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Análisis Fisiológico y Genético de líneas endocriadas de girasol (B59 x B71) con diferente tolerancia a sequía

Director: Dr. Sergio AlemanoCo-Directora: Dra. Ruth HeinzDoctorando: Lic. Maximiliano Escalante

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Introducción

Girasol

Sequia

Germinación y estadio de plántulas

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Introducción

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Introducción

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Introduccion

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Introduccion

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Introduccion

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Hipótesis y Objetivo General

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Para comprobar esta hipótesis se plantea como segundo objetivo específico estudiar el patrón de expresión génica en plántulas de líneas parentales

contrastantes, control y sometidas a estrés hídrico.

Para comprobar esta hipótesis se plantea como segundo objetivo específico estudiar el patrón de expresión génica en plántulas de líneas parentales

contrastantes, control y sometidas a estrés hídrico.

“El estrés hídrico aplicado a plántulas de girasol modifica el patrón de expresión de genes involucrados en los mecanismos de tolerancia a dicho

estrés”.

“El estrés hídrico aplicado a plántulas de girasol modifica el patrón de expresión de genes involucrados en los mecanismos de tolerancia a dicho

estrés”.

Como primer objetivo específico se plantea caracterizar las líneas parentales B59 (sensible a estrés hídrico) y B71 (tolerante a estrés hídrico) con marcadores moleculares

neutros (Microsatélites) para detectar polimorfismos que puedan ser utilizados en la detección de genes y/o QTL involucrados en la tolerancia a estrés hídrico

Como primer objetivo específico se plantea caracterizar las líneas parentales B59 (sensible a estrés hídrico) y B71 (tolerante a estrés hídrico) con marcadores moleculares

neutros (Microsatélites) para detectar polimorfismos que puedan ser utilizados en la detección de genes y/o QTL involucrados en la tolerancia a estrés hídrico

“Líneas de girasol con respuesta contrastantes a estrés hídrico presentan regiones génicas diferentes, las cuales determinan la expresión de genes relacionados a la

tolerancia a ese estrés”.

“Líneas de girasol con respuesta contrastantes a estrés hídrico presentan regiones génicas diferentes, las cuales determinan la expresión de genes relacionados a la

tolerancia a ese estrés”.

Hipótesis y Objetivo Específicos

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Para comprobar esta hipótesis se propone como quinto objetivo específico determinar parámetros fisiológicos y hormonales en familias F3 durante crecimiento temprano (V2). Además se evaluarán genotípicamente las

poblaciones segregantes F2 mediante marcadores moleculares neutros (microsatélites).

Para comprobar esta hipótesis se propone como quinto objetivo específico determinar parámetros fisiológicos y hormonales en familias F3 durante crecimiento temprano (V2). Además se evaluarán genotípicamente las

poblaciones segregantes F2 mediante marcadores moleculares neutros (microsatélites).

““Durante la respuesta de plántulas de girasol de familias F3 (B59 x B71) a estrés hídrico se producen cambios fenotípicos (fisiológicos y hormonales)

que pueden estar asociados con regiones genómicas de las líneas segregantes F2”.

““Durante la respuesta de plántulas de girasol de familias F3 (B59 x B71) a estrés hídrico se producen cambios fenotípicos (fisiológicos y hormonales)

que pueden estar asociados con regiones genómicas de las líneas segregantes F2”.

Para probar esta hipótesis se plantea como cuarto objetivo específico cuantificar la concentración endógena de hormonas asociadas a estrés abiótico: JA y OPDA, ABA y

catabolitos, en plántulas de líneas parentales B59 y B71, crecidas en condiciones control y de estrés hídrico, acompañadas de aplicación o ausencia de inhibidores

químicos.

Para probar esta hipótesis se plantea como cuarto objetivo específico cuantificar la concentración endógena de hormonas asociadas a estrés abiótico: JA y OPDA, ABA y

catabolitos, en plántulas de líneas parentales B59 y B71, crecidas en condiciones control y de estrés hídrico, acompañadas de aplicación o ausencia de inhibidores

químicos.

“Plántulas de girasol en respuesta a estrés hídrico presentan cambios en el perfil de hormonas que explican el rol de estos compuestos en la tolerancia a estrés. Inhibidores

químicos bloquean la biosíntesis y por lo tanto modifican los niveles hormonales endógenos”.

“Plántulas de girasol en respuesta a estrés hídrico presentan cambios en el perfil de hormonas que explican el rol de estos compuestos en la tolerancia a estrés. Inhibidores

químicos bloquean la biosíntesis y por lo tanto modifican los niveles hormonales endógenos”.

Hipótesis y Objetivo Específicos

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Materiales y metodos

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Caracterizacion de lineas parentales B59 y B71

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Muestra • Hojas jovenes •plantas crecidas en invernaculo por 5 semanas

Muestra • Hojas jovenes •plantas crecidas en invernaculo por 5 semanas

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Cuantificacion y Calidad del ADN • fluorometro • Gel de agarosa 0,8%

Cuantificacion y Calidad del ADN • fluorometro • Gel de agarosa 0,8%

1-Evaluación genotípica de líneas parentales B59 y B71

Extracción y cuantificación de ADN

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Amplificacion por PCR

Amplificacion por PCR

Visualizacion • Geles de agarosa

• Electroforesis capilar

Visualizacion • Geles de agarosa

• Electroforesis capilar

1-Evaluación genotípica de líneas parentales B59 y B71

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Evaluaron siguiente parametros

Peso seco y frescoLong totalArea folearVer cual mas pongo!!!!!!

Evaluaron siguiente parametros

Peso seco y frescoLong totalArea folearVer cual mas pongo!!!!!!

2-Evaluación fenotípica de las líneas parentales B59 y B71 y su expresión génica

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Determinaciones de hormonas vegetales.

• JA, OPDA, JA-Ile, 12-OH-JA

• ABA, PA, DPA, ABA-GE, 9OH-ABA, 7OH-ABA

Determinaciones de hormonas vegetales.

• JA, OPDA, JA-Ile, 12-OH-JA

• ABA, PA, DPA, ABA-GE, 9OH-ABA, 7OH-ABA

Extracción de ARN total • Kit de extraccion RNAqueous Plant

Extracción de ARN total • Kit de extraccion RNAqueous Plant


Material vegetal

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Manitol 400 mM + SHAM 10 μM.•Simultaneo•Desfazado

Manitol 400 mM + SHAM 10 μM.•Simultaneo•Desfazado

Ácido salicilhidroxámico (SHAM) 10 μM Ácido salicilhidroxámico (SHAM) 10 μM

Solución de manitol 400 mM (estrés hídrico)Solución de manitol 400 mM (estrés hídrico)

Hoagland 50% de fuerza iónica (control)Hoagland 50% de fuerza iónica (control)

Cosecha a los20 díasCosecha a los20 días

Determinación de hormonas vegetales

JA y OPDA


JA y OPDA

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Evaluación de poblaciones segregantes.

EEA-INTA Manfredi

LíneaLínea TT xx SS

FF11 FF11 XX

FF2 2

S : B59S : B59

T : B71T : B71@@

@@FF33

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Variables determinadas: Recuento final de germinación (RFG)

RFGR(%)= RFG 400mM (%) / RFG Control (%) x 100.

Peso seco (PS) PSR (%) = PS 400mM (gr.) / PS Control (gr.) x 100

Variables determinadas: Recuento final de germinación (RFG)

RFGR(%)= RFG 400mM (%) / RFG Control (%) x 100.

Peso seco (PS) PSR (%) = PS 400mM (gr.) / PS Control (gr.) x 100

25 semillas por bandeja, Arena esteril a 60% cc

16 hs luz, 28°C y 60% HR8 hs oscur idad, 20°C y 70% HR

25 semillas por bandeja, Arena esteril a 60% cc

16 hs luz, 28°C y 60% HR8 hs oscur idad, 20°C y 70% HR

Cosecha a los 11 díasCosecha a los 11 días


JA, ABA y SA


JA, ABA y SA

Fenotipado de familias segregantes F3

Tratamientos:H20 destilada (control)

Solución manitol 400 mM (estres)

Tratamientos:H20 destilada (control)

Solución manitol 400 mM (estres)

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Resultados y Discución

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Evaluación de líneas parentales B59 y B71

1- Evaluación genotípica

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B59 PA

B59 PR

B71 PA

AAO 2 SDR 7,4ABA-8OH3 3

ZEP 2,3NCED 1,7

SDR 4,1ABA-8OH3 5,5

ZEP 2,1SDR 1,8

B71 PR

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Evaluación de líneas parentales B59 y B71

B59 PA

B59 PR

B71 PA

B71 PR

LOX 10,2AOS 2,2AOC 1,70OPR3 2,2

LOX 1,4AOS 2AOC 2,2OPR3 1,6

LOX 4,3AOS 3,3OPR3 1,8ACX1 VA?

LOX 4,1AOS 1,8OPR3 2,3

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Efecto del estrés hídrico y de un inhibidor (SHAM) de la síntesis de jasmonatos sobre el contenido hormonal de plántulas de girasol B59 y B71

Plántulas sometidas a tratamiento simultáneo de estrés hídrico e inhibidor de JA

BParte radical Parte aérea

A

Control Sham Manitol Man+Sham0

200

400

600

800

1000

1200

5000

10000

15000

20000

25000

pmol

.grs

-1 P

S

J A OPDA

b

d

a

d

c

f

ab

e

A

Parte aérea


250

500

7507500

7600

7700

7800

pmol

. grs

-1 P

S

J A OPDA

b

d

a

c

b

e

a

b

B Parte radical

Plántulas línea B59


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Efecto del estrés hídrico y de un inhibidor (SHAM) de la síntesis de jasmonatos sobre el contenido hormonal de plántulas de girasol B59 y B71

BParte radical

Parte aérea

A


100

200

300

4000

8000

12000

16000

pm

ol.

grs

-1 P

S

J A OPDA

ab

d

ab

c

b

e

c

a

Parte aéreaA


200

400

600

800

5000

10000

15000

20000

25000

30000

pm

ol.

grs

-1 P

S

J A OPDA

b

d

a

c c

b

e

eB

Parte radical

Plántulas sometidas a estrés hídrico y posterior aplicación de inhibidor de JA



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Evaluación de poblaciones segregantes

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F 80 F 65 F 59 F 42 F 14 F 116 F 18 F 48 F 19 F 31

0

50

100

PG

R

Flia F3 extremas

Flias sensible Flias tolerantes

A

ABAB B B

C C C

C C

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Determinaciones de hormonas vegetales en familias F3

F 80 F 59 F 65 F 42 F 140

30000

60000

90000

120000

240000

260000

280000

pmol

.grs

PS

-1

Familias F3

control 400 mM manitol

B

A

B

A

B

A

BA

BA

SA

Sensibles

F 116 F 18 F 48 F 19 F 310

20000

40000

60000

80000

100000

260000

270000

280000

290000

pmol

. grs

PS

-1

Familias F3


SA

B

A

B

A

B

AB

A

A

B

Tolerantes

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F 80 F 59 F 65 F 42 F 140

50

100

150

200

250

300

pmol

. grs

PS

-1

Familias F3


J A

B

A

B

AA

A A

A

B

A

Sensibles

F 116 F 18 F 48 F 19 F 310

25

50

75

100

125

150

pmol

. grs

PS

-1

Familias F3


J A

A A

A A

A

A

A

B

B

A

Tolerantes

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F 80 F 59 F 65 F 42 F 140

300

600

900

1200

1500

1800

pm

ol.

grs

PS

-1

Familias F3


ABA

A

B

B

AA A

A

B

A A

Sensibles

F 116 F 18 F 48 F 19 F 310

500

1000

1500

2000

2500

25000

26000

27000

28000

29000

pm

ol.

grs

PS

-1

Familias F3


A AA

B

A B

B

A

BA

ABA

Tolerantes

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Resuspende, filtra y se seca a 35°C

Resuspende, filtra y se seca a 35°C

Doble partición (eter etilico) ysecado de fase organica

Doble partición (eter etilico) ysecado de fase organica

Homogenización y centrifugacion

Homogenización y centrifugacion

ExtraccionExtraccion

Material Vegetal(liofilizado)

Material Vegetal(liofilizado)

Sobrenadante se ajustapH a 2,8

Sobrenadante se ajustapH a 2,8

H2O deionizada +hormonas deuteradas.

H2O deionizada +hormonas deuteradas.

Muele finamente con Nitrogeno liquido.

Muele finamente con Nitrogeno liquido.

Determinaciones de hormonas vegetales

(Durgbanshi et. al. 2005)

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Precipitación con ClLi. Precipitación con ClLi.

Cuantificacion Espectrofotometro Nanodrop,

Integridad Electroforesis en gel agarosa 1,5%.

Calidad Biolanalizador Agilent

Cuantificacion Espectrofotometro Nanodrop,

Integridad Electroforesis en gel agarosa 1,5%.

Calidad Biolanalizador Agilent

Extracción de ARN total

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2 B ₤ ⅔

3 C ¥ ⅛

4 D © ⅜

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6 F § ⅞

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8 H ½ ≠

9 I ¾ ±

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