T16 - El adn y la ingeniería genética

T16 – EL ADN Y LA INGENIERÍA GENÉTICA.

1. De la biotecnología a la ingeniería genética.2. Obtención de fragmentos de ADN.3. Clonación del ADN.4. Identificación de clones mediante sondas.5. Reacción en cadena de la polimerasa.6. Secuenciación del ADN.7. Genómica y proteómica.8. Ingeniería genética y medicina.9. Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente.10. Ingeniería genética y ganadería.11. Proyecto Genoma Humano.12. Bioética.

ANTECEDENTES PAU:

2004 – Junio: clonación, definición y ejemplos;

• Producción de alimentos y bebidas.• Obtención de medicamentos.

• Clonación, mapas genéticos.• Organismos transgénicos, terapia génica.

T16. El ADN y la ingeniería genética.

1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.Biotecnología

Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser humano.

Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser humano.

Ingeniería genética

Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.

Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.


1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.







1. Fragmentar y aislar el ADN.2. Unión a vectores.3. Introducción en las células.4. Clonación.5. Búsqueda del clon idóneo.6. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern.7. Secuenciación.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).


2 – Obtención de fragmentos de ADN.Tecnología del ADN recombinante

1. Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma) corta y conocida.

2. Las secuencias de corte son palindrómicas.

3. El corte puede ser:• Liso.• Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos)

Posteriormente, los fragmentos de distintosADN cortados con la misma enzima se podránunir mediante otra enzima, una ADN ligasa.


2 – Obtención de fragmentos de ADN.Enzimas de restricción


2 – Obtención de fragmentos de ADN.

• Tenemos dos tipos distintos de ADN.• Se separan las cadenas de ADN

(desnaturalización).• Se devuelven las condiciones adecuadas y se

produce la renaturalización.• Se pueden obtener moléculas híbridas de los

dos tipos de ADN.• El porcentaje de hibridación está relacionado

con el parentesco evolutivo.• Estas técnicas permiten localizar enfermedades

genéticas.


2 – Obtención de fragmentos de ADN.Formación de ADN complementario por hibridación

Se utiliza el enzima transcriptasa inversa para sintetizar un ADNc partiendo de un ARNm maduro (sin intrones) para que pueda ser utilizado luego en bacterias (los procariotas no realizan un proceso postranscripcional de eliminación de intrones).

1. Una célula eucariota transcribe el ADN a ARNm. 2. La misma célula procesa la nueva cadena de ARNm eliminando los intrones, y

añadiendo una cola poli-A y un terminal GTP. 3. Esta cadena de ARNm maduro se extrae de la célula. 4. Se hibrida un oligonucleótido poli-T sobre la cola poli-A del molde de ARNm

maduro, ya que la retrotranscriptasa necesita un cebador de doble cadena para comenzar a trabajar.

5. Se añade la retrotranscriptasa, junto con las bases A, T, C y G. 6. La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando la cadena

de ADN complementaria del molde de ARNm (ADNc).7. Se sintetiza la doble cadena.


2 – Obtención de fragmentos de ADN.Síntesis de ADNc usando ARNm como molde





• En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN en el interior de un organismo hospedador.

• Estos organismos deben cumplir las siguientes características:

1. Crecimiento rápido.2. No debe ser patógeno.3. Debe favorecer la entrada del transgén.4. Debe ser muy bien conocido.5. Debe ser fácilmente manipulable.

Escherichia coli


3 – Clonación del ADN.Clonación de ADN

• Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.

• Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. • Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del

fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.


3 – Clonación del ADN.Vectores de clonación

• Plásmidos.• Virus bacteriófagos.• Cósmidos.• YAC´s (cromosomas artificiales de levadura).• BAC´s (cromosomas artificiales de bacterias).• Cromosomas artificiales humanos.


3 – Clonación del ADN.Tipos de vectores de clonación

• Son moléculas de ADN bicatenario circular.

• Se localizan en las bacterias.• Tienen replicación

independiente.• Genes propios (resistencias a

antibióticos) que permiten seleccionarlos posteriormente.

• Facilidad para la manipulación.• Puntos de corte específicos para

enzimas de restricción.


3 – Clonación del ADN.Plásmidos


3 – Clonación del ADN.

• Virus que infectan bacterias.• Incorporan material genético mediante el proceso de transducción.• Al infectar otra célula (bacteria) introduce el materialdel antiguo huésped.


3 – Clonación del ADN.Bacteriófagos

• Consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago.

• Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porción COS (fragmento de fagos necesario para empaquetar el material genético).

• Lleva varios genes de plásmidos.• Incorpora marcadores (resistencia a antibióticos).• Tiene varios sitios de restricción.• Permite transportar grandes cantidades de ADN.


3 – Clonación del ADN.Cósmidos



• Son vectores de clonación de alta capacidad.

• Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.


3 – Clonación del ADN.Cromosoma artificial de levadura



1. Inserción de genes marcadores en el vector (plásmido o lo que sea). Generalmente de resistencia a antibióticos.

2. Se cortan el ADN humano y el vector con el mismo plásmido.3. Se mezclan los fragmentos.4. Obtención de plásmidos recombinantes.5. Se juntan los plásmidos con bacterias. 6. Incorporación de los plásmidos por transformación bacteriana.7. Cultivo de bacterias en presencia de un antibiótico.8. Las bacterias que no han incorporado el plásmido mueren (no

son resistentes).


3 – Clonación del ADN.Clonación de los fragmentos de ADN



• Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido.

• La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debería contener muestras de todo el ADN del organismo.

• Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos.

• Estas genotecas pueden ser de plásmidos, fagos o de ADNc.


4 – Identificación de clones mediantes sondas.Almacenamiento de genes clonados

Sondas de ADN• Oligonucleótidos de cadena sencilla.• Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la secuencia de

aminoácidos de la proteína.• Están marcadas (radiactividad o fluorescencia) para poder ser identificadas.


4 – Identificación de clones mediantes sondas.Identificación de clones


4 – Identificación de clones mediantes sondas.

• Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN y además en muy poco tiempo.


5 – Reacción en cadena de la polimerasa.

La reacción es un proceso cíclico:

1.La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras. 2.Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermusaquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). 3.Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias.


5 – Reacción en cadena de la polimerasa.

• Amplificación de: – ADN antiguos (mamuts, momias, fósiles…– ADN obtenidos de la escena de un crimen (medicina forense).– ADN de células embrionarias (diagnostico prenatal de trastornos

genéticos).– ADN de genes virales (en células infectadas por virus difíciles de

detectar, como el VIH).

Animación de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf


5 – Reacción en cadena de la polimerasa.Aplicaciones de la PCR

http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf

• Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación enzimática (de la polimerización de DNA).

• Elementos necesarios: - DNA polimerasa.- Oligonucleótido (primer o cebador), de 18-30 nucleótidos y complementario al

extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar.- Mezcla de los 4 desoxinucleósidostrifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP).- Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidostrifosfato (ddATP*

o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*florescencia específica para cada uno de ellos).


6 – Secuenciación del ADN.

1. Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN (clonación).

2. Desnaturalización del ADN (obtención de cadenas simples).3. Mezcla de todos los componentes de la reacción.4. Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un

ddNTP marcado.5. Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP*.6. Se separan las moléculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida.7. Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color.8. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.


6 – Secuenciación del ADN.Pasos de la secuenciación


6 – Secuenciación del ADN.


7 – Genómica y proteómica.








8 – Ingeniería genética y medicina.

1.Secuencia de la proteína (insulina).2.Síntesis de los ADN.3.Obtención de plásmidos recombinantes con

los genes para formar las dos cadenas de la insulina.

4.Expresión en E. coli.5.Purificación y procesado químico.6.Obtención de insulina activa.


8 – Ingeniería genética y medicina.Obtención de productos farmacéuticos

1. Los seres humanos difieren en un 0,1% del genoma.2. Estas diferencias están localizadas en regiones

cromosómicas concretas.3. Estas zonas se usan como marcadores genéticos.4. Con la identificación de los marcadores se hace la

huella genética (método de Southernblot).5. La comparación de huellas genéticas permite

resolver casos policiales.


8 – Ingeniería genética y medicina.Medicina forense


8 – Ingeniería genética y medicina.


8 – Ingeniería genética y medicina.Terapia génica


9 – Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente.






10 – Ingeniería genética y ganadería.


10 – Ingeniería genética y ganadería.

• Objetivos:– Situar genes y marcadores moleculares en mapas

genéticos de cada cromosoma.– Caracterizar y localizar físicamente fragmentos de

ADN clonados.– Secuenciar los pequeños fragmentos para

obtener la secuencia genómica completa.

11 – Proyecto Genoma Humano.


• Las ventajas de la ingeniería genética y de las nuevas tecnologías asociadas son muchas, pero los potenciales riesgos también lo son:

– Ecológicos. Posibles efectos secundarios como la contaminación del agua o del suelo.

– Sanitarios. Casos de alergias provocadas por alimentos transgénicos.– Sociales, éticos y legales.

• Surge la bioética, aplicación de la ética a las ciencias de la vida.

12 – Bioética.


Education

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