Prof. Dr. İsmail Hakkı BOYACI
Hacettepe Üniversitesi,
Gıda Mühendisliği Bölümü, Beytepe Ankara
Yüzey plazmon rezonans sistemi ve mikroorganizma tayinine
yönelik biyosensör hazırlanması
Neden mikroorganizma Neden mikroorganizma tayini? tayini?
Halk sağlığıÇevre sağlığıGıda güvenliğiBiyogüvenlikBiyoterör ajanı
Staphylococcus aureus
2
Kültürel yöntemlerMikroskobik yöntemlerKimyasal yöntemlerFiziksel yöntemlerBiyokimyasal yöntemlerMoleküler yöntemlerİmmünolojik yöntemlerBiyosensörler
Mikroorganizma tayini yöntemleriMikroorganizma tayini yöntemleri
3
Mikroorganizma tayini yöntemleriMikroorganizma tayini yöntemleri
A. Diret sayım yöntemleri Kültür sayım yöntemleri (dökme plak, çift
tabakalı dökme plak,agar damlatma yöntemi, membran filtre sayım yöntemleri ve diğer yöntemler)
Mikroskopik sayım yöntemleri (Thoma lamı, Howard lamı, membran fitre ve diğer sayım yöntemleri)
Flow sitometresi B. İndiret sayım yöntemleri En muhtemel sayı yöntemi, Tüp dilisyon yöntemiTürbidimetrik sayım yöntemiHücre içi reaktifine dayalı yöntemlerMetabolik aktiviteye dayalı sayım
yöntemleriKuru maddeye tayinine dayalı sayım
yöntemi
4
Kültürel Kültürel yöntemleryöntemler
Uzun inkübasyon sürelerine gereksinim duyulmaktadır.
Zahmetli yöntemlerdir.
Analiz süresi 1-7 gün arasında değişmektedir.
5
Mikrobiyolojik analizlerde Mikrobiyolojik analizlerde hızlı yöntemlere gereksinim hızlı yöntemlere gereksinim
duyulmaktadır. duyulmaktadır.
100 ml içme suyu 100 ml içme suyu içerisindeki 1 içerisindeki 1 Escherichia coliEscherichia coli’nin ’nin saptanması. saptanması.
HEDEFHEDEF
HızlıHızlıHassasHassasSeçici Seçici
6
BİYOSENSÖRBİYOSENSÖRBiyolojik tanıma mekanizmasına sahip,
hedef molekül derşimine orantılı sinyaller üreten analiz sistemlerine biyosensörbiyosensör denir.
(a) Biyoajan (b) Çevirici (c) Yükseltici (d) İşlemci (e) Gösterge
Referans
7
BioajanlBioajanlararAntikorDNAEnzimProteinMikroorganizmaBitkisel ve hayvansal
dokularAptamer
ÇeviricilÇeviricilerer
ElektrokimyasalElektrikselOptikKütle hassasTermal
8
Yüzey plazmon rezonans sistemi (SPR):
9
Polarize ışık, yüzeyi altın kaplı bir prizmaya gönderildiğinde ışığın bir kısmı absorplanmakta, bir kısmı da yansımakatdır. Geliş açısı değiştirilip yansıyan ışığın şiddeti izlendiğinde yansıyan ışık şiddetinde azalma görülür. Yansıyan ışığın şiddetinde maksimum kaybın gerçekleştiği açıya rezonans açısı ya da SPR açısı adı verilir.
Bu geliş açısında ışık, yüzey plazmonlarını (elektron paketçikleri) harekete geçirecek, yüzey plazmon rezonans olayı gerçekleşecektir. Yüzey plazmon rezonansı iki optik ortamın ara yüzeyine ince iletken bir film yerleştirildiğinde meydana gelir. Spesifik bir geliş açısında metal yüzeyindeki elektron frekanslarının eşleşmeleri nedeniyle gelen ışık ile rezonans durumuna gelecektir. Bu rezonans durumunda enerji absorblanacağı için yansıyan ışının yoğunluğunda bir azalma meydana gelmektedir.
Uyarma Yansıma
Altın tabaka(~50 nm)
Cam
SPW ( penetrrasyon derinliği ~400 nm)Dielektrik
(tampon + örnek)
10
Metal yüzeyiyle temas halinde ortamın özelliklerinin değişmesi veya yüzeyde birikim sağlanması durumunda rezonans açısı değişmektedir.
Yüzeyde birikim kontrollü olarak sağlanması durumunda birikin madder derişimiyle ilgili kantitatif sensör çalışmalaırnda kullanılabilmektedir.
Bu amaçla zamana karşı SPR açısını takip eden ticari sistemler geliştirilmiştir.
Molecule Rinse
SPR Sinyalinde Kayma Reflaktif Indeks (RI) Kayması-Zaman Grafiği
11Krestschmann ATR Otto
12
Işık
Kaynağ
ı
Dedektör
Pirizma
Altın yüzey
Akış hüçresi
Deney düzeneği
SpreetaTM sesnör (Texas Instruments, Dallas,
TX)
13
Antikorun tutuklanması
Yüzeyin temizlenmsiAvidin ile kaplanması (1 mg/ml, 10 μl/min)Yıkama
Au yüzey
Streptavidin
14
Antikorun tutuklanması-2
Biyotin işaretli anti-E. coli antikorunun yüzeye başlanması
Yıkama, tamponYıkama, % 1SDS Biotin
conjugated antibodies
15
3500
4500
5500
6500
7500
8500
9500
10500
11500
12500
0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500
Time (sec)
Res
pon
se U
nit
(R
U)
Antikor tutuklama
Yüzeye streptavidinin ve biyotin işaretli antikorun bağlanması sonucunda sensör cevabı
Streptavidin
PBS
SDS
Antikor PBS
SDS
GlisinPBS
SDS
16
Süre (Saniye)
17
Bakteri tayiniÖrnek enjeksiyonu (1 ml)YıkamaRejenerasyon, % 1 SDS
E. coli
Farklı derişimlerde E. coli (~ 102 to 106 kob/ml) örneklerden 1 mL sensör yüzeyle etkilşemesi sağlanmaktadırwere injected.
Uygun yıkama çözeltileri ile yıkama gerçekleşmektedir.
Örneklem sonrasında sensör cevabında meydana gelen değişimler kaydedilmekte ve sonrasında kalibrasyon grafiği üretilmketedir.
Sensör yüzeyi uygun çözeltilerle temizlenerek tekrar kullanılmaktadır.
18
The response (RU) to binding of E. coli and regeneration. Injection of
A) E. coli solution (9.0×101 cfu ml-1); B) PBS; C) %1 SDS solution; D) E. coli solution(1.8×103 cfu ml-1); E) E. coli solution(1.8×105 cfu ml-1).
Immunosensors using surface plasmon resonance (Real time antigen determination)
Reusability
The sensor responses for E. coli solution (~103 cfu/ml) intra-day.
0
100
200
300
400
500
600
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Runs
Res
pon
se U
nit
s (R
U)
19
Selectivity
The change in RU induced by the binding E. aerogenes (1.8×105 cfu/ml) and E. dissolvens (1.4×104 cfu/ml) and E. coli (1.8×104 cfu/ml).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
E.aerogenes E.coli E.dissolvens
Cha
nge
in R
espo
nse
Uni
t (D
RU
)
20
Real water samples
Water SourceSPR-based immunosensor
(cfu ml-1)Plate counting method
(cfu ml-1)
River < Detection Limit Not Detected
Lake 2.4 × 102 5.6 × 102
E. coli inoculated tap water 1.9 × 104 3.1 × 104
Table. The results of real water samples obtained from the developed immunosensor and plate counting method
21
Sonuç… SPR sistemi kullanılarak çok farklı hedef moleküle
karşı biyonsensör geliştirilebilmekte farklı etkileşimler takip edilebilmektedir.
Diğer biyosensörlere göre daha hızlı, hassas ve seçici uygulamalar gerçekleştirilebilmektedir.
En önemli avantajı sandviç analizlerde olduğu gibi ikincil tanıyıcı molekül gereksinim duymamasıdır.
Aynı SPR yüzeyleri tekrar tekrar kullanılabilmektedir.
Sistem optimize edilerek taşınabilir sistemlerin geliştirilmesi mümkün olabilmektedir.
Yaygın kullanıma uygun bir teknolojidir.
22
Daha fazla bilgi için:
23
F. Baldini, A. N. Chester, J. Homola, and S. Martellucci (editors): Optical Chemical Sensors, NATO Science Series II, Vol. 224, Springer, 2006.
J. Homola (editor): Surface Plasmon Resonance Based Sensors, Springer, 2006.
M. Piliarik, H. Vaisocherová, J. Homola: Surface Plasmon Resonance Biosensing, in Biosensors and Biodetection, Methods in Molecular Biology, Vol. 503, editors A. Rasooly, K. E. Herold, Humana Press, 2009, 65-88.
Dudak F.C., İ.H. Boyacı, Development of an Immunosensor Based On Surface Plasmon Resonance for Enumeration of Escherichia coli in Water Samples, Food Research International, 40, 803-807 (2007).
Dudak F.C., İ.H. Boyacı, Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors, Biotechnology Journal 7 1003-1011 (2009).