Prof. Dr. İsmail Hakkı BOYACI

Hacettepe Üniversitesi,

Gıda Mühendisliği Bölümü, Beytepe Ankara

ihb@hacettepe.edu.tr

Yüzey plazmon rezonans sistemi ve mikroorganizma tayinine

yönelik biyosensör hazırlanması

Neden mikroorganizma Neden mikroorganizma tayini? tayini?

Halk sağlığıÇevre sağlığıGıda güvenliğiBiyogüvenlikBiyoterör ajanı

Staphylococcus aureus

2

Kültürel yöntemlerMikroskobik yöntemlerKimyasal yöntemlerFiziksel yöntemlerBiyokimyasal yöntemlerMoleküler yöntemlerİmmünolojik yöntemlerBiyosensörler

Mikroorganizma tayini yöntemleriMikroorganizma tayini yöntemleri

3

Mikroorganizma tayini yöntemleriMikroorganizma tayini yöntemleri

A. Diret sayım yöntemleri Kültür sayım yöntemleri (dökme plak, çift

tabakalı dökme plak,agar damlatma yöntemi, membran filtre sayım yöntemleri ve diğer yöntemler)

Mikroskopik sayım yöntemleri (Thoma lamı, Howard lamı, membran fitre ve diğer sayım yöntemleri)

Flow sitometresi B. İndiret sayım yöntemleri En muhtemel sayı yöntemi, Tüp dilisyon yöntemiTürbidimetrik sayım yöntemiHücre içi reaktifine dayalı yöntemlerMetabolik aktiviteye dayalı sayım

yöntemleriKuru maddeye tayinine dayalı sayım

yöntemi

4

Kültürel Kültürel yöntemleryöntemler

Uzun inkübasyon sürelerine gereksinim duyulmaktadır.

Zahmetli yöntemlerdir.

Analiz süresi 1-7 gün arasında değişmektedir.

5

Mikrobiyolojik analizlerde Mikrobiyolojik analizlerde hızlı yöntemlere gereksinim hızlı yöntemlere gereksinim

duyulmaktadır. duyulmaktadır.

100 ml içme suyu 100 ml içme suyu içerisindeki 1 içerisindeki 1 Escherichia coliEscherichia coli’nin ’nin saptanması. saptanması.

HEDEFHEDEF

HızlıHızlıHassasHassasSeçici Seçici

6

BİYOSENSÖRBİYOSENSÖRBiyolojik tanıma mekanizmasına sahip,

hedef molekül derşimine orantılı sinyaller üreten analiz sistemlerine biyosensörbiyosensör denir.

(a) Biyoajan (b) Çevirici (c) Yükseltici (d) İşlemci (e) Gösterge

Referans

7

BioajanlBioajanlararAntikorDNAEnzimProteinMikroorganizmaBitkisel ve hayvansal

dokularAptamer

ÇeviricilÇeviricilerer

ElektrokimyasalElektrikselOptikKütle hassasTermal

8

Yüzey plazmon rezonans sistemi (SPR):

9

Polarize ışık, yüzeyi altın kaplı bir prizmaya gönderildiğinde ışığın bir kısmı absorplanmakta, bir kısmı da yansımakatdır. Geliş açısı değiştirilip yansıyan ışığın şiddeti izlendiğinde yansıyan ışık şiddetinde azalma görülür. Yansıyan ışığın şiddetinde maksimum kaybın gerçekleştiği açıya rezonans açısı ya da SPR açısı adı verilir.

Bu geliş açısında ışık, yüzey plazmonlarını (elektron paketçikleri) harekete geçirecek, yüzey plazmon rezonans olayı gerçekleşecektir. Yüzey plazmon rezonansı iki optik ortamın ara yüzeyine ince iletken bir film yerleştirildiğinde meydana gelir. Spesifik bir geliş açısında metal yüzeyindeki elektron frekanslarının eşleşmeleri nedeniyle gelen ışık ile rezonans durumuna gelecektir. Bu rezonans durumunda enerji absorblanacağı için yansıyan ışının yoğunluğunda bir azalma meydana gelmektedir.

Uyarma Yansıma

Altın tabaka(~50 nm)

Cam

SPW ( penetrrasyon derinliği ~400 nm)Dielektrik

(tampon + örnek)

10

Metal yüzeyiyle temas halinde ortamın özelliklerinin değişmesi veya yüzeyde birikim sağlanması durumunda rezonans açısı değişmektedir.

Yüzeyde birikim kontrollü olarak sağlanması durumunda birikin madder derişimiyle ilgili kantitatif sensör çalışmalaırnda kullanılabilmektedir.

Bu amaçla zamana karşı SPR açısını takip eden ticari sistemler geliştirilmiştir.

Molecule Rinse

SPR Sinyalinde Kayma Reflaktif Indeks (RI) Kayması-Zaman Grafiği

11Krestschmann ATR Otto

12

Işık

Kaynağ

ı

Dedektör

Pirizma

Altın yüzey

Akış hüçresi

Deney düzeneği

SpreetaTM sesnör (Texas Instruments, Dallas,

TX)

13

Antikorun tutuklanması

Yüzeyin temizlenmsiAvidin ile kaplanması (1 mg/ml, 10 μl/min)Yıkama

Au yüzey

Streptavidin

14

Antikorun tutuklanması-2

Biyotin işaretli anti-E. coli antikorunun yüzeye başlanması

Yıkama, tamponYıkama, % 1SDS Biotin

conjugated antibodies

15

3500

4500

5500

6500

7500

8500

9500

10500

11500

12500

0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500

Time (sec)

Res

pon

se U

nit

(R

U)

Antikor tutuklama

Yüzeye streptavidinin ve biyotin işaretli antikorun bağlanması sonucunda sensör cevabı

Streptavidin

PBS

SDS

Antikor PBS

SDS

GlisinPBS

SDS

16

Süre (Saniye)

17

Bakteri tayiniÖrnek enjeksiyonu (1 ml)YıkamaRejenerasyon, % 1 SDS

E. coli

Farklı derişimlerde E. coli (~ 102 to 106 kob/ml) örneklerden 1 mL sensör yüzeyle etkilşemesi sağlanmaktadırwere injected.

Uygun yıkama çözeltileri ile yıkama gerçekleşmektedir.

Örneklem sonrasında sensör cevabında meydana gelen değişimler kaydedilmekte ve sonrasında kalibrasyon grafiği üretilmketedir.

Sensör yüzeyi uygun çözeltilerle temizlenerek tekrar kullanılmaktadır.

18

The response (RU) to binding of E. coli and regeneration. Injection of

A) E. coli solution (9.0×101 cfu ml-1); B) PBS; C) %1 SDS solution; D) E. coli solution(1.8×103 cfu ml-1); E) E. coli solution(1.8×105 cfu ml-1).

Immunosensors using surface plasmon resonance (Real time antigen determination)

Reusability

The sensor responses for E. coli solution (~103 cfu/ml) intra-day.

0

100

200

300

400

500

600

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Runs

Res

pon

se U

nit

s (R

U)

19

Selectivity

The change in RU induced by the binding E. aerogenes (1.8×105 cfu/ml) and E. dissolvens (1.4×104 cfu/ml) and E. coli (1.8×104 cfu/ml).

0

100

200

300

400

500

600

700

800

E.aerogenes E.coli E.dissolvens

Cha

nge

in R

espo

nse

Uni

t (D

RU

)

20

Real water samples

Water SourceSPR-based immunosensor

(cfu ml-1)Plate counting method

(cfu ml-1)

River < Detection Limit Not Detected

Lake 2.4 × 102 5.6 × 102

E. coli inoculated tap water 1.9 × 104 3.1 × 104

Table. The results of real water samples obtained from the developed immunosensor and plate counting method

21

Sonuç… SPR sistemi kullanılarak çok farklı hedef moleküle

karşı biyonsensör geliştirilebilmekte farklı etkileşimler takip edilebilmektedir.

Diğer biyosensörlere göre daha hızlı, hassas ve seçici uygulamalar gerçekleştirilebilmektedir.

En önemli avantajı sandviç analizlerde olduğu gibi ikincil tanıyıcı molekül gereksinim duymamasıdır.

Aynı SPR yüzeyleri tekrar tekrar kullanılabilmektedir.

Sistem optimize edilerek taşınabilir sistemlerin geliştirilmesi mümkün olabilmektedir.

Yaygın kullanıma uygun bir teknolojidir.

22

Daha fazla bilgi için:

23

F. Baldini, A. N. Chester, J. Homola, and S. Martellucci (editors): Optical Chemical Sensors, NATO Science Series II, Vol. 224, Springer, 2006.

J. Homola (editor): Surface Plasmon Resonance Based Sensors, Springer, 2006.

M. Piliarik, H. Vaisocherová, J. Homola: Surface Plasmon Resonance Biosensing, in Biosensors and Biodetection, Methods in Molecular Biology, Vol. 503, editors A. Rasooly, K. E. Herold, Humana Press, 2009, 65-88.

Dudak F.C., İ.H. Boyacı, Development of an Immunosensor Based On Surface Plasmon Resonance for Enumeration of Escherichia coli in Water Samples, Food Research International, 40, 803-807 (2007).

Dudak F.C., İ.H. Boyacı, Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors, Biotechnology Journal 7 1003-1011 (2009).

ihb@hacettepe.edu.tr