BIODEGRADACIÓN DE NAFTALENO POR Achromobacter sp. EN MEDIO ACUOSO

Ponente: Ubaldo Bedoya Menco

Director: Luis Oviedo Zumaque M. Sc.

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA

MONTERÍA - CÓRDOBA 2013

Contenido Introducción Marco teórico Objetivos Materiales y métodos Resultados y discusión Conclusiones Recomendaciones Bibliografía Agradecimientos

Introducción

La contaminación de suelos, aguas superficiales, subterráneas y el aire con sustancias tóxicas y peligrosas es uno de los mayores problemas ambientales que afronta el mundo de hoy. Dentro de estas, la contaminación ambiental por hidrocarburos ha tomado gran interés en los últimos años debido a los efectos de sus compuestos potencialmente nocivos para la salud humana (Kanaly and

Harayama,2000).

Muchos de los hidrocarburos que componen el petróleo están clasificados por la Agencia de Protección Ambiental estadounidense (EPA) como contaminantes ambientales prioritarios, lo que coloca este problema en un foco de atención debido a su impacto ambiental negativo.

Objetivos

GENERAL

Evaluar la capacidad de biodegradación del naftaleno por la bacteria Achromobacter s.p. en medio acuoso.

ESPECÍFICOS

Determinar la tolerancia a diferentes concentraciones del naftaleno de la especie Achromobacter s.p.

Evaluar el efecto del pH, concentración inicial y adición de salicilato en la biodegradación del naftaleno.

Determinar el porcentaje de biodegradación de naftaleno a

condiciones específicas seleccionadas.

Marco teórico

Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA´s) son compuestos químicos

formados por 2 o más anillos bencénicos en disposiciones lineales,

angulares o en racimos. Son ampliamente usados en pinturas, pesticidas y otros productos industriales (Nigam et. al., 1998)

Entre los mayores contaminantes ambientales los HPA´s son los de mayor interés debido a su fácil absorción a la materia orgánica y baja hidrosolubilidad lo que les permite acumularse en el ambiente causando efectos tóxicos, mutagénicos y carcinogénicos (Grosser et. al., 2000; Bogen et. al., 2008).

Marco teórico

La degradación de HPA´s de dos o tres anillos aromáticos (naftaleno, fluoreno y fenantreno) mediante cepas puras o consorcios se encuentra bien documentada en la literatura (Šepič et al., 2003)

Este potencial es el que se pretende explotar para beneficio del medio ambiente o de sitios contaminados llegando incluso a degradar compuestos químicos completamente a agua (H2O) y dióxido de carbono(CO2) (Daugulis y Littlejohns, 2008)

Marco teórico

Biodegradación microbiana: proceso mediante el cual los microorganismos transforman sustancias toxicas en otras menos complejas como agua y dióxido de carbono.

Biodegradación de contaminantes en el ambiente es un proceso complejo que dependen de la naturaleza y cantidad del contaminante, de las condiciones ambientales locales, y de la composición de la población microbiana nativa (Atlas, 1981; Leahy and Colwell, 1990a; Hinchee and Olfenbuttel, 1994)

Es necesario profundizar en el conocimiento de los procesos de biodegradación.

Marco teórico

El naftaleno (C10H8) es el hidrocarburo policíclico de menor tamaño y mayor solubilidad, de bajo peso molecular (128.17 g/mol) está formado por dos anillos bencénicos. Es moderadamente volátil, su punto de ebullición es de 218° C y una solubilidad en agua de 31,7 mg/L a 25° C(Preuss et al., 2003).

Se ha usado ampliamente como modelo para entender las rutas

metabólicas de degradación de los HPA´s más complejos

Marco teórico

Diversas estrategias se han implementado para mejorar la biodegradación de HPA´s, entre ellas, el uso de nutrientes como el fosforo y el nitrógeno, el uso de solventes orgánicos como el etanol y la acetona que reducen el tiempo necesario para degradar ciertos componentes (Lee et al., 2001), la adición de biosurfactantes que mejoran la biodisponibilidad de los contaminantes (Mulligan, 2005), la adición de metabolitos intermediarios como el salicilato que actúa como inductor de las enzimas de las vías de oxidación del naftaleno (Barnsley, 1975)

Materiales y métodos

MICROORGANISMO A c h r o m o b a c t e r d e n i t r i f i c a n s - Bacilo gram negativo . API 20NE :98% - Mezquida (2010)

Inoculo: 0,5 mL de suspensión con Abs 600 nm 1,0 = 6,3 x108 cel

TOLERANCIA 50 –100 –200–300–400–600–800 p.p.m. x 7 días

CINETICA

Naftaleno 50 p.p.m. - 150 r.p.m. Cada 24 h – Abs 600 nm

x duplicado

CURVA PATRÓN Diluciones a partir de sln .madre de células – Abs 600 nm 1,0

Abs. vs Biomasa

PREANALITICA

BIODEGRADACIÓN Microcosmos. pH, [naftaleno] y salicilato

0,5 mL de inóculo 6,2 – Twin 80% - Tº amb. – sin luz, agitación 150 r.p.m. 120 h. Ctrl. Abiótico.

Determinación de biomasa por Abs. a 600 nm

ANÁLISIS QUIMICO

Naftaleno residual por GC – FID – Lab. de análisis instrumental . U. Nacional, Medellín

ANALITICA

Materiales y métodos

Diseño experimental: DCA con tres factores:

3 x 2 x 2 = 12 tratamientos x triplicado = 36 u/e

Tratamiento pH Concentración de

naftaleno(ppm)

Salicilato

1 6.0 [100] Sin adición

2 7.0 [100] Sin adición

3 8.0 [100] Sin adición

4 6.0 [350] Sin adición

5 7.0 [350] Sin adición

6 8.0 [350] Sin adición

7 6.0 [100] Con adición

8 7.0 [100] Con adición

9 8.0 [100] Con adición

10 6.0 [350] Con adición

11 7.0 [350] Con adición

12 8.0 [350] Con adición

Materiales y métodos

Análisis estadístico Software Design Expert Versión 6.0.1 (Stat-Ease, Inc. Minneapolis, USA)

Análisis de Varianza - ANOVA

Hipótesis nula: no hay diferencias significativas entre los diferentes tratamientos de biodegradación de naftaleno. Hipótesis alternativa: al menos uno de los tratamientos es significativamente diferente a los demás.

Resultados

Tolerancia

Cinética de crecimiento

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0 24 48 72 96 120 144 168

ab

sorb

an

cia

60

0

tiempo (horas)

Naftaleno en

p.p.m.

Crecimiento

50 +

100 +

200 +

300 +

400 +

600 -

800 -

Resultados

y = 1,8333x + 8,3125 R² = 0,9257

8

8,5

9

9,5

10

10,5

11

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

A b s o r b a n c i a 600 nm

Bio

ma

sa

g/L

Curva patrón

Mediciones por duplicado en espectrofotómetro Genesys 20 Thermo Scientific ®

Resultados

Source Sum of squares DF Mean Square F -Value Prob > F Significance

Model 0,631 11 0,057 26,585 < 0.0001 Si

A 0,526 2 0,263 121,722 < 0.0001 Si

B 0,010 1 0,010 4,572 0.0429 No

C 0,004 1 0,004 1,653 0.2108 No

AB 0,040 2 0,020 9,183 0.0011 Si

AC 0,006 2 0,003 1,305 0.2896 No

BC 0,006 1 0,006 2,693 0.1138 No

ABC 0,041 2 0,021 9,549 0.0009 Si

Pure Error 0,052 24 0,002

Cor Total 0,683 35

Análisis de varianza

A= pH; B= concentración de naftaleno; C= Adición de salicilato

Y = 8,44 – 0,038 x A – 0,13 x A2 + 0,26 x A x B + 0,021 x A2 x B + 3,521 x 10-3 – 0,013 A2 x C + 0,034 A x B x C + 0,012 x A2 donde Y = biomasa en mg/L

Resultados

Tratamiento

Condiciones

experimentales

Biomasa*

T1 b 6.0 - 100 -Sin salic. 8,42

T2 b 7.0 - 100 - Sin salic 8,43

T3 b 8.0 - 100 - Sin salic 8,64

T4 b 6.0 - 350 - Sin salic. 8,4

T5 b 7.0 - 350 - Sin salic. 8,32

T6 b 8.0 - 350 - Sin salic. 8,63

T7 b 6.0 - 100 - Con salic. 8,36

T8 b 7.0 - 100 - Con salic. 8,34

T9 a 8.0 - 100 - Con salic. 8,7

T10 b 6.0 - 350 - Con salic. 8,43

T11 b 7.0 - 350 - Con salic 8,32

T12 b 8.0 - 350 - Con salic. 8,54

* Valores promedio por triplicado

Resultados

Efecto del pH: El pH influyó en la biodegradación de naftaleno de manera altamente significativa (P< 0.01), mostrando diferencias con las otras variables

Resultados y discusión

Se observó, que el pH al que se obtuvo la mayor cantidad de biomasa está dentro de los valores reportados en estudios anteriores de degradación de naftaleno donde se evaluaron rangos de pH entre 5.5 y 9.5 encontrando degradaciones con valores óptimos que van de 6.0 a 8.0 (Chen et al., 2006; Lin et al., 2010)

En un estudio con la bacteria Pseudomonas H0B1 se encontró que la biodegradación de naftaleno fue efectiva a pH’s entre 7.5 y 8.5 a temperaturas de 35 a 37ºC (Pathak et al., 2009) La mayoría d estudios sugieren el pH de 7,0 como optimo para la biodegradación de naftaleno, en nuestro caso un pH alcalino favoreció el crecimiento.

Resultados

Efecto de la concentración del naftaleno en la producción de biomasa. a: pH 6.0 sin salicilato, b: pH 6.0 con salicilato; c: pH 7.0 sin salicilato, d: pH 7.0 con salicilato; e: pH 8.0 sin salicilato, f: pH 8.0 con salicilato.

Resultados y discusión

Aunque el microorganismo degradó naftaleno en todas las unidades experimentales, no se observaron diferencias significativas en la biodegradación a 100 o 350 p.p.m. y solo se vio afectada a una concentración de 350 p.p.m. en presencia de salicilato, lo que podría explicarse debido a un efecto tóxico combinado entre la concentración de naftaleno y la adición de salicilato (Lin et al., 2010)

Resultados y discusión

Interacción ABC

La interacción entre estos tres factores afectó significativamente la producción de biomasa y por lo tanto la biodegradación de naftaleno (P < 0,01) .

Resultados y discusión

Efecto de la adición de salicilato en la biodegradación de naftaleno. a: 100 p.p. m. a pH 6.0; b: 350 p.p.m. a pH 6.0; c:100 p.p.m. a pH 7.0; d: 350 p.p.m. a pH 7.0; e: 100 p.p.m. a pH 8.0; f: 350 p.p.m. a pH 8.0.

Resultados y discusión

Achromobacter s.p. no fue inducido por el salicilato debido a que el microorganismo en presencia de dos fuentes de carbono experimentó un crecimiento diáuxico (Monod, 1958; Nigam et al., 1998)

Achromobacter s.p. no fue inducido por salicilato y este fue hidrolizado a gentisato como lo sugieren estudios previos (Grund et al., 1992)

Uz y col., Encontraron que Rhodococus opacus cepa M213 creció en naftaleno como única fuente de carbono en la cual el salicilato no parece ser un metabolito intermediario, lo que sugiere una vía de degradación diferente (Uz et al. 2000)

Resultados

Determinación del porcentaje de biodegradación de naftaleno en el tratamiento T9

Naftaleno residual por análisis cromatográfico: Cromatógrafo Agilent 123-5536 , columna capilar 50 um, gas Helio, 1.6 mL/min, 40 min.

Resultados y discusión

El naftaleno fue mineralizado hasta un 86,6 % dentro de las primeras 120 horas de incubación, lo que sugiere que existe actividad degradativa por Achromobacter s.p.

Estudios anteriores encontraron una degradación del 90 % a las 140 horas de incubación (San Miguel et al., 2009) y otros investigadores usando Bacillus fusiformis lograron una tasa de biodegradación del 100% en 108 horas de incubación (Lin et al., 2010)

Mycobacterium sp. cepa BB1 degradó fenantreno en un 76 % a las 130 horas de incubación (500 p.p.m.), Este valor es inferior al porcentaje encontrado en este estudio a pesar de que este compuesto es mucho mas soluble (1,22 mg/L) (Boldrin et al., 1993)

Conclusiones

Bajo condiciones controladas es posible biodegradar naftaleno en medio acuoso con altas tasas de degradación.

La bacteria nativa Achromobacter s.p. tiene potencial

biodegradador de naftaleno en medio acuoso dada su tolerancia a este tóxico.

El pH es un parámetro importante en la biodegradación de naftaleno por Achromobacter s.p. en medio acuoso.

Recomendaciones

Se recomienda hacer pruebas a escala piloto con Achromobacter s.p. en estudios de biodegradación de HPA’s para conocer la eficacia de esta alternativa en condiciones de campo.

Bibliografía

Chen, H.-J., Guo, G.-L., Tseng, D.-H., Cheng, C.-L., and Huang, S.-L. (2006) Growth factors, kinetics and biodegradation mechanism associated with Pseudomonas nitroreducens TX1 grown on octylphenol polyethoxylates. Journal of Environmental Management 80: 279-286.

Lin, C., Gan, L., and Chen, Z.-L. (2010) Biodegradation of naphthalene by strain Bacillus fusiformis (BFN). Journal of Hazardous Materials 182: 771-777.

San Miguel, V., Peinado, C., Catalina, F., and Abrusci, C. (2009) Bioremediation of naphthalene in water by< i> Sphingomonas paucimobilis</i> using new biodegradable surfactants based on poly (É›-caprolactone). International biodeterioration & biodegradation 63: 217-223.

Feijoo-Siota, L., Rosa-Dos-Santos, F., de Miguel, T., and Villa, T. (2008) Biodegradation of Naphthalene by Pseudomonas stutzeri in Marine Environments: Testing Cells Entrapment in Calcium Alginate for Use in Water Detoxification. Bioremediation Journal 12: 185-192.

Boldrin, B., Tiehm, A., and Fritzsche, C. (1993) Degradation of phenanthrene, fluorene, fluoranthene, and pyrene by a Mycobacterium sp. Applied and environmental microbiology 59: 1927-1930.

Bibliografía

Pathak, H., Kantharia, D., Malpani, A., and Madamwar, D. (2009) Naphthalene degradation by Pseudomonas sp. HOB1: In vitro studies and assessment of naphthalene degradation efficiency in simulated microcosms. Journal of Hazardous Materials 166: 1466-1473.

Nigam, P., Banat, I.M., Marchant, R., and Singh, D. (1998) Degradation of naphthalene by bacterial cultures. Environment International 24: 671-677.

Šepič, E., Bricelj, M., and Leskovšek, H. (2003) Biodegradation studies of polyaromatic hydrocarbons in aqueous media. Journal of applied microbiology 83: 561-568.

Grosser, R.J., Friedrich, M., Ward, D.M., and Inskeep, W.P. (2000) Effect of Model Sorptive Phases on Phenanthrene Biodegradation: Different Enrichment Conditions Influence Bioavailability and Selection of Phenanthrene-Degrading Isolates. Appl Environ Microbiol 66: 2695-2702.

Uz, I., Duan, Y., and Ogram, A. (2000) Characterization of the naphthalene degrading bacterium, Rhodococcus opacus M213. FEMS Microbiology Letters 185: 231-238.

Agradecimientos

Grupo Grubiodeq.

Laboratorio de análisis instrumental de la Universidad Nacional

de Colombia – Sede Medellín

Comité de la Maestría en Biotecnología

Robert Day – “Como escribir y publicar trabajos científicos” .OPS

Cada uno de los que colaboraron de alguna forma con este trabajo.