Upload
putra-santoso-msi
View
2.531
Download
57
Embed Size (px)
DESCRIPTION
U may can use it...
Citation preview
BAHAN AJARMIKROTEKNIK HEWAN
OLEH :Dra. NETTY MARUSIN
PUTRA SANTOSO, M.Si
JURUSAN BIOLOGI FMIPA UNAND, PADANG
PENGANTAR
• Metode-metode yang dikaji adalahmetode dasar untuk pembuatan sediaanpermanen yang utuh maupun yang disayat.
• Penekanan pada metode parafin danpenggunaan zat kimia dan zat warnayang mudah didapat
Bahan ajar mikroteknik hewan
Pembuatan Sediaan Utuh
Pembuatan sediaan utuh dari sampelorganisme akan lebih sederhana daripadadengan sediaan yang disayat
Proses pembuatan sediaan utuh meliputibeberapa langkah sbb :
• Fiksasi-pencucian(jika perlu hidrasi)-pewarnaan “in toto”-diferensiasi-dehidrasi-penjernihan-ditutup
Bahan ajar mikroteknik hewan
Sediaan yang Disayat
Proses pembuatan sediaan yang disayat lebih panjangdaripada sediaan utuh
Langkah-langkah penting dalam prosedur ini sbb :
Pengambilan jaringan-fiksasi-pencucian (khusus)-dehidrasi-penjernihan-infiltrasi-penanaman-penyayatan-penempelan pada kaca objek-melarutkan parafin-hidrasi-pewarnaan-dehidrasi-penjernihan-ditutup dengan kaca penutup
Bahan ajar mikroteknik hewan
A. PROSES FIKSASI
• Bahan yang difiksasi harus segar
• tujuan pokok adalah untuk mengawetkanprotoplasma dengan seminimal mungkinuntuk terjadinya perubahan
• dapat dilakukan dengan menggunakanberbagai senyawa fiksatif sesuai sifatnya
Bahan ajar mikroteknik hewan
Sifat-sifat fiksasi yang ideal
Dapat menghentikan proses-proses metabolismedengan cepat untuk mencegah terjadinyaperubahan-perubahan postmortemDapat masuk dengan cepat kedalam jaringanMengawetkan dan mengeraskan protoplasmaTidak mengubah bentuk semulaMenambah afinitas protoplasma terhadap zat
warnaBahan ajar mikroteknik hewan
Beberapa Larutan Fiksatif
Formalin : Formalin 10 ml + Aquadest90 ml
Larutan Bouin : larutan asam pikratjenuh 75 ml + formalin pekat 20 ml + asam asetat pekat 5 ml
Bahan ajar mikroteknik hewan
Lanjutan ........
FAA (Formalin Alcohol Acetic) : Alkohol 70% 90 ml + formalin 10 ml + asam asetat pekat2 ml
Larutan Zenker : Kalium dikromat 2.5 g + HgCl2 5.0 g + Natrium sulfat 1.0 g + Aquadest 100 ml
Bahan ajar mikroteknik hewan
Fiksatif Formalin
• Paling umum dipakai di laboratorium
• Objek dapat disimpan dalam waktu tak terbatastanpa adanya kerusakan
• Objek yang telah difiksasi dalam formalin jangandicuci dengan air karena jaringan dapatmenggembung
• Setelah difiksasi langsung didehidrasi
Bahan ajar mikroteknik hewan
Fiksatif Bouin
• Juga umum dipakai di laboratorium zoologidengan perendaman sebaiknya 18-20 jam
• Larutan dicampur pada waktu akan dipaka
• i
• Setelah difiksasi objek langsung dimasukkankedalam alkohol 70% dan diganti beberapakali untuk menghilangkan kelebihan fiksatif
Bahan ajar mikroteknik hewan
Fiksatif Zenker
• Campuran zenker pada waktu akan dipakaiharus ditambah dengan 0.5 ml asam asetatglasial untuk setiap 10 ml larutan stok
• Merupakan fiksatif khusus terutama untukjaringan ikat
• Sampel direndam selama 3-12 jam dalamfiksatif
Bahan ajar mikroteknik hewan
Fiksatif FAA
• Umum dipakai untuk memfiksasi cacingintestinal terutama untuk sediaan utuh
• Jika objek akan diwarnai terlebih dahulu, masukkan kedalam alkohol 35% lalukedalam air dan selanjutnya diwarnai
• Fiksatif ini juga digunakan pada sampeltumbuhan
Bahan ajar mikroteknik hewan
Hal-Hal Penting Dalam Fiksasi
• Fiksasi yang baik adalah dasar dari kesempurnaanhasil preparat selanjutnya, sehingga harusdigunakan fiksasi yang cocok dengan sampel
• Kesegaran jaringan sangat penting untukmenjamin terbentuknya preparat yang representatif
• Volume fiksatif yang dipakai sebaiknya 50 x volume objek yang difiksasi kecuali untuk fiksatifchrom dan osmium dipakai 5-10x volume objek
Bahan ajar mikroteknik hewan
Lanjutan....
• Pencucian terhadap jaringan yang difiksasidalam formalin dan bouin dilakukan denganalkohol 50% atau 70%, jangan dalam air
• Jaringan yang difiksasi dengan osmium atauchrom dan K-dikromat perlu dicuci dengan air mengalir selama 2 kali waktu fiksasi
• Endapan merkuri klorida harus dikeluarkandari jaringan sebelum mewarnai jaringan
Bahan ajar mikroteknik hewan
Lanjutan...
• Sering setelah memakai fiksatif zenkerdidapatkan endapan coklat pada tepijaringan yang disayat
• Ini adalah akibat pencucian yang kurangsempurna setelah fiksasi
• Dapat dihilangkan dengan merendamsayatan yang telah ditempel dengan 1% HCldalam alkohol 70% selama 15-30 menit
Bahan ajar mikroteknik hewan
B. PROSES PENCUCIAN (WASHING)
Pencucian dengan air :• Dilakukan terhadap sampel yang difiksasi
dengan larutan yang mengandung K-dikromat, HgCl2, asam osmic dan cromat
• Pencucian dilakukan dengan air mengalir dandilakukan dua kali waktu fiksasi
• Dapat dilakukan juga dengan merendam dalamair dan menggantinya beberapa kali
Bahan ajar mikroteknik hewan
Pencucian Jaringan segar
• Jaringan segar sebelum difiksasi dapat dicucidengan garam normal atau larutan buffer
• larutan gara normal mencegah terjadinyaperubahan osmotik atau plasmolitik
• larutan buffer selain bersifat seperti larutangaram normal juga menjaga kesetimbanganasam-basa protoplasma
Bahan ajar mikroteknik hewan
Larutan Garam Normal (salin)• Garam NaCl : 7.5-8.0 g
• Aquadest : 1 liter
Larutan RingerUntuk hewan berdarah dingin :
• NaCl : 8.0 g KCl : 0.2 g
• CaCl2 : 0.2 g Na2CO3 : 0.2 g
• Aquadest : 1 literBahan ajar mikroteknik hewan
Larutan RingerUntuk hewan berdarah panas :
• NaCl : 9.0 g KCl : 0.42 g
• CaCl2 : 0.24 g K2CO3 : 0.20 g
• Aquadest : 1 liter
Bahan ajar mikroteknik hewan
C. PROSES DEHIDRASI
• Tujuan dehidrasi adalah mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakanmedium tertentu yang dapat mengganti ataumengisi tempat air di dalam jaringna
• Medim tersebut harus dapat bercampurdengan zat penjernih pada prosespenjernihan dan tidak boleh berlawanandengan kerja fiksatif
Bahan ajar mikroteknik hewan
Alkohol Sebagai Zat Dehidrator
• Alkohol absolut dapat bercampur dengan zat-zatpenjernih maka dehidrator yang cocok adalahalkohol bertingkat (alkohol seri)
• Konsentrasi alkohol yang digunakan bertingkatkonsentrasinya dari rendah ke tinggi
• Biasanya dimulai dari 35%-50%-70%-80%-90% dan kemudian alkohol absolut
• Terkadang alkohol 35% dapat diabaikanBahan ajar mikroteknik hewan
• Dehidrasi dari alkohol 50% sampai 80% tidakboleh berhenti dan setelah sampai di alkohol80% jaringan dapat didiamkan dan disimpansampai proses selanjutnya
• Jika dipakai fiksatif yang mengandung HgCl2 maka pada alkohol 80% atau 70% ditambahdengan iodium agar endapan HgCl2 dalamjaringan hilang
• Selain alkohol ada beberapa zat dehidrator yaitu: dioxan, n-butyl alkohol dll
Bahan ajar mikroteknik hewan
D. PROSES PENJERNIHAN
• Bahan penjernih yang umum dipakai adalahxilol, toluol, benzol dan kloroform
• Untuk objek yang tidak mengalami dehidrasitotal dipakai senyawa lain yaitu minyak cedar wood atau metyl salisilat
• Proses penjernihan dilakukan denganmerendam objek di dalam bahan penjernihselama beberapa waktu tertentu
Bahan ajar mikroteknik hewan
Lanjutan .......
• Penjernih xylol dapat menggantikan alkoholdalam waktu singkat sehingga lama penjernihanlebih cepat
• Perendaman terlalu lama (lebih 24 jam) menyebabkan jaringan keras dan rapuh
• Toluol, chloroform dan minyak cedarwoodbekerja lambat sebagai penjernih
• Benzen (benzol) sangat baik karena sedikit sekalipengkerutan, mudah masuk dalam jaringan danmudah menguap dalam inkubator parafin
Bahan ajar mikroteknik hewan
E. PROSES INFILTRASI
• Pada proses ini terjadi penggantian medium penjernih dengan medium penanaman didalam jaringan
• Untuk penaman dalam parafin, objekdipindahkan dari dalam penjernih kedalamparafin cair (dalam inkubator)
• Inkubator yang umum dipakai adalah suhu58-60 derajat celcius
Bahan ajar mikroteknik hewan
Parafin yang umum dipakai dengan titik leleh :
• 48-50 derajat celcius (soft parafin)
• 52-54 derajat celcius (parafin sedang/medium)
• 58-60 derajat celcius (hard parafin)
Hal yang perlu diperhatikan pada waktu memilihparafin adalah :
Sifat objek (keras atau lunak)Suhu kamar tempat penyayatan
Bahan ajar mikroteknik hewan
PROSES-PROSES SELANJUTNYA :
A. PENANAMAN OBJEK DALAM PARAFIN (EMBEDDING)
B. PENYAYATAN DENGAN MIKROTOM (SECTIONING)
C. PENEMPELAN SAYATAN PADA KACA OBJEK
D. PEWARNAAN (STAINING)
E. PENUTUPAN DAN PELABELAN (FINISHING)
Bahan ajar mikroteknik hewan