Cap 14 ing. genetica

Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla 1

Ingeniería Genética-I.G.

Microbiología General- Biol 3705


Objetivos

Al terminar de discutir este capítulo, el estudiante estará capacitado para: Mencionar vocabulario de ingeniería

genética (biotecnología, clonación, otras) Denominar técnicas de ingeniería genética

como: endonucleasas de restricción, transcriptasa inversa, electroforesis, sondas de DNA, etc.


Objetivos

Distinguirá las etapas de la recombinación del DNA, hacer una quimera

Explicará la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR)

Mencionará algunos productos obtenidos a través de rDNA

Distinguirá metodología para realizar cultivos transgénicos, plantas y animales


Introducción- I.G.

Ingeniería genética-manipulación y modificación genoma organismos

Biotecnología- desarrollo productos industriales usando organismos para nuestro beneficio Aplicacion tecnológica que usa sist. Biológicos,

para hacer o modificar productos o procesos para uso específico

DNA se aisla, maneja, y modifica Secuenciar DNA- orden de bases



Introducción- I.G.

rDNA- DNA recombinado, insertar genes en célula, modificando genéticamente organismos

clonar- insertar y propagar DNA, requiere vectores especiales


Steps in Cloning a Gene

Figure 14.1


Herramientas y Téc. De I.G.

Características DNA Sube temp. de 90-95C se desnaturaliza, si

enfria temp. vuelven a unirse las bandas por enlaces de H

DNA se corta con endonucleasas de restricción


Extraccion de DNA


Extracción de DNA

Cultivo Sonido/bolitas vidrio Vortex + fenol +calor-

romper paredes y/o capsida; + detergente- remover membrana

Proteasas-precipitar proteínas + sales

Agitar mezcla con cloroformo y fenol- DNA en medio de 2 fases

DNA precipitarlo con etanol frío (insoluble en alcohol)

Pellet DNA lavarlo con alcohol frío

Secar y colocar en buffer

Confirmar presencia en electroforesis



Endonucleasas de Restricción

Enzimas reconocen y cortan secciones palindrómicas (4-5-6-7 pares)

Se nombran por la 1a letra del género - bacteria aislada, 1as. 2 letras de la especie y núm. De endonucleasa EcoR1- G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G usado para cortar DNA en pequeñas

porciones usado para remover e insertar en DNA


Restriction Endonucleases and Their Recognition Sequences

Table 14.2


Enzima de Restricción

Enzima de restricción Bam HI

Se obtiene de Bacillus amyloliquefaciens


Endonucleasas de Restricción

No cortan DNA de donde provienen- está modificado por adición de grupos metilo (CH3 )

Cortan en “cohesive ends” o “sticky ends”- parean entre sí ej. DNA cortado con EcoR1 siempre

producirá los mismos “sticky ends” permite ‘sticky ends” se junten ( enlaces H)

al enfriar temp. no importa de donde provengan


Endonucleasas Restricción

Hay cortes que no son “sticky ends”. Se llaman “blunt ends” y es menos eficiente Ej. C-C-C G-G-G Proceso de ligación es menos eficiente que

con “sticky ends”


Eco R1


Figure 14.3


Enzima de Restricción


Otras Enzimas- I.G.

Ligasas- sellan pedazos cortados previamente por endonucleasas, sellan genes en plásmido y cromosomas

Transcriptasa inversa- usada convertir RNA en DNA; copias hechas con esta enzima se denominan- cDNA (“complimentary”)- permite sintesís DNA de r,m,t RNA sin introns (eucariotas), descubierta en 1970


Synthesis of cDNA

Figure 14.4


Recombinant DNA molecules

Jackson, Symons, and Berg (1972) generated first recombinant DNA molecules

Cohen and Boyer (1973) produced first plasmid vector capable of

being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA


Recombinant plasmid construction

Figure 14.5


Análisis DNA- Electroforesis

Proceso verificación cortes DNA sean los correctos

Electroforesis-muestras cortadas colocarlas en gel (agarosa) y se expone a campo eléctrico DNA carga -, se moverá al área + partículas más peq. se moverán más rápido visualiza con bromuro de etidio y luz uv


Electroforesis

Bandas se ven con bromuro de etidio y luz UV

Estándares permiten saber los cortes y tamaño de ellos

Permite decidir si 2 muestras son idénticas


Gel Electrophoresis

used to separate molecules based on their charge and size

agarose or acrylamide gels can be used to separate DNA fragments

DNA is acidic; it migrates from the negative to the positive end of the gel each fragment’s migration rate is inversely

proportional to the log of its molecular weight



Electroforesis


Hibridización Acidos Nucleicos y Sondas (“Probes”)

Banda de DNA puede hibridizarse con otra- permite detectar secuencias específicas de nucleótidos de muestras desconocidas

Areas de hibridización se pueden visualizar por: Marcadores radiactivos Isótopos- emiten radiación


Sondas de DNA

Sondas de DNA

DNA probe - a length of single-stranded DNA that matches part of the gene and is linked to a radioactive atom. The single-stranded probe seeks and binds to the gene. Radioactive signals from the probe are then made visible on x-ray film, showing where the probe and gene matched.

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http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene14.php

http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/index.php

http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene16.php

http://www.accessexcellence.org/ae-bin/fav_site.cgi

http://www.accessexcellence.org/RC/astronomy.php

http://www.accessexcellence.org/RC/biology.php

http://www.accessexcellence.org/RC/biotech.php

http://www.accessexcellence.org/RC/botany.php

http://www.accessexcellence.org/RC/computers.php

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http://www.accessexcellence.org/RC/microscopy.php

http://www.accessexcellence.org/RC/reference.php

http://www.accessexcellence.org/RC/debates.php

http://www.accessexcellence.org/RC/education.php


“Southern Blot”

Método donde se fragmenta DNA y separa por electroforesis, se desnaturaliza (1 hebra) e inmobiliza en un papel de filtro. Una sonda se incuba con la muestra y si halla áreas complementarias se hibridizará

Uso de sondas usadas diagnosticar infecciones e identificación de microorg. Hay kits comerciales para identificación de bacterias y virus


Southern blotting technique

developed by Edwin M. Southern (1975)

used to detect specific DNA fragments often uses radioactive DNA

hybridization probes autoradiography

method for detecting radioactively labeled molecules



Southern Blotting Technique

Figure 14.6



Métodos de Recombinación DNA

rDNA- DNA recombinado, se conoce desde 1970

Se crean clones: Remover el gen seleccionado de X organismo

(donante), cortado con endonucleasas y aislado Propagación en un hospedero diferente Gen insertado a un vector (plásmido o virus) Insertar en hospedero de clonación (bacteria o

levadura)


Características Vectores Clonación

Llevar DNA donado Aceptar hospedero de clonación Plásmidos excelentes , pequeños, fácil

de manejar- pueden transferirse por transformación

Bacteriófagos- buenos vectores, inyectan DNA a hospedro bacteriano por transducción


Cloning Vectors and Creating Recombinant DNA

there are four types of cloning vectors plasmids (most commonly used) phages and viruses cosmids artificial chromosomes


Cosmids

do not exist in nature these vectors have been constructed to

contain features from both phages and plasmids they have a selectable marker, multiple

cloning sites from plasmids and a cos site from λ phage


Artificial Chromosomes

used when large fragments of DNA must be cloned

bacterial artificial chromosomes (BACs) played important role in the human

genome project


Caract. Vectores Clonación

Vectores tienen información de resistencia a antibióticos (ampicilina, tetraciclina); lo que ayuda a usar medios selectivos y los clones recombinados sean evidentes

Hospedero de clonación deberá crecer rápido, usar medios de cultivo ordinarios, genoma conocido como E.coli , Saccharomyces , Bacillus subtilis


Vector de Clonación - Plásmido

Vector de clonación pBR322 – plásmido

Contiene genes de resistencia a antibióticos : Ampicilina Tetraciclina

Tamaño DNA = menos de 5 kb (4,363 nucleótidos)


Plasmido pBR322


Bacteriofago Lambda


Construction of a Recombinant Plasmid

Figure 14.13


Reacción de Polimerasa en Cadena- PCR

Técnica bien sensitiva, puede detectar una sola célula cancerosa

Necesita materiales: “primers”- oligonucleótidos 15-30 bases DNA polimerasa- Taq polimeras (Thermus

aquaticus) Máquina realiza ciclos: desnaturaliza a 94C,

priming-enfriar de 50 (A=T), 65C (G=C)- 3 enlaces H, extensión- 72C


The Polymerase Chain Reaction (PCR)

enables the rapid synthesis of many copies of a specific DNA fragment from a complex mixture of DNA and other cellular components

reaction mix contains primers target DNA thermostable DNA polymerase such as Taq polymerase each of the four deoxyribonucleotide triphosphates

thermocycler is the instrument used


PCR

En 20 ciclos se producen 1 millón de copias, máquina puede hacer 20 ciclos en 2-3 horas desnaturalizar “priming” extensión



Quimera

Quimera – inserción en hospedero de clonación y expresión genética

Ejemplo – Construcción Quimera 1. Se aisla gen interferón humano (500 pb y

codifica proteina de 166 amino ácidos). Se corta con endonucleasa Hind III

2. Se abre el plásmido (vector de clonación) con Hind III


Quimera – cont.

3. Permite que lados “sticky ends” de (1) y de (2) se junten por complementaridad. Enzima ligasa sellará uniones = quimera

4. Quimera se introduce por transformación en hospedero de clonación E. coli

5. Cultivo de E. coli con quimera se coloca en medio de cultivo con ampicilina; solo crecerá E. coli que tenga el plásmido ( lleva gen de R-amp). Se seleccionan colonias de la placa petri.


Quimera – cont.

6. Se cultivan colonias de E. coli transformadas

7. Se coloca (6) en medio de cultivo especial- condiciones óptimas que permita expresión del gen interferón humano por su transcripción y traducción; se sintetiza la proteina y la libera al medio de cultivo

8. Procesamiento final – purificación proteina y remoción del microorg.

9. Así se han sintetizado hormonas, enzimas, etc.


Inserting Recombinant DNA into Host Cells

most common hosts E. coli - procaryotic host S.cerevisiae – eucaryotic host

hosts are engineered to lack restriction enzymes and recA

DNA introduction into microbes transformation electroporation


Inserting Recombinant DNA into Eucaryotic Host Cells

electroporation microinjection gene gun Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens

(used to introduce foreign DNA into plant genomes)


Expression of Foreign Genes in Host Cells

cloned genes, in the new host cell, are called heterologous genes ,and may not be expressed unless they are modified recombinant gene must have a promoter that host

RNA polymerase recognizes introduced eucaryotic genes must be modified to

have a procaryotic leader sequence and all introns must be removed

expression vectors are used to overcome problems with expression of recombinant genes in host cells



Verificacion Cultivo Clonado


Construction of Genomic Libraries

used when gene of interest is on a chromosome that has not been sequenced

the library is constructed by cleaving the genome and then cloning the fragments into vectors

the libraries are screened for the genes of interest in a variety of ways


III. Productos Bioquímicos de Tecnología de DNA Recombinante

Tecnología DNA recombinante usada por compañias farmaceúticas – manufacturar medicinas contra: diabetis y enanismo Antes se usaba insulina porcina y bovina

para los diabéticos, aunque podia ocasionar reacciones alérgicas

Enanismo se trataba con hormona de crecimiento (HGH) extraída de cadáveres


The Numerous Applications of Genetic Engineering

in medicine many useful proteins gene therapy

in agriculture use of genetic engineers allows for the

direct transfer of desirable traits to agriculturally important animals and plants


Insulina rDNA

Insulina recombinada


Productos de Tec. rDNA

Hoy se produce insulina y HGH por rDNA. También se elaboran vacunas.

Otros productos


Organismos Genéticamente Modificados - GMO’s

Transfección – proceso de introducir genes extraños a un organismo

Transgénico – organismo modificado genéticamente (GMO’s) Pseudomonas fluorescens – se añadió 1

gen de Bacillus thuringiensis que codifica para la producción de un insecticida- proteina

Liberación de GMO’s regulado por EPA


GMO’s

GMO’s pueden realizar bioremediación ( degradación de sustratos contaminantes como hidrocarburos, benceno, otros)

Plantas: Uso Agrobacterium tumefaciens – transfiere

fragmento de su DNA a planta y la recombina; tiene plásmido- usarlo como vector de clonación para alterar la planta


Bioengineering of Plants

Figure 14.19


GMO’s

Animales: Genes extraños se insertan al óvulo usando

alto voltaje o microinyección Se han logrado ratones transgénicos con

enfermedades de alzheimer, fibrosis cística, etc.

Usando animales transgénicos se ha logrado: sintetizar factores de coagulación de humanos; sustancia disuelve coágulos sanguíneos


Terapia Genética

Sustituir genes defectuosos por genes funcionales usando vectores de clonación.


Terapia Genetica


Social Impact of Recombinant DNA technology

there is scientific and philosophical concern about the use of embryonic stem cells in gene therapy.

This is currently a major controversial issue in the U.S.

the production of genetically engineered food the possibility of the production of genetically

engineered organisms by bioterrorists and other issues


Referencias

www.slic2.wsu.edu:82/.../pages/Chap10.html

http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/Chap10.html

Biotecnología en Bacterias

José MoreyMisraim Vélez

Producción de vacuna recombinante



Ventajas

Desarrollo de productos médicos Antibióticos Vacunas Hormonas Productos dificiles de

obtener, en grandes cantidades

Conclusión

Los microorganismos son máquinas flexibles y fascinantes capaces de producir un vasta variedad de compuestos útiles. Podemos esperar ver muy pronto la utilización de estos en la bioremediación y la producción de nuevos metabolitos, compuestos de bioconversiones y expresión de nuevas proteínas; Nos espera un futuro brillante en la biotecnología de microorganismos.

Education

Cap 14 ing. genetica