Monika Gontarska
Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej z detekcją
densytometryczną oraz innych instrumentalnych technik
analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych
pochodnych kwasu octowego i kwasu propionowego
(otwarcie przewodu doktorskiego)
Opiekun pracy
Prof zw dr hab T Kowalska
Zakład Chemii Ogoacutelnej i Chromatografii
Instytut Chemii
Uniwersytet Śląski w Katowicach
Instytut Chemii
Uniwersytet Śląski
Katowice 2009
2
Spis treści
1 Wstęp
2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych
3 Cel pracy
4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznym oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
412 Polarymetira
4121Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
4122Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
422 Test biuretowy
423 Polarymetria
4231Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
4232Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
5 Wnioski
6 Dalsze plany badawcze
7 Literatura
8 Lista prac własnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
9 Lista publikacji konferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
10 Życiorys
3
1 Wstęp
Reakcje oscylacyjne to swoista rzadkość wśroacuted reakcji chemicznych Przedmiot
niniejszych badań zarysował się podczas opracowywania metod chromatograficznego
rozdziału par enancjomeroacutew ibuprofenu i naproksenu należących do grupy niesteroidowych
lekoacutew o właściwościach przeciwzapalnych i przeciwgorączkowych (ang non-steroidal anti-
inflammatory drugs NSAIDs) Ustalono woacutewczas iż związki te nie są stabilne podczas
przechowywania ich jako optycznie czystych enancjomeroacutew rozpuszczonych w prostych
niskocząsteczkowych rozpuszczalnikach Niestabilność ta jest związana z oscylacyjną zmianą
stężenia pierwotnie rozpuszczonego enancjomeru badanego związku ktoacutery z czasem
przechodzi w swoacutej własny antymer
Profeny jako leki przeciwboacutelowe są dziś ogromnie popularne i ogoacutelnodostępne Roacutewnież
wiele innych niskocząsteczkowych chiralnych kwasoacutew karboksylowych jest stosowanych
jako substancje lecznicze lub ich prekursory W związku z tym nasuwa się refleksja o
prawdopodobnej powszechności opisanej wyżej labilności sterycznej i o jej znaczeniu dla
biochemii i farmakologii
W ramach niniejszych badań postanowiłam sprawdzić czy zjawisko inwersji chiralnej
dotyczy innych niż ibuprofen i naproksen związkoacutew z grupy profenoacutew tj ketoprofenu i
flurbiprofenu Jednocześnie wytypowałam do badań dwie pochodne kwasu octowego
odgrywające znaczącą rolę w medycynie i kosmetologii tj -fenyloglicynę i kwas
migdałowy Między innymi starałam się znaleźć odpowiedź na pytanie czy wspomniana
wyżej niestabilność steryczna jest zależna od długości łańcucha węglowego
2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych
Profeny to kwasy 2-arylopropionowe (ang 2-arylpropionic acids 2-APAs) należące do
niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych (NLPZ) szerokiej i niejednorodnej grupy lekoacutew o
działaniu przeciwzapalnym przeciwboacutelowym i przeciwgorączkowym [1] Z powodu
obecności w strukturze profenoacutew asymetrycznego atomu węgla występują one w postaci
dwoacutech optycznie czynnych enancjomeroacutew [2] Najprostszym przedstawicielem grupy
profenoacutew jest kwas 2-fenylopropionowy ktoacutery nie posiada jednak właściwości leczniczych w
żadnej z form czynnych optycznie Na rynku farmaceutycznym są one dostępne głoacutewnie w
formie racematu jedynie naproksen od samego początku jest sprzedawany w formie
enancjomeru S Uważa się że działanie terapeutyczne wykazują jedynie enancjomery o
4
konfiguracji S natomiast ich antymery R są obojętne dla organizmu Z tego powodu coraz
więcej profenoacutew zaczyna się sprzedawać w formie S [3] Wykazano natomiast iż pod
wpływem roacuteżnorakich czynnikoacutew działających in vivo a także in vitro może zachodzić
zmiana struktury przestrzennej profenoacutew z izomeru R do formy S czyli inwersja chiralna
Wiele spośroacuted kwasoacutew arylooctowych należy podobnie jak profeny do grupy
niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych Przykładowo kwas migdałowy stosuje się obecnie
w zwalczaniu zmian skoacuternych a -fenyloglicyna wchodząca w skład wielu peptydoacutew
zwiększa ich zdolności lecznicze Oba te związki charakteryzują się stosunkowo niską masą
cząsteczkową i tym że są one chiralne ndash zatem występują w postaci dwoacutech enancjomeroacutew a
co za tym idzie istnieje możliwość że ulegają konwersji chiralnej
Aktywność terapeutyczna profenoacutew polega na hamowaniu działania cyklooksygenazy
kluczowego enzymu w biosyntezie prostaglandyn (czyli grupy hormonoacutew pochodnych
kwasu arachidonowego będących regulatorami procesoacutew fizjologicznych) Enzym ten
występuje w postaci dwoacutech form izomerycznych a mianowicie COX-1 i COX-2 Pierwszy z
nich odpowiada za syntezę prostaglandyn chroniących błonę wyściełającą żołądek
zmniejszając wytwarzanie kwasu żołądkowego i regulując wydzielanie śluzu oraz prawidłowe
ukrwienie żołądka natomiast enzym COX-2 uczestniczy w procesach zapalnych i przyczynia
się do powstawania boacutelu gorączki i obrzękoacutew Bardzo ważną ścieżką w metabolizmie
kwasoacutew 2-arylopropionowych jest inwersja chiralna podczas ktoacuterej nieaktywny w stosunku
do cyklooksygenazy enancjomer R jest przekształcany w swoacutej własny antymer aktywny
wobec cyklooksygenazy
Dlaczego tylko enancjomer R a nie jego antymer ulega inwersji chiralnej Wspoacutelną
strukturalną właściwością profenoacutew jest tetraedryczna hybrydyzacja chiralnego atomu węgla
do ktoacuterego przyłączony jest łańcuch zawierający grupę arylową Stereospecyficzność może
być zaobserwowana w procesach farmakokinetycznych w ktoacuterych wykorzystywany jest
nośnik białkowy czyli receptor lub enzym Dodatkowo występują roacuteżne stosunki ilościowe
lub jakościowe ze względu na stereoselektywność procesoacutew farmakodynamicznych
Mechanizm inwersji sugeruje że enancjomer R może być aktywowany przez przekształcenie
go w adenylan (soacutel kwasu adenozynomonofosforowego) do dalszej reakcji z koenzymem A
podczas gdy adenylan powstały z S-(+)-profenu nie jest zdolny do takiej reakcji [4] Co
ciekawe hamowanie syntezy prostaglandyn przeprowadzane in vitro pokazuje iż aktywność
w tym względzie wykazuje tylko enancjomer S Jednak ta stereoselektywność działania nie
występuje in vivo z powodu jednokierunkowej metabolicznej inwersji chiralnego centrum
asymetrii z nieaktywnego izomeru R do jego antymeru S [5] Farmakokinetyka absorpcji
5
dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego
z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne
cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie
jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku
tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]
Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można
podzielić na pięć grup [8]
I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej
II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w
ogoacutele
III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej
inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
V Profeny nieulegające inwersji chiralnej
Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen
pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie
enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale
reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem
grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji
chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz
nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej
występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy
IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen
oraz karprofen
Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku
ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa
inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen
wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może
być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]
Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie
optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju
Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego
[11]
6
W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez
bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję
kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu
migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a
w szczeglności u szczuroacutew [13]
Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo
Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem
podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew
ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy
pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej
techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu
propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym
niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej
konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy
pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki
zostały przedstawione min w pracach [14-19]
Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle
pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych
farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości
marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W
szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a
dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną
rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych
Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być
brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla
szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie
bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]
7
3 Cel pracy
Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące
I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu
propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej
inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen
II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o
zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew
karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie
asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w
łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy
III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji
elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew
karboksylowych
4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie
W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych
dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in
vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-
flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej
peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach
etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny
wykonano dodatkowo test biuretowy
8
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery
flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i
odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem
S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)
Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału
enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału
dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada
[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew
ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem
krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą
składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego
użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był
oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań
L-arginina+ + S-(+)-profen
-L-arginina
+ S-(+)-profen
- (K1) (2)
L-arginina+ + R-(-)-profen
-L-arginina
+ R-(-)-profen
- (K2) (3)
gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest
warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu
We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory
S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku
objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1
Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o
stężeniu 02 mgmL-1
dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego
rozpuszczalnika
9
W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu
pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej
badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych
warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki
tego procesu przedstawiają rys 1 i 2
(a)
(b)
Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)
powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
2
Spis treści
1 Wstęp
2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych
3 Cel pracy
4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznym oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
412 Polarymetira
4121Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
4122Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
422 Test biuretowy
423 Polarymetria
4231Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
4232Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
5 Wnioski
6 Dalsze plany badawcze
7 Literatura
8 Lista prac własnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
9 Lista publikacji konferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
10 Życiorys
3
1 Wstęp
Reakcje oscylacyjne to swoista rzadkość wśroacuted reakcji chemicznych Przedmiot
niniejszych badań zarysował się podczas opracowywania metod chromatograficznego
rozdziału par enancjomeroacutew ibuprofenu i naproksenu należących do grupy niesteroidowych
lekoacutew o właściwościach przeciwzapalnych i przeciwgorączkowych (ang non-steroidal anti-
inflammatory drugs NSAIDs) Ustalono woacutewczas iż związki te nie są stabilne podczas
przechowywania ich jako optycznie czystych enancjomeroacutew rozpuszczonych w prostych
niskocząsteczkowych rozpuszczalnikach Niestabilność ta jest związana z oscylacyjną zmianą
stężenia pierwotnie rozpuszczonego enancjomeru badanego związku ktoacutery z czasem
przechodzi w swoacutej własny antymer
Profeny jako leki przeciwboacutelowe są dziś ogromnie popularne i ogoacutelnodostępne Roacutewnież
wiele innych niskocząsteczkowych chiralnych kwasoacutew karboksylowych jest stosowanych
jako substancje lecznicze lub ich prekursory W związku z tym nasuwa się refleksja o
prawdopodobnej powszechności opisanej wyżej labilności sterycznej i o jej znaczeniu dla
biochemii i farmakologii
W ramach niniejszych badań postanowiłam sprawdzić czy zjawisko inwersji chiralnej
dotyczy innych niż ibuprofen i naproksen związkoacutew z grupy profenoacutew tj ketoprofenu i
flurbiprofenu Jednocześnie wytypowałam do badań dwie pochodne kwasu octowego
odgrywające znaczącą rolę w medycynie i kosmetologii tj -fenyloglicynę i kwas
migdałowy Między innymi starałam się znaleźć odpowiedź na pytanie czy wspomniana
wyżej niestabilność steryczna jest zależna od długości łańcucha węglowego
2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych
Profeny to kwasy 2-arylopropionowe (ang 2-arylpropionic acids 2-APAs) należące do
niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych (NLPZ) szerokiej i niejednorodnej grupy lekoacutew o
działaniu przeciwzapalnym przeciwboacutelowym i przeciwgorączkowym [1] Z powodu
obecności w strukturze profenoacutew asymetrycznego atomu węgla występują one w postaci
dwoacutech optycznie czynnych enancjomeroacutew [2] Najprostszym przedstawicielem grupy
profenoacutew jest kwas 2-fenylopropionowy ktoacutery nie posiada jednak właściwości leczniczych w
żadnej z form czynnych optycznie Na rynku farmaceutycznym są one dostępne głoacutewnie w
formie racematu jedynie naproksen od samego początku jest sprzedawany w formie
enancjomeru S Uważa się że działanie terapeutyczne wykazują jedynie enancjomery o
4
konfiguracji S natomiast ich antymery R są obojętne dla organizmu Z tego powodu coraz
więcej profenoacutew zaczyna się sprzedawać w formie S [3] Wykazano natomiast iż pod
wpływem roacuteżnorakich czynnikoacutew działających in vivo a także in vitro może zachodzić
zmiana struktury przestrzennej profenoacutew z izomeru R do formy S czyli inwersja chiralna
Wiele spośroacuted kwasoacutew arylooctowych należy podobnie jak profeny do grupy
niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych Przykładowo kwas migdałowy stosuje się obecnie
w zwalczaniu zmian skoacuternych a -fenyloglicyna wchodząca w skład wielu peptydoacutew
zwiększa ich zdolności lecznicze Oba te związki charakteryzują się stosunkowo niską masą
cząsteczkową i tym że są one chiralne ndash zatem występują w postaci dwoacutech enancjomeroacutew a
co za tym idzie istnieje możliwość że ulegają konwersji chiralnej
Aktywność terapeutyczna profenoacutew polega na hamowaniu działania cyklooksygenazy
kluczowego enzymu w biosyntezie prostaglandyn (czyli grupy hormonoacutew pochodnych
kwasu arachidonowego będących regulatorami procesoacutew fizjologicznych) Enzym ten
występuje w postaci dwoacutech form izomerycznych a mianowicie COX-1 i COX-2 Pierwszy z
nich odpowiada za syntezę prostaglandyn chroniących błonę wyściełającą żołądek
zmniejszając wytwarzanie kwasu żołądkowego i regulując wydzielanie śluzu oraz prawidłowe
ukrwienie żołądka natomiast enzym COX-2 uczestniczy w procesach zapalnych i przyczynia
się do powstawania boacutelu gorączki i obrzękoacutew Bardzo ważną ścieżką w metabolizmie
kwasoacutew 2-arylopropionowych jest inwersja chiralna podczas ktoacuterej nieaktywny w stosunku
do cyklooksygenazy enancjomer R jest przekształcany w swoacutej własny antymer aktywny
wobec cyklooksygenazy
Dlaczego tylko enancjomer R a nie jego antymer ulega inwersji chiralnej Wspoacutelną
strukturalną właściwością profenoacutew jest tetraedryczna hybrydyzacja chiralnego atomu węgla
do ktoacuterego przyłączony jest łańcuch zawierający grupę arylową Stereospecyficzność może
być zaobserwowana w procesach farmakokinetycznych w ktoacuterych wykorzystywany jest
nośnik białkowy czyli receptor lub enzym Dodatkowo występują roacuteżne stosunki ilościowe
lub jakościowe ze względu na stereoselektywność procesoacutew farmakodynamicznych
Mechanizm inwersji sugeruje że enancjomer R może być aktywowany przez przekształcenie
go w adenylan (soacutel kwasu adenozynomonofosforowego) do dalszej reakcji z koenzymem A
podczas gdy adenylan powstały z S-(+)-profenu nie jest zdolny do takiej reakcji [4] Co
ciekawe hamowanie syntezy prostaglandyn przeprowadzane in vitro pokazuje iż aktywność
w tym względzie wykazuje tylko enancjomer S Jednak ta stereoselektywność działania nie
występuje in vivo z powodu jednokierunkowej metabolicznej inwersji chiralnego centrum
asymetrii z nieaktywnego izomeru R do jego antymeru S [5] Farmakokinetyka absorpcji
5
dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego
z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne
cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie
jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku
tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]
Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można
podzielić na pięć grup [8]
I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej
II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w
ogoacutele
III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej
inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
V Profeny nieulegające inwersji chiralnej
Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen
pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie
enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale
reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem
grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji
chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz
nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej
występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy
IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen
oraz karprofen
Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku
ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa
inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen
wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może
być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]
Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie
optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju
Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego
[11]
6
W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez
bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję
kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu
migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a
w szczeglności u szczuroacutew [13]
Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo
Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem
podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew
ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy
pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej
techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu
propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym
niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej
konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy
pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki
zostały przedstawione min w pracach [14-19]
Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle
pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych
farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości
marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W
szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a
dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną
rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych
Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być
brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla
szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie
bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]
7
3 Cel pracy
Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące
I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu
propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej
inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen
II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o
zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew
karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie
asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w
łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy
III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji
elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew
karboksylowych
4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie
W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych
dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in
vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-
flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej
peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach
etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny
wykonano dodatkowo test biuretowy
8
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery
flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i
odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem
S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)
Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału
enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału
dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada
[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew
ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem
krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą
składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego
użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był
oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań
L-arginina+ + S-(+)-profen
-L-arginina
+ S-(+)-profen
- (K1) (2)
L-arginina+ + R-(-)-profen
-L-arginina
+ R-(-)-profen
- (K2) (3)
gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest
warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu
We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory
S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku
objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1
Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o
stężeniu 02 mgmL-1
dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego
rozpuszczalnika
9
W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu
pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej
badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych
warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki
tego procesu przedstawiają rys 1 i 2
(a)
(b)
Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)
powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
3
1 Wstęp
Reakcje oscylacyjne to swoista rzadkość wśroacuted reakcji chemicznych Przedmiot
niniejszych badań zarysował się podczas opracowywania metod chromatograficznego
rozdziału par enancjomeroacutew ibuprofenu i naproksenu należących do grupy niesteroidowych
lekoacutew o właściwościach przeciwzapalnych i przeciwgorączkowych (ang non-steroidal anti-
inflammatory drugs NSAIDs) Ustalono woacutewczas iż związki te nie są stabilne podczas
przechowywania ich jako optycznie czystych enancjomeroacutew rozpuszczonych w prostych
niskocząsteczkowych rozpuszczalnikach Niestabilność ta jest związana z oscylacyjną zmianą
stężenia pierwotnie rozpuszczonego enancjomeru badanego związku ktoacutery z czasem
przechodzi w swoacutej własny antymer
Profeny jako leki przeciwboacutelowe są dziś ogromnie popularne i ogoacutelnodostępne Roacutewnież
wiele innych niskocząsteczkowych chiralnych kwasoacutew karboksylowych jest stosowanych
jako substancje lecznicze lub ich prekursory W związku z tym nasuwa się refleksja o
prawdopodobnej powszechności opisanej wyżej labilności sterycznej i o jej znaczeniu dla
biochemii i farmakologii
W ramach niniejszych badań postanowiłam sprawdzić czy zjawisko inwersji chiralnej
dotyczy innych niż ibuprofen i naproksen związkoacutew z grupy profenoacutew tj ketoprofenu i
flurbiprofenu Jednocześnie wytypowałam do badań dwie pochodne kwasu octowego
odgrywające znaczącą rolę w medycynie i kosmetologii tj -fenyloglicynę i kwas
migdałowy Między innymi starałam się znaleźć odpowiedź na pytanie czy wspomniana
wyżej niestabilność steryczna jest zależna od długości łańcucha węglowego
2 Inwersja chiralna kwasoacutew arylooctowych i arylopropionowych
Profeny to kwasy 2-arylopropionowe (ang 2-arylpropionic acids 2-APAs) należące do
niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych (NLPZ) szerokiej i niejednorodnej grupy lekoacutew o
działaniu przeciwzapalnym przeciwboacutelowym i przeciwgorączkowym [1] Z powodu
obecności w strukturze profenoacutew asymetrycznego atomu węgla występują one w postaci
dwoacutech optycznie czynnych enancjomeroacutew [2] Najprostszym przedstawicielem grupy
profenoacutew jest kwas 2-fenylopropionowy ktoacutery nie posiada jednak właściwości leczniczych w
żadnej z form czynnych optycznie Na rynku farmaceutycznym są one dostępne głoacutewnie w
formie racematu jedynie naproksen od samego początku jest sprzedawany w formie
enancjomeru S Uważa się że działanie terapeutyczne wykazują jedynie enancjomery o
4
konfiguracji S natomiast ich antymery R są obojętne dla organizmu Z tego powodu coraz
więcej profenoacutew zaczyna się sprzedawać w formie S [3] Wykazano natomiast iż pod
wpływem roacuteżnorakich czynnikoacutew działających in vivo a także in vitro może zachodzić
zmiana struktury przestrzennej profenoacutew z izomeru R do formy S czyli inwersja chiralna
Wiele spośroacuted kwasoacutew arylooctowych należy podobnie jak profeny do grupy
niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych Przykładowo kwas migdałowy stosuje się obecnie
w zwalczaniu zmian skoacuternych a -fenyloglicyna wchodząca w skład wielu peptydoacutew
zwiększa ich zdolności lecznicze Oba te związki charakteryzują się stosunkowo niską masą
cząsteczkową i tym że są one chiralne ndash zatem występują w postaci dwoacutech enancjomeroacutew a
co za tym idzie istnieje możliwość że ulegają konwersji chiralnej
Aktywność terapeutyczna profenoacutew polega na hamowaniu działania cyklooksygenazy
kluczowego enzymu w biosyntezie prostaglandyn (czyli grupy hormonoacutew pochodnych
kwasu arachidonowego będących regulatorami procesoacutew fizjologicznych) Enzym ten
występuje w postaci dwoacutech form izomerycznych a mianowicie COX-1 i COX-2 Pierwszy z
nich odpowiada za syntezę prostaglandyn chroniących błonę wyściełającą żołądek
zmniejszając wytwarzanie kwasu żołądkowego i regulując wydzielanie śluzu oraz prawidłowe
ukrwienie żołądka natomiast enzym COX-2 uczestniczy w procesach zapalnych i przyczynia
się do powstawania boacutelu gorączki i obrzękoacutew Bardzo ważną ścieżką w metabolizmie
kwasoacutew 2-arylopropionowych jest inwersja chiralna podczas ktoacuterej nieaktywny w stosunku
do cyklooksygenazy enancjomer R jest przekształcany w swoacutej własny antymer aktywny
wobec cyklooksygenazy
Dlaczego tylko enancjomer R a nie jego antymer ulega inwersji chiralnej Wspoacutelną
strukturalną właściwością profenoacutew jest tetraedryczna hybrydyzacja chiralnego atomu węgla
do ktoacuterego przyłączony jest łańcuch zawierający grupę arylową Stereospecyficzność może
być zaobserwowana w procesach farmakokinetycznych w ktoacuterych wykorzystywany jest
nośnik białkowy czyli receptor lub enzym Dodatkowo występują roacuteżne stosunki ilościowe
lub jakościowe ze względu na stereoselektywność procesoacutew farmakodynamicznych
Mechanizm inwersji sugeruje że enancjomer R może być aktywowany przez przekształcenie
go w adenylan (soacutel kwasu adenozynomonofosforowego) do dalszej reakcji z koenzymem A
podczas gdy adenylan powstały z S-(+)-profenu nie jest zdolny do takiej reakcji [4] Co
ciekawe hamowanie syntezy prostaglandyn przeprowadzane in vitro pokazuje iż aktywność
w tym względzie wykazuje tylko enancjomer S Jednak ta stereoselektywność działania nie
występuje in vivo z powodu jednokierunkowej metabolicznej inwersji chiralnego centrum
asymetrii z nieaktywnego izomeru R do jego antymeru S [5] Farmakokinetyka absorpcji
5
dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego
z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne
cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie
jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku
tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]
Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można
podzielić na pięć grup [8]
I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej
II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w
ogoacutele
III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej
inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
V Profeny nieulegające inwersji chiralnej
Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen
pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie
enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale
reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem
grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji
chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz
nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej
występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy
IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen
oraz karprofen
Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku
ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa
inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen
wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może
być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]
Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie
optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju
Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego
[11]
6
W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez
bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję
kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu
migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a
w szczeglności u szczuroacutew [13]
Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo
Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem
podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew
ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy
pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej
techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu
propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym
niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej
konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy
pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki
zostały przedstawione min w pracach [14-19]
Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle
pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych
farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości
marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W
szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a
dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną
rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych
Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być
brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla
szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie
bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]
7
3 Cel pracy
Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące
I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu
propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej
inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen
II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o
zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew
karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie
asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w
łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy
III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji
elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew
karboksylowych
4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie
W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych
dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in
vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-
flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej
peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach
etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny
wykonano dodatkowo test biuretowy
8
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery
flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i
odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem
S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)
Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału
enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału
dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada
[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew
ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem
krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą
składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego
użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był
oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań
L-arginina+ + S-(+)-profen
-L-arginina
+ S-(+)-profen
- (K1) (2)
L-arginina+ + R-(-)-profen
-L-arginina
+ R-(-)-profen
- (K2) (3)
gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest
warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu
We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory
S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku
objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1
Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o
stężeniu 02 mgmL-1
dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego
rozpuszczalnika
9
W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu
pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej
badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych
warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki
tego procesu przedstawiają rys 1 i 2
(a)
(b)
Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)
powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
4
konfiguracji S natomiast ich antymery R są obojętne dla organizmu Z tego powodu coraz
więcej profenoacutew zaczyna się sprzedawać w formie S [3] Wykazano natomiast iż pod
wpływem roacuteżnorakich czynnikoacutew działających in vivo a także in vitro może zachodzić
zmiana struktury przestrzennej profenoacutew z izomeru R do formy S czyli inwersja chiralna
Wiele spośroacuted kwasoacutew arylooctowych należy podobnie jak profeny do grupy
niesteroidowych lekoacutew przeciwzapalnych Przykładowo kwas migdałowy stosuje się obecnie
w zwalczaniu zmian skoacuternych a -fenyloglicyna wchodząca w skład wielu peptydoacutew
zwiększa ich zdolności lecznicze Oba te związki charakteryzują się stosunkowo niską masą
cząsteczkową i tym że są one chiralne ndash zatem występują w postaci dwoacutech enancjomeroacutew a
co za tym idzie istnieje możliwość że ulegają konwersji chiralnej
Aktywność terapeutyczna profenoacutew polega na hamowaniu działania cyklooksygenazy
kluczowego enzymu w biosyntezie prostaglandyn (czyli grupy hormonoacutew pochodnych
kwasu arachidonowego będących regulatorami procesoacutew fizjologicznych) Enzym ten
występuje w postaci dwoacutech form izomerycznych a mianowicie COX-1 i COX-2 Pierwszy z
nich odpowiada za syntezę prostaglandyn chroniących błonę wyściełającą żołądek
zmniejszając wytwarzanie kwasu żołądkowego i regulując wydzielanie śluzu oraz prawidłowe
ukrwienie żołądka natomiast enzym COX-2 uczestniczy w procesach zapalnych i przyczynia
się do powstawania boacutelu gorączki i obrzękoacutew Bardzo ważną ścieżką w metabolizmie
kwasoacutew 2-arylopropionowych jest inwersja chiralna podczas ktoacuterej nieaktywny w stosunku
do cyklooksygenazy enancjomer R jest przekształcany w swoacutej własny antymer aktywny
wobec cyklooksygenazy
Dlaczego tylko enancjomer R a nie jego antymer ulega inwersji chiralnej Wspoacutelną
strukturalną właściwością profenoacutew jest tetraedryczna hybrydyzacja chiralnego atomu węgla
do ktoacuterego przyłączony jest łańcuch zawierający grupę arylową Stereospecyficzność może
być zaobserwowana w procesach farmakokinetycznych w ktoacuterych wykorzystywany jest
nośnik białkowy czyli receptor lub enzym Dodatkowo występują roacuteżne stosunki ilościowe
lub jakościowe ze względu na stereoselektywność procesoacutew farmakodynamicznych
Mechanizm inwersji sugeruje że enancjomer R może być aktywowany przez przekształcenie
go w adenylan (soacutel kwasu adenozynomonofosforowego) do dalszej reakcji z koenzymem A
podczas gdy adenylan powstały z S-(+)-profenu nie jest zdolny do takiej reakcji [4] Co
ciekawe hamowanie syntezy prostaglandyn przeprowadzane in vitro pokazuje iż aktywność
w tym względzie wykazuje tylko enancjomer S Jednak ta stereoselektywność działania nie
występuje in vivo z powodu jednokierunkowej metabolicznej inwersji chiralnego centrum
asymetrii z nieaktywnego izomeru R do jego antymeru S [5] Farmakokinetyka absorpcji
5
dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego
z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne
cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie
jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku
tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]
Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można
podzielić na pięć grup [8]
I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej
II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w
ogoacutele
III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej
inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
V Profeny nieulegające inwersji chiralnej
Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen
pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie
enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale
reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem
grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji
chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz
nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej
występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy
IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen
oraz karprofen
Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku
ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa
inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen
wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może
być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]
Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie
optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju
Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego
[11]
6
W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez
bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję
kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu
migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a
w szczeglności u szczuroacutew [13]
Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo
Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem
podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew
ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy
pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej
techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu
propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym
niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej
konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy
pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki
zostały przedstawione min w pracach [14-19]
Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle
pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych
farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości
marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W
szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a
dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną
rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych
Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być
brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla
szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie
bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]
7
3 Cel pracy
Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące
I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu
propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej
inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen
II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o
zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew
karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie
asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w
łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy
III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji
elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew
karboksylowych
4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie
W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych
dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in
vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-
flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej
peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach
etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny
wykonano dodatkowo test biuretowy
8
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery
flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i
odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem
S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)
Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału
enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału
dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada
[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew
ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem
krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą
składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego
użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był
oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań
L-arginina+ + S-(+)-profen
-L-arginina
+ S-(+)-profen
- (K1) (2)
L-arginina+ + R-(-)-profen
-L-arginina
+ R-(-)-profen
- (K2) (3)
gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest
warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu
We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory
S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku
objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1
Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o
stężeniu 02 mgmL-1
dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego
rozpuszczalnika
9
W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu
pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej
badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych
warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki
tego procesu przedstawiają rys 1 i 2
(a)
(b)
Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)
powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
5
dystrybucji metabolizmu łączenia się z białkiem czy eliminacji może być roacuteżna dla każdego
z enancjomeroacutew szczegoacutelnie woacutewczas gdy dodatkowo weźmie się pod uwagę indywidualne
cechy każdego organizmu żywego oraz toksyczność lekoacutew [6] Kiedy inwersja chiralna nie
jest obserwowana zakłada się iż po prostu nie zachodzi lub że poprzedza ją eliminacja leku
tak jak to się dzieje w przypadku kwasu tiaprofenowego [7]
Ze względu na zasięg i kierunki zachodzenia inwersji chiralnej in vivo profeny można
podzielić na pięć grup [8]
I Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej
II Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w
ogoacutele
III Profeny ulegające jednokierunkowej inwersji chiralnej lub dwukierunkowej
inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
IV Profeny ulegające dwukierunkowej inwersji chiralnej lub nieulegające jej w ogoacutele
V Profeny nieulegające inwersji chiralnej
Grupę I reprezentują min ibuprofen fenoprofen benaksoprofen flunaksoprofen
pranoprofen i indoprofen Grupę II w ktoacuterej profeny mogą ulegać inwersji chiralnej gdzie
enancjomer R może przekształcać się w swoacutej antymer S lub nie ulegać jej wcale
reprezentują flurbiprofen suprofen oraz naproksen Jak do tej pory jedynym reprezentantem
grupy III wydaje się być ketoprofen ktoacutery charakteryzuje się tym iż może ulegać inwersji
chiralnej w jednym lub obu kierunkach a także nie ulegać jej wcale Kwas tiaprofenowy oraz
nie wykazujący właściwości leczniczych kwas 2-fenylopropionowy należą do grupy w ktoacuterej
występuje dwukierunkowa inwersja chiralna lub nie występuje ona w ogoacutele czyli do grupy
IV Grupę V czyli grupę profenoacutew nie ulegających inwersji chiralnej reprezentują pirprofen
oraz karprofen
Enzymy ktoacuterymi dysponuje grzyb Verticilium lecanii sprawiają iż w przypadku
ibuprofenu indoprofenu suprofenu flurbiprofenu i fenoprofenu zachodzi jednokierunkowa
inwersja chiralna gdzie enancjomer R przekształca się w swoacutej antymer S a tylko ketoprofen
wykazuje inwersję w odwrotnym kierunku Te wyniki sugerują iż Verticilium lecanii może
być wykorzystywany do produkcji czystych enancjomeroacutew wymienionych związkoacutew [9]
Innym rodzajem grzyba mogącego służyć do produkcji czystych enancjomeroacutew a konkretnie
optycznie czystego S-(+)-atliprofenu jest Candida rugosa [10] natomiast bakterie z rodzaju
Nocardia diaphanozonaria są wykorzystywane w syntezie kwasu R-2-fenylopropionowego
[11]
6
W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez
bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję
kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu
migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a
w szczeglności u szczuroacutew [13]
Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo
Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem
podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew
ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy
pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej
techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu
propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym
niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej
konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy
pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki
zostały przedstawione min w pracach [14-19]
Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle
pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych
farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości
marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W
szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a
dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną
rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych
Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być
brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla
szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie
bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]
7
3 Cel pracy
Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące
I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu
propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej
inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen
II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o
zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew
karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie
asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w
łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy
III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji
elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew
karboksylowych
4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie
W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych
dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in
vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-
flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej
peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach
etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny
wykonano dodatkowo test biuretowy
8
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery
flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i
odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem
S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)
Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału
enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału
dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada
[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew
ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem
krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą
składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego
użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był
oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań
L-arginina+ + S-(+)-profen
-L-arginina
+ S-(+)-profen
- (K1) (2)
L-arginina+ + R-(-)-profen
-L-arginina
+ R-(-)-profen
- (K2) (3)
gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest
warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu
We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory
S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku
objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1
Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o
stężeniu 02 mgmL-1
dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego
rozpuszczalnika
9
W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu
pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej
badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych
warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki
tego procesu przedstawiają rys 1 i 2
(a)
(b)
Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)
powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
6
W przypadku kwasu migdałowego inwersja chiralna in vivo jest powodowana przez
bakterie Pseudomonas putida Jeden z enzymoacutew tych bakterii powoduje chiralną inwersję
kwasu S-(+)-migdałowego do jego antymeru [12] Przechodzenie jednego enancjomeru kwasu
migdałowego w drugi obserwuje się roacutewnież u najliczniejszego rzędu ssakoacutew czyli gryzoni a
w szczeglności u szczuroacutew [13]
Zjawisko inwersji chiralnej in vitro nie jest tak dokładnie poznane jak inwersja in vivo
Zespoacuteł kierowany przez prof T Kowalską po raz pierwszy zetknął się z tym zagadnieniem
podczas opracowywania metod chromatograficznego rozdziału par enancjomeroacutew
ibuprofenu naproksenu i kwasu 2-fenylopropionowego Podczas badań prowadzonych przy
pomocy chromatografii cienkowarstwowej z chiralną fazą stacjonarną jako podstawowej
techniki rozdzielczej odkryto że roztwory trzech chiralnych pochodnych kwasu
propionowego sporządzone w dwoacutech rozpuszczalnikach wodnych oraz w jednym
niskocząsteczkowym rozpuszczalniku niewodnym ulegają samorzutnej oscylacyjnej
konwersji chiralnej Wyniki badań chromatograficznych zostały potwierdzone przy pomocy
pomiaroacutew polarymetrycznych oraz analiz przeprowadzonych z wykorzystaniem
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Uzyskane w ramach tych badań wyniki
zostały przedstawione min w pracach [14-19]
Zrozumienie znaczenia konformacyjnej stabilności lekoacutew chiralnych może być niezwykle
pomocne przy interpretacji danych otrzymanych z badań farmaceutycznych
farmakokinetycznych czy też farmakodynamicznych Ocena względnej wartości
marketingowej racematu czy też czystego enancjomeru jest wieloczynnikowa W
szczegoacutelności zależy ona od znaczenia i wielkości korzyści terapeutycznych i finansowych a
dodatkowo musi być ustalona dla każdej substancji leczniczej z osobna Dlatego tak ważną
rolę odgrywają w takich przypadkach badania nad inwersją chiralną lekoacutew racemicznych
Przy produkcji stereochemicznie czystych związkoacutew i racematoacutew inwersja chiralna musi być
brana pod uwagę jako kwestia rozstrzygająca i jest to wystarczającym uzasadnieniem dla
szczegoacutełowego rozważania inwersji na każdym z etapoacutew szczegoacutelnie przy produkcji i ocenie
bezpieczeństwa stosowania lekoacutew [20]
7
3 Cel pracy
Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące
I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu
propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej
inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen
II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o
zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew
karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie
asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w
łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy
III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji
elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew
karboksylowych
4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie
W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych
dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in
vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-
flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej
peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach
etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny
wykonano dodatkowo test biuretowy
8
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery
flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i
odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem
S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)
Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału
enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału
dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada
[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew
ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem
krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą
składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego
użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był
oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań
L-arginina+ + S-(+)-profen
-L-arginina
+ S-(+)-profen
- (K1) (2)
L-arginina+ + R-(-)-profen
-L-arginina
+ R-(-)-profen
- (K2) (3)
gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest
warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu
We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory
S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku
objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1
Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o
stężeniu 02 mgmL-1
dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego
rozpuszczalnika
9
W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu
pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej
badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych
warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki
tego procesu przedstawiają rys 1 i 2
(a)
(b)
Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)
powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
7
3 Cel pracy
Szczegoacutełowe cele badawcze niniejszej rozprawy doktorskiej są następujące
I Przebadanie wybranych profenoacutew jako asymetrycznych pochodnych kwasu
propionowego pod kątem ich zdolności do ulegania samorzutnej oscylacyjnej
inwersji chiralnej in vitro Do badań tych wytypowano ketoprofen i flurbiprofen
II Stwierdzenie czy i w jaki sposoacuteb długość łańcucha węglowego decyduje o
zachodzeniu samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro kwasoacutew
karboksylowych W tym celu do prowadzonych badań wytypowano odpowiednie
asymetryczne pochodne kwasu octowego czyli związki o dwoacutech atomach węgla w
łańcuchu Wytypowanymi związkami zostały -fenyloglicyna i kwas migdałowy
III Pogłębienie dotychczasowego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu reakcji
elementarnych składających się na zachodzący in vitro proces samorzutnej
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych asymetrycznych kwasoacutew
karboksylowych
4 Wyniki badań własnych i ich omoacutewienie
W niniejszym rozdziale zostaną przedstawione i omoacutewione wyniki badań własnych
dotyczących możliwości ulegania procesowi samorzutnej oscylacyjnej konwersji chiralnej in
vitro w abiotycznych roztworach etanolowo-wodnych przez S-(+)-flurbiprofen i R-(-)-
flurbiprofen a także wyniki badań związanych z możliwością zachodzenia samorzutnej
peptyzacji in vitro enancjomeroacutew i racematu -fenyloglicyny w abiotycznych roztworach
etanolowo-wodnych Wyniki te pochodzą z badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej i polarymetrii a w przypadku roztworoacutew -fenyloglicyny
wykonano dodatkowo test biuretowy
8
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery
flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i
odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem
S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)
Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału
enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału
dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada
[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew
ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem
krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą
składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego
użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był
oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań
L-arginina+ + S-(+)-profen
-L-arginina
+ S-(+)-profen
- (K1) (2)
L-arginina+ + R-(-)-profen
-L-arginina
+ R-(-)-profen
- (K2) (3)
gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest
warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu
We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory
S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku
objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1
Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o
stężeniu 02 mgmL-1
dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego
rozpuszczalnika
9
W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu
pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej
badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych
warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki
tego procesu przedstawiają rys 1 i 2
(a)
(b)
Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)
powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
8
41 Zjawisko racemizacji w układzie chromatograficznycm oraz oscylacyjne zmiany
skręcalności właściwej ([]D) S-(+)-flurbiprofenu i R-(-)-flurbiprofenu
411 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy enancjomery
flurbiprofenu ulegają konwersji chiralnej to znaczy przemianie antymeru S-(+) w R-(-) i
odwrotnie jak to przedstawiono poniższym roacutewnaniem
S-(+)-profen enol R-(-)-profen (1)
Jak do tej pory nie istnieją żadne doniesienia literaturowe na temat rozdziału
enancjomeroacutew flurbiprofenu metodą chromatografii cienkowarstwowej Warunki rozdziału
dla układu TLC były wzorowane na danych zawartych w publikacji Bhushana i Parshada
[21] ktoacuterzy jako pierwsi opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla antymeroacutew
ibuprofenu Jako fazę stacjonarną wykorzystano gotowe płytki pokryte żelem
krzemionkowym i zaimpregnowane metanolowym roztworem L-argininy Na fazę ruchomą
składał się czysty etanol plus kilka kropli lodowatego kwasu octowego Kwasu octowego
użyto do sprotonowania grupy aminowej L-argininy i dzięki temu rozdział enancjomeroacutew był
oparty na mechanizmie tworzenia par jonowych według następujących roacutewnań
L-arginina+ + S-(+)-profen
-L-arginina
+ S-(+)-profen
- (K1) (2)
L-arginina+ + R-(-)-profen
-L-arginina
+ R-(-)-profen
- (K2) (3)
gdzie K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi reakcji natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest
warunkiem rozdziału chromatograficznego dwu antymeroacutew flurbiprofenu
We wszystkich przeprowadzonych doświadczeniach użyto świeżo sporządzone roztwory
S-(+)-flurbiprofenu oraz R-(-)-flurbiprofenu w mieszaninie etanolu i wody w stosunku
objętościowym 73 o trzech roacuteżnych stężeniach roacutewnych 01 05 i 10 mgmL-1
Przygotowano roacutewnież roztwoacuter testowy tj mieszaninę racemiczną RS-(plusmn)-flurbiprofenu o
stężeniu 02 mgmL-1
dla każdego z enancjomeroacutew przy zastosowaniu tego samego
rozpuszczalnika
9
W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu
pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej
badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych
warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki
tego procesu przedstawiają rys 1 i 2
(a)
(b)
Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)
powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
9
W celu sprawdzenia czy warunki odpowiednie do rozdziału enancjomeroacutew ibuprofenu
pozwalają na rozdział enancjomeroacutew flurbiprofenu testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej
badanego związku poddano procesowi chromatografowania w wyżej wymienionych
warunkach Zastosowano dwukierunkowe rozwijanie płytek chromatograficznych Wyniki
tego procesu przedstawiają rys 1 i 2
(a)
(b)
Rys 1 Wideoskany (a) całej płytki chromatograficznej rozwijanej w dwoacutech kierunkach oraz (b)
powiększonego obszaru na ktoacuterym nastąpił rozdział antymeroacutew flurbiprofenu
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
10
(a)
(b)
Rys 2 (a) Dwuwymiarowy i (b) troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający rozdział enancjomeroacutew
flurbiprofenu Obrazy te wygenerowano przez densytometryczne skanowanie chromatogramu 30 liniami w
odstępach 1 mm
Dwie plamki widoczne na rys 1 zostały poddane analizie Pierwszym sposobem
identyfikacji plamek była densytometryczna rejestracja widm UV każdej z nich bezpośrednio
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
11
z chromatografowanej płytki Obie plamki dały identyczne widmo w ultrafiolecie Co więcej
z płytki zdrapano żel krzemionkowy z umiejscowionymi plamkami a każdą proacutebkę żelu z
osobna zalano etanolem Następnie tak przygotowane roztwory przesączono zagęszczono i
poddano analizie techniką niechiralnej HPLCndashDAD Otrzymane wyniki dla każdej z proacutebek
były takie same Maksima pikoacutew chromatograficznych odpowiadających każdej z dwoacutech
plamek posiadały ten sam czas retencji i w dodatku to samo widmo UV Można zatem
stwierdzić iż doszło do rozdziału mieszaniny racemicznej flurbiprofenu a każda z plamek
reprezentuje jeden z enancjomeroacutew
Następnym etapem eksperymentu była proacuteba określenia każdej z plamek jako
odpowiednio S-(+)- oraz R-(-)-flurbiprofenu W tym celu chromatografowano świeżo
sporządzone etanolowo-wodne roztwory każdego z nich w takich samych warunkach co
testowy roztwoacuter mieszaniny racemicznej Niestety nie udało się zidentyfikować plamek gdyż
chromatogramy otrzymane dla każdego z antymeroacutew flurbiprofenu wyglądały identycznie
jak chromatogram otrzymany dla roztworu testowego co widać na rys 3a i b ktoacutere są
praktycznie identyczne z rys 1b
(a) (b)
Rys 3 Wideoskany chromatogramoacutew uzyskanych dla (a) S-(+)-flurbiprofenu i (b) R-(-)-flurbiprofenu
Ostatnim etapem eksperymentu było wykazanie ilościowej zależności rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia proacutebki W tym celu dla każdego z enancjomeroacutew
flurbiprofenu sporządzono roztwory etanolowo-wodne o trzech roacuteżnych stężeniach o czym
wspomniano już wcześniej a następnie chromatografowano je w identyczny sposoacuteb jak
poprzednio Na rys 4 i 5 przedstawiono wyniki otrzymane jedynie dla R-(-)-flurbiprofenu
ponieważ jego antymer S-(+) zachowuje się w podanych warunkach dokładnie tak samo Jak
widać rys 4a-4c są analogiczne z rys 2a natomiast rys 5a-5c z rys 2b Wynika z nich
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
12
jednoznacznie że w miarę wzrostu początkowego stężenia czystego pojedynczego
enancjomeru profile stężeniowe i rozdzielone pasma obu składnikoacutew
zracemizowanego związku roacutewnież wzrastają
Rys 4 Duwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
Rys 5 Troacutejwymiarowy densytogram przedstawiający zależność wysokości profili stężeniowych rozdzielanych
antymeroacutew od początkowego stężenia R-(-)-flurbiprofenu roacutewnego (a) 01 mgmL-1
(b) 05 mgmL-1
i (c) 10
mgmL-1
Densytogram wygenerowany na podstawie wynikoacutew otrzymanych przez skanowanie odpowiednich
chromatogramoacutew 30 liniami w odstępach 1 mm
(a)
(b)
(c)
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
13
Wobec uzyskanych techniką chromatografii cienkowarstwowej wynikoacutew nasuwa się
pytanie o naturę chemiczną plamek skoro w badanych przypadkach rozwijano roztwory
pojedynczych czystych enancjomeroacutew flurbiprofenu Jedynym rozsądnym wytłumaczeniem
wydaje się być fakt iż każdy z dwoacutech enancjomeroacutew ulegał szybkiej racemizacji wywołanej
przez sam proces chromatografowania Jest to cenna informacja na temat łatwości z jaką
rozpatrywany profen ulega samorzutnej racemizacji jeśli znajduje się w odpowiednim
środowisku Jednocześnie wyklucza to opracowany układ TLC jako narzędzie identyfikacji i
oznaczania ilościowego poszczegoacutelnych enancjomeroacutew flurbiprofenu w konkretnych
zadaniach analitycznych
412 Polarymetria
4121 Polarymetria S-(+)-flurbiprofenu
Badanie zmian skręcalności właściwej S-(+)-flurbiprofenu było przeprowadzone w
roztworze etanolowo-wodnym w stosunku objętościowym obydwu rozpuszczalnikoacutew
roacutewnym 73 przechowywanym przez 8 dni w temperaturze 22plusmn1OC Rejestracja w sposoacuteb
nieciągły była prowadzona prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-minutowych
odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 6
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
14
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
0 25 50 75 100 125 150 175time [hours]
[]D
day 0
44
45
46
47
48
0 1 2 3 4 5 6 7
day 1
43
44
45
46
23 24 25 26 27 28 29 30 31day 2
41
42
43
44
45
45 50 55
day 5
39
40
41
42
43
116 121 126
day 6
40
41
42
43
141 146 151
day 7
40
41
42
43
44
164 169 174
Rys 6 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla S-(+)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 6 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej w przypadku S-(+)-flurbiprofenu są z
natury oscylacyjne co jest szczegoacutelnie dobrze widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na
tym rysunku oraz że długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
wskazuje na postępujący proces racemizacji S-(+)-flurbiprofenu gdyż wartości liczbowe [α]D
zmierzają do zera
Wyniki badań polarymetrycznych oraz badań przeprowadzonych techniką chiralnej
chromatografii cienkowarstwowej wyraźnie wskazują na to iż S-(+)-flurbiprofen łatwo może
ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierającym wodę
rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
15
4122 Polarymetria R-(-)-flurbiprofenu
Badania zmian skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu były przeprowadzone w trzech
seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu
w roztworze etanolowo-wodnym przechowywanym przez 9 dni w temperaturze 22plusmn1OC
były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka godzin dziennie w 10-
minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys 7
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
time [hours]
[]D
day 0
-40
-39
-38
-37
-36
0 2 4 6
day 1
-38
-37
-36
-35
-34
24 25 26 27 28 29 30 31
day 2
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
46 48 50 52 54
day 5
-22
-21
-20
-19
-18
120 122 124 126 128
day 6
-19
-18
-17
-16
144 146 148 150 152
day 7
-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8
167 169 171 173
day 8
-8
-7
-6
-5
192 193 194 195
Rys 7 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC Głoacutewny
kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany zachodzące w
wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Rys 7 pokazuje iż zmiany skręcalności właściwej R-(-)-flurbiprofenu są z natury
oscylacyjne co jest najlepiej widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku a
długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D wskazuje na postępujący
proces racemizacji R-(-)-flurbiprofenu (wartości [α]D zmierzają do zera)
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 9 godzin od chwili sporządzenia roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 8
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
16
Rys 8 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze 22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu R-(-)-flurbiprofenu w
funkcji czasu stanowi kolejny dowoacuted na to iż obserwowane zmiany mają charakter
oscylacyjny
W trzeciej serii doświadczeń skręcalność właściwa [α]D roztworoacutew R-(-)-flurbiprofenu
była mierzona w sposoacuteb nieciągły przez okres 6 godzin w dwoacutech temperaturach 9plusmn1OC i
22plusmn1OC W każdej temperaturze przeprowadzano dwa roacutewnoległe pomiary jeden dla
roztworu poddawanego działaniu ultradźwiękoacutew a drugi dla roztworu nie poddawanego temu
działaniu W żadnym z tych dwoacutech przypadkoacutew skręcalność właściwa nie pozostawała
niezmienna w czasie Przeciwnie obserwowano oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej
w trakcie całego trwania eksperymentu Amplituda tych zmian była jednakże znacznie
mniejsza w temperaturze 22plusmn1OC niż w temperaturze 9plusmn1
OC Na rys 9a i b przedstawiono
wyniki uzyskane w trzeciej serii doświadczeń
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
17
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(a)
-160
-150
-140
-130
-120
-110
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 60 120 180 240 300 360
time [min]
[]D
(b)
Rys 9 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla R-(-)-flurbiprofenu rozpuszczonego
w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 przechowywanego w temperaturze
(a) 22plusmn1degC i (b) 9plusmn1degC Wyniki dla roztworoacutew poddawanych działaniu ultradźwiękoacutew i nie poddawanych temu
działaniu przedstawiono odpowiednio przy pomocy linią przerywaną i linią ciągłą
Rejestracja zmian skręcalności właściwej w trzeciej serii prowadzonego eksperymentu
polarymetrycznego miała na celu wyeksponowanie wpływu czynnika dyfuzyjnego na
przebieg obserwowanego procesu najprawdopodobniej będącego samorzutną oscylacyjną
konwersją chiralną R-(-)-flurbiprofenu Wpływ czynnika dyfuzyjnego starano się
wyeksponować poprzez obniżenie temperatury badanego roztworu co wiąże się ze wzrostem
jego lepkości oraz przez poroacutewnanie przebiegu oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej
roztworu mieszanego przy pomocy ultradźwiękoacutew oraz roztworu niemieszanego Silny
wzrost amplitudy oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej [α]D badanych roztworoacutew
wywołany obniżeniem ich temperatury i jednoczesnym wzrostem ich lepkości wskazuje na
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
18
bardzo istotną rolę dyfuzji w badanym procesie jak to ma bardzo często miejsce w przypadku
roacuteżnych reakcji oscylacyjnych
Zastosowanie ultradźwiękoacutew do mieszania badanych roztworoacutew miało na celu
ułatwienie dyfuzji cząsteczek flurbiprofenu w tych roztworach a przez to obniżenie wpływu
czynnika dyfuzyjnego na proces konwersji chiralnej i być może częściowe stłumienie albo
nawet wyeliminowanie zjawiska oscylacyjnych zmian skręcalności właściwej Tymczasem
kształt krzywych pozwala wnioskować że mieszanie badanych proacutebek ultradźwiękami nie
wpływa znacząco na amplitudę skręcalności właściwej badanych roztworoacutew
Wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to iż R-(-)-flurbiprofen
może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim rozpuszczeniu w zawierających
wodę rozpuszczalnikach niskocząsteczkowych
Należy dodać że proces ten wykazuje stosunkowo większą dynamikę w przypadku
enancjomeru R-(-) niż enancjomeru S-(+) co jak wynika z dotychczasowych badań wydaje
się być regułą dla profenoacutew
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
19
42 Samorzutna peptyzacja in vitro -fenyloglicyny w środowisku wodnym
421 Chiralna chromatografia cienkowarstwowa
Celem niniejszych badań było eksperymentalne stwierdzenie czy L-(+)--fenyloglicyna
oraz D-(-)--fenyloglicyna ulegają konwersji chiralnej czyli przemianie enancjomeru L-(+) w
D-(-) i odwrotnie Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literaturowego i według naszej
najlepszej wiedzy wyniki prezentowane w tym rozdziale są pierwszą proacutebą separacji
enancjomeroacutew -fenyloglicyny przy pomocy chiralnej chromatografii cienkowarstwowej
Warunki rozdziału dla układu TLC zostały częściowo zaczerpnięte z publikacji Bhushana i
wspoacutełpracownikoacutew [22] ktoacuterzy opracowali warunki rozdziału chromatograficznego dla
antymeroacutew innych aminokwasoacutew np fenyloalaniny Jako fazę stacjonarną wykorzystano
gotowe płytki pokryte żelem krzemionkowym i zaimpregnowane najpierw roztworem
zawierającym jony Cu2+
a następnie roztworem L-proliny Faza ruchoma składała się z
dioksanu i wody (91 vv) W tym przypadku rozdział enancjomeroacutew aminokwasu był oparty
na mechanizmie kompleksowania schematycznie przedstawionym poniższymi roacutewnaniami
[Cu(L-Pro)2]2+
+ D-(-)--Phg [Cu(L-Pro)(D-(-)--Phg)]2+
+ L-Pro K1 (4)
[Cu(L-Pro)2]2+
+ L-(+)--Phg [Cu(L-Pro)(L-(+)--Phg)]2+
+ L-Pro K2 (5)
gdzie L-Pro to L-prolina -Phg to -fenyloglicyna K1 i K2 przedstawiają stałe roacutewnowagi
odpowiednich reakcji chelatowania natomiast nieroacutewność K1 ne K2 jest warunkiem rozdziału
chromatograficznego dwu antymeroacutew -fenyloglicyny
Rozwijanie chromatogramoacutew prowadzono w systemie jednokierunkowym w temperaturze
22plusmn1OC Do badań użyto roztworoacutew etanolo-wodnych (73 vv) czystych enancjomeroacutew oraz
racematu i skalematoacutew -fenyloglicyny sporządzonych przez zmieszanie optycznie czystych
antymeroacutew L-(+) i D-(-) w stosunkach molowych 11 075025 025075
Eksperyment chromatograficzny przynioacutesł interesujące wyniki Densytometryczne
skanowanie chromatogramoacutew L-(+)--fenyloglicyny i D-(-)--fenyloglicyny pokazało iż oba
enancjomery migrują na stosunkowo dużą odległość dając wartość wspoacutełczynnika retardacji
RF w granicach 039-042 Natomiast na densytogramie uzyskanym z mieszaniny racemicznej
pojawił się wysoki pik na linii startu oraz bardzo niewielki pik przy RF=040 Eksperyment
ten był powtarzany przez 12 dni w odstępach jednodobowych z użyciem tych samych
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
20
starzejących się roztworoacutew Jak widać z rys 10 wyniki z poszczegoacutelnych dni praktycznie nie
roacuteżnią się między sobą
Rys 10 Densytogramy pokazujące zależność położenia profili stężeniowych L-(+)--fenyloglicyny D-(-)--
fenyloglicyny i DL-(plusmn)--fenyloglicyny od czasu przechowywania odpowiednich proacutebek
Aby jeszcze silniej podkreślić zaobserwowane zjawisko wybrane chromatogramy z
poszczegoacutelnych dni eksperymentu przeskanowano wzdłuż linii startu w kierunku
prostopadłym do kierunku rozwijania co zostało przedstawione na rys 11 W ten sposoacuteb
uzyskano jeszcze bardziej poglądowy obraz tego iż racemat zostaje unieruchomiony na
starcie Dodatkowo w przypadku pierwszego dnia eksperymentu L-(+)--fenyloglicyna
zachowała się analogicznie do racematu
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
21
Rys 11 Densytogramy linii startowych dla chromatogramoacutew rozwijanych w dniach 0 1 2 i 3 eksperymentu
W celu jeszcze gruntowniejszego zademonstrowania zaobserwowanej sytuacji na jednej
płytce rozwinięto etanolowo-wodne roztwory czystej D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2)
czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej LD-(plusmn)-a-fenyloglicyny
(linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i
mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6) Uzyskane wyniki
przedstawiono na rys 12 Zaroacutewno czysta D-(-)--fenyloglicyna jak i czysta L-(+)--
fenyloglicyna migrują stosunkowo wysoko w przeciwieństwie do racemicznych i
skalemicznych roztworoacutew fenyloglicyny Przeważające ilości racematu DL-(plusmn)-a-
fenyloglicyny pozostają na linii startowej Dwa skalematy zachowują się podobnie
prawdopodobnie roacutewnomolowa ilość enancjomeru L-(+) i D-(-) tworzy oligopeptyd i
pozostaje na starcie natomiast nadmiar enancjomeru D-(-)
lub enancjomeru L-(+) migruje wzdłuż płytki
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
22
Rys 12 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla czystej
D-(-)--fenyloglicyny (linie 1 i 2) czystej L-(+)--fenyloglicyny (linie 9 i 10) mieszaniny racemicznej DL-(plusmn)-
a-fenyloglicyny (linie 3 i 4) oraz mieszaniny skalemicznej z nadmiarem antymeru L-(+) (linie 7 i 8) i mieszaniny
skalemicznej z nadmiarem antymeru D-(-) (linie 5 i 6)
Otrzymane wyniki sugerują że racemat DL-(plusmn)--fenyloglicyny ulega prawie
natychmiastowej peptyzacji ponieważ większa masa cząsteczkowa utworzonego peptydu
uniemożliwia mu opuszczenie miejsca naniesienia proacutebki
Należy uwzględnić fakt że wpływ na peptyzację mają odwadniające właściwości żelu
krzemionkowego ktoacuterym pokryta jest płytka co najprawdopodobniej ułatwia utworzenie
wiązania peptydowego miedzy kolejnymi aminokwasami
Aby zbadać wymienione właściwości żelu krzemionkowego przeprowadzono następujący
eksperyment Sporządzono 10 roztworoacutew racematoacutew DL-(plusmn)--fenyloglicyny stosując jako
rozpuszczalnik 1) wodę redestylowaną 2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv)
4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6) etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda
(64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10) etanol absolutny
Wszystkie te roztwory rozwinięto na jednej płytce chromatograficznej a uzyskane wyniki
pokazano na rys 13
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
23
Rys 13 Troacutejwymiarowy densytogram pokazujący pozycję na chromatogramie profili stężeniowych dla
racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny rozpuszczonego w następujących rozpuszczalnikach 1) woda redestylowana
2) etanol-woda (19 vv) 3) etanol-woda (28 vv) 4) etanol-woda (37 vv) 5) etanol-woda (46 vv) 6)
etanol-woda (55 vv) 7) etanol-woda (64 vv) 8) etanol-woda (73 vv) 9) etanol-woda (9505 vv) 10)
etanol absolutny
Podczas reakcji peptyzacji dochodzi do dysocjacji elektrolitycznej przy ktoacuterej niezbędna
jest woda pomimo iż z roacutewnania (6) wynika że dodawanie wody cofa polikondensację [23]
(7)
Na rys 13 można zaobserwować iż roztwoacuter zupełnie bezwodny (linia 10) oraz ten z
niewielką ilością wody (linia 9) nie wykazują zachodzenia peptyzacji ndash dowodzi tego brak
piku w miejscu naniesienia proacutebki Dodatkowo w przypadku linii 9 zadziałały odwadniające
właściwości żelu krzemionkowego
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
24
422 Test biuretowy
Aby rozważyć czy peptyzacja zachodzi tylko na stałej powierzchni żelu
krzemionkowego czy roacutewnież w roztworze wykonano test biuretowy [24] Trzy roztwory
D-(-)--fenyloglicyny L-(+)-α-fenyloglicyny i racematu DL-(plusmn)--fenyloglicyny
w rozpuszczalniku etanolo-wodnym (73 vv) po trzech dniach przechowywania zmieszano
z odczynnikiem biuretowym Wyniki przedstawiono na rys 14 W każdej z trzech proboacutewek
zaobserwowano roacuteżowo-fioletową warstwę ktoacutera jest charakterystyczna dla występowania
wiązania peptydowego w peptydach i białkach Uzyskana wydajność peptyzacji była jednak
inna w każdej z proboacutewek Najciemniejszy kolor roacuteżowo-fioletowy odpowiada racematowi
(Rys 14c) Tutaj obecność wiązań peptydowych jest największa i zmniejsza się
systematycznie przez L-(+)-α-fenyloglicynę (Rys 14b) do D-(-)--fenyloglicyny (Rys 14a)
(a)
(b)
(c)
Rys 14 Zdjęcia zawartości proboacutewek po przeprowadzeniu reakcji biuretowej w etanolowo-wodnym (73 vv)
roztworze (a) D-(-)--fenyloglicyny (b) L-(+)-α-fenyloglicyny i (c) DL-(plusmn)--fenyloglicyny po 3 dniach
przechowywania odpowiednich proboacutewek
Wynik testu biuretowego dodatkowo potwierdza osiągnięte wcześniej rezultaty
chromatograficzne Poroacutewnanie braku chromatograficznej mobilności racematu DL-(plusmn)--
fenyloglicyny z najbardziej intensywnym kolorem w proboacutewce jest przejawem prawie
natychmiastowej peptyzacji roacutewnomolowych ilości antymeroacutew Pojawienie się pikoacutew L-(+)-
α-fenyloglicyny w punkcie startowym w drugim i trzecim dniu przechowywania proacutebki (Rys
11) odzwierciedla zachodzenie peptyzacji na dużo mniejszą skalę Jest to najprawdopodobniej
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
25
wynik wstępnej inwersji chiralnej L-(+)-α-fenyloglicyny do antymeru D-(-) a następnie
peptyzacji roacutewnomolowych ilości obu antymeroacutew
423 Polarymetria
4231 Polarymetria L-(+)--fenyloglicyny
Badania zmian skręcalności właściwej L-(+)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń
W pierwszym doświadczeniu rejestrowano zmiany skręcalności właściwej L-(+)--
fenyloglicyny rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 4 dni
w temperaturze 22plusmn1OC Były one rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po
kilka godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono
na rys 15
Rys 15 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane umieszczone na rys 15 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest wyraźnie widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w
przebiegu linii głoacutewnej Długoterminowy trend zmian wartości skręcalności właściwej [α]D
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
26
wskazuje na postępujący proces racemizacji L-(+)--fenyloglicyny a nawet na całkowitą
konwersję chiralną do jej antymeru D-(-) W tym przypadku racemizacja następuje już po 20
godzinach przechowywania roztworu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszych 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 16
Rys 16 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla L-(+)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu L-(+)--fenyloglicyny w
funkcji czasu stanowi kolejny dobitny dowoacuted na to iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Rezultat pomiaroacutew polarymetrycznych dodatkowo potwierdza wyniki badań
chromatograficznych i testu biuretowego zgodnie z ktoacuterymi L-(+)--fenyloglicyna ulega
inwersji chiralnej ktoacutera w przypadku tego związku prawdopodobnie prowadzi do
samorzutnej polikondensacji
4232 Polarymetria D-(-)--fenyloglicyny
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
27
Badania zmian skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny były przeprowadzone w
dwoacutech seriach doświadczeń podobnie jak dla jego antymeru
W pierwszym doświadczeniu zmiany skręcalności właściwej D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie etanolowo-wodnej przechowywanej przez 8 dni w
temperaturze 22plusmn1OC były rejestrowane w sposoacuteb nieciągły prawie codziennie po kilka
godzin dziennie w 15-minutowych odstępach czasu Otrzymane wyniki przedstawiono na rys
17
Rys 17 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC Głoacutewny kierunek zmian jest zaznaczony linią ciągłą a wykresy w bdquookienkachrdquo obrazują zmiany
zachodzące w wybranych dniach przeprowadzanego eksperymentu
Dane zamieszczone na rys 17 pokazują iż zmiany skręcalności właściwej były z natury
oscylacyjne co jest widoczne w bdquookienkachrdquo zamieszczonych na tym rysunku i w przebiegu
linii głoacutewnej Jednak w przeciwieństwie do swojego antymeru L-(+) D-(-)--fenyloglicyna
nie ulega szybkiej racemizacji co wynika z powyższego wykresu
W drugim eksperymencie polarymetrycznym rejestrację oscylacyjnych zmian
skręcalności właściwej przeprowadzono w sposoacuteb ciągły roacutewnież w temperaturze 22plusmn1OC
przez pierwszch 5 godzin od chwili sporządzenia roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
rozpuszczalniku etanolowo-wodnym Uzyskany wynik przedstawiono na rys 18
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
28
Rys 18 Oscylacyjne zmiany skręcalności właściwej [α]D w funkcji czasu dla D-(-)--fenyloglicyny
rozpuszczonej w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda w stosunku objętościowym 73 w temperaturze
22plusmn1degC
Wynik ciągłej rejestracji zmian skręcalności właściwej roztworu D-(-)--fenyloglicyny w
funkcji czasu dodatkowo potwierdza iż zmiany te mają charakter oscylacyjny
Tak więc wyniki badań przeprowadzonych techniką chiralnej chromatografii
cienkowarstwowej oraz badań polarymetrycznych zdają się jednoznacznie wskazywać na to
iż D-(-)--fenyloglicyna może ulegać oscylacyjnej konwersji chiralnej po uprzednim
rozpuszczeniu w zawierającym wodę rozpuszczalniku niskocząsteczkowym
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
29
Najbardziej prawdopodobny mechanizm procesu chiralnej konwersji dla aminokwasoacutew
aromatycznych prowadzi przez produkt pośredni ndash enol Możemy traktować proces chiralnej
konwersji jako roacutewnoległy do procesu polikondensacji co pokazano przy pomocy poniższego
schematu
(7)
5 Wnioski
Przedstawione w niniejszym opracowaniu wyniki stanowią jedynie fragment
zrealizowanego prawie w całości celu przygotowywanej rozprawy doktorskiej W ramach
tego celu wytypowano siedem chiralnych kwasoacutew karboksylowych oraz racemat jednego z
nich Były to pochodne kwasu octowego i kwasu propionowego z grupy profenoacutew
aminokwasoacutew oraz hydroksykwasoacutew Taki wyboacuter służył zbadaniu ich zdolności do ulegania
w abiotycznych roztworach wodnych samorzutnej oscylacyjnej inwersji chiralnej in vitro
Stosując chiralną chromatografię cienkowarstwową i polarymetrię przebadano wszystkie
wytypowane związki Okazało się że w przyjętych warunkach reakcyjnych ulegają one
oscylacyjnej inwersji chiralnej co sugeruje względną powszechność rozpatrywanego procesu
Fakt ten posiada szczegoacutelnie istotne znaczenie z uwagi na szerokie zastosowanie tychże
związkoacutew jako substancji leczniczych lub ich prekursoroacutew bardzo obecnie popularnych i
ogoacutelnodostępnych
Oproacutecz znaczenia poznawczego przeprowadzone badania posiadają roacutewnież bardzo
istotne znaczenie metodyczne Znaczenie to polega min na szerokim oraz skutecznym
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
30
zastosowaniu chiralnej chromatografii cienkowarstwowej do badania mechanizmu
oscylacyjnej inwersji chiralnej wybranych kwasoacutew karboksylowych Wymienione
zastosowanie chiralnej chromatografii cienkowarstwowej zostało zapoczątkowane pracami
badawczymi prowadzonymi w zespole kierowanym przez prof T Kowalską podczas gdy
wcześniejsze badania labilności sterycznej związkoacutew chiralnych były prowadzone wyłącznie
z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) i elektroforezy kapilarnej (CE)
Dodatkowe istotne znaczenie metodyczne posiada wykorzystanie w przeprowadzonych
przeze mnie badaniach pomiaroacutew polarymetrycznych z ciągłą rejestracją skręcalności
optycznej analizowanych roztworoacutew Jakkolwiek pomiary polarymetryczne są powszechnie
stosowane w badaniach nad związkami chiralnymi i ich szeroko rozumianą reaktywnością
chemiczną to jednak ciągły pomiar zmian skręcalności optycznej w funkcji czasu jest
stosunkowo rzadko prowadzony
6 Dalsze plany badawcze
Dalsze plany badawcze w odniesieniu do niniejszej pracy doktorskiej przewidują min
zebranie dodatkowego materiału doświadczalnego (głoacutewnie przy pomocy spektroskopii
Ramana spektroskopii 13
C NMR oraz spektrometrii mas) ktoacutery pozwoliłby na pogłębienie
naszego zrozumienia szczegoacutełowego mechanizmu procesu oscylacyjnej konwersji chiralnej
badanych niskocząsteczkowych kwasoacutew karboksylowych
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
31
7 Literatura
[1] W Rhys-Williams F McCarthy J Baker Y-F Hung M J Thomason A W Lloyd G
W Hanlon Enzyme Microb Tech 22 281 (1998)
[2] K Williams R Day R Knihinicki A Duffield Biochem Pharmacol 35 3403 (1986)
[3] N M Davies J Chromatogr B 691 229 (1997)
[4] M F Landoni A Soraci Current Drug Metab 2 37 (2001)
[5] J Caldwell A J Hutt S Fournel Biochem Pharmacol 37 105 (1988)
[6] N Muller E Payan F Lapicque B Bannwarth P Netter Fundam Clin Pharmacol 4
617 (1990)
[7] N N Singh F Jamali F M Pasutto A S Russell R T Coutts K S Drader J Pharm
Sci 75 439 (1986)
[8] V Wsoacutel L Skaacutelovaacute B Szotaacutekovaacute Curr Drug Metab 5 517 (2004)
[9] M J Thomason W Rhys-Williams A W Lloyd G W Hanlon J Appl Microbiol 85
155 (1998)
[10] S Mittal S Khanna A Roy P V Bhratam H P S Chawla Enzyme Microb
Technol 36 232 (2005)
[11] K Mitsukura T Yoshida T Nagasawa Biotechnol Lett 24 1615 (2002)
[12] G L Kenyon G D Hegeman Biochemistry 9 4036 (1970)
[13] L Drummond J Caldwell H K Wilson Xenobiotica 20 159 (1990)
[14] R Piętka bdquoZastosowanie chromatografii cienkowarstwowej oraz innych
instrumentalnych technik analitycznych do badania reakcji oscylacyjnych wybranych kwasoacutew
2-arylopropionowychrdquo praca doktorska Uniwersytet Śląski Katowice 2008
[15] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska Acta Chromatogr 15 131-149 (2005)
[16] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Chromatogr Sci 43 542-548
(2005)
[17] M Sajewicz R Piętka P Kuś T Kowalska Acta Chromatogr 16 181-191 (2006)
[18] M Sajewicz R Piętka A Pieniak T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol
29 2059-2069 (2006)
[19] M Sajewicz R Piętka G Drabik T Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 29
2071-2082 (2006)
[20] I K Reddy R Mehvar bdquoChirality in Drug Design and Developmentrdquo Marcel Dekker
New York 2004
[21] R Bhushan V Parshad J Chromatogr A 721 369 (1996)
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
32
[22] R Bhushan G P Reddy S Joshi J Planar Chromatogr 7 126 (1994)
[23] PW Atkins bdquoChemia fizycznardquo PWN Warszawa 2001
[24] HC Freeman JEWL Smith and JC Taylor Acta Cryst 14 407 (1961)
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
33
8 Lista prac własnych tematycznie związana z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2185-2192 (2007)
[2] M Sajewicz M Gontarska M Wroacutebel T Kowalska J Liq Chromatogr Relat
Technol 30 2193-2208 (2007)
[3] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach Ł Wojtal G Grygierczyk T Kowalska
Acta Chromatogr 18 226-237 (2007)
[4] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska J Planar Chromatogr -
Modern TLC 21 349-353 (2008)
[5] M Sajewicz M Gontarska D Kronenbach T Kowalska Acta Chromatogr 21 151-
160 (2009)
[6] M Sajewicz R Wrzalik M Gontarska D Kronenbach M Leda IR Epstein T
Kowalska J Liq Chromatogr Relat Technol 32 1359-1372 (2009)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska M Wroacutebel R Piętka T Kowalska J
Planar Chromatogr - Modern TLC 22 241-248 (2009)
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
34
9 Lista publikacji koferencyjnych tematycznie związanych z rozprawą doktorską
[1] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
XXXI Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody badania związkoacutew
organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 4-6062007 (poster)
[2] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach T Kowalska
13th
International Symposium on Separation Sciences Strbske Pleso (Słowacja) 27-
29062007 (poster)
[3] M Sajewicz G Grygierczyk M Gontarska Ł Wojtal D Kronenbach M Leda IR
Epstein T Kowalska 1th
International Conference on Drug Design amp Discovery Dubai
(Zjednoczone Emiraty Arabskie) 4-7022008 (poster)
[4] M Sajewicz M Leda M Matlengiewicz M Gontarska D Kronenbach M Wroacutebel
A Sekuła T Kowalska IR Epstein XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne
metody badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[5] M Sajewicz M Matlengiewicz D Kronenbach M Gontarska A Noworzyn A
Ostrowska T Kowalska XXXII Sympozjum Naukowe nt Chromatograficzne metody
badania związkoacutew organicznych Katowice-Szczyrk (Polska) 3-5062009 (poster)
[6] M Sajewicz M Leda M Gontarska D Kronenbach T Kowalska IR Epstein 12th
European Symposium on Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
[7] M Sajewicz D Kronenbach M Gontarska T Kowalska 12th
European Symposium on
Organic Reactivity Haifa (Izrael) 6-11092009 (poster)
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii
35
10 Życiorys
Imię i nazwisko Monika Gontarska
Data i miejsce urodzenia 28091983 Katowice
Stan cywilny panna
Adres zamieszkania ul Wczasowa 166 40-694 Katowice
Wykształcenie
Od 2007 słuchaczka Studium Doktoranckiego przy Instytucie Fizyki
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
2002-2007 Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Mat-Fiz-Chem
kierunek chemia
Specjalność Fizykochemiczne metody w ocenie
środowiska
1998ndash2002 VII Liceum Ogoacutelnokształcące im Harcerzy Obrońcoacutew
Katowic w Katowicach
Doświadczenie zawodowe
2007 Rozpoczęcie stacjonarnych studioacutew doktoranckich na
Uniwersytecie Śląskim w Katowicach dyscyplina Chemia
2008 Przyznanie stypendium doktoranckiego w ramach projektu
bdquoUniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzyrdquo
(UPGOW) wspoacutełfinansowanego przez Unię Europejską
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (EFS)
2008 Umowa o pracę z Uniwersytetem Śląskim na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Chemii
Ogoacutelnej i Chromatografii Instytutu Chemii na Wydziale
Matematyki Fizyki i Chemii