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Determinación de células formadoras
de anticuerpos
Laboratorio de inmunología 2011
Objetivo: Poner de manifiesto en un
cultivo in vitro la existencia de
células que producen anticuerpos
en un animal inmunizado.
Célula formadora de anticuerpo
Las células plasmáticas pertenecen al sistema
inmunitario y su papel consiste en la secreción de
grandes cantidades de anticuerpos.
Se diferencian a partir de los linfocitos B gracias a
la estimulación de los linfocitos CD4+
Las células plasmáticas se originan en la médula
ósea, posteriormente se desplazan al bazo o a
los nódulos linfáticos para secretar anticuerpos
(aproximadamente 10 000 por segundo)
Célula Th
Célula B
Célula plasmáticaAnticuerpos secretados
Método de Jerne
El método de placas
hemolíticas da la idea del
número de células formadoras de
anticuerpo en una población.
Las placas hemolíticas fueron
desarrolladas por Niels Jerne, en
1963.
Estas células se denominan
células formadoras de placa
(CFP).
Demostrar, en forma experimental, la sensibilización previa de una animal frente a un antígeno, estudiando in-
vitro la capacidad de los linfocitos B para producir anticuerpos, y analizando el fenómeno de la
interacción celular requerida tanto durante la presentación del antígeno
como en el proceso de activación de la célula B por la célula T
Medida cuantitativa de las células productoras de
anticuerpo contra un antígeno.
Las placas que se obtienen directamente, representan
principalmente células que producen IgM, pues este
anticuerpo tiene una alta eficiencia hemolítica.
Para demostrar células que sintetizan IgG
(placas indirectas)
Recubrir la superficie
del eritrocito
Favorecer la unión del complemento al
complejo eritrocito- anticuerpo IgG,
añadiendo antes suero anti-IgG
Identificar distintas células, que fabriquen anticuerpos
pertenecientes a diferentes subclases, suponiendo que se
posea los antisueros apropiados.
Modificaciones de la técnica de
Jerne
Golub, Mishell y Dutton: Esta modificación emplea toxoide de difteria,
con la finalidad de obtener una mayor cantidad de anticuerpos.
Schwartz Braun: Es una prueba con bacterina, emplea E.coli muertas
por calor. Se lleva a cabo con células del bazo + E. colì viva +
agar+MEM. Se le adiciona complemento y permite la lisis
Nossal, Warner y Lewis: Inmuniza a conejo con Salmonella typhi;
emplea Células de ganglios linfáticos, Sangra al conejo a los 5 días y
un segundo conejo a los 21 días Observa una primera respuesta que
es IgM (respuesta primaria) y IgG (respuesta secundaria).
Cunningham y Szemberg: Emplea portaobjetos en lugar de placas,
no utiliza agarosa. Emplea células+GRG+MEM
Metodologí
a
0.1 mL de GRC al 10 %
Organza sobre
un vaso de
precipitados
Sacrificar.
dislocación
cervical
Extraer el bazo
La solución salina
balanceada de Hank es
un medio de cultivo
estándar utilizado para la
conservación celular.
Ph de 7.2
5 mL Sol. Hank.
Macerar
Dejar reposar
5 min.
Metodologí
a
Metodologí
a
Dilución 1:5
Sol. Hank
43°C
2 mL. agar al
0.8%
GRC
0.15 mL
S. Celular
0.1 mL
Incubar 37°C
45 min.
El anticuerpo
secretado por una
célula se difundirá
a través del agar,
reaccionara con
los eritrocitos, y
formara un
complejo
localizado,
antígeno-
anticuerpo.
1.5 mL. Suero de
cobayo
1:10
Incubar 37°C. 30 min.
Cuando se añade complemento a la capa de eritrocito-linfocito, solo aquellos
eritrocitos que han reaccionado con el anticuerpo se fijarán el complemento y se consumara su lisis, estos producen zonas
localizadas de hemolisis.
Células en el bazo
Colorante de Türk.
Solución de violeta de genciana ácido
acético.
Para conteo de leucocitos en Cámara de
Neubauer
El acido acetico contenido en la solución
hemoliza los eritrocitos y el colorante
contenido tiñe los leucocitos
Dilución 1:5
Colorante Türk
Resultados
# Promedio
de UFA
# leucocitos/0.1
mL bazo
CFA/10^6 células de bazo
1 577.33 18.9^6 30.54
2 267 16.25*10^6 164.3
3 350.33 8.85*^6 39.58
4 301.3 1.97*10^6 152.94
5 25 40.5*10^4 62.18
6 344-3 1.0 75*10^6 319.7
Referencias
