Genética molecular 1

Aplicação de marcadores moleculares na agricultura

Prof. Adjunta Adriana DantasEngenharia de Bioprocessos e BiotecnologiaUERGS, Bento Gonçalves, RS

DOGMA CENTRAL

DNA armazenaa informação

RNA transferea informação

Proteína executaa função

DNA armazenaa informação

RNA transferea informação

Proteína executaa função

genes ambiente FENÓTIPO

MARCADORES MARCAS GENES?

MARCADORES

Morfológicos Bioquímicos

Marcadores moleculares

DNA RNA

Ferramentas da Biologia Molecular

Enzima de restriçãoEnzima de restrição

DNA ligaseDNA ligase

PCR Termociclador

PCR TermocicladorEletroforese




PCR Termociclador


GENOMA

ENZIMA DE RESTRIÇÃO

fragmentos do genoma

Enzimas de restrição

M icrorganism o Enzim a Sequência Alvo

E coR IE scher ich ia co li

B acillu s am ylo liquefaciens H

H aem op h ilu s ae gyp tiu s



P rovide ncia s tuartii

S trep tococcus a lbus G

T herm us aqua tic us

Serra tia m arce sce ns

B rev ib acterium a lb id ium

B acillu s g lob ig ii

B am H I

B glI I

P stI

B alI

Sm a I

H ae I II

Taq I

Sa lI

H ind I II

H ae I I

G A A T T CC T T A A G

G G A T C CC C T A G G

A G A T C TT C T A G A

P G C G C P iP i C G C G Puy u

A A G C T TT T C G A A

C T G C A GG A C G T C

G T C G A CC A G C T G

T G G C C AA C C G G T

A G G C C T T C C G G A

C C C G G GG G G C C C

T C G AA G C T

Tabela 1. Algumas endonuclease de restrição: origem e sítios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

Clivam o DNA somente em determinadas seqüências de

nucleotídeos, normalmente curtas, 4 – 8 pares de bases.

Cada enzima reconhece um sítio de clivagem específico!!!

A clivagem do DNA –cortam o DNA em sítios específicos

DNA na célula - moléculas muito grandes

Endonucleases de restrição ou enzimas de restrição

a) Clivagem no eixo de simetria

Moléculas com extrem idades abruptas Moléculas com extrem idades coesivas

b) Clivagem simétricamente situada aoredor do eixo de simetria

...TC GA...

...AG CT...

3 ’

5 ’ 3 ’

5 ’

+

...GAA TTC...

...CTT AAG...

+3 ’

5 ’ 3 ’

5 ’

Figura 1. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restrição. As setas indicam os sítios de clivagem. As linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequência.

A separação dos fragmentos da molécula de DNA em gel de eletroforese

Características do DNA

Separação por tamanho




PCR Termociclador


CAS

CO

LAR

CA

SC

OLA

R

DNA ligase DNA ligase

Liga o cDNA em vetores apropriados

DNA vetor

Fragmento de DNA a ser clonado

Ligação catalisada pela DNA ligase

DNA recombinante

Transformação

DNA recombinante

Cromossomobacteriano

Plasmídeo de

E.coli

DNA

DNA ligase

Plasmídeo híbrido

Enzima Enzima

GCA T T ACG

TGCA TGCAACGT ACGT

TGCAACGT

TG

CA TGCA

A C

GT ACGT

Construção de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição.

Resistência aampicilina

Pstl

EcoRI Cla IHind III

BamHI

SalI

Resistênciaa tetraciclina

Origem da replicaçãodo plasmídeo

A

B

RAmp

R R

RTc

RTc

RTc

pBR322

pBR322recirculacizado

SítioHIBam

BamHI

DNA ligase

Sítio HI Bam

DNA Exógeno

BamHI

Transformação de E.coli

Plasmídeo hibrido contendoDNA Exógeno

Transformantes resistentesa ampicilina e tetraciclina

Transformantes resistentesa ampicilina mas sensívela tetraciclina

pBR322

Amp Amp

Estrutura do plasmídeo pBR322, um típico vetor de clonagem. A seta indica a direção da replicação do DNA a partir da sua origem (A). Método da inativação insercional para isolar plasmídeos contendo DNA exógeno.

A insersão do DNA exógeno no plasmídeo pBR322 causa inativação da resistência à tetraciclina, permitindo o isolamento de transformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B).

CARTUCHO DE CLONAGEM - Polylinker

Ligação com várias enzimas diferentes, vários sítios de clonagem




PCR Termociclador


Eletroforese (Michaelis, 1909)

+

—Géis

Amido

Agarose

Acrilamida

Soluções-tampões

O sentido e a velocidade de migração é determinado pelo tamanho e carga das moléculas

O princípio básico envolvido na obtenção e detecção de cada classe de marcador bioquímico ou de DNA reside no uso de eletroforese.

O termo eletroforese foi criado por Michaelis em 1909, para descrever migração de colóides sob a influência de um campo elétrico.

Seu princípio é simples: moléculas de carga negativa migram para o pólo positivo, e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo.

A eletroforese visa à separação de moléculas em função de suas cargas elétricas, de seus pesos moleculares e de suas conformações, em suportes porosos (géis) e soluções-tampões (estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo de corrente elétrica).

AGAROSE

Carregando o gel com as amostras

Revelando gel de agarose em U.V. – brometo de etídeo

Gel acrilamida

Exemplo, de caso resolvido pelo gel vertical de acrilamida corado com nitrato de prata

Sangue retirado de chapéu e jeans

S = suspeito

V- vítima

Análise DNA forense

isoenzimas

RAPD

MICROSSATÉLITES - SSR

AFLP

RFLP-PCR

cDNA+AFLP

ESTs

SNPs

Marcadores específicos (SCARs, OGMs, etc. )

Tipos de marcadores genéticos

Eletroforese de isoenzimas

* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de uma mesma enzima, apresentando função idêntica ou similar, presente num mesmo indivíduo (Markert & Moller, 1959).

Gel de Araucaria angustifolia

6PGDH -CM

MANTOVANI, 2003

Co-dominância

Isoenzimas

Fosfoglucomutase (PGM)

monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3


monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3


monoméricaalelo 1

alelo 2alelo 3

MANTOVANI, 2003

Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas

Figura 1. Zimograma de PGM de couve. Início na parte inferior, ânodo no topo.1 = Ribeirão Pires 2620 com bandas na região A e B: B, E, G, H; 2 = 1811 C, G; 3 = Roxa B, C, G, H; 4 = São Roque A, C, E, G, H; 5 = Gigante 915 C, D, F, G, H; 6 = 916 C, G, H; 7 = Crespa Piracicaba A, E, G, H; 8 = Ribeirão Pires 2446 C, G, H; 9 = Crespa Capão Bonito C, E, G; 10 = Tupi B, G, H; 11 = Jundiaí C, F, I; 12 = Mococa C, E, I; 13 = São José C, G, H; 14 = Roxa Monte Alegre A, C, F, I; 15 = Verde-Escura A, C, E, F,

Figura 2. Zimograma de PRX de couve. Início na parte inferior, ânodo no topo. 1 = Ribeirão Pires 2620 com bandas na região A: B1 Região B com banda monomórfica; 2 = 1811 B1; 3 = Roxa B1; 4 = São Roque A1 e B1; 5 = Gigante 915 A1; 6 = 916 B1; 7 = Crespa Piracicaba B1; 8 = Ribeirão Pires 2446 B1; 9 = Crespa Capão Bonito A1 e B1; 10 = Tupi B1; 11 = Jundiaí B1; 12 = Mococa B1; 13 = São José B1; 14 = Roxa Monte Alegre B1; 15 = Verde-Escura A1.

Aplicações

Análise da variabilidade genética

Reação de polimerase em cadeia (PCR)

– princípio e aplicação da técnica

Replicação do DNA

Técnica usada para amplificar uma região específica de DNA em

visando produzir quantidade de DNA suficiente

PCRDesnatura

94 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tempo

5’3’

3’5’

PCRDesnatura

94 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tempo

3’5’

5’3’

Calor

PCRDesnatura

94 oCAnela

Primers50 oC

Extende72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tempo

3’5’

5’3’5’

5’

Desnatura94 oC

PCRDesnatura

94 oCDesnatura

94 oCAnela

Primers50 oC

Extende72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tempo

30x

3’5’

5’3’

Calor

Calor

5’

5’

5’

PCRDesnatura

94 oCDesnatura

94 oCAnela

Primers50 oC

Extende72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tempo

30x

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCR

Tem

pera

tura

100

0

50

Tempo

Desnatura

94 oC

Desnatura

94 oCAnela

Primers50 oC

Extende72 oC

30x

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

Calor

Calor

PCRDesnatura

94 oCDesnatura

94 oCAnela

Primers50 oC

Extende72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tempo

30x

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Fragmento de tamanho definido

PCRDesnatura

94 oC

Denatura

94 oCAnela

Primers50 oC

Extenção72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tempo

30x

3’5’

5’3’ 5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’5’

5’

5’

DNA dobra a cada ciclo

0Ciclos

Número de ciclos

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

ATCTTGTATTCCGGCC CCTTACCGGTATACTA

TAGAACATAAGGCCGG5´

5´

5´-TAGAACATAAGGCCTA-3´

GGAATGGCCATATGAT

3´- CCTTACCGGTATACTA -5´

ATCTTGTATTCCGGAT CCTTACCGGTATACTA

TAGAACATAAGGCCTA GGAATGGCCATATGAT5´

5´

5´-TAGAACATAAGGCCTA-3

SIM

NÃO

ATCTTGTATTCCGGAT CCTTACCGGTATACTATAGAACATAAGGCCTA GGAATGGCCATATGAT5´

5´

ATCTTGTATTCCGGCC CCTTACCGGTATACTA

TAGAACATAAGGCCGG GGAATGGCCATATGAT5´5´

3´- CCTTACCGGTATACTA -5´

Como funciona MESMO??

Do que precisa???

O que imita????

Reação de PCR

Extração de DNA (Doyle e Doyle, 1987)

Amostra

Sol. extratora

pellet

1.5

1.0

0.5

0.1

1.5

1.0

0.5

0.1

1.5

1.0

0.5

0.1

1.5

1.0

0.5

Adição de CIA

1.5

1.0

0.5

Adição de CIA

1.5

1.0

0.5

Adição de CIA

1.5

1.0

0.5

0.1

Adição de etanol

1.5

1.0

0.5

0.1

Adição de etanol

Centrifugação

RNAse

Quantificação de DNA

20 50 100

Quantificação DNA (gel agarose 0,8%)

• Logo após Kary Mullis ter descoberto a Polymerase Cadeia Reação (PCR) ele percebeu que primers curtos ligariam a vários locais em um genoma e assim poderiam produzir fragmentos múltiplos

• Williams et al. (1990) desenvolveu Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) - uma técnica que utiliza 10 primers de base muito curto para gerar fragmentos de DNAs

• Fragmentos de RAPD podem ser separados e usado

como marcadores genéticos ou um tipo de impressão digital

Constatações

RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA)

A

A B

B

RAPD

DNA

Primer se liga a muitos locais no DNA

Só quando primer locais que liga em direção oposta – amplificação

RAPD

DNA

Primers encontram-se na mesma direção, amplificação NÃO acontecerá

RAPD

DNA

> 2,000 bases

DNA

Primers são separados em pouca distância, fragmento É AMPLIFICADO

100 - 1,500 bases

RAPDDominante

A1A1 A1A2 A2A2

Marcadores “dominantes”

Ind. L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8

01020304050607080910

0100100010

1001101101

0011011010

1011000101

1110111001

0101100100

1000000000

1111110111

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

L2L1

L3

L5

L6

L4

L7

L8

Marcadores “dominantes”

A1A1 A1A2 A2A2

Marcadores “co-dominantes”

O problema da “dominância”

1

2

01 02 03

1/1 1/2 2/2

1

01 02 03

1/? 1/? 2/2

1 1 0

1

2

01 02 03

1/1 1/2 2/2

1

01 02 03

1/? 1/? 2/2

1 1 0

Ind. L1

01020304050607080910

1/33/42/33/31/31/11/31/43/31/2

1

2

3

4

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

Marcadores “co-dominantes”

OQUE É IMPORTANTE?

QUAIS AS MONOMÓRFICAS?

QUAIS AS POLIMÓRFICAS?QUAIS AS SEGREGANTES?

deve ser capaz de diferenciar progenitores

deve ser reproduzido com precisão na progênie

Do ponto de vista molecular, um marcador genético (ou loco marcador) serve para identificar um local ou uma região de um cromossomo.

Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos:

alto nível de polimorfismo

estabilidade em diferentes ambientes

detectar grande número de locos não ligados

herança simples

Marcador genético é uma característica que é capaz de detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou organismos.

RAPDs

(Randomly Amplified Polymorphic DNA)

Amplificação de um segmento de DNA delimitado por dois iniciadores (ou primers, ou oligonucleotídeos), comumente com 10 pares de bases, que são complementares a dois sítios de nucleotídeos, um em cada fita do DNA, posicionados inversamente a uma distância geralmente não superior a 4kb.

Marcador molecularMarcador molecular

Todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso, (isoenzimas, proteinas, RNAm)

ou de um segmento específico de DNA (regiões expressas ou não do genoma).

TransposonsSequências de

inserçãoSatélites

Microssatélites

Minissatélites

Genoma

Repetições em tandem

Repetições dispersas

Onde moram os marcadores???

IntronsFragmentos

de genes

RAPDs

AFLPs

outros

Genes e sequências

relacionadas

DNA extragênico

DNA repetitivoDNA codificante

DNA não codificante

DNA repetitivo

GGCTATCAAAGACCTGAAGAAGCCCAGTATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAAGCATACAAATCAATTNTATCTGGCATGAATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCTCTTATCTGGCTGCCGCGATGCAGTTCTTTGAGGGATCATGTCCTGAGGACTGGACTAGCTATGGAATCCTGATAGCTCGGAAGGGAGACAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAGACGTACTGATGTGGAAGGGAATTGGGCTCTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCCTACTGTTTCAGAGCATGCATCTCTCTCTCTTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGACCCTACTGTTTCATGTGCGCTAACTGGAGTACCATACCAAATTTCAGATTCCTGGCTGGGGCTATCAAAGACCTGAAGAAGCCCAGTATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAAGCATACAAATCAATTNTATCTGGCATGAATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCTCTTATCTGGCTGCCGCGATGCAGTTCTTTGAGGGATCATGTCCTGAGGACTGGACTAGCTATGGAATCCTGATAGCTCGGAAGGGAGACAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAGACGTACTGATGTGGAAGGGAATTGGGCTCTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCCTACTGTTTCAGAGCATGCATCTCTGGTTGGCCTTCTCTTGAGTTTATATAGGTTGAGCAAAATCTCCGGGCAGAATACCGGCAATTACAAGACAAACATCGCGGATACGAATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCCCCCTTTGCAAAAATCGTAGAACATCATACTTTGATGACGACCCACAAAATGTGCGCTAACTGGAGTACCATACCAAATTTCAGATTCCTGGCTGGGGCTATCAAAGACCTGAAGAAGCCCAGTATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAAGCATACAAATCAATTNTATCTGGCATGAATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCTCTTATCTGGCTGCCGCGATGCAGTTCTTTGAGGGATCATGTC CTGAACTGTAGACTAGCTATGGAATCCTGATAGCTCGGAAGGGAGACAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAGACGTACTGATGTGGAAGGGAATTGGGCTCTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCCTACTGTTTCAGAGCATGCATCTCTGGTTGGCCTTCTCTTGAGTTTATATAGGTTGAGCAAAATCTCCGGGCAGAATACCGGCAATTACAAGACAAACATCGCGGATACGAATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCCCCCTTTGCAAAAATCGTAGAACATCATACTTTGATGACGACCCACAAAATGTGCGCTAACTGGAGTACCATACCAAA

?TACTGTTTCAGAGCATGCA

CTCTCTCTCGACCCTACTGTTTC

CTGAGGACTG

CTGAGGACTG

CTGAGGACTG

Microssatélites

Consistem de pequenas seqüências (“sequencemotif”) com 1 a 4 nucleotídeos de

comprimento, repetidas em tandem.

Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC

Dinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC

Trinucleotídeos TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC

Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC

Características

M

homozigotoheterozigoto

M

homozigotoheterozigoto

Marcador co-dominante

Marcador multialélico

Detecção de locos SSR

CACACA

GTGTGT CACACA

GTGTGT

(CA)3

(CA)3

CACACA

GTGTGT

CACACACACA

GTGTGTGTGT

(CA)3

(CA)

5

CACACACACA

GTGTGTGTGT

CACACACACA

GTGTGTGTGT(CA)

5

(CA)

5

Amostra 1 Amostra 3Amostra 2

5´

5´ 3´GTGTGTGTGT

CACACACACA GTGT

3´

Taqiniciador reverse

iniciador forward

P2 GTGTGT

5´ 3´

3´ CACACA 5´

P2

P1

P1

GTGTGTGTGT

5´ 3´

3´ CACACACACA 5´

F1

F1

5´ 3´

3´

GTGTGTGTGT

CACACACACA 5´

5´ 3´

3´

GTGTGT

CACACA 5´

Na recombinação dos alelos

Microsatélites

• SSR – Simple Sequence Repeats

– Pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos repetidos em tandem - Amplificados via PCR

– Classe de marcadores moleculares mais polimórficos

SinonimiasSinonimias

SSR (Simple Sequence Repeats);SSR (Simple Sequence Repeats);

STMS (Sequence Tagged Microsatellites);STMS (Sequence Tagged Microsatellites);

SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);

Onde são encontrados ???Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)Plantas: (AT)nMitocôndrias

MICROSSATÉLITES

Aplicações dos Microssatélites

Genetic Characterization of Active Bank of Germoplasm of Pineapple Guava (Acca Sellowiana) by transfer of markers Microsatellites of Eucalyptus spp

Karine Louise dos Santos1, Leocir José Welter1, Adriana Cibele de Mesquita Dantas1, Jean Pierre Ducroquet2 , Rubens Onofre Nodari1

1Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal, CCA/UFSC, Florianópolis, SC, Brasil

2 Estação Experimental de São Joaquim, Epagri, São Joaquim, SC, Brasil

Modelos para explicar os processos mutacionais envolvidos na formação das repetições

•Escorregões da DNA polimerase

•Crossing over desigual

Como os microsatélites são formados ?

Fita nascenteFita molde

Replicação

+1 repeat -1 repeat

Slippage

Misalignment

Se você escolheu os microssatélites como marcador molecular para o seu estudo a primeira coisa a fazer é verificar se já

existem microsatélites para a sua espécieno GenBank.

Se não, existem você terá que desenvolve-los !

SEQUENCIAMENTO

animação

Microsatélites em sequências

DNA cromossômicogene

Restrição com endonuclease(1 ou mais)

Separação por eletroforese

PCR-RFLP

animação

Alelo S-Rnases – marcador específico

Superfície

estigmática

Auto-incompatibilidade Gametofítica

Estilete

CELSO L.DE ALBUQUERQUE JUNIOR (2004)

Compatibilidade Gametofítica

CELSO L.DE ALBUQUERQUE JUNIOR (2004)

Análise das marcas específicas

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Zabeau (1993), Vos et al. (1995)

O ensaio combina a especificidade, resolução e poder de amostragem da digestão de enzimas de restrição com a velocidade e praticidade de detecção do polimorfismo via PCR

Co-amplificação específica de um grande número de fragmentos de restrição

Tipicamente 40-100 fragmentos são amplificados e detectados em gel de poliacrilamida

Esta característica também é chamada de “índice de multiplex do ensaio AFLP ”

AATTCA --------GTTA

TTAAGT---------CAAT

Pré-amplificaçãoPré-amplificação

EcoR EcoR II primer primer E-E-A

Mse Mse I I primer primer M - M - CC

5´------GAATTC --------TTAA-----3´

3´------CTTAAG---------AATT-----5´

AATTC --------T

G---------AAT

AATTC --------TTA

TTAAG---------AAT

Ligação de adaptadoresLigação de adaptadores

Mse Mse I I adaptadoradaptador

EcoR EcoR II adaptadoradaptador TATTAA

5´------GAATTC --------TTAA-----3´

3´------CTTAAG---------AATT-----5´

Mse Mse II

EcoR EcoR II

Digestão do DNADigestão do DNA

Mse Mse I I primer primer M - M - CAC

AATTCAACA -----------GTGGTTA

TTAAGTTGT------------CACCAAT

EcoR EcoR II primer primer E- E- ACA

AmplificaçãoAmplificação

Vantagem é indiscutivel

-Grande número de fragmentos

-Número de marcadores simultâneos analisados

-Facilidade e rapidez com que é realizado,

-Alta resolução e repetitivo

Desvantagem

-Discriminar o heterozigoto dos homozigotos.

(mas com exceção!)

AFLP

S C M

Progênie F1 (Santa Rosa x Chatard)

Marcas segregantes

Excelente = Saturar mapas genéticos

840 marcadores:

475 AFLPs

235 RAPDs

129 SSRs

SCARs (Sequence characterized amplified RAPD)

Desenvolvimento de um SCAR Desenvolvimento de um SCAR

1) identificação de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks de DNA com fenótipos contrastantes,

2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor (plasmideo),

3) sequenciamento do fragmento isolado,

4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os decâmeros

5) teste final (Paran e Michelmore, 1993).

Bulk resistentes

Bulk suscetíveis

Padrão de banda dos Bulks

1

2

3

4

5

P1

(Resistente)

P2

(Suscetível)

Seleção de indivíduos F1 expressando o carater de resistência

Seleção de indivíduos F1 expressando o carater de suscetibilidade

Extração de DNA Extração de DNA

Mistura equitativa de DNA

Mistura equitativa de DNA

Análise de RAPD dos indivíduos e

confirmação entre o marcador detectado

nos bulks e a expressão do carater

1

2

3

4

5

DNA de indivíduos da população que são resistentes (todos

possuem a banda 3)

DNA de indivíduos da população que são

suscetíveis (nenhum possui a banda)

Atributos

Isoenzimas

Proteínas de sementes

RFLPs

RAPDs

Microssatélites

AFLPs

Nível de Polimorfismo

baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto

Estabilidade ambiental

moderada alta alta alta alta alta

Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante Número de alelos por loco

2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2

Distribuição no genoma

regiões de cópia única

regiões de cópia única

várias ao acaso ao acaso ao acaso

Acessibilidade tecnológica

muito alta muito alta média muito alta muito baixa média

Aplicabilidade no melhoramento

rápido, baixo custo


lento, custo médio


lento, custo alto rápido, custo baixo

Identificação de genótipos

baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta

Avaliação de germoplasma

média baixa alta alta alta muito alta

Mapeamento genético

baixa muito baixa alta alta muito alta alta

Mapeamento de regiões específicas

baixa inadequado média muito alta média muito alta

Mapeamento comparativo

baixa inadequado muito alta baixa alta baixa

Genética de Autógamas

baixa baixa média alta muito alta muito alta

Genética de Alógamas

média baixa média alta muito alta muito alta

Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).

Abordagem Estratégias

Diversidade genética Alozimas

Filogenia

Fluxo gênico

Análise de paternidade

RAPD

AFLP

SSR

Limitações

Financeira

Biblioteca genômica

Amostragem

Mapeamento genético

RGAs (Resistance gene homologues)

P-loop RNBS-A

Não TIRRNBS-A

TIR

Kinase-2

W/D GLPLRNBS-D

Não TIRRNBS-D

TIR

N-terminal C-terminal

Motivos exclusivos TIR

Motivos exclusivos não TIR

Motivos TIR e não TIR

P r i m e r s S e n s e M o t i v o s S e q u e n c i a 5 ’ - 3 ” 3 9 F 1 P - l o o p ( n - t e r m i n a l ) : T C A T C A A G G A C G A G C T G A R W B N A T G M A P 1 a P - L o o p G G I A T G C C I G G I I I I G G I A A R A C I A C P 3 a G L P L A I I T Y I R I I R Y I A G I G G Y A A I C C L M 6 3 8 P - l o o p G G I G G I G T I G G I A A I A C I A C 1 F P - l o o p - G K T T G G C G G G G T G G G C A A R A C N A C N H T P 1 c P - l o o p - G K T T n o n T I R

A r a b i d o p s i s G G I C G I C C I G G I I I I G G I A A R A C I A C 3 F 2 k i n a s e G A G G T A C T T C C T G G T G C T G G A Y G A Y R T B T G 2 F n b s - 2 A A C G G C T G C A G G A T C A T G R T B A C H A C H M G O L E 1 1 2 1 P - l o o p G G W A T G G E G G W R T H G G W A A R A C H A C

P r i m e r s a n t i s e n s e M o t i v o s S e q u e n c i a 5 ’ - 3 ” P 1 b P - l o o p G G I A T G G G I G G I I I I G G I A A R A C I A C P 3 d G L P L A I I T Y I R I I R Y Y A A I G G I A G I C C R N B S - D G G R A A I A R I S H R C A R T A I V I R A A R C 1 R 1 P - l o o p C G T G C T G G G C C A G G G T N G T Y T T N C C P 3 b G L P L – n o n T I R A r a b i d o p s i s A I I T Y I R I I R Y I A G I G G I A G I C C 1 3 R 1 G L P L – C - t e r m i n a l C G G C C A A G T C G T G C A Y V A K R T C R T G C A 1 1 R 1 G L P l – C - t e r m i n a l T C A G C T T G C C G A T C C A C T Y D G G S A G B Y T O L E 1 2 2 G L P L A L A R N W Y Y T T V A R D G C V A R W G G V A R W C C

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M 39F1/1R1F G Br Bs A

2F/13R1F G Br Bs A

RGAs polimórficos

Sequenciamento e alinhamento dos motifs

Aplicações

Genes diferencialmente expressos

Biblioteca de frruto suscetívelBiblioteca de fruto resistente

Genes exclusivos de uma forma

Genes comuns

Determinando o perfil de expressão gênica e identificando genes diferencialmente expressos

• Determinação da função de um gene

• Caracterização de um estádio de desenvolvimento ou fisiológico

• Caracterização de elementos regulatórios

Por que?

Técnicas disponíveis

• Seleção diferencial e hibridização subtrativa (Sambrook et al., 1989)

• cDNA-AFLP (Bachem et al.,1996)

• Differential Display Reverse Transcription PCR - (DDRT-PCR) (Liang and Pardee., 1992)

• RFLP-coupled differential display (RC4D) (Fischer et al., 1995)

• Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) (Velculescu et al., 1995)

• Macroarrays (Chen et al., 1998)

• Microarrays (Schena et al., 1995)

ESTs (Expression Sequences Tags)

AAAAAAAAA TTTTTTTTTRT

PCRClonagem

Seqüenciamento

Extração RNAm + Oligo (dT)

cDNA

cDNA “tester“com adaptador 1 R cDNA“tester“com adaptador 2 RcDNA “Driver”

(em excesso)

1ª Hibridização

a

RNA mensageiro

Subtração

Ligação dosadaptadores

cDNA

Digestão comRsaI

a, b, c, d + e

2ª Hibridização: mistura de amostras,

adição de “Driver” desnaturado eanelamento

Preenchimento dos terminais

d

b

c

a

d

b

c

e Adição de “primers”Amplificação por PCR

a e d - nenhuma amplificação

b- b’ - nenhuma amplificação

c - amplificação linear

e - amplificação exponenciale5’

5’

3’

3’

Construção de bibliotecas Subtrativas

TesterRNA tecido A

DriverRNA tecido B

cDNA

Digestão com Dpn II

Ligação ao oligo A Ligação ao oligo B

Hibridização com excesso de Driver

PCR com a utilização de iniciadores complementares ao oligo A

Amplificação seletiva dos cDNAs derivados do Tester

Clonagem em vetores e montagem da biblioteca

(a) (b)(a) (b)

Estacas enraizadas dos porta-enxertos: (a) Marubakaido (tolerante) e (b) M9 (sensível) em Al3+

Clone Sequenciamento Sequences producing significant alignments:

e value

C5 A10 hypothetical protein [Erwinia amylovora]. 3e-13 C5 A10 putative reverse transcriptase [Cicer

arietinum] 3e-13

F6 B10 formate dehydrogenase beta-subunit [Methanococcus voltae]..

1e-10

C8 C10 Catalase 8e-11 C9 D10 class III chitinase [Sphenostylis stenocarpa]. 7e-06 D8 E10 Catalase 3e-11 G8 F10 Structural Analysis Of The Spiroplasma Virus 3e-40 E10 H10 IntI [Citrobacter freundii] 2e-13

Clone Sequenciamento Sequences producing significant alignments:

e value

C5 A10 hypothetical protein [Erwinia amylovora]. 3e-13 C5 A10 putative reverse transcriptase [Cicer

arietinum] 3e-13

F6 B10 formate dehydrogenase beta-subunit [Methanococcus voltae]..

1e-10

C8 C10 Catalase 8e-11 C9 D10 class III chitinase [Sphenostylis stenocarpa]. 7e-06 D8 E10 Catalase 3e-11 G8 F10 Structural Analysis Of The Spiroplasma Virus 3e-40 E10 H10 IntI [Citrobacter freundii] 2e-13

cDNA-AFLP

cDNA-AFLP

Vantagens:• Alta reprodutibilidade;• Poucos falso positivos;• Necessita de pequenas quantidades

iniciais de RNA.

Desvantagens:• O cDNA precisa conter o sítio de

restrição da enzima utilizada.

DDRT-PCR (Differential Display Reverse Transcription PCR)

SNPs

(Single nucleotide polymorphisms)

5’ leader Coding sequence(exons)

3’ end Poly-A

Seqüênciamento 5’Seqüênciamento 5’

Seqüênciamento 3’Seqüênciamento 3’

Polimorfismo de um único nucleotídeo

I.G. Gut, Automation in genotyping single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 17 (2001) 475–492.

detectar a variação de seqüência na janela de um alinhamento de ESTs de um mesmo gene, parcialmente

sobrepostas

SNPs - Princípio

Variações mais frequentes no genoma: 1 substituição a cada 31 pb não codificadora e a cada 124 pb em regiões codificadoras

Detecção e validação de SNPs

Princípio da genotipagem

TTACGCATAACCTATCGAATTCCATCGCATCGA1. PCR amplificação

2. Restrição do produto PCR com a enzima adequada (ex: EcoRI, GAATTC)

TAACCTATCGAATTCCATCG

C

SNP site

TAACCTATCGACTTCCATCG

Se ‘A’ está presente ocorrea restrição

Se ‘C’ está presente, não ocorrea restrição

-

+

N R -

+

N R

Análise Molecular de OGMs

Identificação Molecular

Análise de DNA- PCR- Southern Blot - Real Time PCR- Arranjos

Análise de ProteínaBaseadas em imunologia

- ELISA- Western blot- Proteoma

4. Hibridização da membrana com a sonda específica

Retirada da membrana com o DNA

Hibridização da membrana com sonda radioativa

Solução de transferência

Esponja

Gel

Membrana de Nylon

Papel para Absorção

3. Transferência do DNA para a membrana de nylon (Blotting)

2. Eletroforese DNA em Gelde Agarose

5. Revelação do autoradiograma

Retirada das hibridizações

não específicas

1. Digestão do DNA com enzimas de restrição

Southern Blot

Análise Molecular

Digestão com EcoRI e hibridação com sonda específica para

sarcotoxin IA

PCR

Southern blot

Análise do fenótipo

Sintoma aos 25 dias após inoculação (104 CFU/ml)

stx-5Controle

Western blot

Real Time PCR

Resultados após amplificação

Análise da Expressão de Genes

Arranjos de DNA

Aumento do número de genes

chips de DNA

diferentes seqüências para detectar genes expressos ou

introduzidos em plantas

BibliotecaEstoque de bactéria

em glicerol (96 ou 384-well )

Amplificação de PCRDiretamente do estoque Usando iniciadores SP6-T7 em placas 96-well

Mantagem em placas 384-well

Gotas em matrizesSobre lâminas devidro

Impressão do chip DNA

Proteoma

Levantamento quantitativo de proteínas/peptídeos em uma amostra para identificar mudanças de interesse

Proteoma GenomaProteínas e peptídeos

Dinâmico

Células e tecido específicos

DNA

Estático

Orgão específico

Separação e preparo de amostraSeparação e preparo de amostra

Digestão - tripsina

Peptídeo

Separação

Education

Genética molecular 1