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Técnicas de estudio de las células
1. Microscopía
Biología II Enero 2009
Técnicas de estudio de las células
1. Microscopía1.1 Óptica1.2 Flourescencia1.3 Contraste de Fases1.4 Confocal1.5 Microscopía electrónica (TEM y SEM)
Biología II Enero 2009
Qué es Microscopía?
La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. En este campo ha habido gran impulso por parte de la física.Biología II Enero 2009
Tamaño relativo de células
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1.1 Microscopía Óptica
Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas que nos permiten observar objetos de puequeño tamaño. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek.Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces.
Elementos de un microscopio básico: (1) ocular, (2) revólver, (3) objetivo, (4) mecanismo de enfoque, (5) tornillo de enfoque fino, (6) platina, (7) espejo, (8) condensador.
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Principio de funcionamiento Las lentes de un microscopio óptico son el
condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse
sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso.
El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular.
En el ocular se realiza el aumento final. Biología II Enero 2009
Aumento y resolución
Es importante recordar que un microscopio, aparte de tener la capacidad de dar AUMENTO al tamaño de la imagen de la muestra, también tiene PODER RESOLUTIVO, esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos.
Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras.
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Microscopio óptico de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen.
El objeto iluminado dipersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada.
Las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partículas se ven brillantes.
Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.
También es bastante utilizado en la observación de muestras metalográficas para la observación de detalles en superficies con alta reflectancia.
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1.2 Microscopía de Fluorescencia
El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio óptico, dotado de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda.La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda.Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo.Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.
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Diagrama de Microscopio de Fluorescencia
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1.3 Microscopio de contraste de fases
Es un microscopio óptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad.
Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminación de tal manera que vaya en diferentes rutas a través de las distintas partes de una célula.
El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad.
Con este método, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras.
Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.
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Microscopio de contraste de fases
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1.4 Microscopio confocal El microscopio confocal es en principio un
microscopio óptico que incluye como fuente de luz un láser y un sistema electrónico que ayuda a la captación de imágenes.
Debido a esto, el microscopio confocal consigue un aumento en la resolución y obtener imágenes de secciones ópticas extremadamentes finas, eliminando así la interferencia que produce la luz que llega de los diferentes campos ópticos de todo el grosor de la muestra que se observa, consiguiendo así que el enfoque se realice sobre un único plano (confocal).
Las imágenes obtenidas son digitales.Biología II Enero 2009
Microscopio confocal
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1.5 Microscopio electrónico
En el Microscopio Electrónico la luz se sustituye por un haz de electrones que pasan por un tubo (con vacío para mejorar el paso de los electrones).
Permite la observación de las estructuras interiores de las células.
Sirve para visualizar virus.Tiene una resolución de 10 A (se pueden
ver objetos muy pequeños, incluyendo algunas moléculas).
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Microscopio electrónico Un haz de electrones es lanzado por un cañón en
el que se establece una diferencia de potencial, entre el cátodo y el ánodo.
El chorro de electrones pasa a través de la muestra a observar, que está colocada en una rejilla.
Los electrones chocan con la muestra y se desvían, y estas desviaciones son recogidas por la pantalla.
Observamos la imagen a través de una pantalla que es excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo similar a la televisión). Las imágenes las recogemos mediante una placa fotográfica que es impresionada directamente por los electrones.
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Microscopio electrónico: principio de funcionamiento
En un microscopio óptico, la potencia amplificadora está limitada por la longitud de onda de la luz visible.
El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar un objeto; los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz, y pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas.
La longitud de onda más corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 ángstroms (1 ángstrom es 0,0000000001 metros). La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0,5 ángstroms.
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Microscopio electrónico: principio de funcionamiento
Es importante el vacío dentro del cañón del microscopio electrónico, ya que Los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características.
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Microscopio electrónico
Existen dos tipos básicos de microscopio electrónico:
1. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
2. Microscopio electronico de barrido (SEM)
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Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Principio de funcionamiento: El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de
electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por
el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra.
Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms.
Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
El primer microscopio electrónico de transmisión fue desarrollado entre 1931 y 1933 por Ernst Ruska y sus colaboradores.
El primer microscopio electrónico de transmisión comercial lo construyó la compañía Siemens en 1939.
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Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Microscopios Electrónicos deTransmisión en Chile (izq.) yPuerto Rico (der.).
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Microscopio electrónico de barrido (SEM)
El microscopio electrónico de barrido o SEM (Scanning Electron Microscopy), es un microscopio que tiene una gran profundidad de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra.
Produce imágenes de alta resolución, que significa que características espacialmente cercanas en la muestra pueden ser examinadas a una alta magnificación.
La preparación de las muestras es relativamente fácil pues la mayoría de SEMs sólo requieren que estas sean conductoras.
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Microscopio electrónico de barrido (SEM)
En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón.
Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV.
Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio.
Inventado en 1981 por Ernst Ruska, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer.
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Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Un microscopio electrónico de barrido crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto.
No es necesario cortar la muestra en capas, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos.
El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un
haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión.
Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparición de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen.
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Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla.
A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor.
Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o más.
Este tipo de microscopio es muy útil porque produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.
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Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Son ampliamente utilizados en la biología celular. Aunque permite una menor capacidad de aumento que el
microscopio electrónico de transmisión, permite apreciar con mayor facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que hayan sido pulverizados metálicamente antes de su observación.
Por esta razón solamente pueden ser observados organismos muertos, y no se puede ir más allá de la textura externa que se quiera ver.
Los microscopios electrónicos sólo pueden ofrecer imágenes en blanco y negro puesto que no utilizan la luz.
Este instrumento permite la observación y caracterización superficial de materiales inorgánicos y orgánicos, entregando información morfológica del material analizado.
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Microscopio electrónico de barrido (SEM)
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