dĺžka polymorfného fragmentu, DArT markry značené šesťmiestnym identifikačným číslom a zvyšné zamapované lokusy sú SSR, STS a génové markry s veľkosťou polymorfného fragmentu. Na mape je po pravej strane chromozómov vyznačený rozsah 15 lokusov s nasledujúcimi kvantitatívnymi znakmi: počet odnoží (Tn) rozpadavosť klasu (Sh) počet kláskov na klas (Spn) výška rastliny (Ht) dĺžka klasu (El) chlpatosť listov (Hl) hustota klasu (Sd) priemerná hmotnosť obsah proteínov (Gpc) zrna (Tgw)

Chromozóm 4Am - 2. časť

60

Obrázok č.21 (pokračovanie):

Chromozóm 2Am Chromozóm 3Am

61

Obrázok č.21 (pokračovanie):

Chromozóm 5Am Chromozóm 6Am

62

Obrázok č.21 (pokračovanie): Chromozóm 7Am

63

6. DISKUSIA

Použitím 96 F10 RIL línií mapovacej populácie z kríženia kultúrnej a divokej formy

pšenice jednozrnovej bolo v našej práci na 7 chromozómoch Am genómu zamapovaných 15

QT lokusov pre 10 fenotypovaných znakov. Mapované QT lokusy sú výsledkom

fenotypovacieho pokusu na jednej lokalite v dvoch sezónach a to 2009 (Klocová, 2010)

a 2010. Obdobne, na podobnej populácii z F10 RIL mapovacej populácie T. monococcum L

(Hori et al. 2007) bolo po dvoch sezónach 2003 a 2004 na jednej lokalite identifikovaných 24

QT lokusov ovplyvňujúcich 10 fenotypovaných znakov. V tých to dvoch prácach bolo možné

porovnať 4 znaky (priemerná hmotnosť zrna, dĺžka klasu, počet kláskov na klas a chlpatosť

listov).

Výnos ako najdôležitejší agronomický znak bol mapovaný v mnohých štúdiách však

jeho dedivosť malá a a preto sa väčšina štúdii zameriava na jednotlivé komponenty výnosu

s veľmi dobrou dedivosťou. Avšak nie všetky mapy sú konštruované použitím rovnakých

markerov, zvlášť čo sa týka použitia moderných „highthroughput“ markerov, je počet štúdií

použitím týchto markerov obmedzená. Aby bolo možné diskutovať a pôvod na základe

pozície nami mapovaných QTLs v porovnaní s ostatnými štúdiami na T. monococcum použili

sme percentá vzdialenosti lokusov od začiatku chromozómu. Pretože nie sú všetky

chromozómy v našej štúdii orientované (2Am a 6Am), ako správne sme použili iba

chromozómy u ktorý je orientácia ramien možná na základe prítomnosti iného markeru so

známou polohou. Keďže nie je neznáma orientácia chromozómu 2Am a 6Am, v zátvorke je

vždy udávaná alternatíva percentuálneho zamapovania lokusu, ku ktorej by došlo, ak by sa

chromozóm otočil o 180°. Vzhľadom k duplikáciam a translokáciam, ku ktorým došlo počas

rozrôznenia sa obilnín od ancestrálneho genómu tráv napr. chromozóm 4A (Devos et al.,

1995, Miftahudin et al., 2004) sú pozície mapovaných znakov diskutované v rámci celých

chromozómov.

Dôležitý komponent výnosu, priemerná hmotnosť zrna (QTgw), bol v tejto práci

zamapovaný v úseku 72,5 % dĺžky chromozómu 5Am a 26,3 % (73,7 %) od začiatku

chromozómu 2Am. Na základe fenotypizácie v roku 2009 bol lokus detekovaný 32,5% od

začiatku chromozómu 2Am, na chromozóme 4Am v oblasti 96,2 % a taktiež na chromozómoch

1Am a 7Am. Z dát určujúcich percentuálne zamapovanie lokusu pre oba roky na chromozóm

2Am vyplýva, že lokus bol detekovaný v približne rovakých oblastiach. Navyše bol znak pre

priemernú hmotnosť zrna asociovaný na 2Am s rovnakým markrom v oboch prácach (DArT

marker 470029, Obrázok č.21), čo je znakom relatívne veľkej spoľahlivosti mapovania tohto

64

lokusu. Hori et al. (2007) síce tiež našli lokus pre tento znak na chromozóme 2Am, ale v

oblasti približne 39-41 % chromozómu. Odchýlka v lokalizácii lokusu môže byť spôsobená

vplyvom rôznorodých prírodných podmienok, pri ktorých rastie a dozrieva mapovacia

populácia, chybou v niektorej z máp alebo na základe rôzneho pôvodu lokusu. V porovnaní

s genómom T. aestivum L., lokusy vplývajúce na priemernú hmotnosť zrna boli zamapované

v genóme A na všetkých chromozómoch okrem chromozómu 1A (2A-Huang et al., 2004,

Verma et al., 2005, 5A-Kato et al., 2000, Börner et al., 2002, Cuthbert et al., 2008, 3A-Shah

et al., 1999, Börner et al., 2002, Huang et al., 2004, 4A-Araki et al., 1999, 6A a 7A-Huang et

al., 2004).

Ďalší komponent výnosu, počet kláskov na klas (QSpn), bol na základe výsledkov

z roku 2010 zamapovaný na koniec chromozómu 1Am (98,2 % dĺžky). Z dát získaných v roku

2009 bol však lokus detekovaný len na chromozómoch 4Am (87 %) a 7Am. Istá asociácia

tohto znaku bola pozorovaná i na konci 1Am pre sezónu 2009, avšak neprekročila štatistickú

významnosť. Tento znak bol na tejto mapovacej populácii detekovaný na konci 1AmL už

predtým v práci (Bullrich et al., 2002) a je predmetom pozičného klonovania (Valaárik et al.,

2006), a okrem počtu kláskov na klas ovplyvňuje aj dobu kvitnutia. Tieto zistenia poukazujú

na vyššiu spoľahlivosť QTL analýzy zo sezóny 2010. Hori et al. (2007) mapovali tento lokus

na chromozóm 4Am v oblasti 57 % z celkovej dĺžky chromozómu a tiež na chromozóme 3Am.

Zo získaných výsledkov sa nedá usudzovať možnosť spoločného pôvodu týchto lokusov. U

hexaploidnej pšenice bol zmieňovaný lokus detekovaný na chromozóme 4AS v blízkosti

centroméry v práci Araki et al. (1999), výsledkom ostatných analýz bolo zamapovanie lokusu

na chromozómy 2B, 5A a 6A (Araki et al., 1999, Kato et al., 2000, Verma et al., 2005).

Z výsledkov analýz nemožno usúdiť jednoznačné zamapovanie QSpn. I keď v troch prácach

bol detekovaný na chromozóme 4, vždy bolo jeho zamapovanie v odlišných oblastiach

chromozómu. Preto je potrebné prevádzať ďalšie mapovania či už na T. monococcum L. alebo

hexaplidnej pšenici.

QTL pre výšku rastliny (QHt) bol na základe signifikantných výsledkov z roku 2010

zamapovaný v oblasti okolo 35,4 % chromozómu 3Am a na chromozóm 2Am v oblasti 41 %

(59 %) z celkovej dĺžky chromozómu. Lokus bol síce pre dáta z roku 2009 zamapovaný

taktiež na 3Am, ale v rozdielnej oblasti chromozómu (63,5 %). Posun umiestenia QHt mohlo

byť spôsobené ovplyvnením fenotypovaných dát vonkajšími podmienkami počas rastu rastlín

alebo ľudskou chybou pri fenotypovaní. U hexaploidnej pšenice popísali výskyt lokusu na

konci dlhého ramena chromozómu 3A Shah et al. (1999), naopak Huang et al. (2004) na

začiatku krátkeho ramena chromozómu 3A. Čo sa týka percentuálnej dĺžky chromozómu,

65

zamapovanie QHt by sa mohlo približne rovnať, rozdiel je len v umiestnení centroméry, čiže

vo vyznačení krátkeho a dlhého ramena. Jedným z vysvetlení by mohlo byť nesprávne

odlíšenie dlhého a krátkeho ramena alebo taktiež prítomnosť dvoch rozdielnych

zamapovaných lokusov pre jeden znak na jednom chromozóme. Rozdielne zamapovanie QHt

bolo popísané aj v práci Wanga s kolektívom (2010) na mapovacej populácii T. aestivum L.

Pre A genóm bol lokus detekovaný na chromozóm 2, čo sa týka chromozómu 3, lokus bol

zamapovaný len v D genóme. Börner s koletívom (2002) prevádzali mapovania celkovo počas

štyroch rokov na troch lokalitách, z toho najviac (päťkrát) bol pokus detekovaný na

chromozóme 4A, no v menšej miere aj na chromozómy 3B, 5D a 6A. Vzhľadom k tomu, že

počas evolúcie eukaryot dochádzalo k rozsiahlym duplikáciam a prestavbám medzi

chromozómami, príkladom môže byť ryžový genóm (Guyot et Keller, 2004), je možné tento

fakt predpokladať aj u pšenice. Tým by bolo možné vysvetliť zamapovanie lokusov aj na

homoeológny chromozóm 3B či na ostatné chromozómy v genóme.

Ďalším zamapovaným lokusom na chromozóme 2Am v oblasti 41 % (59 %) z jeho

dĺžky, bol lokus ovplyvňujúci dĺžku klasu (QEl). Jeho výskyt bol taktiež detekovaný v 59 %

dĺžky chromozómu 4Am. Hori et al. (2007) zamapovali lokus tiež na chromozóme 4Am

v približne zhodnej oblasti chromozómu (55 % od jeho začiatku). Vplyvom zhodného

zamapovania lokusov na rovnakom chromozóme je možné predpokladať spoločný pôvod

tohto lokusu a spoľahlivosť mapovaných dát. Avšak okrem chromozómu 4Am bol lokus

zamapovaný aj na 3Am (Hori et al., 2007). V porovnaní s našimi dátami z roku 2009 však bol

lokus QEl detekovaný len na chromozóme 7Am, čo nie je možné porovnať ani s jedným

lokusom vo vyššie spomínaných prácach. Pri mapovaní populácie T. aestivum L. bol lokus

zamapovaný tiež na chromozóme 4A v prácach do prvej tretiny chromozómu (Sourdille et al.,

2000) a približne v polovici chromozómu 4AS (Börner et al., 2002). I keď v práci Sourdille et

al. (2000) nie je zaznačené umietnenie centroméry, je možné predpokladať spoločný pôvod

týchto lokusov. Ďalšia detekcia QEl pre A genóm bola na 1A (Sourdille et al., 2000) i na

chromozóme 5A (Kato et al., 1999, Sourdille et al., 2000, Börner et al., 2002).

Podobne aj pre veličinu určujúcu hustotu klasu (Spike density, QSd), vzniknutú

vydelením počtu kláskov a dĺžkou klasu pre každú líniu, bol lokus lokalizovaný v oblasti

32 % (68 %) chromozómu 2Am. Zamapovanie tohto znaku nie je možné porovnať s dátami

z roku 2009, pretože QSd nebolo fenotypované a ani v analýzach už spomínaných autorov

nebol tento znak hodnotený. Len analýza Sourdille a kolektívu (2000) skúmala v genóme T.

aestivum L. regióny, kontrolujúce hustotu klasu, no neboli schopní určiť polohu génu,

66

zároveň kontrolujúceho počet kláskov aj dĺžku klasu. Preto je tento kvantitatívny znak

potrebné ďalej skúmať a pokúsiť sa potvrdiť alebo vyvrátiť zamapovanie QSd v tejto práci.

Výnosovo významný lokus, ovplyvňujúci obsah proteínov v zrne (QGpc),

bol zamapovaný v oblasti 42 % na chromozóm 5Am. Zamapovanie QGpc z výsledkov dát

z roku 2009 bolo na chromozómoch 7Am a tiež 5Am (35,4% chromozómu). Detekcia lokusov

z oboch rokov pre chromozóm 5Am síce nebola zhodná, ale oba lokusy boli zamapované

v druhej štvrtine chromozómu. Börner s kolektívom (2002) však toto QTL u T. aestivum L.

zamapovali len ako minoritný lokus na krátke rameno chromozómu 7A a 2D. Na spresnenie

detekcie QGpc bude potrebné previesť v nasledujúcich rokoch ďalšie mapovania.

Počet odnoží u rastlín (Tiller number, QTn), ďalší z významných komponentov

výnosu, odpovedajúci v našej práci počtu klasov na rastlinu, bol zamapovaný na tri

chromozómy - 1Am v oblasti 26 % dĺžky chromozómu, 4Am (od začiatku chromozómu

do 12,8 % chromozómu) a na konci chromozómu 6Am (91,7 %, v prípade obrátenia na

začiatku chromozómu do 8,3 %). Vzhľadom k nehodnoteniu tohto znaku v roku 2009 ani

v spomínaných prácach zameraných na mapovanie T. monococcum L., je detekcia QTn

porovnávaná len s hexaploidnou pšenicou. Araki s kolektívom (1999) na hexaploidnej pšenici

taktiež umiestnili QTn na začiatok chromozómu 4AS, no pre ich chromozóm bola stanovená

poloha centroméry a tým aj orientácia krátkeho a dlhého ramena. Ale i tak je zamapovanie

lokusov pre chromozóm 4A približne rovnaké. Kato et al. (2000) s využitím genetickej

väzbovej mapy s homozygotnými rekombinantnými líniami zamapovali lokus na chromozóm

5AL. Síce počas domestikácie obilnín došlo k translokácii medzi dlhými ramenami

chromozómov 5A a 4A (Devos et al., 1995), čo by mohlo vysvetliť zamapovanie lokusu

na 5A (Kato et al., 2000), ale Araki et al. (1999) zamapovali spomínaný lokus na krátke

rameno chromozómu 4A. Je však možné predpokladať detekciu viacerých lokusov

na rôznych častiach jedného chromozómu. U hexaploidnej pšenice však nie vždy zodpovedá

počet odnoží počtu klasov, a preto je potrebné túto veličinu porovnať i s veličinou

stanovujúcou počet klasov na m2. Huang et al. (2004) zamapovali lokusy na chromozómy 1B

a 7A. Táto detekcia sa síce nezhoduje s vyššie uvedenými výsledkami, a preto je potrebné

prevádzať ďalšie mapovania tohto lokusu u na diploidnej i tetraploidnej pšenici.

Rozpadavosť klasu (Ear shattering, QSh), jeden z hlavných domestikačných znakov,

bola zamapovaná v intervale 33 % chromozómu 3Am a v oblasti 51,5 % na 7Am. Výsledkom

fenotypizácie z roku 2009 síce bol lokus pre rozpadavosť klasu zamapovaný na 3Am, ale v 95

% dĺžky chromozómu. Taktiež druhé zamapovanie lokusu na chromozóme 1Am nepotvrdilo

zhodnosť detekcie QSh pre oba roky. Chyba mohla nastať pri fenotypizácii dát alebo silným

67

vplyvom prostredia. Ani analýzy u tetrapolidnej pšenice (Peng et al., 2003) neobjasnili túto

problematiku, pretože lokus pre rozpadavosť klasu bol mapovaný na chromozóm 2A.

U hexaploidnej pšenice zatiaľ nebol tento znak hodnotený (Araki et al., 1999, Kato et al.,

1999, Shah et al., 1999, Sourdille et al., 2000, Börner et al., 2002, Huang et al., 2004, Wanga

et al., 2010).

Lokus pre chlpatosť listov (QHl) bol na základe výsledkov z tejto práce lokalizovaný

na chromozóme 3Am v oblasti 53,3%. V porovnaní v fenotypovaním prevedeným v roku 2009

bol lokus mapovaný na chromozómoch 5Am a 3Am (37,2 %). Na chromozóme 3Am bol

zamapovaný výskyt lokusu na základe DArT markra (860735, Obrázok č.21), ktorý

sa vyskytoval vo vzdialenosti 1,2 cM od markra pre lokus z roku 2010. Tým sa potvrdila

pozícia lokusov pre chlpatosť listov u oboch rokov. Vzhľadom k použitiu detailnejšej

metodiky v roku 2010 možno predpokladať, že na základe zozbieraných dát bolo

zamapovanie QHl na chromozóme 3Am presnejšie. Ďalšie analýzy z fenotypovania

T. monococcum L. (Hori et al., 2007) i hexaploidnej pšenice (Jing et al., 2007) však

nepriniesli zhodu a skúmaný znak bol zamapovaný v oboch prípadoch na chromozóm 5A.

Štúdie Taketu s kolektívom (2002) však detailnejšie popísali hodnotenie chlpatosti listov a ich

analýza priniesla tiež odlišné výsledky. Listy s chlpmi hodnotili ako holé, husto ochlpené

a menej ochlpené, čím vytvorili tretiu kategóriu, nachádzajúcu sa „v strede“ medzi fenotypmi

oboch kontrastných rodičov. Taktiež počítali všetky chlpy vo vnútri poľa okulára na dvoch

náhodne vybratých miestach v strednej časti listu. Zistili, že bol veľký rozdiel v počte a dĺžke

chlpov u stredne a veľmi chlpatých listov. Usúdili, že genetickej analýzy chlpatosti listov je

náročná a pravdepodobne existuje variácia v hustote chlpov vo vnútri rastliny medzi rôznymi

pozíciami a rastovými stupňami listov. Na základe analýzy umiestnili lokusy ovplyvňujúce

počet chlpov na listoch u hexaploida na chromozómy 4B a 7B. Nami prevedené

fenotypovanie nezahŕňalo hodnotenie hustoty chlpov. Samozrejme, taktiež hustota ochlpenia

listov vykazovala variabilitu, ale nebolo možné jednoznačne určiť hranicu medzi druhou

a treťou kategóriou hodnotenou v Taketu s koletívom (2002). Takto získané dáta môžu byť

nepresné a zavádzajúce. Taktiež naša analýza zahŕňala počítanie až troch oblastí pre tri listy

z každej rastliny, čím sa predpokladá vyššia štatistická významnosť s minimalizovanín

ľudskej chyby pri počítaní. V porovnaní s ostatnými analýzami bolo práve fenotypovanie

Taketu et al. (2002) najpresnejšie a je možné, vzhľadom na chromozómové rekonštrukcie,

ktoré v genóme pšenice prebiehali počas evolúcie a domestikácie predpokladať, že lokus

pre chlpatosť listov sa bude vyskytovať okrem genómu A aj na genómoch B a D.

68

Porovnaním fenotypovaných dát v sezóne 2009 a 2010 bola potvrdená pozícia dvoch

lokusov, pre priemernú hmotnosť zrna (2Am) a chlpatosť listov (3Am). U zvyšných

porovnávaných znakov mohla byť rozdielna pozícia lokusov na chromozómoch spôsobená

vplyvom vonkajších podmienok či ľudskou chybou pri fenotypizácii. Na potvrdenie polohy

lokusov budú potrebné ďalšie fenotypizácie v nasledujúcich sezónach.

Jednotlivé QT lokusy boli v tejto práci zamapované do mapy T. monococcum L., ktorá

vznikla z pôvodnej mapy T. monococcum L. od Klocovej (2010) po doplnení ďalších

markrov. Celková dĺžka novej mapy dosiahla hodnotu 841,7 cM. s 648 zamapovanými

markrami. V porovnaní s mapou z práce Klocovej (2010), bolo síce celkovo zamapovaných

o 20 markrov viac, ale do mapy bolo vnesených nových 40 IRAP (Vanžurová, 2011) a 8 SSR

markrov. Vplyvom nastavenia prísnejších podmienok na tvorbu mapy (JoinMap 4, Van

Ooijen, 2006), došlo k vyradeniu nespoľahlivých markrov, čím sa skrátila dĺžka mapy takmer

o 20 cM (Tabuľka č.5) a taktiež sa niektoré lokusy preusporiadali, čím možno túto novú mapu

považovať za presnejšiu. Ukázalo sa, že IRAP markry nie sú najvhodnejšie pre mapovanie

genómu, vzhľadom k nízkemu stupňu polymorfizmu, problémami s reprodukovateľnosťou

a pracnou analýzou. Hori et al. (2007) zamapovali na mapovacej populácii T. monococcum L.

341 markrov, čo je asi o polovicu menej ako v našej mape. Išlo manoritne o markry založené

na PCR odvodené z jačmenných ESTov, ale aj o RFLP či morfologické markry. Dĺžka mapy

bola 1 038,1 cM, čo je v porovnaní s našou mapou o takmer 200 cM viac. Tatiež mapa T.

monococcum L., vytvorená Singhom s kolektívom (2007) bola oveľa dlhšia od našej mapy

(1262 cM) a len so 171 zamapovanými markrami. Variácia v dĺžke mapy môže byť

spôsobená typom mapovacej populácie, i rozdielom v rekombinačnej frekvencii, ku ktorej

dochádza počas jednotlivých crossing-overov (Hori et al., 2007). Je možné však

predpokladať, že vzhľadom k vyššiemu počtu zamapovaných markrov a kratšej vzdialenosti

je naša mapa napresnejšia z vyššie uvedených máp. U našej mapy bola priemerná vzdialenosť

medzi susednými markrami 1,3 cM, zhodná s mapou z práce Klocovej (2010), no oveľa

väčšia bola priemerná vzdialenosť medzi susednými markrami u Horiho s kolektívom (2007),

až 3,1 cM. Z porovania vyplýva, že naša mapa bola oveľa viac zahustená markrami, a tak je

lepšie použiteľná pre ďalšie mapovania (napríklad QTLs, klonovanie génov, integrácia máp,

štúdium kolinearity medzi pšeničnými genómami).

V tejto práci je geneticky najdlhším chromozómom, so 152 zamapovanými markrami

a dĺžkou 165,7 cM chromozóm 7Am. V práci Hori s kolektívom (2007) bol geneticky najdlhší

chromozóm 5Am s veľkosťou 192,5 cM, podobne ako v práci Dubcovskeho s kolektívom

(1996) s mapovacou populáciou z rovnakého kríženia ako v našom prípade. Naopak,

69

geneticky najkratším chromozómom bol 4Am, podobne ako v práci Klocovej (2010)

i v ďalších piatich prácach porovnávaných Singhom s kolektívom (2007). Fyzicky však

chromozóm hexaploidnej pšenice 4A patrí v genóme medzi najdlhšie, vďaka dvom

postupným translokáciam. Najskôr došlo k translokácii na úrovni diploida vnesením dlhého

ramena chromozómu 5A a následne na úrovni tetraploida translokáciou 7BS (Devos et al.,

1995). Fakt, že bol na chromozóm 4Am zamapovaný malý počet markrov, by mohlo byť

spôsobené malou variabilitou v jeho sekvencii. Na druhej strane i po zamapovaní väčšieho

množstva markrov môže byť dĺžka chromozómu malá, ak dochádza k malej alebo žiadnej

rekombinácii medzi markrami. Každopádne je potrebné i nadaľej skúmať pšeničný genóm,

pretože jeho veľkosť a komplikovanosť poskytuje veľa stále nedoriešených otázok.

70

7. ZÁVER

Pšenica jednozrnová (T. monococcum L.), ako diploidný blízky príbuzný donora

A genómu pre hexaploidné pšenice, sa stala vďaka genetickej diverzite ideálnym modelom na

genetické mapovanie a klonovanie. Zostrojením genetickej mapy T. monococcum L.

a následným určením lokalizácie QTLs je možné prehĺbiť informácie o umiestnení

a príspevku každého génu ku konečnej expresii skúmaného znaku, a tak napomôcť

šľachtiteľom ku zvýšeniu výnosu a odolnosti pšenice siatej.

Diplomová práca bola zameraná na mapovanie agronomicky a morfologicky

dôležitých génov u diploidnej pšenice T. monococcum L. Na dopestovanej mapovacej

populácie generácie F10, pochádzajúcej z kríženia kultivovanej formy T. monococcum L.

subsp. monococcum cv. DV92 s divokou formou T. monococcum L. subsp. aegilopoides cv.

G3116 bola prevedená kontrolná genotypizácia s následnou fenotypizáciou desiatich

agronomicky, morfologicky a výnosovo významných znakov (obsah proteínov v zrne,

rozpadavosť klasu, výška rastliny, chlpatosť listov, rozkladitosť trsu, počet kláskov na klas,

počet odnoží, priemerná hmotnosť zrna, dĺžka a hustota klasov). Na tejto populácii bola

optimalizovaná aj metodika hodnotenia chlpatosti na „flag“ listoch. Po zozbieraní, spracovaní

a porovnaní dát s údajmi získanými v roku 2009 z práce Mgr. Klocovej (2010), bola určená

lokalizácia 15 lokusov ovplyvňujúcich kvantitaívny prejav deviatich znakov na 7

chromozómoch A genómu T. monococcum L. Lokus ovplyvňujúci rozkladitosť sa v tejto

práci nepodarilo zamapovať. Analýzou dát pre obe sezóny sa potvrdila pozícia dvoch

lokusov, a to pre priemernú hmotnosť zrna na chromozóme 2Am a chlpatosť listov pre

chromozóm 3Am. Taktiež bol rozšírený počet fenotypovaných znakov a detekovaných

lokusov pre hustotu klasu na chromozóme 2Am a počet odnoží na chromozómoch 1Am, 4Am

a 6Am.

V práci bolo tiež zamapovaných 8 nových SSR markrov a spolu s údajmi z diplomovej

práce Mgr. Klocovej (2010) a bakalárskej práce Bc. Vanžurovej (2011) bola vytvorená

genetická mapa T. monococcum L., s celkovou dĺžkou 841,7 cM a so 648 zamapovanými

DArT, STS, IRAP, markrami odvodenými z génov a SSR markrami. Pre mapovanie boli

najvhodnejšie DArT markry, vďaka detekcii veľkého množstva polymorfizmov naraz

a rovnomernému rozloženiu naprieč genómom.

71

8. LITERATÚRA

Akbari, M.; Wenzl, P.; Caig, V. et al. (2006): Diversity arrays technology (DarT) for high-

throughput profiling of hexaploid wheat genome. Theoretical and Applied Genetics 113

(8): 1409-1420.

Araki, E., Miura, H., Sawada, S. (1999): Identification of genetic loci affecting amylose

content and agronomic traits on chromosome 4A of wheat. Theoretical and Applied

Genetics 98: 977-984.

Barkworth, M. E., Bothmer, R. (2009): Scientific Names in the Triticeae. In: Feuillet, C.,

Muehlbauer, G. J. (ed.): Genetics and Genomics of the Triticeae. Springer

Science+Business Media, New York, USA.

Börner, A., Schumann, E., Fürste, A., Cöster, H., Leithold, B., Röder, M. S., Weber, W. E.

(2002): Mapping of quantitative trait loci determining agronomic important characters

in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.). Theoretical and Applied Genetics 10:

921-936.

Brandolini, A., Vaccino, P., Boggini, G., Özkan, H., Kilian, B., Salamini, F. (2006):

Quantification of genetic relationships among A genomes of wheats. Genome 49: 297-

305.

Broman, K. W., Wu, H., Sen, S., Churchill, G. A. (2003): R/Qtl: QTL mapping in

experimental crosses. Bioinformatics 19: 889-890.

Brown, D.A., Windham, M.T., Graham, E.T. (1994): The association of Discula destructiva

(Red.) hyphae with Cornus florida (L.) trichomes. Journal of Phytopathology 140:

312-318.

Brookers, A. J. (1999): The essence of SNPs. Gene 234: 177-186.

72

Bullrich, L., Appendino, M. L., Tranquilli, G., Lewis, S., Dubcovsky, J. (2002) Mapping of a

thermo-sensitive earliness per se gene on Triticum monococcum chromosome 1Am.

Theoretical and Applied Genetics 105: 585-593.

Cuthbert, J. L., Somers, D. J., Bruˆ le´-Babel, A. L., Brown, P. D., Crow, G. H. (2008):

Molecular mapping of quantitative trait loci for yield and yield components in spring

wheat (Triticum aestivum L.). Theoretical and Applied Genetics 117: 595-608.

Červenka, M., Feráková, V., Háber, M., Kresánek, J., Paclová, L., Peciar,V., Šomšák, L.

(1978): Z našej prírody. Príroda, vydavateľstvo kníh a časopisov, n. p. v Bratislave

De Pace, C., Snidaro, D., Ciaffi, M., Vittori, D., Ciofo, A., Cenci, A., Tanzarella, O. A.,

Qualset, C. O., Scarascia Mugnozza, G. T. (2001): Introgression of Dasypyrum

villosum chromatin into common wheat improves grain protein quality. Euphytica

117: 67-75.

Devos, K. M., Dubcovsky, J., Dvořák, J., Chinoy, C. N., Gale, M. D. (1995): Structural

evolution of wheat chromodomes 4A, 5A, and 7B and its impact on recombination.

Theoretical and Applied Genetics 91: 282-288.

Dobrovolskaya, O., Pshenichnikova, T. A, Arbuzova, V. S., Lohwasser, U., Röder, M. S.,

Börner, A. (2007): Molecular mapping of genes determining hairy leaf character in

common wheat with respect to other species of the Triticeae. Euphytica 155: 285-293.

Doveri, S., Lee, D., Maheswaran, M., Powell, W. (2008): Molecular Markers - History,

Features and Applications. In: Kole, Ch., et Abbott, A. G. (ed.): Principles and

Practices of Plant Genomics, Science Publishers, Enfield, NH, USA.

Dubcovsky, J., Luo, M.-Ch., Zhon, G.-Y., Bransteitter, R., Desai, A., Kilian, A., Kleinhofs,

A., Dvořák, J. (1996): Genetic Map of Diploid Wheat, Triticum mmococcum L., and

Its Comparison With Maps of Hordeum uulgare L. Genetics 143: 983-999.

Duran, Ch., Edwards, D., Batley, J. (2009): Molecular Marker Discovery and Genetic Map

Visualisation. Bioinformatics: Tools and Applications: 165-189.

73

Dvořák, J., Zhang, H. B. (1990): Variation in repeated nucleotide sequences sheds light on the

phylogeny of the wheat B and G genomes. Proc Natl Acad Sci USA 87: 9640-9644.

Dvořák, J., Di Terlizzi, P., Zhang, H.B., Resta, P. (1993): The evolution of polyploid wheats:

identification of the A genome donor species. Genome 36: 21-31.

Ehtemam, M. H., Rahiminejad, M. R., Saeidi, H., Tabatabaei, B. E. S., Krattinger, S. G.,

Keller, B. (2010): Relationships among the A Genomes of Triticum L. Species as

Evidenced by SSR Markers, in Iran. International Journal of Molecular Sciences 11:

4309-4325.

Feuillet, C., Langridge, P., Waugh, R.(2007): Cereal breeding takes a walk on the wild side.

TRENDS in Genetics 24 (1): 24-32.

Golovnina, K. A., Kondratenko, E. Ya., Blinov, A. G., Goncharov, N. P. (2009): Phylogeny

of the A Genomes of Wildand Cultivated Wheat Species. Russian Journal of Genetics

45 (11): 1360-1367.

Gupta, P. K., Varshney, R. K., Sharma, P. C., Ramesh, B. (1999): Molecular markers and

their applicatons in wheat breeding. Plant Breeding 118: 369-390.

Gut, I. G. (2001): Automation in Genotyping of Single Nucleotide Polymorphisms. Human

Mutation 17: 475-492.

Guyot, R., Keller, B. (2004): Ancestral genome duplication in rice. Genome 47: 610-614.

Heun, M., Schäfer-Pregl, R., Klawan, D., Castagna, R., Accerbi, M., Borghi, B., Salamini, F.

(1997): Site of Einkorn Wheat Domestication Identified by DNA Fingerprinting.

Science 278: 1312-1314.

Hittalmani, S., Girish, T. N., Biradar, H., Maughan, J. (2008): Mapping Populations:

Development, Descriptions and Deployment. In: Kole, Ch., et Abbott, A. G. (ed.):

Principles and Practices of Plant Genomics, Science Publishers, Enfield, NH, USA.

74

Hopf, M., Zohary, D. (2000): Domestication of plants in the old world – The origin and

spread of cultivated plants in West Asia, Europe, and Nile Valley (3rd ed.). Oxford

University Press, Oxford, England.

Hori, K., Takehara, S., Nankaku, N., Sato, K., Sasakuma, T., Takeda, K. (2007): Barley EST

Markers Enhance Map Saturation and QTL Mapping in Diploid Wheat. Breeding

Science 57: 39-45.

Huang, X. Q., Kempf, H., Ganal, M. W., Röder, M. S. (2004): Advanced backcross QTL

analysis in progenies derived from a cross between a German elite winter wheat

variety and a synthetic wheat (Triticum aestivumL.). Theoretical and Applied Genetics

109: 933-943.

International Human Genome Sequencing Consortium (2004): Finishing the euchromatic

sequence of the human genome. Nature 431 (7011): 931-945.

Jaccoud, D., Peng, K., Feinstein, D., Kilian, A. (2001): Diversity Arrays: a solid state

technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acid Research

29 (4): 1-7.

Jing, H.-Ch., Kornyukhin, D., Kanyuka, K., Orford, S., Zlatska, A., Mitrofanova, O. P.,

Koebner, R., Hammond-Kosack, K. (2007): Identification o variation in adaptively

important traits and genome-wide analysis of treit-marker associations in Triticum

monococcum. Journal of Experimental Botany 58 (13): 3749-3764.

Jing, H.-Ch., Bayon, C., Kanyuka, K., Berry, S., Wenzl, P., Huttner, E., Kilian, A.,

Hammond-Kosack, K. (2009): DArT markers: diversity analyses, genomes

comparison, mapping and integration with SSR markers in Triticum monococcum.

BioMed Central Genomics 10 (458): 1-17.

Johnson, B. L., and Dhaliwal, H. S. (1976): Reproductive isolation of Triticum boeoticum and

Triticum urartu and the origin of the tetraploid wheats. American Journal of Botany 63

(8): 1088-1094.

75

Kalendar, R., Grob, T., Regina, M., Suoniemi, A., Schulman, A. (1999): IRAP and REMAP:

two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques. Theoretical and

Applied Genetics 98:704-711.

Karagöz, A., Arcak, Ç., Güçdemir, Đ. H. (2009): Relationship Between in situ Conserved

Wild Wheat Species, Associated Plants and Soil Characteristics. Tarim Bilimleri

Dergisi 15 (2): 134-141.

Kato, K., Miura, H., Sawada, S. (1999): QTL mapping of genes controlling ear emergence

time and plant height on chromosome 5A of wheat Theoretical and Applied Genetics

98: 472-477.

Kato, K., Miura, H., Sawada, S. (2000): Mapping QTLs controlling grain yield and its

components on chromosome 5A of wheat. Theoretical and Applied Genetics 101:

1114-1121.

Keller, B., Feuillet, C. (2000): Colinearity and gene density in grass genomes. Trends Plant

Science 5 (6): 246-251.

Kilian, B., Özkan, H., Pozzi, C., Salamini, F. (2009): Domestication of the Triticeae in the

Fertile Crescent. In: Feuillet, C., Muehlbauer, G. J. (ed.): Genetics and Genomics of

the Triticeae. Springer Science+Business Media, New York, USA.

Klocová, B. (2010): Mapování genů kvantitativních znaků u diploidní pšenice T.

monococcum L. Ústav Experimentální botaniky Akademie věd ČR, Olomouc.

Klocová, B., Sedláček, T., Gallová, L., Valárik, M., Doležel, J. (2011): Construction of

genetic linkage map of Triticum monococcum L. and mapping of quantitative traits. In:

Olomouc Biotech 2011, Plant Biotechnology: Green for Good, Olomouc, Czech

Republic.

Konieczny, A., Ausubel, F. M. (1993): A procedure for mapping Arabidopsis mutations using

co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant Journal 4 (2): 403-410.

76

Kosambi, D. D. (1943): The estimation of map distances from recombination values. Ann.

Eugenics. 12: 172-175.

Kumar, N., Kulwal, P. L., Gaur, A., Tyagi, A. K., Khurana, J. P., Khurana, P., Balyan, H. S.,

Gupta, P. K. (2006): QTL analysis for grain weight in common wheat. Euphytica 151:

135-144.

Kuspira, J., Maclagan, J., Bhambhani, R. N. (1989): Genetic and cytigenetic analyses of the

A genome of Triticum monococcum L. V. Inheritance and linkage relationships of

genes determining the expression of 12 qualitative characters. Genome 32: 869-881.

Lander, E. S., Botstein, D. (1989): Mapping Mendelian Factors Underlying Quantitative

Traits Using RFLP Linkage Maps. Genetics 129: 185-199.

Landjeva, S., Korzun, V., Börner, A. (2007): Molecular markers: actual and potential

contributions to wheat genome charakterization ad breeding. Euhytica 156: 271-296.

Mangelsdorf, P. C. (1966): Genetic potencials for increasing yields of food crops and animals.

N.A.S.Symposium: Prospects of World Food Supply 56: 370-375.

Mantovani, P., Maccaferri, M., Sanguineti, M. C., Tubeosa, R., Catizone, I., Wenzl, P.,

Thomson, B., Carling, J., Huttner, E., DeAmbrogio, E., Kilian, A. (2008): An

integrated DArT-SSR linkage map of durum wheat. Molecular Breeding 22: 629-648.

Miftahudin, Ross, K., Ma, X.-F., Mahmoud, A. A., Layton, J., Rodriguez Milla, M. A.,

Chikmawati, T., Ramalingam, J., Feril, O., Pathan, M. S., Surlan Momirovic, G., Kim,

S., Chema, K., Fang, P., Haule, L., Struxness, H., Birkes, J., Yaghoubian, C., Skinner,

R., McAllister, J., Nguyen, V., Qi, L. L., Echalier, B., Gill, B. S., Linkiewicz, A. M.,

Dubcovsky, J., Akhunov, E. D., Dvořák, J., Dilbirligi, M., Gill, K. S., Peng, J. H.,

Lapitan, N. L. V., Bermudes-Kandianis, S. F., Lazo, G. R., Chao, S., Anderson, O. D.,

Gonzalez-Hernandez, J., Conley, E. J., Anderson, J. A., Choi, D.-W., Fenton, R. D.,

Close, E. J., McGuire, P. E., Qualset, C. O., Nguyen, H. T., Gustafson, J. P. (2004):

Analysis of Expressed Sequence Tag Loci on Wheat Chromosome Group 4. Genetics

168: 651-663.

77

Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. (1998): dCAPS, a simple technique for the

genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in

Arabidopsis thaliana genetics.

Nelson, J. C. (2005): Methods and Software for Genetic Mapping. In: Meksem, K. et Kahl, G.

(ed): The Handbook of Plant Genome Mapping: Genetic and Physical Mapping.

WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim, Germany.

Nguyen, H. T., Wu, X. (2005): Molecular Marker Systems for Genetic Mapping. In: Meksem,

K. et Kahl, G. (ed): The Handbook of Plant Genome Mapping: Genetic and Physical

Mapping. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim, Germany.

Padulosi, S., Hammer, K., Heller, J. (1996): Hulled wheat. Promoting the conservation and

use of underutilised and neglected crops 4. Proceedings of First International

Workshop on hulled wheats. IPGRI, Rome.

Paterson, A. H., Lander, E. S., Hewitt, J. D., Peterson, S., Lincoln, S. E., Tanksley, S. D.

(1988): Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete

linkage map of restriction fragment length polymorphisms. Nature 335, 721 - 726.

Peng, J., Ronin, Y., Fahima, T., Röder, M. S., Li, Y., Nevo, E., Korol, A. (2003):

Domestication quantitative trait loci in Triticum dicoccoides, the progenitor of wheat.

PNAS 100 (5): 2489-2494.

Quarrie, S. A., Quarrie, P. S., Radosevic, R., Rancic, D., Kaminska, A., Barnes, J. D.,

Leverington, M., Ceoloni, C., Doding, D. (2006): Dissecting a wheat QTL for yield

present in a range of environments: from the QTL to candidate genes. Joutnal of

Experimental Botany 57 (11): 2627-2637.

Roberts, J. J., Gallun, R. L., Patterson, F. L., Foster, J. E. (1979): Effects of Wheat Leaf

Pubescence on the Hessian Fly. Journal of Economic Entomology 72: 211-214.

78

Roy, B. A., Stanton, M. L., Eppley, S. M. (1999): Effects of environmental stress on leaf hair density and consequences for selection. Journal of Evolutionary Biology 12 (6): 1089- 1103.

Sadeque, A., Turner, M. A. (2010): QTL Analysis of Plant Height in Hexaploid Wheat

Doubled Haploid Population. Thai Journal of Agricultural Science 43 (2): 91-96.

Shah, M. M., Gill, K. S., Baenziger, P. S., Yen, Y., Kaeppler, S. M., Ariyarathne, H. M.

(1999): Molecular Mapping of Loci for Agronomic Traits on Chromosome 3A of

Bread Wheat. Crop Science 39: 1728-1732.

Sharma, H. C., Waines, J. G. (1994): Inheritance of Leaf Pubescence in Dipolid Wheat. The

Journal of Heredity 85 (4): 286 – 288.

Schlötterer, C. (2000): Evolutionary dynamics of microsatellite DNA. Nucleic Acid Research

20: 211-215.

Schneider, K. (2005): Mapping Populations and Principles of Genetic Mapping. In: Meksem,

K. et Kahl, G. (ed): The Handbook of Plant Genome Mapping: Genetic and Physical

Mapping. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim, Germany.

Singh, K., Ghai, M., Garg, M., Chhuneja, P., Kaur, P., Schnurbusch, T., Keller, B., Dhaliwal,

H. S. (2007): An integrated molecular linkage map of diploid wheat based on a

Triticum boeoticum Ł T. monococcum RIL population. Theoretical and Applied

Genetics 115: 301-312.

Sourdille, P., Tixier, M. H., Charmet, G., Gay, G., Cadalen, T., Bernard, S., Bernard, M.

(2000): Location of genes involved in ear compactness in wheat (Triticum aestivum)

by means of molecular markers. Molecular Breeding 6: 247-255.

Syvänen, A.-Ch. (2001): Accessing genetic variation: Genotyping single nucleotide

polymorphisms. Nature Reviews, Genetics 2: 930-942.

79

Taketa, S., Chang, C.L., Ishii, M., Takeda, K. (2002): Chromosome arm location of the gee

controlling leaf pubescence of a Chinese local wheat cultivar „Hong-mang-mai“.

Euphytica 125: 141-147

Tanksley, S.D., Ganal, M.W., Prince, J.P., Devicente, M.C., Bonierbale, M.W., Broun, P.,

Fulton, T.M., Giovannoni, J.J., Grandillo, S., Martin, G.B., Messeguer, R., Miller, J.C.,

Miller, L., Paterson, A.H., Pineda, O., Roder, M.S., Wing, R.A., Wu, W., Young, N.D.

(1992). Genetics 132 (4): 1141-1160.

Tautz, D. (1989): Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic

DNA markers. Nucleic Acid Research 17 (16): 6463-6471.

Taylor, C., Madsen, K., Borg, S., Møller, M. G., Boelt, B., Holm, P. B. (2001): The

development of sequence-tagged sites (STSs) in Lolium perenne L.: the application of

primer sets derived from other genera. Theoretical and Applied Genetics 103: 648-

658.

Valarik, M., Linkiewicz, A., Dubcovsky, J. (2006): A microcolinearity study at the earliness

per se gene Eps-Am1 region reveals an ancient duplication that preceded the wheat-

rice divergence. Theoretical and Applied Genetics 112: 945-957.

Van Ooijen, J. W. (2006) JoinMap ® 4, Software for the calculation of genetic linkage maps

in experimental populations. Kyazma B. V., Wageningen, Netherlands.

Vanžurová, H. (2011): Zavedení nových typů markerů do mapy Triticum monococcum L. pro

mapování výnosu a prvků výnosu. Ústav Experimentální botaniky Akademie věd ČR,

Olomouc.

Verma, V., Worland, A. J., Sayers, E. J., Fish, L., Caligari, P. D. S., Snape, J. W. (2005):

Identification and characterization of quantitative trait loci related to lodging

resistance and associated traits in bread wheat. Plant Breeding 124: 234-241.

80

Wang, Z., Wu, X., Ren, Q., Chang, X., Li, R., Jing, R. (2010): QTL mapping for

developmental behavior of plant height in wheat (Triticum aestivum L.). Euphytica

174: 447-458.

Ware, D., Stein, L. (2003): Comparison of genes among cereals. Current Opinioun in Plant

Biology 6: 121-127.

Wenzl, P, Carling, J, Kudrna, D, Jaccoud, D., Huttner, E., Kleinhofs, A., Kilian, A. (2004):

Diversity Arrays Technology (DArT) for whole-genome profiling of barley.

Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America

101(26): 9915-9920.

Yan, L., Loukolanov, A., Tranquilli, G., Helguera, M., Fahlma, T., Dubcovsky, J. (2003):

Positional cloning of the wheat vernalization gene VRN 1. PNAS 100: 6263-6268.

Yan, L., Loukolanov, A., Tranquilli, G., Blechl, A., Khan, I. A., Ramakrishna, W., San

Miguel, P., Bennetzen, J. L., Echnique, V., Lijavetzky, D., Dubcovsky, J. (2004): The

wheat VRN 2 gene is a flowering repressor down-regulated by vernalization. Science

303: 1640-1644

Zeng, Y., Li, J., Wang, Ch., Chang, M. M., Yang, R., Wu, R. (2008): Genetic Mapping of

Quantitative Trait Loci. In: Kole, Ch., et Abbott, A. G. (ed.): Principles and Practices

of Plant Genomics, Science Publishers, Enfield, NH, USA.

http://botany.cz/cs/triticum-monococcum/ http://learn.genetics.utah.edu/content/health/pharma/snips/ http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/splist.pl?12442 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechCAPS.shtml http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechSTS.shtml http://www.ncbi.nim.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi

81

9. ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK A SYMBOLOV

- AFLP - polymorfizmus amplifikovaných fragmentov (Amplified Fragment

Length Polymorphism)

- APS - peroxodisíran amónny

- BAC - umelý bakteriálny chromozóm (Bacterial Artificial Chromosome)

- BC - populácie spätných krížencov (Backcross Population)

- bp - páry bází (base pairs)

- CAPS - našiepené amplifikované polymorfné sekvencie (Cleaved Amplified

Polymorphic Sequence)

- cDNA - komplementárna DNA (complementary DNA)

- cM - centiMorgan, jednotka vzdialenosti na genetickej väzbovej mape

- cy3, cy5 - cyanín3, cyanín5 (fluorescenčné farbivá)

- dATP - deoxyadenozíntrifosfát

- DArT - Diversity Arrays Technology

- dCAPS - vytvorená štiepiteľná amplifikovaná polymorfná sekvencia (derived

Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)

- dCTP - deoxycytozíntrifosfát

- dGTP - deoxyguanozíntrofsfát

- DH - dihaplidné línie (Double Haploid lines)

- DNA - deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid)

- dTTP - deoxytimidíntrifosfát

- EDTA - etyléndiamíntetraoctová kyselina

- F1 (2,3,8,10) - prvá filiálna generácia (druhá, tretia, ôsma, desiata)

- F primer - forward primer

- Gb - gigabázy (Giga base)

- hl - lokus pre listy bez chlpov

- HlP - lokus pre chlpaté listy (Hairy leaf, Pubescence)

- HlVP - lokus pre veľmi chlpaté listy (Hairy leaf, Very Pubescence)

- Hl1 - gén pre výskyt ochlpenia na listoch (Hairy leaf 1)

- Hl2Aesp - gén pre chlpatosť listov (Hairy leaf 2, Aegilops speltoides)

- IRAP - medziretrozómový amplifikovaný polymorfizmus (Inter-Retrotranspozon

Amplified Polymorphism)

- KCl - chlorid draselný

82

- LOD - limit detekcie (Limit Of Detection)

- LTR - long terminal repeat, dlhá terminálna repetícia

- m2 - štvorcový meter

- MAS - markrom asistovaná selekcia (Marker Assisted Selection)

- Mb - megabázy (Mega base)

- mg - miligram

- MgCl2 - chlorid horečnatý

- n, 2n - haploidný počet chromozómov, diploidný počet chromozómov

- NaCl - chlorid sodný

- NIL - takmer izogénne línie (Nearly Isogenic Lines)

- PCR - polymerázová reťazová reakcia (Polymerase Chain Reaction)

- QTL - lokus s kvantitatívnym znakom (Quantitative Trait Loci)

- RAPD - náhodne amplifikovaná polymorfná DNA (Random Amplified

Polymorphic DNA)

- RE - restrikčná endonukleáza

- RFLP - dĺžkový polymorfismus restrikčných fragmentov (Restriction Fragment

Lenght Polymorphism)

- RIL - rekombinantné inbredné línie (Recombinant Inbred Lines)

- R primer - reverse primer

- SDS - dodecylsíran sodný

- SNP - jednonukleotidový polymorfizmus (Single Nucleotide Polymorphisms)

- SSD - jedno-semenné línie (Single-Seed Descent lines)

- SSR - jednoduché opakujúce sa sekvencie (Simple Sequence Repeats)

- STS - miesto so sekvenčnou adresou (Sequence-Tagged Site)

- Taq - Thermus aquaticus

- TEMED - N, N, N´, N´ - tertraetylénmetyléndiamín

- Tris-HCl - tris(hydroxymetyl)aminometán hydrochlorid

- UV - ultrafialové žiarenie