GENÉTICA MOLECULAR DE EUCARIONTES

SÍNTESIS DEL DNA

La capacidad de reproducirse es fundamental para todas las especies

Organismos-reproducción, células-división celular, material genético-duplicación). En DNA es un proceso de duplicación

Moléculas DNA = material genético (contiene información para su propia duplicación, pero carece de la capacidad para ejecutar la actividad por sí misma)

Duplicación del DNA

Watson y Crick (1953)

Formulan estructura del DNA. Modelo de doble hélice (naturaleza antiparalela)

Reglas de apareamiento de las bases (A-T, G-C)

Las dos cadenas de DNA son complementarias cada cadena puede servir como templado o plantilla para construir la otra cadena

Propuesta de duplicación (H-H mantienen unida la doble cadena, débiles, duplicación = separación de la doble cadena = zipper semiconservadora

5’ 3’

Cada célula hija recibe una mitad de la estructura original

Una célula hija sólo contiene la doble cadena conservada en su totalidad y la otra cél. hija sólo contiene DNA recién sintetizado

Las células hijas contienen dobles cadenas ambas compuestas de fragmentos DNA viejo y nuevo

DNA 14 N ligeroDNA 14 N 15 N híbrido

DNA 15 N pesado

La duplicación del DNA es de una manera semiconservadora. Cuando las cadenas progenitoras se separan, cada una sirve como templado para hacer una nueva cadena complementaria.

Experimento de Meselson-Stahl: Crecen E. coli en medio rico con 15N (Marca DNA con 15N, más denso)

Cambian bact. a medio normal con 14N por diferentes tiempos DNA

Someten DNA a ultracentrifugación en un gradiente de CsCl

Duplicación de células bacterianas: Bifurcación de la duplicación y duplicación bidireccional

• Naturaleza circular de cromosomas bacterianos

• Patrón de duplicación con estructura theta (): 3 DNA, uno es la porción no duplicada, los otros dos moléculas hijas en proceso de formación

•La duplicación comienza en un sitio específico = origen Corresponde a un sitio donde se abre la doble cadena y se incorporan nucleótidos a las cadenas nuevas (unión de proteínas), alejándose del origen y en ambas direcciones (bidireccional). Donde se encuentran, es el punto donde la duplicación concluye.

• Bifurcaciones de duplicación: puntos donde se unen el par de segmentos duplicados con los no duplicados.

ORIGEN

PROPIEDADES DE LAS DNA POLIMERASAS Enzimas que construyen nuevas cadenas de DNA

Requiere DNA y cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótido (dTTP, dATP, dCTP y dGTP)

Requiere una cadena plantilla de DNA y una cadena iniciadora (a la cual pueda añadir nucléotidos)

Las DNA polimerasas sólo añaden nucleótidos al extremo 3’de la cadena (cadena iniciadora)

Sólo es capaz de sintetizar DNA de 5’ 3’

Se desplazan a lo largo de una sola cadena de DNA leyendo cada nucleótido de la plantilla e incorporando un nucleótido complementario sobre el extremo de la cadena que se ensambla

E de Kornberg (DNA pol I). DNA pol II y III (400: 40:10 copias/cél)

DNA pol III es principal en incorporar más nucleótidos en la duplicación

*Cómo se inicia la DUPLICACIÓN de una nueva cadena?

Duplicación Semidiscontinua Crecimiento de la nueva cadena

(polimerización) 5’3’ (incorporación de nucleótidos en 3’)

Una cadena crece hacia la bifurcación de la duplicación y la otra crece alejándose

Conforme la cadena se va abriendo, se exponen nuevas regiones de DNA para replicar

La única forma de replicar el DNA de la nueva región (c. aleja) es reiniciando la síntesis en la bifurcación, esto ocurre una y otra vez (piezas cortas de DNA = fragmentos de Okazaki, eventualmente se unen por DNA ligasa) duplicación del DNA es semidiscontinua. Una cadena se replica continuamente (cadena adelantada) en dirección de la bifurcación y la otra discontinuamente en dirección opuesta (cadena retrasada)* Cómo i, no hay 3’?

RNA polimerasa (primasa) construye un primer (peq pieza de RNA que proporciona el extremo libre necesario para que inicie la replicación del DNA) = iniciador corto que se extiende por la acción de la DNA pol y que permite iniciar la síntesis de los fragmentos de Okazaki

Se eliminan los iniciadores de RNA, se rellena con DNA y se sella

DNA girasa (topoisomerasa) “eslabón giratorio” desdobla ambas cadenas de DNA liberando tensión durante la duplicación

Helicasa: desenrolla la doble cadena de DNA rompiendo los H-H (ATP). Varias. Relacionada con primasa (primosoma)

Proteínas enlazadoras de cadena sencilla de DNA: sólo se unen a DNA de cadena sencilla, lo mantienen extendido evitando que se enrrolle nuevamente

Estructura y función de las DNA polimerasas (procariotas)

Polimerización de la cadena de DNA

DNA polimerasa III (replicasa):

9 subunidades dif: subunidad catalítica, (, , , , , ’, , )

Subunidad (no catalítica):mantiene asocia a la E con el DNA, desplazamiento (pinzas deslizantes)

DNA polimerasa II: reparación

DNA polimerasa I:

Reparación del DNA

Elimina iniciadores de RNA (5’-Okazaki)

Actividad de exonucleasa: descompone ác. nucléicos (eliminando nucléotidos teminales o en extremos). DNA/RNA. Exonucleasas 5’ 3’ y 3’ 5’, DNA pol I.

Control de la fidelidad de la duplicación

- Un error durante la duplicación produce una mutación (selección de nt incorrecto 105-106 nt incorporados) *Cómo se mantiene baja la tasa de mutaciones?

3’ 5’

Interacción de la maquinaria de duplicación con la actividad de Exonucleasa 3’ 5’- En incorporación de nt erróneo

- Se detiene pol III para dar t

- Actúa Exo 3’ 5’

- Elimina 99 % errores (tasa 10-8)

Fragmentos Klenow: contienen regiones de la polimerasa y exonucleasa

Diferencias en la duplicación de eucariotas y procariotas:

• Mecanismos similares

• Proteínas semejantes

• Cinco DNA polimerasas eucariotas: -relacionada con primasa, -reparación del DNA, -como ligasa, -duplica DNA mitocondrial y -duplicación del DNA nuclear

• Alargamiento de DNA 5’ 3’

• Ninguna síntesis i sin iniciador

• DNA pol’s tienen act. exonucleasa 3’5’ alta fidelidad de la duplicación

• A dif. de procariortes (en un solo sitio), en eucariotas duplicación i simultaneamente en muchos sitios del cromosoma *(Replicones = peq. porciones replicadas).

-Talasemia: Hb anormal

Locus del gen de b-globina

•Maquinaria de replicación localizada en sitios llamados loci

• Se activan en la fase S del ciclo celular. Se duplica una sola vez durante cc Mec. de restricción de la replicación

• Regulación de la replicación: estado de compactación (+ compactas = heterocromatina, últimas. Eucromatina replicación temprana)

•Qué pasa después de la duplicación del DNA? DNA nuevo se asocia rápidamente al nucleosoma (DNA-histonas)

REPARACIÓN DEL DNA

• DNA, molécula muy susceptible al daño ambiental (radiación ionizante lo rompe, comp. químicos alteran su estructura, UV genera dímeros de timina) lesiones, si no se reparan generan mutación pasa de una generación a otra (impiden transcripción, duplicación, conducen inf. maligna, acelerar envejecimiento de un organismo)

• Consecuencias drásticas. Para evitar una alta frecuencia de lesiones o mutaciones Sistemas de reparación del DNA (procariotes y eucariotes). Tres principales sistemas de reparación de DNA:

Reparación por escisión de nucleótidos (REN): Elimina una parte de la cadena de DNA (nucleótidos = varias bases) que contiene la lesión

Dos vías: “preferencial” (repara genes que se transcriben activamente), otra (corrige el resto del genoma)

Reparación por escisión de bases (REB): Elimina las bases alteradas que provocan deformaciones menores en la hélice del DNA

DNA glucosilasa (uracilo DNA glucosilasa= muy conservada) elimina la base por desdoblamiento del enlace glucosídico que la sostiene al azucar. Varias, específicas para el tipo de base

El fosfato de ribosa decapitado se elimina por una endonucleasa

Fosfodiesterasa amplía la abertura

DNA pol III llena

DNA ligasa sella

U

C

C

Reparación de inserciones erróneas: eliminan bases no coincidentes (distorsión geométrica), insertadas por la DNA polimerasa, que escaparon a la acción de endonucleasas

• Puesto que en muchos eucariotes no hay metilación del DNA se cree que existe otro mecanismo

Deficiencias en la REN en el humano:- Xeroderma pigmentosa: enf. genética recesiva, deficiente sistema de reparación del DNA, incapaz de eliminar segmentos de DNA dañados por UV (persona hipersensible a la luz solar) riesgo de cáncer cutáneo

- Síndrome de Cockayne (SC): trastorno hereditario, sensibilidad a luz, disfunción neurológica (desmielinización de las neuronas), anormalides del desarrollo. Problema en la vía preferencial de reparación del DNA de transcripción activa

- Escisión normal: no todas las lesiones se corrigen probabilidad de cáncer cutáneo: cél. basales y escamosas (comunes, en cél. de la piel, no se propaga), melanoma maligno (mortal, en cél. pigmentadas = lunar, en aumento, más riesgo piel blanca)

RECOMBINACIÓN GENÉTICA: Los organismos frecuentemente tienen combinaciones de alelos (par de genes del padre y madre que pueden ser iguales o no)

Puede ocurrir por entrecruzamiento: Recombinación genética (revolver genes): Reordenamiento al azar de los genes sobre los cromosomas disrupción de uniones. Ocurre durante la meiosis como resultado de la separación y reunión de segmentos de cromosomas homólogos.

Nuevas combinaciones pueden permitir adaptación

Proceso importante en la reparación del DNA

Recombinación puede ser de tres tipos:

1.- Recombinación homóloga: más común, depende de grandes sec. similares entre DNA participantes (homólogas), ocurre en meiosis.

2.- Recombinación sitio específica: depende de pequeñas sec. similares entre los DNAs e involucra las mismas regiones

3.- Transposición: el mov. de elementos de DNA de un locus a otro requiere sec. similares entre los DNAs (recombinación ilegítima)