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Tecnologia Enzimática

Este site é baseado no livro de texto "Tecnologia Enzimática 'escrito por Martin Chaplin e Christopher Bucke (Cambridge University Press, 1990), que está atualmente fora de catálogo. Espera-se que ele será gradualmente editada e atualizada, mantendo-se neste site.

Capítulo 1 : Fundamentos da cinética enzimática

Por enzimas? Nomenclatura de Enzimas

Unidades de enzima

O mecanismo de ação da enzima

Cinética simples de ação enzimática Efeito do pH e da força iónica sobre a catálise enzimática

Efeito da temperatura e da pressão

Reacções reversíveis A inibição de enzimas

Determinação da V max e K m

Resumo e Bibliografia do Capítulo 1

Capítulo 2 : preparação da enzima e uso

Fontes de enzimas

Triagem para novas enzimas

Mídia para a produção da enzima

Preparação de enzimas Centrifugação

Filtration

Sistemas bifásicos aquosos Ruptura celular Ultrasonic rompimento celular Homogeneizadores de alta pressão A utilização de moinhos de esferas

Uso de Freeze-prensas

A utilização de métodos líticas

Preparação de enzimas a partir da solução clarificada Tratamento térmico

Cromatografia

Cromatografia de troca Ion A cromatografia de afinidade

Cromatografia de exclusão em gel Preparação de enzimas para venda Atendimento ao Cliente

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Segurança e aspectos regulatórios do uso de enzimas

Resumo e Bibliografia do Capítulo 2

Capítulo 3 : A preparação e a cinética de enzimas imobilizadas

O argumento econômico para a imobilização

Métodos de imobilização A cinética de enzimas imobilizadas

Efeito de partição de soluto sobre a cinética de enzimas imobilizadas

Efeitos de difusão do soluto sobre a cinética de enzimas imobilizadas Análise dos efeitos difusionais em suportes porosos

Resumo e Bibliografia do Capítulo 3

Capítulo 4 : A utilização em larga escala de enzimas em solução

A utilização em larga escala de enzimas em solução

A utilização de enzimas em detergentes Aplicações de proteases na indústria de alimentos

O uso de proteases nas indústrias de couro e lã

A utilização de enzimas na hidrólise de amido Produção de xarope de glucose

Produção de xarope contendo maltose

Enzimas na indústria de sacarose Glicose a partir de celulose

O uso de lactase na indústria de lacticínios

Enzimas nas indústrias de sucos de frutas, vinho, cerveja e das destilarias A glucose oxidase e catalase na indústria alimentar Aplicações médicas de enzimas

Resumo e Bibliografia do Capítulo 4

Capítulo 5 : imobilizada enzimas e seus usos

Reactores enzimáticos Reactores de membrana

Reactores de fluxo contínuo

Reactores de leito fixo Fluxo de reactores de tanque agitado contínuo

Os reactores de leito fluidizado

Processos de enzima imobilizada

Xaropes de milho de alto -fructose (HFCS) Uso de raffinase imobilizada

Uso de invertase imobilizada

A produção de ácidos aminados Uso de lactase imobilizada

Produção de antibióticos

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Preparação de acrilamida

Resumo e Bibliografia do capítulo 5

Capítulo 6 : Biosensores

A utilização de enzimas em análise

Quais são biossensores? Biossensores calorimetria

Biossensores potenciométricos

Biossensores amperométricos Biossensores ópticos

Biossensores Piezo-elétrico

Imunossensores Resumo e Bibliografia do Capítulo 6

Capítulo 7 : Os recentes avanços na tecnologia enzimática

As reacções enzimáticas em sistemas bifásicos líquidos

A estabilização de enzimas em sistemas aquosos-orgânicos bifásicos

Equilíbrio em sistemas bifásicos aquosos-orgânicos Cinética de enzimas em sistemas aquosos-orgânicos bifásicos

O uso de sistemas aquosos de 2 fases

Exemplos práticos da utilização de enzimas 'ao contrário' As glicosidases utilizadas em reacções sintéticas

A interesterificação de lípidos

Resumo e Bibliografia do Capítulo 7

Capítulo 8 : Perspectivas da tecnologia enzimática

Para onde a tecnologia enzimática? O uso de substratos de "não naturais" Engenharia Enzyme

Enzimas artificiais Sistemas de regeneração Coenzima

Conclusões

Resumo e Bibliografia do Capítulo 8

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Tecnologia Enzimática

Por enzimas?

Catalisadores aumentar a velocidade das reações de outra forma lenta ou imperceptíveis sem sofrer qualquer alteração líquida em sua estrutura. O desenvolvimento inicial do conceito de catálise na 19 thséculo andava de mãos dadas com a descoberta de poderosos catalisadores de fontes biológicas. Estes foram chamados enzimas e foram mais tarde descobriu ser proteínas. Eles mediar todas as reações de síntese e de degradação realizados por organismos vivos. Eles são catalisadores muito eficientes, muitas vezes, muito superior aos catalisadores químicos convencionais, razão pela qual eles estão sendo utilizados cada vez mais na sociedade de alta tecnologia de hoje, como uma parte muito significativa da expansão biotecnológico. Sua utilização criou um negócio de bilhões de dólares, incluindo uma grande diversidade de processos industriais, produtos de consumo, e florescente campo de biossensores. Outras aplicações estão sendo descobertos constantemente.

As enzimas têm um número de vantagens distintas sobre os catalisadores químicos convencionais. Entre tais são a sua especificidade e seletividade não só para as reações particulares, mas também em sua discriminação entre as partes semelhantes de moléculas (regioespecificidade) ou isômeros ópticos (estereoespecificidade). Eles apenas catalisar as reações de intervalos muito estreitos de reagentes (substratos), o qual pode consistir de um pequeno número de classes de compostos intimamente relacionados (por exemplo, tripsina catalisa a hidrólise de alguns pépticos e ésteres, em adição a maioria das proteínas), uma única classe de compostos (por exemplo, hexocinase catalisa a transferência de um grupo fosfato do ATP para várias hexoses), ou um único composto (por exemplo, glucose-oxidase de glucose oxida apenas entre os açúcares que ocorrem naturalmente). Isto significa que a reação pode ser catalisada escolhido para a exclusão de reações secundárias, eliminando subprodutos indesejáveis. Assim, as produtividades mais elevadas podem ser alcançadas, reduzindo os custos de material. Como um bônus, o produto é gerado em um estado não contaminada reduzindo assim os custos de purificação e a carga ambiental a jusante. Muitas vezes, um número menor de etapas podem ser necessários para produzir o produto final desejado. Além disso, certas reações Estero específicas (por exemplo, a conversão de glicose em frutose) não pode ser conseguida por métodos químicos clássicos sem um grande dispêndio de tempo e esforço. Enzimas trabalhar sob condições de processamento geralmente moderadas de temperatura, pressão e pH. Isto diminui os requisitos de energia, reduz os custos de capital devido ao equipamento de processo resistente à corrosão e reduz ainda mais a reações laterais indesejadas. As altas velocidades de reação e regulação catalítico simples obtidos em reações catalisadas por enzimas permitem um aumento da produtividade com redução de custos de produção, devido a salários e despesas gerais.

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Existem algumas desvantagens da utilização de enzimas que não pode ser ignorada mas que estão actualmente a ser tratadas e superar. Em particular, o custo elevado de isolamento e purificação da enzima ainda desencoraja a sua utilização, especialmente em áreas que têm actualmente um procedimento alternativo estabelecido. A natureza geralmente instável de enzimas, quando removido de seu ambiente natural, é também uma grande desvantagem para o seu uso mais extensivo.

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Nomenclatura de Enzimas

Todas as enzimas contêm um esqueleto da proteína. Em algumas enzimas esta é a única componente da estrutura. No entanto, existem porções adicionais não proteicos geralmente presentes que pode ou não participar na actividade catalítica da enzima. Grupos de hidratos de carbono ligadas covalentemente são comumente encontradas características estruturais que muitas vezes não têm relação direta com a atividade catalítica, embora eles podem muito bem afetar a estabilidade de uma enzima e solubilidade.Outros fatores frequentemente encontrados são íons metálicos ( co-fatores ) e baixa moléculas orgânicas de peso molecular ( coenzimas ). Estes podem ser vagamente ou fortemente ligados por forças não covalentes ou covalentes. Eles são frequentemente componentes importantes que contribuem tanto para a actividade e a estabilidade das enzimas. Este requisito para cofactores e coenzimas deve ser reconhecido se as enzimas devem ser utilizados de forma eficiente e é particularmente relevante em processos contínuos, onde pode haver uma tendência para que se separam da parte de proteína de uma enzima.

As enzimas são classificadas de acordo com o relatório do Comitê de Nomenclatura nomeado pela União Internacional de Bioquímica (1984). Esta comissão enzima atribuído cada enzima um nome recomendado e um 4-part número distintivo. Deve notar-se que alguns nomes alternativos permanecem em uso comum, tais que eles vão ser utilizados, se for caso disso, no presente texto. A comissão enzima ( EC ) dividir números enzimas em seis grupos principais de acordo com o tipo de reacção que é catalizada:

(1) Oxidorredutases que envolvem reações redox em que o hidrogênio ou oxigênio átomos ou elétrons são transferidos entre as moléculas. Esta classe extensa inclui as desidrogenases (transferência de hidreto), oxidases (transferência de elétrons ao oxigênio molecular), oxigenases (transferência de oxigênio do oxigênio molecular) e peroxidases (transferência electrónica de peróxido). Por exemplo: a glicose oxidase (EC 1.1.3.4, nome sistemático, -D-glucose: oxigênio 1-oxidoreductase).

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[1,1]

-D-glicose + oxigénio D-glucono-1,5-lactona + peróxido de hidrogénio

(2) Transferases que catalisam a transferência de um átomo ou grupo de átomos (eg acil-, alquil- e glycosyl-), entre duas moléculas, mas excluindo estas transferências como são classificados nos outros grupos (por exemplo, oxidoreductases e hidrolases). Por exemplo: aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1, nome sistemático, L-aspartato: aminotransferase 2-oxoglutarato, também chamado de transaminase glutâmico-oxalacética ou simplesmente GOT).

[1,2]

L-aspartato + 2-oxoglutarato oxaloacetato + L-glutamato

(3) Hidrolases que envolvem reacções hidrolíticas e a sua reversão. Isto é actualmente a classe mais comum encontrado de enzimas dentro do campo da tecnologia de enzima e inclui as esterases, glicosidases, lipases e proteases. Por exemplo: quimosina (CE 3.4.23.4, nenhum nome sistemática declarado; também chamada renina).

7

[1,3]

-caseína + água Pará - -caseína + caseino macropéptido

(4) liases que envolvem reacções de eliminação em que um grupo de átomos é removido a partir do substrato. Isto inclui as aldolases, descarboxilases, desidratases e alguns pectinases, mas não inclui hidrolases. Por exemplo: histidina amoníaco-liase (EC 4.3.1.3, nome sistemático, L-histidina amónia-liase; também chamado histidase).

[1.4]

L-histidina urocanate + amoníaco

(5) Isomerases que catalisam isomerisations moleculares e inclui as epimerases, racemases transferases e intramoleculares. Por exemplo: xilose isomerase (CE 5.3.1.5, nome sistemático, D-xilose ketol-isomerase; comumente chamado isomerase glucose).

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[1,5]

-D-glucopiranose -D-frutofuranose

(6) As ligases , também conhecido como sintetases, formam um grupo relativamente pequeno de enzimas que envolvem a formação de uma ligação covalente juntar duas moléculas em conjunto, juntamente com a hidrólise de um nucleósido-trifosfato. Por

exemplo: a glutationa-sintetase (EC 6.3.2.3, nome sistemático, -L-glutamil-L-cisteína: glicina ligase (ADP-formação); também chamado glutationa-sintetase).

[1.6]

ATP + -L-glutamil-L-cisteína + glicina + ADP + fosfato de glutationa

Unidades de enzima

A quantidade de enzima presente ou usado num processo é difícil de determinar, em termos absolutos (por exemplo gramas), como a sua pureza é frequentemente baixo e uma proporção pode estar em uma forma inactiva, ou parcialmente activa, estado. Parâmetros mais relevantes são a actividade da preparação de enzima e as actividades de enzimas quaisquer contaminantes. Estas actividades são habitualmente medida em termos da unidade de actividade ( U ) que é definida como a quantidade que irá catalisar a transformação de 1 micromole de substrato por minuto, em condições normalizadas.Tipicamente, isto representa 10 -6 - 10 -11 Kg de enzimas puras e 10 -4 -

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10 -7 Kg para as preparações de enzimas industriais. Outra unidade de actividade enzimática foi recomendada. Este é o katal ( kat ), que é definida como a quantidade que irá catalisar a transformação de uma mole de substância, por segundo (1 kat = 60 000 000 L). É uma unidade impraticável e ainda não recebeu ampla aceitação. Por vezes, as unidades de actividade não-padrão são usados, tais como Soxhet, Anson e Kilo Novo unidades, que são baseadas em modificações físicas, tais como a redução da viscosidade e supostamente melhor entendida pela indústria. Justamente, essas unidades são gradualmente caindo em desuso. A actividade é uma medida do conteúdo de enzimas que é claramente de grande interesse, quando a enzima é para ser utilizada em um processo. Por esta razão, as enzimas são geralmente comercializados em termos de actividade e não o peso. A actividade específica (por exemplo, L kg -1 ) é um parâmetro de interesse, alguma utilidade como um índice de pureza mas menor importância. Existe um grande problema com essas definições de actividade; a noção bastante vago de "condições normais". Estes destinam-se a referir-se a condições óptimas, especialmente no que diz respeito ao pH, força iónica, temperatura, concentração de substrato e a presença e concentração de cof actores e coenzimas. No entanto, estas condições óptimas assim-chamados variar tanto entre laboratórios e entre fornecedores. Eles também depender da aplicação particular em que a enzima é para ser utilizada. Além disso, as preparações da mesma actividade específica nocional pode ser diferente no que diz respeito à estabilidade e ser capaz de muito diferente catalítica total de produtividade (isto é o total de substrato convertido em produto, durante o tempo de vida do catalisador, sob as condições especificadas). Condições para a atividade inicial máximo não são necessariamente aqueles para a máxima estabilidade. Grande cuidado deve ser tomado a consideração desses fatores quando o catalisador mais eficiente para um fim específico deve ser escolhido

O mecanismo da catálise enzimática

A fim de que ocorra a reacção, as moléculas do reagente devem conter energia suficiente para atravessar uma barreira de energia potencial, a energia de activação . Todas as moléculas possuem diferentes quantidades de energia, dependendo, por exemplo, na sua história recente colisão mas, em geral, apenas alguns têm energia suficiente para a reacção. Quanto mais baixa for a barreira de energia potencial para reacção, os mais reagentes têm energia suficiente e, consequentemente, mais rápida é a reacção irá ocorrer. Todos os catalisadores, incluindo as enzimas, a função através da formação de um estado de transição, com os reagentes, de energia livre mais baixa do que seria encontrada na reacção não catalisada (Figura 1.1). Mesmo reduções bastante modestos neste barreira de energia potencial pode produzir grandes aumentos na taxa de reação (por exemplo, a energia de ativação para a repartição não catalisada de peróxido de hidrogênio em oxigênio e água é de 76 kJ M -1 que, na presença da enzima catalase, esta é reduzida para 30 kJ M -1 e a taxa de reacção é aumentada por um factor de 10 8 , suficiente para converter um tempo de reacção medido em anos em um medido em segundos).

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Figura 1.1. Um diagrama esquemático que mostra o perfil de energia livre do decurso da reacção catalisada por uma enzima que envolve a formação de enzima-substrato (ES) e da enzima de produtos complexos (PE), isto é,

O caminho da reação catalisada passa pela transição Unidos TS c1 , TS c2 e TS c3 , com

energia livre padrão de ativação G c * , ao passo que a reação não catalisada

atravessa os TS estado de transição ucom energia livre padrão de

ativação G u * . Neste exemplo, o passo limitante da velocidade seria a conversão de

ES em PE. Reações envolvendo vários substratos e produtos, ou mais intermediários, são ainda mais complicada. O esquema de reação Michaelis-Menten [1.7] daria um perfil semelhante, mas sem a calha energia livre complexo EP-. O perfil esquemático para a reacção não catalisada é mostrado como a linha tracejada. Deve notar-se que o efeito catalítico apenas se refere à redução da energia livre de activação padrão

de G u * a G c

* e não tem efeito sobre a mudança total de energia livre (isto é. a diferença entre os pontos iniciais e finais ) ou a constante de equilíbrio relacionada.

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Há um número de mecanismos pelos quais esta diminuição da energia de activação pode ser conseguida.A mais importante delas envolve inicialmente a enzima de ligação do substrato (s), com a orientação correcta para reagir, perto dos grupos catalíticos no complexo enzima activo e quaisquer outros substratos. Desta forma, a energia de ligação é usado parcialmente, a fim de reduzir a contribuição da activação considerável entropia, devido à perda dos reagentes '(e grupos catalíticos') de translação e de rotação de entropia, no sentido da energia total de activação. Outros fatores que contribuem são a introdução de tensão em que os reagentes (permitindo mais energia de ligação a estar disponível para o estado de transição), a prestação de uma via alternativa e reativa a dessolvatação de reagir e catalisando grupos iônicos.

As energias disponíveis para ligação de enzimas para os seus substratos é determinada principalmente pela complementaridade de estruturas (ou seja, um ajuste 3-dimensional boa mais forças de ligação iónicos e / ou não-covalentes hidrogénio óptimas). A especificidade depende repulsão estérica mínima, a ausência de cargas não solvatadas ou não emparelhados, e a presença de ligações de hidrogénio suficientes. Estas energias de ligação são capazes de ser muito grande. Como exemplos, constantes de dissociação antígeno-anticorpo são caracteristicamente perto de 10 -8 M (energia livre de ligação é de 46 kJ M -1 ), o ATP se liga a miosina com uma constante de dissociação de 10 -13 M (energia livre de ligação é de 75 kJ M -1 ) e biotina liga-se a avidina, uma proteína encontrada na clara do ovo, com uma constante de dissociação de 10 -15 M (energia livre de ligação é de 86 kJ M -1 ). No entanto, as enzimas não usar esta energia de ligação potencial simplesmente a fim de vincular o substrato (s) e formam complexos estáveis e duradouras. Se fosse este o caso, a formação do estado de transição entre ES e EP implicaria uma extremamente grande variação de energia livre, devido à quebra destas fortes forças de ligação, e a velocidade de formação de produtos seria muito lento. Eles devem usar essa energia de ligação para reduzir a energia livre do estado de transição. Isto é geralmente conseguido através do aumento da ligação para o estado de transição, em vez de os reagentes e, no processo, a introdução de uma estirpe energético no sistema e permitindo interacções mais favoráveis entre os grupos catalíticos da enzima e os reagentes.

Cinética simples da ação da enzima

Estabeleceu-se que as enzimas formar um complexo ligado aos seus reagentes (isto é, substratos ) durante o decurso da sua catálise e antes da libertação dos produtos. Isto pode ser simplesmente ilustradas, utilizando o mecanismo baseado no de Michaelis e Menten para uma reacção de um substrato, pela sequência de reacção:

Enzima + Substrato (complexo enzima-substrato) Enzima + Produto

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[1,7]

onde k 1 , k -1 e k 2 são as respectivas constantes de velocidade, tipicamente possuindo

valores de 10 5 - 10 8 M -1 s -1 , 1 - 10 4 s -1 e 1 - 10 5 s -1 , respectivamente ; o sinal de os subscritos indicam a direcção em que a constante de velocidade está a actuar. Por razões de simplicidade a reacção inversa, relativa à conversão de substrato para produto não está incluído neste esquema. Este é (1) admissíveis para o início da reacção quando não há nenhuma, ou pouca, o presente produto, ou (2) quando a reacção é eficazmente irreversível. Reações reversíveis são tratadas com mais detalhes mais adiante neste capítulo.A velocidade da reacção (v) é a taxa à qual o produto é formado.

(1,1)

onde [] indica a concentração molar do material fechado (isto é, [ES] é a concentração do complexo enzima-substrato). A taxa de alteração da concentração do complexo enzima-substrato é igual à taxa de formação do seu menos a taxa do seu automóvel, para a frente para se obter o produto ou para trás para regenerar substrato.

portanto:

(1,2)

Durante o curso da reacção, a enzima total no início da reacção ([E] 0 , no tempo zero) está presente quer como a enzima livre ([E]) ou o complexo ES ([ES]).

ou seja, [E] 0 = [E] + [ES] (1.3)

portanto:

(1,4)

Reunindo termos juntos,

isto dá:

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(1,5)

A equação diferencial de 1,5 é difícil de manusear, mas pode ser consideravelmente simplificado se pode presumir-se que o lado esquerdo é igual a [ES] sozinho. Este pressuposto é válido sob o estado estacionário aproximação suficiente mas desnecessariamente restritivo que a taxa de formação de ES é igual à sua velocidade de desaparecimento pela formação de produto e reversão para o substrato (ou seja, d [ES] / dt é zero). Além disso é válido quando a condição:

(1,6)

é válido. Isto ocorre durante uma parte substancial do curso de tempo de reacção ao longo de uma vasta gama de constantes cinéticas e concentrações de substrato e em baixo para concentrações enzimáticas moderadas. A variação em [ES], [d ES] / dt, [S] e [P], com o curso de tempo da reacção é mostrado na Figura 1.2, onde pode ser visto que a equação simplificada é válido durante a maior parte do reacção.

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. Figura 1.2 Simulação computacional das curvas de progresso da d [es] / dt (0-10 -7 escala M),

[ES] (0-10 -7 escala M), [S] (0-10 -2 escala M ) e [P] (0 - 10 -2 M escala) por uma reacção de obedecer a uma cinética de Michaelis-Menten, com k 1 = 10 6 M -1 s -1 , k -1 = 1000 s -1 , k 2 = 10

s -1 , [E] 0 = 10 -7 M e [S] 0 = 0,01 M. A simulação mostra três fases distintas para o curso de

tempo de reacção, de uma fase transiente inicial, que tem a duração de cerca de um milésimo de

segundo, seguido por um período mais fase de estado estacionário de cerca de 30 minutos, quando [ES] permanece constante, mas apenas uma pequena proporção do substrato reage. Isto é seguido

pela fase final, tendo cerca de 6 horas, durante o qual o substrato é completamente convertido em

produto. é muito menos do que [ES] durante ambas as duas últimas fases.

A equação de Michaelis-Menten (abaixo) é simplesmente derivadas a partir das

equações 1.1 e 1.5, substituindo K m para . K m é conhecida como a constante de Michaelis com um valor tipicamente no intervalo de 10 -1 - 10 -5 M. Quando k 2 << k -1 , K m é igual à constante de dissociação ( k-1 / k 1 ) do complexo de substrato da

enzima.

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(1,7)

ou, mais simplesmente

(1,8)

onde V max é a taxa máxima de reacção, o que ocorre quando a enzima está completamente saturada com substrato (ou seja, quando [S] é muito maior do que K m , V max é igual a k 2 [E], 0 , como o valor máximo [ ES] pode ter é [E] 0 quando

[E] 0 é menor que [S] 0 ). Equação 1.8 pode ser rearranjada para mostrar a dependência da taxa de reacção na proporção de [S] para K m ,

(1,9)

bem como a natureza da hipérbole retangular do relacionamento, tendo asymptotes na v = V max e [S] = -K m ,

(V max -v) (K m + [S]) = V max K m (1,10)

A concentração de substrato nestas equações é a concentração real no momento e, num sistema fechado, apenas será aproximadamente igual à concentração inicial de substrato ([S] 0 ), durante a fase inicial da reacção. Por isso, é usual utilizar estas equações para relacionar a velocidade inicial da reacção com a concentração inicial de substrato, e facilmente predeterminado, (figura 1.3). Isto evita também qualquer problema que possa ocorrer através da inibição do produto ou reversibilidade de reacção (ver mais tarde).

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Figura 1.3. Uma trama normalizada da taxa inicial (v 0 ) em função da concentração inicial de

substrato ([S] 0 ) para uma reacção de obedecer a cinética de Michaelis-Menten (equação 1.8). A

trama foi normalizada a fim de torná-lo mais geralmente aplicável traçando a taxa relativa de reacção inicial (v 0 / V max ) em função da concentração inicial de substrato em relação à constante

de Michaelis ([S] 0 / K m , mais vulgarmente designado a como , a concentração de substrato sem dimensão). A curva é uma hipérbole retangular com asymptotes em v 0 = V max e [S] 0 = -

K m . A tangente à curva na origem passa pelo ponto (v 0 = V máx ), ([S] 0 = K m ). A relação V max / K m é um parâmetro importante cinética que descreve a especificidade relativa de

uma quantidade fixa de enzima para o seu substrato (mais precisamente definida em termos

de k cat / K m ). A concentração do substrato, o que dá uma taxa de metade da velocidade máxima de reacção, é igual a K m .

Tem sido demonstrado que alguns enzimas seguir à equação de Michaelis-Menten longo de uma larga gama de condições experimentais. No entanto, continua a ser, de longe, a equação mais geralmente aplicáveis para descrever reações enzimáticas. Na verdade, pode ser aplicada de forma realista a um número de reacções que têm um mecanismo muito mais complexa do que a descrita aqui. Nestes casos Km permanece uma quantidade importante, característica da enzima e do substrato, correspondente à concentração do substrato necessária para metade das moléculas de enzima para se ligar ao substrato (e, portanto, fazendo com que a reacção prossiga a metade da sua

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velocidade máxima) mas o significado cinética preciso derivado anterior não podem ser titulares e pode ser enganosa. Nestes casos, o K m é provável que igualam uma relação muito mais complexa entre as várias constantes de taxa envolvidos no esquema de reacção. Mantém-se independente das concentrações da enzima e do substrato e indica o grau de ligação entre a enzima e o seu substrato para uma dada concentração de substrato, um K inferiorm indicando um maior grau de ligação. V max depende claramente

da concentração de enzima e, para alguns, mas não todas, as enzimas podem ser em grande parte independente do substrato específico utilizado. K m e V max tanto pode ser

influenciada pela carga e conformação da proteína e do substrato (s) que são determinados pelo pH, temperatura, força iónica e outros factores . É muitas vezes preferível substituir k cat para k 2 , onde V max = k gato [E], 0 , como o significado preciso de k 2 , acima, podem também ser enganadora. k cat também é conhecido como

o número de turnover como ele representa o número máximo de moléculas de substrato que a enzima pode 'virar' para produtos em um tempo definido (por exemplo,

os números de volume de negócios de amilase, glucoamilase e glicose isomerase são 500 s -1 , 160 s -1 e 3 s - 1 , respectivamente; uma enzima com uma massa molecular relativa de 60000 e actividade específica 1 mg L -1 tem um número de turnover de 1 s -1 ). A relação k cat / K m determina a taxa relativa de reacção a concentrações baixas de substrato, e é conhecida como a constante de especificidade . É também aparente a 2 nd constante de velocidade de ordem a baixas concentrações de substrato (ver Figura 1.3), onde

(1.11)

Muitas aplicações de enzimas envolvem sistemas abertos, onde a concentração de substrato permanece constante, devido à reposição, ao longo do curso de tempo de reacção. Isto é, é claro, a situação que prevalece frequentemente in vivo . Nestas

circunstâncias, a equação de Michaelis-Menten é obedecida uma gama ainda maior de concentrações de enzima do que o permitido em sistemas fechados, e é comumente usado para modelar sistemas cinéticos da enzima imobilizada (ver Capítulo 3).

As enzimas têm evoluído ao maximizar k cat / K m (ou seja, a constante de especificidade para o substrato) mantendo K m aproximadamente idêntica à concentração de substrato

encontrados naturalmente. Isto permite que a enzima para operar de forma eficiente e ainda exercer algum controlo sobre a velocidade da reacção.

A constante de especificidade é limitada pela taxa na qual os reagentes encontram um ao outro sob a influência de difusão. Para uma reacção de um único substrato, a taxa de encontro entre o substrato e a enzima é de cerca de 10 8 - 10 9 M -1 s -1 . A constante de especificidade de algumas enzimas abordar este valor, ainda que o intervalo dos valores determinados é muito larga (por exemplo, k cat / K m para a catalase é de 4 x 10 7 M -1 s -1 , enquanto que é 25 M -1 s -1 durante isomerase da glicose, e para outras enzimas varia de menos de 1 M -1 s -1 a superior a 10 8 M -1 s -1 ).

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Efeito do pH e da força iónica

As enzimas são moléculas anfotéricos contendo um grande número de grupos ácidos e básicos, situada principalmente na sua superfície. Os encargos sobre estes grupos podem variar, de acordo com as suas constantes de dissociação de ácido, com o pH do ambiente ( Tabela 1.1 ). Isto irá afectar o custo total líquido das enzimas e a distribuição de carga na sua superfície exterior, para além da reactividade dos grupos cataliticamente activas. Estes efeitos são especialmente importantes no bairro dos sítios ativos.Tomadas em conjunto, as alterações nas taxas de pH com afectar a actividade, solubilidade e estabilidade estrutural da enzima.

Tabela 1.1 . pK um s um e calores de ionização b dos grupos ionizantes comumente encontrados em enzimas.

Grupo Usual

pK umintervalo

Custo aproximado de

pH 7

Heats de ionização

(kJ mol -1 )

Carboxilo (C-

terminal, ácido glutâmico, ácido aspártico)

3-6 -1.0 5

Amónio (N-terminal) (lisina)

7-9 1,0 +45

9-11 1,0 +45

Imidazolilo (histidina)

5-8 0,5 +30

Guanidilo (arginina) 11-13 1,0 +50

Fenólicos (tirosina) 9-12 0.0 +25

Tiol (cisteína) 8-11 0.0 +25

um O pK um (definida como -Log 10 (K um )) é o pH ao qual metade dos grupos são ionizados. Note-se a semelhança entre o K um de um ácido e de K m de uma enzima, que é a concentração do substrato em que metade das moléculas de enzima ter ligado substrato. ( Voltar )

b Por convenção, o calor (entalpia) de ionização é positiva quando o calor é retirado da solução circundante (isto é, a reacção é endotérmica) pela dissociação dos iões de hidrogénio. ( Voltar )

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Haverá um pH, característica de cada enzima, em que a carga líquida na molécula é zero. Isto é chamado de ponto isoeléctrico (pi), na qual a enzima geralmente possui uma solubilidade mínima em soluções aquosas. De uma maneira semelhante ao efeito sobre as enzimas, a distribuição de carga e carga sobre o substrato (s), o produto (s) e coenzimas (onde aplicável) também será afectado por alterações de pH. O aumento da concentração de iões de hidrogénio será, além disso, aumentar a competição bem sucedida dos iões de hidrogénio para qualquer locais na enzima de ligação catiónico de metal, reduzindo a concentração de catião metálico ligado. Uma redução na concentração de iões de hidrogénio, por outro lado, leva a aumento da concentração de iões hidroxilo que competir com ligandos para as enzimas 'divalentes e trivalentes causando a sua conversão em hidróxidos e, em concentrações elevadas, hidroxilo, a remoção completa da enzima. A temperatura também tem um efeito marcado sobre ionisations, cuja extensão depende dos calores de ionização dos grupos particulares em causa ( Tabela 1.1 ). A relação entre a variação no pK um e a mudança de temperatura é determinada por um derivado da equação de Gibbs-Helmholtz:

(1.12)

em que T é a temperatura absoluta (K), R é a constante da lei de gás (8,314 JM -1 K -

1 ), H é o calor de ionização e a constante numérica (2,303) é o logaritmo natural de 10, como pKa um 's são baseados em logaritmos com base 10. Esta variação é suficiente para deslocar o pI de enzimas até uma unidade de pH no sentido de um menor aumento da temperatura de 50C.

Estas variações de carga, além de quaisquer consequentes alterações estruturais, pode ser refletido em mudanças na ligação do substrato, a eficiência catalítica e a quantidade de enzima ativa. Ambos V max e de K m vai ser afectada devido às modificações resultantes para as constantes cinéticas de k 1 , k -1 e k cat(k 2 no mecanismo de Michaelis-Menten), e a variação da concentração de enzima activa . O efeito do pH sobre a V max de uma reacção enzimática catalisada pode ser explicado com o uso, geralmente verdade, pressuposto de que apenas uma forma carregada de enzima é optimamente catalítica e, portanto, a concentração máxima do intermediário enzima-substracto não pode ser maior do que o concentração desta espécie. Em termos simples, assumir EH - é a única forma activa do enzima,

[ 1,8 ]

A concentração de EH - é determinada pelas duas dissociações

[ 1,9 ]

20

[ 1.10 ]

com

(1.13)

e

(1,14)

No entanto,

(1,15)

portanto:

(1.16)

Como a velocidade da reacção é dada por k 2 [EH - S] e esta é máxima quando [EH - S] é máximo (ou seja, quando [EH. - S] = [EH - ] 0 ):

(1,17)

O V max será maior quando

(1,18)

portanto:

(1,19)

Esta derivação envolveu uma série de simplificações sobre a situação real; ignora o efeito da ionização de substratos, os produtos e os complexos enzima-substrato e presume EH - é uma única espécie ionizado quando ela pode conter uma mistura de grupos ionizados diferente mas com carga global idêntica, embora o processo de

21

ligação do substrato tenderá para fixar as espécies iônicas necessárias. Ele, no entanto, produzir uma variação de taxa máxima com pH que dá a curva comumente encontrado 'em forma de sino "( Figura 1.4 ). Quando o esquema de reacção real é mais complexa, pode haver uma relação mais complexa entre V max e pH. Em particular, pode haver uma mudança no passo determinante da velocidade com o pH. Deve ser reconhecido que K m pode mudar com o pH de uma forma independente do V max , uma vez que geralmente envolve outros, ou adicionais, grupos ionizáveis. É claro que em menores concentrações de substrato não saturando as mudanças de actividade com pH pode ou não refletir as mudanças na V max . Deve também notar-se a partir da discussão anterior que a variação da actividade com o pH depende do sentido de reacção sob consideração. O pH óptimo pode muito bem ser diferente na direcção para a frente do que mostrado pela reacção inversa. Isto é particularmente visível quando as reações que liberam ou utilizam prótons são considerados (por exemplo, desidrogenases) onde não podem muito bem ser superior a 2 pH unidades diferença entre o pH ideal mostrado pelas taxas de frente e reações reverter.

Figura 1.4. Um diagrama esquemático de aplicação geral da variação na taxa de uma reacção

catalisada por enzima (V max ) com o pH da solução. O centro (pH ótimo) e amplitude dessa

"forma de sino 'curva depender das constantes de dissociação de ácido dos grupos relevantes na enzima. Deve notar-se que algumas enzimas têm perfis de pH da actividade que mostram pouca

similaridade com este diagrama.

A variação da actividade com o pH, dentro de um intervalo de 2-3 unidades de cada lado da pi, é normalmente um processo reversível. Os extremos do pH, no entanto, provocar um tempo e dependente da temperatura, essencialmente irreversível, a desnaturação. Em solução alcalina (pH> 8), pode haver destruição parcial dos resíduos

22

cisteína devido a catalisada por base reacções -eliminação, enquanto que, em soluções ácidas (pH <4), a hidrólise das ligações peptídicas lábeis, por vezes encontrada ao lado de resíduos de ácido aspártico , pode ocorrer. A importância do conhecimento sobre a variação da atividade com pH não pode ser mais enfatizado. No entanto, um número de outros factores pode significar que o pH óptimo do V max diagrama -pH pode não ser a escolha do pH em um processo tecnológico envolvendo enzimas. Estes incluem a variação de solubilidade do substrato (s) e produto (s), mudanças na posição de equilíbrio para uma reacção, a supressão da ionização de um produto para facilitar a sua divisão e recuperação para um solvente orgânico, e a redução da susceptibilidade a oxidação ou a contaminação microbiana. O principal factor de tal é o efeito do pH sobre a estabilidade da enzima. Esta relação é ainda mais complicada pela variação do efeito do pH com tanto a duração do processo e a temperatura ou perfil de temperatura-tempo. O parâmetro importante derivada destas influências é a produtividade da enzima (ou seja, a quantidade de substrato que é capaz de converter em produto). A variação de pH com a produtividade pode ser semelhante à do V max relação -pH mas as mudanças na composição da corrente e o tempo de contacto do substrato pode também fazer alguma contribuição. Em geral, a variação deve ser determinado de acordo com as condições do processo industrial. É possível alterar os perfis de pH da actividade de enzimas. A ionização dos ácidos carboxílicos envolve a separação dos grupos libertados de carga oposta. Este processo é incentivada dentro das soluções de maior polaridade e reduzido por soluções menos polares. Assim, reduzindo a constante dieléctrica de uma solução aquosa através da adição de um co-solvente de polaridade baixa (por exemplo, dioxano, etanol), ou por imobilização (ver Capítulo 3 ), aumenta o pKa de um dos grupos de ácido carboxílico. Este método é, por vezes, útil, mas geralmente não aplicável aos enzima reações catalisadas, pois pode causar uma mudança drástica na produtividade de uma enzima devido a desnaturação (mas veja Capítulo 7 ). O pK umdos grupos básicos não são igualmente afetados, pois não há separação de cargas, quando grupos básicos ionizar. No entanto, os grupos básicos protonados que são estabilizadas por grupos vizinhos carregados negativamente será estabilizado (ou seja, ter reduzido pK um ) por

soluções de baixa polaridade. As alterações na força iónica ( ) da solução pode também ter algum efeito. A força iónica é definida como metade da soma total da concentração (c i ) de todas as espécies iónicas (I) na solução vezes o quadrado da sua

carga (z i ); isto é. = 0,5 (c i z i 2 ).

Por exemplo, a força iónica de uma solução 0,1 M de CaCl 2 é 0,5 x (0,1 x 2 2 + 0,2 x 1 2 ) = 0,3 M. Na maior solução iónica força, cobrar separação é estimulado com uma concomitante redução do ácido carboxílico pK um s. Estas alterações extensivas, como eles podem ser, têm pouco efeito sobre a carga total da molécula de enzima em pH neutro e, portanto, só é susceptível de exercer uma pequena influência sobre o ponto isoeléctrico da enzima. Métodos de derivatização química estão disponíveis para converter cargas superficiais do positivo para o negativo e vice-versa. Verificou-se que uma única mudança na carga tem pouco efeito sobre o perfil de pH da actividade, a menos que seja no local activo. No entanto, se todas as lisinas são convertidos em carboxilatos (por

23

exemplo, por reacção com anidrido succínico) ou se todos os carboxilatos são convertidas em aminas (por exemplo, por acoplamento de etileno diamina por meio de uma carbodiimida, ver Capítulo 3 ) o perfil pode ser deslocado sobre um pH unidade na direcção de pH mais elevado ou inferior, respectivamente. A causa desses desvios é principalmente a estabilização ou desestabilização das taxas no local activo durante a reacção, e os efeitos são mais evidentes a baixa força iónica. Alguns, mais poderoso, métodos para mudar o perfil de pH-atividade são específicas de enzimas imobilizadas e descrito no Capítulo 3 .

A força iónica da solução que é um parâmetro importante que afecta a actividade da enzima. Isto é especialmente perceptível em catálise depende do movimento de moléculas carregadas em relação ao outro. Assim, tanto a ligação de substratos cobradas para enzimas e o movimento de grupos carregados dentro do sítio catalítico "ativo" será influenciada pela composição iônica do meio. Se a velocidade da reacção depende da abordagem de porções carregadas da seguinte relação aproximada pode segurar,

(1.20)

onde k é a constante de velocidade real, k 0 é a constante de velocidade a zero, a força iónica, z Uma ez Bsão as cargas electrostáticas das espécies reagentes, e Ié a força

iónica da solução. Se as cargas sejam opostas, em seguida, há uma diminuição na taxa de reacção com o aumento da força iónica enquanto que, se as cargas são idênticos, um aumento na taxa de reacção irá ocorrer (por exemplo, o passo de controlo da velocidade do mecanismo catalítico de quimotripsina envolve a abordagem de dois grupos carregados positivamente, 57 histidina + e 145 de arginina + causando um aumento significativo em k cat no aumento da força iónica da solução). Mesmo se uma relação mais complexa entre as constantes de velocidade e a força iónica se mantém, é claramente importante para controlar a força iónica das soluções em paralelo com o controlo de pH.

Efeito da temperatura e da pressão

Taxas de todas as reacções, incluindo aquelas catalisada por enzimas, sobem com o aumento da temperatura de acordo com a equação de Arrhenius.

(1,21)

onde k é a constante de velocidade cinética para a reacção, A é a constante de

Arrhenius, também conhecido como o factor de frequência, L * é a energia livre padrão de activação (kJ M -1 ) que depende da factores de entalpia e entropia, R é a constante de lei dos gases e T é a temperatura absoluta.Energias livres padrão típicos de ativação (15-70 kJ M -1 ) dá origem a aumentos na taxa por fatores entre 1,2 e 2,5 para cada 10C aumento da temperatura. Este factor para o aumento da velocidade de

24

reacção para cada aumento de 10 ° C na temperatura é geralmente indicada pelo termo Q 10 (isto é, neste caso, Q10 está dentro do intervalo 1,2-2,5). Todas as constantes de velocidade que contribuem para o mecanismo catalítico irá variar independentemente, resultando em alterações tanto K m e V max . Daqui resulta que, numa reacção exotérmica, a reacção inversa (tendo uma energia de activação superior) aumenta mais rapidamente com a temperatura de reacção para a frente. Isto, não só altera a constante de equilíbrio (ver equação 1,12), mas também reduz a temperatura óptima para a conversão máxima medida que a reacção progride. O inverso aplica-se para reacções endotérmicas, tais como a de isomerase de glucose (verreacção [1,5] ), onde a proporção de frutose em glucose, no estado de equilíbrio, aumenta de 1,00 para 1,17 a 55C em 80C.

Em geral, é preferível a utilização de enzimas em altas temperaturas, a fim de fazer uso deste aumento da taxa de reacção mais a protecção contra ela proporciona a contaminação microbiana. As enzimas, porém, são proteínas e sofrem essencialmente irreversível desnaturação (isto é. a alteração conformacional que implica uma perda de actividade biológica), a temperaturas acima daquelas a que se encontram normalmente expostos no seu ambiente natural. Estas reacções de desnaturação têm energias livres de padrão de activação de cerca de 200-300 kJ mol -1 (Q 10 no intervalo de 6-36), o que significa que, acima de uma temperatura crítica, há uma rápida taxa de perda de actividade ( Figura 1.5 ) . A perda real da atividade é o produto dessa taxa ea duração da incubação ( Figura 1.6 ). Isso pode ser devido a alterações covalentes, tais como a desaminação de resíduos de asparagina ou alterações não covalentes, tais como o rearranjo da cadeia de proteína. Inactivação por desnaturação pelo calor tem um efeito profundo sobre a produtividade enzimas ( Figura 1.7 ).

Figura 1.5. Um diagrama esquemático que mostra o efeito da temperatura sobre a actividade de uma enzima reacção catalisada. curto período de incubação; ----- longo

25

período de incubação. Note-se que a temperatura à qual parece haver actividade máxima varia com o tempo de incubação.

Figura 1.6. Um diagrama esquemático que mostra o efeito da temperatura sobre a estabilidade de uma enzima reacção catalisada. As curvas mostram a atividade percentual restante como o período de incubação aumenta. Do alto que representam aumentos iguais na temperatura de incubação (50C, 55C, 60C, 65C e 70C).

Figura 1.7. Um diagrama esquemático que mostra o efeito da temperatura sobre a produtividade de uma reacção catalisada por enzima. 55C; 60C; 65C. A produtividade óptima é visto a variar com o tempo do processo, o que pode ser determinado por outros factores adicionais (por exemplo, custos gerais). É muitas vezes difícil conseguir um controlo preciso da temperatura de um processo catalisado enzima e, sob estas circunstâncias, pode ser visto que é prudente errar no lado de baixa temperatura.

26

A desnaturação térmica de uma enzima pode ser modelada pela seguinte esquema de desactivação de série:

[1.11]

onde k d1 e K d2 são os coeficientes da taxa de desactivação de primeira ordem, E é a enzima nativa, que pode, ou não, ser uma mistura de equilíbrio de um número de espécies, caracterizada a estrutura ou actividade, e E 1 e E 2 são moléculas de enzima de actividade específica média em relação a E de A 1 e A2 . A 1 pode ser maior ou menor que a unidade (isto é, E 1 pode ter actividade mais elevada ou mais baixa do que E) Um passo que 2 é normalmente muito pequena ou zero. Este modelo permite que os raros casos que envolvem a enzima livre (por exemplo, a tirosinase) e os casos que envolvem um pouco plebeu enzima imobilizada (ver Capítulo 3), onde há uma pequena ativação inicial ou período de graça que envolve a perda insignificante discernível de atividade durante períodos de incubação curto, mas antes a desactivação mais tarde. Supondo que, no início da reacção:

(1,22)

e:

(1,23)

No instante t,

(1,24)

Decorre o esquema de reacção [1.11] ,

(1,25)

Integrando a equação 1.25 usando a condição de contorno na equação 1.22 dá:

(1,26)

A partir do esquema de reacção [1,11],

27

(1,27)

Substituindo [E] a partir da equação 1.26,

(1,28)

Integrando a equação 1.27 usando a condição de contorno na equação 1.23 dá:

(1,29)

Se o termo "atividade fraccionada» (A f ) é introduzido onde,

(1.30)

em seguida, substituindo [E 2 ] a partir da equação 1.24, dá:

1.31

portanto:

1,32

Quando ambos A 1 e A 2 são iguais a zero, os simples de primeira ordem resultados de expressão velocidade de desactivação

(1.33)

A meia-vida (t 1/2 ) de uma enzima é o tempo que leva para a actividade para reduzir à metade da actividade original (i, e. Uma f = 0,5). Se a inactivação do enzima obedece a equação 1,33, a meia-vida pode ser derivada simplesmente,

(1,34)

portanto:

(1,35)

28

Neste caso simples, a semi-vida da enzima é mostrada a ser inversamente proporcional à taxa de desnaturação.

Muitas preparações de enzimas, ambos gratuitos e imobilizados, parecem seguir este esquema de desativação do tipo série. No entanto, porque os dados de confiança e reprodutível é difícil de obter, os dados de inactivação deverá, em geral, ser considerada como sendo um pouco propensa a erros. Não é de estranhar que esses dados podem ser feitas para ajustar um modelo envolvendo quatro parâmetros determinados (A 1 , A 2 , k d1 e k D2 ). Apesar dessa possível reserva, equações 1.32 e 1.33 permanecem bastante útil e a teoria possui a vantagem definitiva da simplicidade. Em alguns casos, o tipo série de desactivação pode ser devido a micro-heterogeneidade estrutural, em que a preparação de enzima é constituída por uma mistura heterogénea de um grande número de formas estruturais afins. Estas podem ter sido formados durante o história passada da enzima durante a preparação e armazenagem devido a uma série de reacções secundárias, tais como a desamidação de um ou dois resíduos de asparagina ou glutamina, ou a proteólise limitada de intercâmbio de dissulfureto. Alternativamente, pode ser devido ao equilíbrio de estrutura quaternária ou a presença de variantes genéticas distintas. Em qualquer caso, a maior variabilidade ainda mais evidente será a cinética de inactivação do tipo série. O efeito prático disto é que geralmente k d1 é aparentemente muito maior que k d2 e A 1 é menor que a unidade.

A fim de minimizar a perda de actividade em armazenamento, mesmo temperaturas moderadas devem ser evitados. A maioria das enzimas são estáveis durante meses, se refrigerado (0 - 4C). Arrefecimento abaixo de 0 ° C, na presença de aditivos (por exemplo, glicerol), que evitar o congelamento, em geral, pode aumentar esta estabilidade de armazenamento ainda mais. Soluções enzimáticas de congelamento é melhor evitar, uma vez que muitas vezes provoca desnaturação devido ao estresse e pH variação causada pela formação de gelo cristal. As constantes de primeira ordem de desactivação são muitas vezes significativamente menor no caso de enzima-substrato, enzima-inibidor e complexos enzima-produtos que ajuda a explicar os efeitos estabilizadores substanciais de ligandos adequados, especialmente a concentrações onde existe pouco enzima livre (por exemplo, [S] >> K m ). Outros factores, tais como a presença de anti-oxidantes de tiol, pode melhorar a estabilidade térmica, em casos particulares.

Verificou-se que a desnaturação pelo calor de enzimas é essencialmente devido às interacções das proteínas com o ambiente aquoso. Eles são geralmente mais estáveis no concentrado, em vez de diluir, soluções. Em um estado predominantemente seco ou desidratado, eles permanecem ativos por períodos consideráveis, mesmo em temperaturas acima de 100C. Esta propriedade tem uma grande importância tecnológica e está sendo explorada pelo uso de solventes orgânicos (ver Capítulo 7 ).

As alterações de pressão também afetará as reações catalisadas enzima. Claramente qualquer reação envolvendo gases dissolvidos (por exemplo Oxigenases e descarboxilases) serão particularmente afectados pelo aumento da solubilidade do gás

29

em altas pressões. A posição de equilíbrio da reacção também será deslocado devido a qualquer diferença nos volumes molares entre os reagentes e produtos.No entanto, um, se bastante pequena, a influência adicional é devido às mudanças de volume que ocorrem durante enzimática de ligação e catálise. Algumas misturas de enzimas-reagentes podem sofrer reduções no volume, no montante de até 50 ml toupeira -1 durante a reação devido a restrições de conformação e as mudanças na sua hidratação. Este, por sua vez, pode conduzir a uma duplicação da kcat , e / ou uma redução para metade na K m para um aumento de 1000 vezes na pressão. Os efeitos relativos em k cat e K m depender das variações de volume e de ligação relativa durante a formação dos estados de transição da reacção.

Reacções reversíveis

Uma reacção enzimática reversível (por exemplo, a conversão de glicose em frutose, catalizada pela isomerase da glucose) pode ser representado pelo seguinte esquema de reacção onde a atravessa os estágios reversíveis de enzima-substrato (ES) a formação do complexo, a conversão enzima-produto (EP ) complexo e, finalmente, a dessorção do produto. Nenhuma etapa de controlo de taxa está completamente.

[1.12]

Os pares de equações simétricas podem ser obtidas pela alteração na concentração dos intermediários com o tempo:

(1,36)

(1,37)

Assumindo que não há nenhuma desnaturação, a concentração total de enzima deve permanecer constante e:

(1.38a)

portanto:

(1.38b)

coleta de termos [ES]

30

(1.39a)

(1.39b)

e,

(1.38c)

agrupando termos [EP]

(1.40a)

(1.40b)

Sob condições semelhantes às discutidas anteriormente para o mecanismo de Michaelis-Menten (por exemplo, sob as premissas de estado estacionário quando ambos d [ES] / dt e d [EP] / dt é zero, ou mais exactamente quando

(1,41)

e

(1,42)

são ambas verdadeiras. As seguintes equações podem ser derivados a partir da equação 1.39b utilizando a aproximação, dada por equações 1,41 e termos colectores.

(1.43a)

(1.43b)

31

(1.43c)

Além disso, as seguintes equações (simétricas ao acima) pode ser derivada a partir da equação 1.40butilizando a aproximação, dada pela equação de 1,42 , e recolhendo termos.

(1.44a)

(1.44b)

(1.44c)

Substituindo [ES] da equação 1.44c na equação 1.43a

(1.43d)

(1.43E)

(1.43f)

Removendo condições idênticas a partir de ambos os lados da equação:

(1,43 g)

Juntando todos os termos [EP]:

(1.43h)

(1.43i)

32

Além disso, a substituição de [EP] a partir da equação 1.43c na equação 1.44a

(1.44d)

(1.44e)

(1.44f)

Removendo condições idênticas a partir de ambos os lados da equação:

(1,44 g)

Juntando todos os termos [ES]:

(1.44h)

(1.44i)

A taxa de líquido de reacção (isto é. Taxa à qual o substrato é convertido no produto menos a taxa à qual o produto é convertido ao substrato) pode ser denotado por v onde,

(1,45)

Substituindo a partir de equações 1.43i e 1.44i

(1.46a)

Simplificando:

33

(1.46b)

Portanto,

(1,47)

onde:

(1,48)

(1,49)

(1,50)

(1,51)

Em equilíbrio:

(1,52)

e, porque o numerador da equação de 1,47 deve ser igual a zero,

(1,53)

onde [S] e [P] são as concentrações no equilíbrio do substrato e produto (em tempo infinito). Mas, por definição,

(1,54)

Substituindo a partir da equação 1.53

34

(1,55)

Este é o Haldane relação.

Portanto:

(1,56)

Se K m S e K m

P são aproximadamente iguais (por exemplo, a isomerase comercial imobilizada glicose, Sweetase, tem K m (glucose) de 840 mm e K m (frutose) de 830 mM a 70 ° C), e notando que o total quantidade de substrato e produto em qualquer altura, deve ser igual à soma do substrato e do produto no início da reacção:

(1,57)

Portanto:

(1,58)

Portanto:

(1,59)

onde:

(1,60)

K 'não é um verdadeiro constante cinética, uma vez que só é constante se o substrato inicial, bem como a concentração do produto é mantido constante.

Além disso,

(1,61)

35

Substituindo na equação 1,54 ,

(1,62)

Deixe [S # ] igualar a diferença de concentração entre a concentração real de substrato e a concentração de equilíbrio.

(1,63)

Portanto:

(1,64)

Substituindo na equação 1.47

(1,65)

Reorganizando a equação 1.55 ,

(1.66)

Portanto:

(1,67)

Portanto:

(1,68)

Onde

36

(1,69)

Portanto:

(1,70)

Portanto:

(1,71)

e:

(1,72)

Tal como no caso de K 'na equação 1.59 , K não é um verdadeiro constante cinética, uma vez que varia com [S] e, por conseguinte, a soma de [S] 0 e [P] 0 . É apenas se constante a concentração de substrato inicial mais produto é mantido constante. Por um argumento semelhante, mas simétrica, a taxa líquida de reação inversa,

(1,73)

com constantes definidas como anteriormente, mas por simetricamente troca de K m

P com K m S , V e rcom V f .

Ambas as equações ( 1.59 ) e ( 1.68 ) são úteis na modelagem de reações reversíveis, particularmente a reação tecnologicamente importante catalizada pela isomerase glucose. Eles podem ser mais desenvolvidas para dar estimativas de tempo de produtividade e para uso na comparação de diferentes configurações de reatores (ver capítulos 3 e 5 ).

Embora nunca uma enzima pode alterar a posição de equilíbrio de uma reacção catalisada, pois não tem qualquer efeito sobre o padrão de variação de energia livre envolvidos, que podem favorecer a reacção numa direcção, em vez de o seu inverso. Ele consegue isso por apenas obrigatório o produto (s) fracamente da ligação forte, como complexos enzima-reagente, os reagentes nesta direção preferencial, mas. A enzima está ligada com o reagente (s), favorecendo a sua reacção, deixando

37

pouco livre para catalisar a reacção no sentido inverso. É pouco provável, portanto, que a mesma preparação de enzima seria óptimo para catalisar uma reacção reversível em ambas as direcções.

A inibição de enzimas

Um certo número de substâncias podem causar uma redução da taxa de reacção catalisada por uma enzima. Alguns destes (por exemplo, ureia) desnaturantes de proteínas não-específicos. Outros, que actuam geralmente de forma bastante específica, são conhecidos como inibidores. A perda de actividade pode ser reversível, em que a actividade pode ser restabelecida por remoção do inibidor, ou irreversível, que a perda de actividade é dependente do tempo e não pode ser recuperado durante a escala temporal de interesse. Se a enzima inibida é totalmente inactivo, a inibição irreversível comporta-se como uma perda dependente do tempo da concentração de enzima (isto é. Baixa V max ), em outros casos, envolvendo inactivação incompleta, pode haver alterações dependentes do tempo em ambos K m e V max .Íons de metais pesados (por exemplo, mercúrio e chumbo) geralmente deve ser impedido de entrar em contato com as enzimas como eles costumam causar tal inibição irreversível através da ligação forte com a estrutura de aminoácidos.

Mais importante para a maioria dos processos catalisados por enzimas é o efeito de inibidores reversíveis.Estes são geralmente discutidos em termos de uma extensão simples para o esquema de reacção de Michaelis-Menten.

[1.13]

em que I representa o inibidor reversível e o inibidor (dissociação) Constantes de K i e K i são dadas por '

(1,74)

e,

(1,75)

38

Para os presentes fins, presume-se que nem E eu nem ES I pode reagir para formar o produto. Equilíbrio entre E I e ES I é permitido, mas não faz nenhuma contribuição líquida para a equação da taxa de como deve ser equivalente ao equilíbrio estabelecido por meio de:

[1.14]

A ligação de inibidores pode mudar com o pH da solução, conforme discutido anteriormente para o substrato de ligação, e resultar na variação independente de ambos K i e K i 'com o pH.

A fim de simplificar a análise substancialmente, é necessário que a taxa de formação de produto (k 2 ) é lento em relação ao estabelecimento do equilíbrio entre as espécies.

Portanto:

(1,76)

também:

(1,77)

onde:

(1,78)

portanto:

(1,79)

Substituindo a partir das equações (1.74), (1.75) e (1,76), seguido por simplificação, dá:

(1,80)

portanto:

39

(1,81)

Se a concentração total de enzima é muito menos do que a concentração total de inibidor (isto é, [E] 0 << [I ] 0 ), em seguida:

(1,82)

Esta é a equação utilizada geralmente para a inibição mista envolvendo tanto E I e ES I complexos (Figura 1.8a ). Um número de processos simplificados existir.

A inibição competitiva

K i "é muito maior do que a concentração total de inibidor e o ES eu complexo não é formado. Isto ocorre quando tanto o substrato e inibidor competem para a ligação ao local activo da enzima. A inibição é mais perceptível a baixas concentrações de substrato, mas pode ser superada em concentrações suficientemente elevadas de substrato como o V max permanece não afectada ( Figura 1.8b ). A equação de taxa é dada por:

(1,83)

em que K m app é a aparente K m para a reacção, e é dada por:

(1,84)

Normalmente, o inibidor competitivo tem alguma semelhança estrutural com o substrato, e muitas vezes é um produto da reacção ( inibição do produto , por exemplo, inibição de lactase por galactose), que podem causar uma perda substancial de produtividade quando são requeridos elevados graus de conversão. A equação de velocidade para a inibição produto é obtido a partir das equações (1,83) e (1,84).

(1,85)

40

Um efeito similar é observado com substratos concorrentes, bastante situação comum em conversões industriais, e especialmente relevante para hidrólises macromoleculares onde um número de diferentes substratos podem coexistir, todos com diferentes parâmetros cinéticos. A reação envolvendo dois co-substratos pode ser modelado pelo regime.

[1.15]

Ambos os substratos competem para o mesmo sítio catalítico e, por conseguinte, a sua ligação é mutuamente exclusivas e que se comportam como inibidores competitivos das reacções uns dos outros.Se as taxas de formação de produto são muito mais lenta do que a obtenção de equilíbrio (isto é, k 2 e k 4são muito menos do que k -1 k e -3 , respectivamente), a taxa de formação de P 1 é dada por :

(1,86)

e a taxa de formação de P 2 é dada pela

(1,87)

Se as concentrações de substrato são pequenos em relação aos seus K m valores:

(1,88)

Portanto, em uma situação competitiva usando o mesmo enzima e com ambos os substratos na mesma concentração:

(1,89)

41

onde e > neste caso simplificado. As taxas relativas de reacção estão na razão das constantes de especificidade. Se ambas as reacções produzem o mesmo produto (por exemplo, algumas hidrólises):

(1,90)

portanto:

(1,91)

Inibição não competitiva

K i é muito maior do que a concentração total de inibidor e o complexo EI não é formado. Isto ocorre quando o inibidor se liga a um sítio que só se torna disponível após o substrato (S 1 ) foi ligado ao sítio activo da enzima. Esta inibição é mais comumente encontrados em reacções de multi-substrato, onde o inibidor é competitivo em relação a um substrato (por exemplo, S 2 ), mas não competitiva em relação ao outro (por exemplo, S 1 ), em que o esquema de reacção pode ser representada pela

[1.16]

A inibição é mais notável em concentrações elevadas de substrato (ou seja, S 1 no esquema acima) e não pode ser ultrapassado tanto como o V max e de K m são igualmente reduzidos ( Figura 1.8c ). A equação da taxa é:

(1,92)

onde V max app e K m

app são a V aparente max e K m dada por:

(1,93)

e

42

(1,94)

Neste caso, a constante de especificidade não é afectada pela inibição. Normalmente, o inibidor não competitivo também tem alguma semelhança estrutural com um dos substratos e, novamente, é muitas vezes um produto de reacção.

. Figura 1.8 . Um diagrama esquemático que mostra o efeito de inibidores reversíveis da velocidade de reacções catalisadas por enzimas nenhuma inibição, (a) a inibição mista ([I] = K i = 0,5 K i '); inferior V max

app (= 0,67 V max ), maior K m app (K = 2 m ). (B) a inibição

competitiva ([I] = K i ); V max app inalterada (= Vmax ), maior K m

app (K = 2 m ). (C) inibição não competitiva ([I] = K i '); inferior V max

app (= 0,5 V max ) e Km app (K = 0,5 m ). (D) inibição

não competitiva ([I] = K i = K i '); inferior V max app (= 0,5 V max ), inalterada Km

app (= K m ).

Um caso especial de inibição não competitiva é inibição pelo substrato que ocorre em concentrações elevadas de substrato de cerca de 20% de todas as enzimas conhecidas (por exemplo, invertase é inibida por sacarose). Ela é causada principalmente por ligação mais do que uma molécula de substrato para um local activo destinado a apenas um, frequentemente por diferentes partes das moléculas de substrato que se ligam a diferentes sublocais dentro do local de ligação ao substrato. Se o complexo resultante é inactiva neste tipo de inibição provoca uma redução na velocidade da reacção, em concentrações elevadas de substrato. Ele pode ser modelada pela seguinte esquema

43

[1.17]

onde:

(1,95)

A suposição é feita que ESS não pode reagir para formar o produto. Segue-se a partir da equação ( 1.82 ) que:

(1,96)

Mesmo os valores bastante elevados para K S levam a uma estabilização da taxa de reação em concentrações elevadas de substrato, e menores K S valores causar uma inibição substancial ( Figura 1.9).

44

Figura 1.9. O efeito de inibição pelo substrato na taxa de uma reacção catalisada por enzima. Uma comparação é feita entre a inibição causada pelo aumento K S relativamente a K m . nenhuma inibição, KS / K m >> 100; K S / K m = 100; K S / K m = 10 ; K S / K m = 1. Pela natureza da ligação fazendo com que esta inibição, que é pouco provável que K S / K m <1.

Inibição não-competitiva

Ambos os complexos e EI ESI são formadas igualmente bem (ou seja, K i é igual a K i '). Isto ocorre quando o inibidor se liga a um local afastado do local de ligação ao substrato, causando uma redução da taxa catalítica. É muito raramente encontrada como um caso especial de inibição mista. A inibição fraccionada é idêntico em todas as concentrações de substrato e não pode ser superada pelo aumento da concentração do substrato, devido à redução em V max ( Figura 1.8d ). A equação de taxa é dada por:

(1,97)

onde V max app é dada por:

(1,98)

A diminuição na velocidade de reacção com o pH, descrito anteriormente, pode ser considerado como um caso especial de inibição não-competitiva; o inibidor ser o ião hidrogénio no lado ácido da óptimo ou o ião hidróxido no lado alcalino.

Determinação da V max e K m

É importante ter um conhecimento tão completa quanto possível das características de desempenho das enzimas, se eles são para ser utilizados mais eficientemente. A cinética parâmetros V max , K m , k cat / Km deve, portanto, ser determinado. Existem duas abordagens para este problema usando a curva de progresso da reacção (método integral) ou se as velocidades iniciais de reacção (método diferencial). Uso de qualquer um dos métodos depende do conhecimento prévio do mecanismo para a reacção e, pelo menos aproximadamente, as condições óptimas para a reacção. Se o mecanismo é conhecido e complexo, em seguida, os dados devem ser reconciliados com o modelo adequado (hipótese), geralmente por uso de uma análise computer-aided envolvendo um ponderados mínimos quadrados. Muitos desses programas de computador estão disponíveis no momento e, se não, a habilidade de programação envolvida é geralmente

45

bastante baixo. Se o mecanismo não é conhecido, as tentativas iniciais são geralmente feitos para ajustar os dados para o modelo de cinética de Michaelis-Menten. Combinando as equações ( 1.1 ) e ( 1.8 ),

(1.99)

que, na integração, usando a condição de contorno que o produto está ausente no tempo zero e substituindo [S] por ([S] 0 - [P]), se torna

(1.100)

Se a conversão fraccionada ( X ) é introduzida, onde

(1.101)

então a equação (1.100) pode ser simplificada para dar:

(1.102)

A utilização da equação ( 1.99 ) envolve a determinação da taxa inicial de reacção sobre uma ampla gama de concentrações de substrato. As taxas iniciais são utilizados, de modo que [S] = [S] 0 , a predeterminada e conhecida com precisão a concentração do substrato no início da reacção. A sua utilização também assegura que não há nenhum efeito de reversibilidade da reacção ou inibição produto que pode afectar o método integral com base na equação ( 1.102 ). A equação ( 1.99 ) pode ser utilizado directamente, utilizando um programa de computador, que envolve um dos mínimos quadrados ponderados encaixar, onde os parâmetros para determinar a relação hiperbólica entre a velocidade inicial da reacção e da concentração inicial de substrato (isto é. de K m e V max ) são escolhidos a fim de minimizar os erros entre os dados e o modelo, e é feita a suposição que os erros inerentes aos dados praticamente determinadas são normalmente distribuídas em torno do seu valor médio (livre de erros).

Em alternativa, o enredo linear direta pode ser usado ( Figura 1.10 ). Este é um método estatístico não paramétrico poderoso que depende da suposição de que quaisquer erros nos dados experimentalmente derivados são tão propensos a ser positivo (ou seja, muito alta) como negativo (ou seja, muito baixo). É prática comum para mostrar os dados obtidos pelos métodos estatísticos acima num dos três lotes linearizadas, derivadas a partir da equação ( 1.99 ) ( Figura 1.11 ). Destes, o lote duplo recíproco é o

46

preferido para testar a correção qualitativa de um mecanismo proposto, eo enredo Eadie-Hofstee é o preferido para a descoberta de desvios de linearidade.

Figura 1.10. O enredo linear direta. Um gráfico da taxa inicial da reacção em função da concentração inicial de substrato, também mostra a maneira como as estimativas podem ser feitas directamente do K me V max . Cada par de pontos de dados pode ser utilizada para fornecer uma estimativa independente destes parâmetros (ou seja, n (n-1) / 2 estimativas de pontos de dados com n diferindo [S] 0 ). Estas estimativas são determinadas a partir das interseções das linhas que passam pelos pontos (x, y) (- [S] 0 , 0) e (0 v,); cada intersecção formando uma estimativa separada do K m e V max . Os cruzamentos são classificados separadamente, a fim de valor de ambos K aumentando m e V max e os valores medianos tomadas como base as melhores estimativas para esses parâmetros. O erro nestas estimativas podem ser simplesmente determinadas a partir de sub-intervalos de estas estimativas, a largura da sub-gama depende da precisão necessária para o erro e o número de pontos de dados na análise. Neste exemplo, existem sete pontos de dados e, portanto, 21 Estimativas para ambos K m e V max . A lista de classificação das estimativas para K m (MM) é 0.98,1.65, 1,68, 1,70, 1,85, 1,87, 1,89, 1,91, 1,94, 1,96, 1,98 , 1,99, 2,03, 2,06, 1,12, 2,16, 2,21, 2,25, 2,38 , 2,40, 2,81, com um valor médio de 1,98 mM. O K m deve estar entre as 4 (1,70 mM) e 18 (2,25 mM) estimativa em um nível de confiança de 97% (Cornish-

Bowden et al. , 1978).A lista das estimativas para V max ( m.min -1 ) é classificada separadamente como 3,45, 3,59, 3,80, 3,85, 3,87, 3,89, 3,91, 3,94, 3,96, 3,96, 3,98 , 4,01, 4,03, 4,05, 4,13, 4,14, 4,18, 4,26, 4,29, 4,35, com um valor médio de

47

3,98 m.min -1 . O V max deve estar entre as 4 (3,85 m.min -1 ) e 18 (4,18 m.min -1 ) estimativa em um nível de confiança de 97%. Pode ser visto que as estimativas periféricas têm pouca ou nenhuma influência sobre os resultados. Esta é uma grande vantagem sobre os procedimentos estatísticos menos quadrados, onde os pontos de dados falsos causam efeitos fortemente tendenciosas.

Figura 1.11. Três formas em que a relação hiperbólica entre a velocidade inicial da reacção e da concentração de substrato inicial

podem ser reorganizadas para dar parcelas lineares. Os exemplos são desenhados usando K m = 2 mM e V max = 4 M min -1 .

(A) Lineweaver-Burk (double-recíproca) lote de 1 / v contra 1 / [S] 0 dando intercepta em 1 / V max e -1 / Km

(1.103)

(B) Eadie-Hofstee lote de v contra v / [S] 0 dando intercepta na V max e V max / K m

48

(1.104)

c) Hanes-Woolf () lote de meio recíproca de [S] 0 / v contra [S] 0 intercepta dando a K m / V max e K m .

(1,105)

49

A curva de progresso da reacção ( Figura 1.12 ) pode ser usado para determinar a constante de especificidade (k cat / K m ), fazendo uso da relação entre o tempo de reacção e conversão fraccionada (ver equação ( 1.102 ). Isto tem a vantagem sobre a utilização das taxas iniciais (acima) em que há menos determinações precisam de ser feito, possivelmente apenas uma curva de progresso é necessária, e por vezes a velocidade inicial da reacção é bastante difícil de determinar devido à sua rápida descida. Se apenas a parte inicial de a curva do progresso, ou um seu derivado, é utilizado na análise, este procedimento pode ser utilizado mesmo em casos em que há inibição competitiva pelo produto, ou em que a reacção é reversível.

50

Figura 1.12. Um gráfico esquemático que mostra a quantidade de produto formado (produtividade) contra o tempo de reacção, num sistema fechado. A constante de especificidade pode ser determinada por um ajuste ponderada menos ao quadrado dos dados para a relação dada pela equação (1.102).

O tipo de inibição e as constantes de inibição pode ser determinada a partir do efeito de diferentes concentrações de inibidor sobre a aparente K m , V max e k cat / K m , embora algumas parcelas mais especializados não existem (por exemplo, Cornish-Bowden, 1974 ).

Resumo e Bibliografia do Capítulo 1

a. Enzimas são catalisadores específicos de vasto alcance e utilidade. b. A sua actividade é regulada pela sua estrutura e do ambiente físico. c. Cuidados devem ser tomados em relação à interpretação de unidades reportados

de atividade enzimática e as condições necessárias para a máxima produtividade. d. As enzimas podem perder a sua atividade catalítica reversível ou

irreversivelmente devido a desnaturação ou inibição, dependente das condições

e. Os valores de K m , V max , constantes de especificidade, o pH óptimo e a velocidade de desnaturação térmica são todos de importância e utilidade para enzima tecnologia

Referências e Bibliografia

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Fontes de enzimas

Biologicamente enzimas activas podem ser extraídos a partir de qualquer organismo vivo. Uma ampla gama de fontes são usadas para a produção de enzima comercial de Actinoplanes para Zymomonas , do espinafre para veneno de cobra. Dos cem ou

mais enzimas sendo usado industrialmente, mais de metade são de fungos e leveduras e mais de um terço são de bactérias com o restante dividido entre animais (8%) e planta (4%) fontes ( Tabela 2.1 ). Uma muito maior número de enzimas podem ser utilizados na análise química e diagnóstico clínico. As fontes não microbianas proporcionar uma proporção maior destas, no momento presente. Os micróbios são preferidos para plantas e animais, como fontes de enzimas, porque:

1. eles são geralmente mais baratos de produzir.

52

2. seu conteúdo de enzimas são mais previsíveis e controláveis, 3. fornecimento regular de matéria-prima de composição constante são mais

facilmente arranjado, e

4. tecidos vegetais e animais contêm materiais mais nocivos do que os micróbios, incluindo phecompostos nolic (de plantas), inibidores de enzimas endógenas e proteases.

Estão sendo feitas tentativas para superar algumas destas dificuldades com o uso de cultura de células animais e vegetais.

Tabela 2.1 . Algumas enzimas industriais importantes e suas fontes.

Enzyme um Número

CEb Fonte

Intra / extra CELULARESc

Escala de produção d

Utilização industrial

Enzimas de Animais

Catalase 1.11.1.6 Fígado Eu - Comida

Chymotrypsin 3.4.21.1 Pâncreas E - Couro

Lipase e 3.1.1.3 Pâncreas E - Comida

Coalho f 3.4.23.4 Abomaso E + Queijo

Tripsina 3.4.21.4 Pâncreas E - Couro

Enzimas de plantas

Actinidin 3.4.22.14 Kiwis E - Comida

amilase 3.2.1.1 Cevada maltada E +++ Preparação

-amilase 3.2.1.2 Cevada maltada E +++ Preparação

Bromelina 3.4.22.4 Latex Pineapple E - Preparação

-glucanase g 3.2.1.6 Cevada maltada E ++ Preparação

Ficina 3.4.22.3 Latex Fig E - Comida

Lipoxigenase 1.13.11.12 Soja Eu - Comida

Papaína 3.4.22.2 Latex Mamão E ++ Carne

Enzimas bacterianas

amilase 3.2.1.1 Bacilo E +++ Amido

-amilase 3.2.1.2 Bacilo E + Amido

Asparaginase 3.5.1.1 Escherichia coli Eu - Saúde

A glicose isomerase h 5.3.1.5 Bacilo Eu ++ Xarope de frutose

A penicilina amidase 3.5.1.11 Bacilo Eu - Farmacêutico

Proteasei 3.4.21.14 Bacilo E +++ Detergent

Pullulanasej 3.2.1.41 Klebsiella E - Amido

Fungal enzymes

53

amilase 3.2.1.1 Aspergillus E ++ Baking

Aminoacylase 3.5.1.14 Aspergillus Eu - Farmacêutico

Glucoamylasek 3.2.1.3 Aspergillus E +++ Amido

Catalase 1.11.1.6 Aspergillus Eu - Comida

Cellulase 3.2.1.4 Trichoderma E - Waste

Dextranase 3.2.1.11 Penicillium E - Comida

Glucose oxidase 1.1.3.4 Aspergillus Eu - Comida

Lactasel 3.2.1.23 Aspergillus E - Dairy

Lipase e 3.1.1.3 Rhizopus E - Comida

Rennetm 3.4.23.6 Mucor miehei E ++ Queijo

Pectinasen 3.2.1.15 Aspergillus E ++ Drinks

Pectin lyase 4.2.2.10 Aspergillus E - Drinks

Proteasem 3.4.23.6 Aspergillus E + Baking

Raffinaseo 3.2.1.22 Mortierella Eu - Comida

Yeast enzymes

Invertasep 3.2.1.26 Saccharomyces I/E - Confectionery

Lactasel 3.2.1.23 Kluyveromyces I/E - Dairy

Lipase e 3.1.1.3 Candida E - Comida

Raffinaseo 3.2.1.22 Saccharomyces Eu - Comida

a Os nomes de uso comum são dadas. Como a maioria das enzimas industriais são constituídos por misturas de

enzimas, estes nomes podem variar em relação aos nomes recomendados de seu componente principal. Sempre que

necessário, os nomes recomendados deste componente principal é dado abaixo.

B, o número CE do componente principal.

c I - enzima intracelular; E - enzima extracelular.

d +++> 100 ton ano-1; ++> 10 ton ano-1; +> 1 ton ano-1; - <1 ton ano-1.

e triacilglicerol lipase;

f quimosina;

54

g endo-1,3 (4) -b-glucanase;

h xilose isomerase;

i subtilisina;

j-dextrina uma endo-1,6-a-glucosidase;

k 1,4-glucano um-glicosidase;

l b-galactosidase;

m proteinase aspártica microbiana;

n poligalacturonase;

o a-galactosidase;

p b-frutofuranosidase.

Na prática, a grande maioria das enzimas microbianas vir de um número muito limitado de géneros, espécies de

Aspergillus, que as espécies de Bacillus e Kluyveromyces (também chamado Saccharomyces) espécies predominantes.

A maioria das estirpes utilizadas, quer tenham sido empregadas pela indústria de alimentos por muitos anos ou que

tenham sido derivados dessas cepas por mutação e seleção. Existem muito poucos exemplos da utilização industrial de

enzimas que têm sido desenvolvidos para uma tarefa. Brilhantes exemplos de tais empreendimentos são a produção

de xarope de alta frutose utilizando isomerase glucose e à utilização de pullulanase na hidrólise do amido.

Os produtores de enzimas industriais e seus clientes irão compartilhar os objetivos comuns da economia, eficácia e

segurança. Eles vão querer ter estirpes de alto rendimento de micróbios que fazem a enzima constitutiva e segregam -

lo em seu meio de crescimento (enzimas extracelulares). Se a enzima não é produzida constitutivamente, de indução

tem de ser rápida e barata. Produtores procurará utilizar cepas de micróbio que são conhecidos por serem geralmente

55

seguro. Os usuários vão pagar pouco em conta a maneira em que a enzima é produzida, mas vai insistir em ter

preparações que têm uma actividade conhecida e manter essa atividade por longos períodos, armazenados à

temperatura ambiente ou com refrigeração de rotina. Eles dão pouca atenção para a pureza da preparação de enzima,

desde que ele não contém materiais (ou enzimas) que não interfiram com o seu processo. Os produtores e os usuários

vão querer ter as enzimas em formas que apresentam um risco mínimo para aqueles que manipulam-los ou consumir

seu produto.

O desenvolvimento de enzimas comerciais é uma empresa especializada que é geralmente realizada por um punhado

de empresas que têm altas habilidades em

o rastreio de enzimas novas e melhoradas,

de fermentação para a produção da enzima,

purificações grandes enzima escala,

formulação de enzimas para venda,

ligação do cliente, e

lidando com as autoridades reguladoras.

Triagem para novas enzimas

Se a reacção é termodinamicamente possível, é provável que exista uma enzima que é capaz de catalisar ele. Uma das principais habilidades de empresas de enzimas e laboratórios acadêmicos devidamente financiados é a triagem rápida e eficaz em termos de custos de culturas microbianas para atividades enzimáticas. Amostras naturais, geralmente solo ou material de composto encontrado perto altas concentrações de substratos susceptíveis, são usados como fontes de culturas. Não é incomum em congressos internacionais de tecnólogos de enzimas para ver representantes de empresas de enzimas coletando amostras de solo a ser exibido mais tarde, quando eles retornam para seus laboratórios.

A primeira fase do processo de triagem para as enzimas comerciais é o despiste de ideias, isto é, para determinar a necessidade comercial potencial para uma nova enzima, para estimar a dimensão do mercado e decidir, aproximadamente, a quantidade de potenciais utilizadores do enzima será capaz para dar ao luxo de pagar por isso. Em alguns casos, a determinação do valor potencial de uma enzima não é fácil, por exemplo, quando pode ser utilizado para produzir uma substância totalmente inovadora. Em outros casos, por exemplo quando a nova enzima poderia ser usado para melhorar um processo existente, o seu valor potencial podem ser avaliadas em

56

termos de forma muito precisa. Em ambos os casos, um fluxo de caixa acumulado deve ser estimado, equilibrando a triagem e de capitais de investimento custos iniciais incluindo juros, responsabilidade fiscal e depreciação, contra os lucros esperados a longo prazo.Conta total deve ser feita de inflação, da variação de preço de matéria-prima e fonte, publicidade e outros custos projetados. Além disso, a probabilidade de concorrência de mercado potencial e as mudanças nos fatores políticos ou legais devem ser considerados. Normalmente, a sensibilidade do projecto para mudanças em todas estes factores devem ser estimado, por conjecturas informado, a fim de avaliar o factor de risco envolvido. Re-avaliação financeira deve ser frequentemente realizadas durante o processo de desenvolvimento para verificar se ele ainda constitui uma utilização eficiente dos recursos.

Se o acordo for alcançado, provavelmente depois de discussões com potenciais utilizadores, que o trabalho experimental seria comercialmente justificável, a próxima etapa envolve a localização de uma fonte da enzima necessária. O trabalho do laboratório é caro em mão de obra de forma tão clara, vale a pena usar todas as bases de dados disponíveis para procurar menção da enzima na literatura acadêmica e patentes. As culturas podem então ser procurada de todas as fontes de modo reveladas. Algumas preparações de enzimas comerciais são fontes muito ricas de outros do que a enzima que está sendo oferecido para venda, revelando tais preparações como potenciais fontes de baixo custo que vale a pena investigar enzimas.

Se essas primeiras pesquisas não forem bem sucedidos, é provável que seja necessário para triagem de novas estirpes de microrganismos capazes de realizar a transformação necessária. Isso não deve ser uma tela de "cega": normalmente haverá alguma fonte de micróbios que poderiam ter sido expostas por incontáveis gerações com as condições que a nova enzima deve suportar ou a produtos químicos que é obrigada a modificar. Assim, thermophiles são procurados em fontes termais, osmophiles em fábricas de açúcar, organismos capazes de metabolizar conservantes de madeira nos pátios de madeira e assim por diante. Um exemplo clássico de detecção de uma enzima por rastreio inteligente foi a descoberta de uma enzima degradadora de cianeto comercialmente útil nos micróbios patogénicos de plantas que contêm glicósidos cianogénicos.

A identificação de uma fonte microbiana de uma enzima é de modo algum o fim da história. As propriedades da enzima deve ser determinada; ou seja, a temperatura óptima para a produtividade, o perfil de estabilidade da temperatura, pH óptimo e estabilidade, constantes cinéticas (K m , V max ), se houver substrato ou a inibição do produto, e a capacidade para resistir a componentes de matéria-prima esperado, além do substrato. Uma equipe de cientistas, engenheiros e contabilistas devem então considerar os próximos passos. Se qualquer um desses parâmetros é insatisfatório, a tela deve continuar até que as enzimas melhoradas estão localizados. Agora que a engenharia de proteínas (ver Capítulo 8) pode ser seriamente contemplada, uma enzima com valor potencial suficiente poderia ser melhorado "desde a concepção" para superar uma ou duas falhas. No entanto, isso levaria muito tempo, no nível atual de

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conhecimento e habilidade, de modo ainda mais a triagem de micróbios a partir de fontes selecionadas provavelmente seria considerado mais vantajoso.

Uma vez que uma enzima com propriedades adequadas tenha sido localizada, várias decisões devem ser feitas em relação à aceitabilidade do organismo para as autoridades reguladoras, a produtividade do organismo, e o modo pelo qual a enzima é para ser isolado, utilizado (livre ou imobilizada) e, se necessário, purificado. Se o organismo é inaceitável do ponto de vista regulatório existem duas opções;para eliminar esse organismo completo e continuar a operação de crivação, ou para clonar a enzima num organismo aceitável. A última abordagem é cada vez mais atraente, especialmente como a clonagem também pode ser utilizado para aumentar a produtividade do processo de fermentação. A clonagem também pode ser atraente quando o organismo originalmente produzir a enzima é aceitável do ponto de vista da saúde e segurança, mas cuja produtividade é inaceitável (ver Capítulo 8). No entanto, ainda não é a clonagem de rotina e bem-sucedidos por isso ainda é uma excelente caso a ser feito por aplicação de técnicas de mutação e de isolamento convencionais para a selecção das estirpes melhoradas. Deve notar-se que, embora a tecnologia para a clonagem de isomerase de glucose em organismos de rotina '' é conhecido, que ainda não tenha sido aplicada. Várias das preparações isomerase de glicose utilizados comercialmente consistem de células inteiras, ou fragmentos de células, das estirpes seleccionadas de espécies detectada originalmente por despistagem.

O uso de enzimas imobilizadas (ver Capítulo 3 ) já está familiarizado com a indústria e as suas vantagens são bem reconhecidos por isso a praticidade de usar as novas enzimas de forma imobilizado será determinada no início do procedimento de triagem. Se o enzima é produzido intracelularmente, a viabilidade do uso sem isolamento e purificação serão seriamente considerada e estirpes seleccionadas pela sua receptividade para usar neste modo.

Ressalta-se que haverá um diálogo constante entre os cientistas de laboratório e engenheiros de processos bioquímicos desde as primeiras fases do processo de seleção. Uma vez que os engenheiros bioquímicos estão convencidos de que os seus critérios iniciais de produtividade, atividade e estabilidade podem ser cumpridas, a cepa selecionada (s) de micróbio serão cultivadas em condições de planta piloto.É somente através da aplicação do tipo de equipamento utilizado em plantas em escala real que precisa custeio de processos podem ser alcançados. Estudos-piloto provavelmente irá revelar as imperfeições, ou pelo menos as áreas de ignorância, que deve ser corrigido na escala de laboratório. Se isso for possível, a planta piloto irá produzir amostras da preparação de enzima a ser utilizada por clientes que pode muito bem ser também na fase de instalação piloto para o desenvolvimento do processo de utilização de enzima. A planta piloto enzima também produz amostras para estudos toxicológicos e de segurança, desde que o processo de piloto é exactamente similar ao da operação em grande escala.

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Triagem para novas enzimas é caro para que a propriedade intelectual gerados devem ser protegidos contra cópia pelos concorrentes. Isto é geralmente feito por patentear a enzima ou o seu método de produção ou, de forma mais útil, o processo no qual é para ser utilizado. Patenteamento será iniciada logo que há evidências de que uma descoberta inovadora foi feita.

Mídia para a produção da enzima

Descrição detalhada do desenvolvimento e utilização de fermentadores para o cultivo em grande escala de microrganismos para a produção da enzima está fora do âmbito deste volume, mas o uso de meios de comunicação menção é apropriado porque este tem uma influência sobre o custo da enzima e porque os componentes dos meios frequentemente encontrar seu caminho em preparações de enzimas comerciais.Detalhes de componentes utilizados em caldos de fermentação à escala industrial para a produção da enzima não são prontamente obtidos. Isso não é inesperado, pois os fabricantes não têm nenhum desejo de revelar informações que possam ser de valor técnico ou comercial para os seus concorrentes. Além disso, alguns componentes de suporte pode ser alterada de lote para lote quanto a disponibilidade e custo de, por exemplo, matérias-primas de hidrato de carbono alterado. Tais mudanças se revelam em diferenças muitas vezes bastante profundas na aparência de lote para lote de uma única enzima de um único produtor. Os efeitos das variações de matérias-primas deve ser considerado em relação ao tratamento a jusante. Se esta variabilidade é susceptível de reduzir significativamente a eficiência da metodologia padrão, pode ser económico utilizar um meio definido mais caros da composição facilmente reprodutível.

Media claramente definidos geralmente estão fora de questão para o uso em larga escala por razões de custos, mas pode ser perfeitamente aceitável quando as enzimas são produzidas para fins de alto valor, tais como análise ou terapia médica onde preparações muito puras são essenciais. Meios complexos menos definidos são compostos de ingredientes seleccionados com base no custo e disponibilidade, bem como a composição. Os resíduos e subprodutos das indústrias alimentares e agrícolas são muitas vezes os principais ingredientes. Assim, melaço, licor de milho, destilados solúveis e farelo de trigo são importantes componentes de meios de fermentação que fornecem carboidratos, minerais, nitrogênio e algumas vitaminas. Hidratos de carbono extra é normalmente fornecido como amido, por vezes, refinado, mas muitas vezes simplesmente como grãos de cereais chão. Sais de farelo de soja e de amônio são frequentemente utilizadas fontes de nitrogênio adicional. A maior parte destes materiais variam em qualidade e composição de lote para lote, causando alterações na produtividade enzima.

Preparação de enzimas

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Os leitores de trabalhos relacionados com a preparação de enzimas para fins de investigação estarão familiarizados com as tabelas que detalham as etapas de purificação. Muitas vezes, a enzima pode ser purificada a várias centenas de vezes mas o rendimento da enzima pode ser muito fraca, muitas vezes abaixo de 10% da actividade do material inicial ( Tabela 2.2 ). Em contraste, as enzimas industriais será purificado tão pouco quanto possível, as únicas outras enzimas e materiais que possam interferir com o processo a que a enzima é o de catalisar, vai ser removido. Purificação desnecessário será evitado como cada etapa adicional é dispendiosa em termos de equipamentos, mão de obra e perda de atividade enzimática. Como resultado, algumas preparações enzimáticas comerciais consistem essencialmente de caldo concentrado da fermentação, além de aditivos para estabilizar a actividade da enzima.

Tabela 2.2 . O efeito do número de passos na produção e custos de um processo de purificação típico enzima. As hipóteses realistas são feitos que os rendimentos da etapa são de 75%, purificações passo são os custos de três vezes e step são 10% dos custos iniciais (mais tarde etapas de purificação geralmente são intrinsecamente mais caros, mas são necessariamente de menor escala).

Passo Peso

relativo Rendimento

(%) A actividade específica

Custo total

Custo por peso

Custo por atividade

1.000 100 1 1.00 1 1.00

1 0.250 75 3 1.10 4 1,47

2 0,063 56 9 1.20 19 2.13

3 0,016 42 27 1.30 83 3.08

4 0,004 32 81 1,40 358 4,92

5 0,001 24 243 1.50 1536 6,32

O teor de enzima necessária deve ser tão alta quanto possível (por exemplo, 10% w / w da proteína), a fim de facilitar a tarefa de processamento a jusante. Isto pode ser conseguido através do desenvolvimento das condições de fermentação ou, muitas vezes, mais dramaticamente, por engenharia genética. Pode muito bem ser economicamente viável para passar algum tempo clonagem cópias extras do gene necessário juntamente com um poderoso promotor de volta para o organismo produzir a fim de obter 'over-produtores "(ver Capítulo 8).

É importante que a actividade máxima é retido durante a preparação de enzimas. Inactivação do enzima pode ser causada pelo calor, de proteólise, o pH sub-óptimo, oxidação, desnaturantes, inibidores irreversíveis e perda de cofactores ou coenzimas. Destes inactivação pelo calor, que, em conjunto com os efeitos de pH associados, é provavelmente a mais significativa. É provável que ocorra durante a extração e purificação da enzima se refrigeração insuficiente está disponível

60

(ver Capítulo 1 ), mas o problema é menor quando se prepara enzimas termófilas. A proteólise é mais provável de ocorrer nas primeiras fases de extracção e purificação em que as proteases responsáveis para o volume de proteína em células vivas ainda estão presentes. É também a razão principal para a inactivação da enzima por contaminação microbiana. Nas suas conformações nativas, enzimas têm domínios altamente estruturadas, que são resistentes ao ataque por proteases, porque muitos dos ligações peptídicas são inacessíveis mecanicamente e porque muitas proteases são altamente específicos. As chances de uma ligação peptídica suscetíveis em um domínio estruturado estar disponível para o ataque protease são baixos. '' Entalhes individuais por proteases nestas circunstâncias podem ter pouco efeito imediato sobre a conformação da proteína e, por conseguinte, a actividade. O efeito, no entanto, podem reduzir severamente a estabilidade conformacional da enzima ao calor ou a variação do pH o que reduz grandemente a sua estabilidade operacional. Se o domínio é desdobrada sob estas condições alteradas, toda a cadeia de polipéptido pode estar disponível para a digestão enzimática e o mesmo, específico, a protease pode destruí-lo. É evidente que a melhor maneira de prevenir a proteólise é remover rapidamente, ou inibir, a atividade da protease. Antes isto pode ser conseguido é importante para manter as preparações enzimáticas frio para manter a sua conformação nativa e retardar qualquer acção de proteases que podem ocorrer.

Algumas enzimas intracelulares são utilizados comercialmente, sem isolamento e purificação, mas a maioria das enzimas comerciais são produzidos extracelularmente pelo micróbio ou planta ou devem ser libertados a partir das células em solução e posteriormente tratados ( Figura 2.1 ). Separação sólido / líquido é geralmente necessário para a separação inicial da massa celular, a remoção de detritos celulares após a ruptura das células e a recolha dos precipitados. Isto pode ser conseguido por filtração, centrifugação ou partição bifásica aquosa. Em geral, a filtração e sistemas bifásicos aquosos são usadas para remover as células não desejadas ou detritos celulares enquanto que a centrifugação é o método preferido para a recolha de material sólido necessário.

Figura 2.1. Diagrama de fluxo para a preparação de enzimas.

61

Centrifugação

A centrifugação separa com base no tamanho de partícula e a diferença de densidades entre as fases líquida e sólida. A sedimentação do material num campo centrífugo pode ser descrito pela

(2,1)

em que v é a taxa de sedimentação, d é o diâmetro da partícula, ρ s é a densidade da

partícula, ρ l é a densidade da solução, é a velocidade angular em radianos s -1 , r é o

raio de rotação, é a dinâmica viscosidade, F s é um fator de correção para a interação

de partículas durante a colonização dificultado e é um fator de forma (= 1 para

62

partículas esféricas). F s depende da fracção de volume dos sólidos presentes; aproximadamente igual a 1, 0,5, 0,1 e 0,05 para 1%, 3%, 12% e 20% de fracção de volume de sólidos, respectivamente. Apenas o material que chega a uma superfície, durante o escoamento através de centrífugas contínuas será removida da matéria-prima de centrifugação, a eficiência em função do tempo de residência no interior da centrifugadora e da distância necessária para a sedimentação (D). Este

tempo de permanência será igual ao caudal volumétrico ( ), dividida pelo volume da centrífuga (V). O rendimento máximo de uma centrífuga para uso eficiente é dada por

(2,2)

A eficiência do processo é visto depender da fracção do volume de sólidos, a superfície

eficaz de clarificação (V / D) e o factor de aceleração ( 2 r / g, em que g é a constante gravitacional, 981 centímetros s -2 ; um rotor raio de 25 centímetros girando a 1 rev s -1 tem um factor de aceleração de aproximadamente 1 L). Factores de aceleração de baixo de cerca de 1 500 g pode ser usado para colheita de células Considerando que os factores de aceleração muito mais elevados são necessários para recolher enzima

eficientemente. O produto destes factores ( 2 Vr / gD) é chamado o factor sigma ( ) e é usada para comparar centrífugas e para auxiliar o aumento de escala.

Centrífugas de laboratório, utilizando tubos de swing-out ou de cabeça ângulo rotores

têm alta velocidade angular ( ) e raio de rotação (r), mas pequena capacidade (V) e distância de sedimentação substancial (D). Este tipo de concepção não pode ser dimensionado de forma segura-se, principalmente porque a tensão mecânica na cabeça centrífuga aumenta com o quadrado do raio, o que deve aumentar com o aumento da capacidade.

Para o uso em larga escala, centrífugas contínuas de vários tipos são empregues ( Figura 2.2 ). Estes permitem que a adição contínua de matéria-prima, a remoção contínua do sobrenadante e a remoção descontínuo, semicontínuo ou contínuo de sólidos. Onde ocorre a remoção descontínua ou semi-contínua de precipitado, o precipitado é lavado por sistemas automáticos de descarga que causam a sua diluição com água ou meio e pode ser um problema se o precipitado é necessário para continuar o tratamento. A centrifugação é geralmente o método preferido para a recolha dos sólidos contendo enzima, uma vez que não apresenta um grande perigo para a maioria das enzimas, desde que a produção de espuma, com a consequente inactivação enzimática, é minimizada.

63

Figura 2.2. projetos básicos de centrífugas industriais, mostrando o fluxo de material dentro das taças.Acionamentos de motores, jaquetas de refrigeração e recipientes de recolha de lamas não são mostrados.(A) centrífuga tubular tigela. Isto é geralmente utilizado na vertical, o rotor tubular proporcionando um caminho de fluxo longo permitindo clarificação. O lodo recolhe e deve ser removido. (B) centrífuga de rolagem contínua. Este é operado horizontalmente. O parafuso helicoidal rola os sólidos ao longo da superfície da bacia e do líquido; o lodo a ser desidratada antes da alta. O licor clarificado transborda sobre uma barragem ajustável na outra extremidade da taça. O parafuso transportador roda a uma velocidade ligeiramente diferente para a bacia. (C) multichamber Continuous disco-stack centrífuga. A taça contém um certo número de discos paralelos que fornecem uma superfície com uma grande esclarecimento pequena distância de sedimentação. A lama é removida através de uma válvula.

Pequenas partículas de detritos celulares e proteína precipitada pode ser sedimentadas utilizando centrifugadoras bacia tubulares, das quais centrífugas Sharples (produzidos por Pennwalt Ltd.) são os mais conhecidos. Estas centrifugadoras semi-contínua são longas e finas permitindo a rápida aceleração e desaceleração, minimizando o tempo de paragem necessário para a remoção dos sólidos sedimentados.Aqui o raio e espessura líquida efetiva são pequenos, permitindo uma velocidade angular de alta e, portanto, alta

64

força centrífuga; pequenos modelos podem ser usados para os fatores de aceleração até 50.000 g, acumulando 0,1 kg de depósito molhado que os grandes modelos, destinadas a acumular-se a 5 Kg de depósito, são restritos a 16.000 g. As capacidades destas centrífugas são apenas moderate.Multichamber centrífugas disco-stack, originalmente concebidos (por Westfalia e Alpha-Laval) para separação de creme, conter vários discos perfil cónico em uma pilha que são giradas e sobre o qual o precipitado coleta. Eles podem ser operados semi-continuamente ou, usando uma bomba de pressurização no interior da bacia centrípeta centrífuga que força a lama para fora através de uma válvula, de forma contínua. O raio e capacidade de tais dispositivos são grandes e a espessura de líquido é muito pequeno, devido à grande área de superfície eficaz. A velocidade angular, no entanto, é restrita dando um factor de aceleração máxima de cerca de 8.000 g. Um design diferente que é bastante semelhante, em princípio, é a centrífuga bacia de deslocamento sólido em que um parafuso de Arquimedes, recolhe-se o precipitado de modo a que o fluido e os sólidos deixar em extremidades opostas do aparelho. Estes só podem ser utilizados a baixa aceleração (cerca de 3,000 g) de modo que eles são apropriados apenas para a recolha de partículas relativamente grandes.

Embora muitos tipos de centrífuga estão disponíveis, a precipitação eficiente de pequenas partículas de detritos celulares pode ser difícil, por vezes, quase impossível. É evidente a partir Equação 2.2 , a eficiência de centrifugação pode ser melhorada se o diâmetro das partículas (d) é aumentada. Isto pode ser feito quer através de floculação ou coagulação de partículas. A coagulação é causada pela remoção de cargas electrostáticas (por exemplo, por alteração do pH) e permitindo que as partículas aderem umas às outras. A floculação é conseguido pela adição de pequenas quantidades de elevado peso molecular materiais carregados ponte que as partículas de cargas opostas para se produzir um agregado solto que pode ser prontamente removido por filtração ou centrifugação. A floculação e coagulação são auxiliares baratos e eficazes para precipitar ou de outra forma a colheita de células inteiras, detritos celulares ou proteínas solúveis, mas, claro, é essencial que os agentes utilizados não deve inibir as enzimas alvo. É importante notar que a escolha do floculante é determinada pelo pH e força iónica da solução e da natureza das partículas. A maioria dos floculantes têm concentrações ideais muito definidas acima do qual uma nova adição pode ser contra-eficaz. Alguns floculantes podem ser rapidamente arruinada por cisalhamento.

Uma introdução recente comparativamente concebido para a remoção de detritos de células é um produto moderadamente hidrofóbica, em que é levemente celulose derivatizada com grupos funcionais dietilaminoetilo. Este material (Whatman CDR; removedor de restos celulares) é barato (essencial, uma vez que não é reutilizável), liga-se a células carregadas negativamente constituintes indesejados, actua como uma ajuda de filtro e pode ser incinerado para eliminar os resíduos perigosos.

Filtration

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A filtração separa simplesmente com base no tamanho de partícula. A sua eficácia é limitada pela forma e a compressibilidade das partículas, a viscosidade da fase líquida e às pressões máximas admissíveis. Em larga escala de filtração simples emprega tecidos filtrantes e auxiliares de filtração em uma configuração de placa e quadro de imprensa, em filtros rotativos a vácuo ou filtros centrífugos ( Figura 2.3 ). O caudal volumétrico de um filtro é proporcional à pressão (P) e a área do filtro (A F ) e inversamente proporcional à espessura do bolo do filtro (D F ) e a viscosidade dinâmica

(Vinte e três)

onde k é uma constante de proporcionalidade dependente do tamanho e da natureza das partículas. Para partículas muito pequenas de k depende da quarta potência do seu diâmetro. A filtração de partículas que são leads para filtrar bloqueio eo fracasso das facilmente compactados Equação 2.3 para descrever o sistema. Sob estas circunstâncias, um auxiliar de filtração, tais como a celite, é misturado com a matéria-prima para melhorar a estabilidade mecânica do bolo de filtração. Auxiliares de filtração são geralmente utilizados apenas quando a fase líquida é necessária pois causam problemas substanciais na recuperação dos sólidos. Eles também podem causar a perda de actividade da enzima a partir da solução, devido à física hold-up no bolo de filtração. Muitas vezes, é difícil para um gerente de desenvolvimento de processo para decidir se a tentar recuperar enzima preso desta maneira. Os problemas associados com a acumulação de o bolo de filtração também podem ser evitados por um elevado fluxo tangencial do material de alimentação através da superfície do filtro, um processo conhecido como microfiltração tangencial (Figura 2.4 ). Este método de dispensa com auxiliares de filtração e utiliza conjuntos simétricos especiais de membrana

microporosas, capazes de reter partículas até 0,1-1 m de diâmetro (cf. Bacillus diâmetro de cerca de 2 m).

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Figura 2.3. O projeto básico do filtro rotativo a vácuo. A suspensão é aspirado através de um pano de filtro em um tambor rotativo. Isto produz um bolo de filtro, que é removido com uma lâmina. O bolo de filtro pode ser lavado durante a sua rotação. Estes filtros são geralmente bastante confuso e difícil de conter geralmente tornando-os inadequados para utilização na produção de produtos de ADN recombinante ou tóxicos. Tem havido desenvolvimentos recentes que melhoram a sua adequação, no entanto, como o filtro descartável cilindro giratório .

Um aparelho de filtração simples e familiar é a bacia perfurada centrífuga ou cesta centrífuga, na verdade um spin secador. Os detritos celulares é recolhido num pano com, ou sem, um auxiliar de filtração e pode ser retirado da superfície quando necessário, utilizando uma lâmina adequada. Esses filtros centrífugos têm um grande raio e profundidade do líquido eficaz, permitindo altos volumes. No entanto, a segurança decretos que a velocidade angular deve ser baixa e por isso apenas partículas grandes (por exemplo, material de planta) podem ser removidas de modo satisfatório.

67

A figura 2.4. Princípios de (a) filtração sem saída e (b) filtração de fluxo cruzado. Na filtração dead-end do fluxo faz com que o build-up da torta de filtro, o que pode impedir o funcionamento eficiente. Isto é evitado na filtração de fluxo cruzado onde o fluxo limpo varre a superfície da membrana.

Sistemas bifásicos aquosos

O "incompatibilidade" de certos polímeros em solução aquosa foi observado pela primeira vez por Beijerinck em 1896. Neste caso duas fases foram formadas quando agar foi misturado com amido solúvel ou gelatina. Desde então, diversos sistemas de duas fases aquosas foram encontrados; o sendo o dextrano solução aquosa de polietileno-glicol sistema mais investigados (por exemplo 10% polietilenoglicol 4000/2% de dextrano T500), onde as formas de dextrano o mais hidrófilo, mais densa, a fase inferior e polietileno glicol quanto mais hidrofóbico menos densa, a fase superior. Sistemas de três fases aquosas são também conhecidos.

Fases formar quando limitando as concentrações dos polímeros são excedidos. Ambas as fases contêm principalmente água e são enriquecidos em um dos polímeros. As concentrações limitantes dependem do tipo e peso molecular dos polímeros e em que o pH, força iónica e temperatura da solução. Alguns polímeros formar a fase hidrofóbica superior, na presença de soluções relativamente concentradas de fosfatos ou sulfatos (por exemplo, tampão de fosfato de potássio a 10% de polietileno glicol 4000 / 12,5%).Um inconveniente para o sistema de dextrano / polietilenoglicol útil é o alto custo do dextrano purificado utilizado. Este foi aliviado pela utilização de preparações em bruto não fraccionadas dextrano, derivados de amido de hidroxipropilo muito mais barato e sistemas bifásicos contendo sal.

Sistemas bifásicos aquosos são de valor considerável para a biotecnologia. Eles proporcionam a oportunidade para a rápida separação de materiais biológicos com pouca probabilidade de desnaturação.A tensão interfacial entre as fases é muito baixa (ou seja, cerca de 400 vezes menos do que entre água e um solvente orgânico imiscível), permitindo que o tamanho das gotículas pequenas, grandes áreas interfaciais, uma mistura eficiente, sob agitação muito suave e rápida partição. Os

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polímeros têm uma influência estabilizadora sobre a maioria das proteínas. Uma grande variedade de separações tenham sido alcançados, sendo de longe, o mais importante a separação de enzimas a partir de material bruto de células quebradas. A separação pode ser alcançada em poucos minutos, minimizando a acção prejudicial de proteases endógenas. Os sistemas também têm sido utilizados com sucesso para a separação de diferentes tipos de membranas de células e organelas, a purificação de enzimas e para bioconversões extractivas (ver Capítulo 7 ). Separação de duas fases líquida contínua é mais fácil do que a separação contínua sólido / líquido utilizando equipamento conhecido a partir de sistemas de solventes imiscíveis, por exemplo centrifugadoras de disco e separadores de toda a pilha contra-corrente. Tais sistemas são prontamente passível de aumento de escala e podem ser empregues em processos de extracção de enzimas contínuos que envolvem alguma reciclagem das fases.

As células, proteínas e detritos celulares outro material distribuir-se entre as duas fases de uma maneira descrita pelo coeficiente de partição (P) definidos como:

(2,4)

em que C t C e b representam as concentrações, nas fases superior e inferior, respectivamente. O rendimento e a eficiência da separação é determinada pelas quantidades relativas de material nas duas fases e, por conseguinte, depende da proporção de volume (V t / V b ). O coeficiente de partição é exponencial com o aumento da área de superfície (e, por conseguinte, de peso molecular) e carga de superfície das partículas, para além da diferença de potencial eléctrico e a hidrofobicidade das fases.Geralmente, não é muito sensível a variações de temperatura. Isto significa que as proteínas e as partículas maiores são normalmente dividida em uma fase enquanto que moléculas menores são distribuídos de forma mais equilibrada entre as fases. Um coeficiente de partição superior a 3 é necessária se os rendimentos utilizáveis são para ser conseguido através de um único processo de extracção. Os coeficientes de partição são típicas para proteínas 0,01-100 enquanto que os coeficientes de partição para as células e os detritos celulares são eficazmente zero.

A influência do pH e sais de partição de proteínas é complexa, particularmente quando a solução tampão de fosfato estão presentes. Uma dada proteína distribui de forma diferente entre as fases em diferentes valores de pH e força iónica, mas a presença de iões de fosfato afectar o coeficiente de partição de um modo atípico, pois estes iões distribuem-se desigualmente resultando em potencial electrostático (e) diferenças de pH. Isto significa que os sistemas podem ser "afinados" para enriquecer uma enzima em uma fase, de preferência a fase superior com restos de células e enzimas indesejadas na fase inferior.

Uma enzima pode ser extraído a partir do (polietileno glicol) fase superior por adição de sais ou de outro polímero, gerando um novo sistema bifásico. Esta fase pode ser

69

utilizada para purificar ainda mais a enzima. Uma modificação desta poderosa técnica é combinar o particionamento de fase e particionamento de afinidade. Ligandos de afinidade (por exemplo, corantes de triazina) podem ser acoplados a qualquer dos polímeros num sistema bifásico aquoso e, assim, aumentar grandemente a especificidade da extracção.

Ruptura celular

Várias enzimas intracelulares são utilizados em quantidades significativas e tem de ser libertado a partir de células e purificada ( Tabela 2.1 ). A quantidade de energia que deve ser colocado na quebra das células depende muito do tipo de organismo e, em certa medida sobre a fisiologia do organismo. Alguns tipos de células são prontamente quebrados por tratamento suave, tais como choque osmótico (por exemplo, células animais e algumas bactérias gram-negativas, tais como Azotobacter espécies), ao

passo que outros são altamente resistentes à quebra. Estes incluem leveduras, algas verdes, micélio fúngico e algumas bactérias gram-positivas que apresentam estruturas de parede de célula de membrana e capaz de resistir a pressões osmóticas internas de cerca de 20 atmosferas (2 MPa) e, portanto, têm a força, em termos de peso, de betão armado. Consequentemente, uma variedade de técnicas de rompimento de células têm sido desenvolvidos que envolve cisalhamento sólido ou líquido ou lise celular.

A taxa de proteína libertada por ruptura mecânica da célula é usualmente encontrada para ser proporcional à quantidade de proteína libertável.

(2,5)

onde P representa o teor de proteína remanescente associado com as células, t é o tempo e k é uma constante de libertação dependentes do sistema. Integrando a partir de P = P m (proteína máxima possível libertável) no tempo zero para P = P t no tempo t dá

(2,6)

(2,7)

Como a proteína libertada a partir das células (P r ) é dada pela

(2,8)

a seguinte equação para a ruptura de células é obtido

70

(2,9)

É o mais importante na escolha de estratégias de desestabilização celular para evitar danificar as enzimas. Os perigos para a actividade da enzima relevante para o rebentamento celular estão resumidos na Tabela 2.3 . O mais significativo destes, em geral, são o aquecimento e cisalhamento.

Tabela 2.3 . Riscos susceptíveis de enzimas danos durante o rompimento celular.

Calor

Todos os métodos mecânicos requerem uma grande entrada de energia, gerando calor. O arrefecimento é essencial para a maioria das

enzimas. A presença de substratos, análogos de substrato ou polióis também podem ajudar a estabilizar a enzima.

Tosquiar

As forças de cisalhamento são necessários para romper as células e

pode danificar as enzimas, em particular na presença de iões de metais pesados e / ou uma interface de ar.]

As proteases

O rompimento das células irá inevitavelmente libertam enzimas de

degradação que podem causar graves perdas de actividade da enzima. Tal ação pode ser minimizado pelo aumento da velocidade de

processamento com o máximo de refrigeração possível. Isto pode ser melhorado pela presença de um excesso de substratos alternativos (por exemplo, proteína de baixo custo) ou inibidores no meio de extracção.

pH Soluções tamponadas pode ser necessário. A presença de substratos, análogos de substrato ou polióis também podem ajudar a estabilizar a

enzima.

Químico

Algumas enzimas podem sofrer alterações conformacionais na presença de detergente e / ou solventes. Polifenóis derivados de plantas são

inibidores potentes de enzimas. Este problema pode ser ultrapassado através da utilização de adsorventes, tais como polivinilpirrolidona, e pelo uso de ácido ascórbico de reduzir a acção polifenol oxidase.

Oxidação Agentes de redução (por exemplo ácido ascórbico, mercaptoetanol e o ditiotreitol) pode ser necessária.

A formação de espuma

As interfaces de fase de gás-líquido presentes em espumas podem perturbar a conformação da enzima.

Toxicidade de

metais pesados

Iões de metais pesados (por exemplo, ferro, cobre e níquel) podem ser

introduzidos por lixiviação a partir do aparelho de homogeneização. As enzimas podem ser protegidos da inactivação irreversível pela utilização de reagentes quelantes, tais como EDTA.

Meios para a extração da enzima serão selecionados com base na relação custo-eficácia, irá incluir como alguns componentes quanto possível. Meios normalmente irá ser tamponada a um valor de pH que foi determinada para dar o máximo de estabilidade

71

do enzima a ser extraída. Outros componentes irá combater outros perigos para a enzima, principalmente fatores que causam a desnaturação ( Tabela 2.3 ).

Ultrasonic rompimento celular

O tratamento das células microbianas em suspensão com ultra-som inaudível (superior a cerca de 18 kHz) resulta na sua inactivação e perturbação. Ultra-som utiliza o movimento sinusoidal rápida de uma sonda no interior do líquido. Caracteriza-se por uma elevada frequência (18 kHz - 1 MHz), pequenos deslocamentos (menos do que

cerca de 50 m), velocidades moderadas (algumas ms -1 ), gradientes de velocidade acentuados transversais (até 4000 s -1 ) e muito alta aceleração (até cerca de 80000 g). Ultra-som produz fenômenos de cavitação quando entradas de energia acústicos são suficientemente alta para permitir que a produção múltipla de microbolhas em locais de nucleação no líquido. As bolhas crescem durante a fase de rarefação da onda sonora, em seguida, são recolhidas durante a fase de compressão.Em colapso, uma onda de choque violento passa com o meio. Todo o processo de nucleação de bolhas de gás, o crescimento e colapso devido à acção das ondas sonoras intensas é chamado cavitação. O colapso das bolhas converte energia sonora em energia mecânica sob a forma de ondas de choque equivalente a vários milhares de atmosferas (300 MPa). Esta energia transmite movimentos de partes de células que se desintegram quando seu conteúdo de energia cinética excede a resistência da parede. Um fator adicional que aumenta a quebra das células é o Microstreaming (gradientes de velocidade muito alta, causando tensão de cisalhamento) que ocorrem bolhas perto radialmente vibrando de gás causado pelo ultra-som.

Grande parte da energia absorvida por suspensões de células é convertida em calor tão eficaz arrefecimento é essencial. A quantidade de proteína libertada por ultra-sons tem sido mostrado a seguirequação 2.9 . A constante (k) é independente da concentração de células até níveis elevados e aproximadamente proporcional à potência acústica de entrada acima do limiar de energia necessária para a cavitação. Desintegração é independente da freqüência ultra-sons, exceto na medida em que a freqüência limite cavitação depende da freqüência.

Equipamento para o uso contínuo em grande escala de ultra-sons tem estado disponível por muitos anos e é amplamente utilizado na indústria química, mas ainda não tem encontrado ampla utilização na produção da enzima. As razões para isso pode ser a labilidade conformacional de alguns (talvez a maioria) enzimas de ultra-sons e os danos que eles podem perceber, porém oxidação pelos radicais livres, singlet oxigênio e peróxido de hidrogênio que podem ser produzidas concomitantemente. O uso de captadores de radicais (por exemplo N 2 O) foram mostrados para reduzir esta inactivação. Tal como acontece com a maioria dos métodos de quebra de células, partículas restos celulares muito finos podem ser produzidos o que pode dificultar ainda mais o processamento. A sonicação continua, no entanto, um método de pequena escala popular, útil e simples para a desagregação de células.

72

Homogeneizadores de alta pressão

Vários tipos de alta pressão de homogeneizador estão disponíveis para utilização nas indústrias alimentares e de produtos químicos, mas a concepção que tem sido extensivamente utilizada para a desagregação de células é do tipo homogeneizador Manton-Gaulin APV. Este é constituído por uma bomba de deslocamento positivo, que chama a suspensão de células (cerca de 12% w / v) através de uma válvula de retenção para o cilindro da bomba e força-o, a altas pressões de até 150 MPa (10 toneladas por polegada quadrada) e taxas de fluxo de até 10000 l h -1 , através de uma válvula de descarga ajustável, que tem um orifício limitado ( Figura 2.5 ). As células são submetidas a impacto, corte e uma grave queda de pressão através da válvula, mas o mecanismo exacto de ruptura celular não é clara. O principal factor perturbador é a queda de pressão e consequente aplicada pressão através da válvula. Isto faz com que a tensão de impacto e de corte que são proporcionais à pressão de funcionamento.

Figura 2.5. A secção transversal através da válvula de homogeneizador de Manton-Gaulin, que mostra o fluxo de material. A suspensão de células é bombeado a alta pressão através da válvula e que incide sobre ele o anel de impacto. A forma do bico de saída a partir da sede da válvula varia entre modelos e parece ser um determinante

73

crítico da eficiência de homogeneização. O modelo descrito é o 'Válvula de CD' de APV Gaulin.

Como orifícios estreitos, que são vulneráveis ao bloqueio são partes fundamentais deste tipo de homogeneizador, não é adequado para a ruptura de organismos de micélio, mas tem sido usado extensivamente para a ruptura de organismos unicelulares. A libertação de proteínas pode ser descrito pela equação 2.9 , mas normalmente uma relação semelhante é utilizado, onde a variável de tempo é substituído pelo número de passagens (N) através do homogeneizador.

(2.10)

Na gama de funcionamento normalmente utilizado com pressões abaixo de cerca de 75 MPa, a libertação constante (k) foi encontrado para ser proporcional à pressão elevada a um expoente dependente do organismo e sua história de crescimento (por exemplo, k = k'P 2,9 em Saccharomyces cerevisiae e k = k'P2.2 em Escherichia coli , em que P

representa a pressão de funcionamento e k 'é uma constante de velocidade). Diferentes meios de crescimento pode ser seleccionado para dar origem a células de resistência da parede celular diferente. Claramente, quanto maior for a pressão de funcionamento, o mais eficiente é o processo de interrupção. A taxa de libertação de proteína constante (k) é dependente da temperatura, sendo mais rápida interrupção a temperaturas mais elevadas. Na prática, esta vantagem não pode ser utilizado uma vez que o aumento de temperatura devido à compressão adiabática é muito significativo, pelo que as amostras devem ser pré-arrefecido e arrefeceu-se novamente entre passagens múltiplas. Na pressão de serviço de 50 MPa, a temperatura subir cada passagem é de cerca de 12 graus.C.

Em adição à fragilidade das células, o local de uma enzima no interior das células pode influenciar as condições de utilização de um homogeneizador. Enzimas intracelulares Unbound pode ser liberada por uma única passagem enquanto que as enzimas de membrana ligada exigir vários passes para os rendimentos razoáveis para ser obtida. Várias passagens são indesejáveis porque, é claro, eles diminuem a taxa de produtividade e rendimento porque a nova passagem de células já quebrados resultados em detritos finos que é excessivamente difícil para remover mais a jusante. Consequentemente, homogeneizadores será usado nas mais altas pressões compatíveis com a fiabilidade e segurança do equipamento e a estabilidade à temperatura do enzima (s) libertados. Homogeneizadores de alta pressão são aceitavelmente bom para o rompimento de organismos unicelulares previstas as enzimas necessárias não são calor lábil. As forças de cisalhamento produzidas não são capazes de danificar as enzimas livres em solução. A unidade de válvula é propenso à erosão e deve ser feito de precisão e bem conservado.

74

A utilização de moinhos de esferas

Quando as suspensões de células são agitados na presença de pequenas esferas de vidro ou de aço (geralmente 0,2 -.1.0 mm de diâmetro) que são quebradas pelos elevados gradientes de cisalhamento líquido e colisão com os grânulos. A taxa de eficácia e de libertação de enzima pode ser modificada pela alteração das taxas de agitação e o tamanho dos grânulos, assim como as dimensões do equipamento.Qualquer tipo de biomassa, ou filamentoso unicelular, pode ser interrompido por moagem de esferas, mas, em geral, as células de tamanhos maiores serão quebradas mais facilmente do que as pequenas bactérias. Para o mesmo volume de esferas, um grande número de pequenas esferas será mais eficaz do que um número relativamente pequeno de esferas maiores, devido ao aumento da probabilidade de colisões entre as pérolas e células.

Moinhos de esferas estão disponíveis em vários tamanhos e configurações do shaker Mickle, que tem um volume máximo de cerca de 40 ml de equipamentos de processo contínuo capaz de suportar até 200 kg de fermento molhado ou 20 kg bactérias molhadas cada hora. Os moinhos de esferas que foram estudados em maior detalhe são o Dyno-Mill e o agitador Netsch-Molinex, ambos os quais consistem de um vaso cilíndrico que contém um veio central motorizado equipado com rotores de diferentes tipos. Tanto pode ser operada continuamente, sendo equipados com dispositivos que mantêm as esferas no interior da câmara de moagem. Ballotini vidro ou de aço inoxidável bolas são usados, a gama de tamanho a ser seleccionado para a libertação mais eficaz da enzima necessária. Assim, um milímetro de diâmetro grânulos são satisfatórios para a rápida libertação de enzimas a partir de levedura, mas peripl�micos grânulos de diâmetro 0,25 milímetros deve ser utilizado, por um período mais longo, para libertar enzimas ligadas à membrana a partir de bactérias.

As cinéticas de libertação de proteína a partir de moinhos de esferas segue a relação dada pela Equação de 2,9 no que diz respeito ao tempo (t) de que uma partícula passa no moinho. Infelizmente, no entanto bem concebido estes moinhos são, quando trabalha continuamente haverá uma quantidade significativa de retromistura que reduz a eficácia

da proteína libertada em relação ao tempo de residência médio ( , ver a discussão relativa em reactores de retromistura em Capítulo 5 ). Isto é mais perceptível a baixas taxas de fluxo (tempos de residência de alta e média) quando a proporção de proteína libertada é alta.Pode ser neutralizada através da concepção do moinho de esferas para encorajar características de escoamento tampão. Nestas circunstâncias, a relação pode ser demonstrado que são

(2.11)

75

onde i representa o grau de retromistura (isto é, i = 0 sob condições de caudal de êmbolo ideais e i = 1 para retromistura completa ideal). Equação 2.11 reduz para se obter a relação simplificada de Equação 2,9 a baixa (quase zero) valores de i.

Além do tamanho do grânulo, a constante de velocidade de libertação de proteína (k) é uma função da temperatura, carga de esferas, velocidade de rotação do impulsor e de carregamento da célula.Velocidades do impulsor pode ser aumentada com vantagem até talão de quebra se torna significativa, mas a geração de calor também irá aumentar. A uma velocidade do rotor constante, a eficiência do equipamento diminui com o rendimento como o grau de retromistura aumenta. Haverá uma velocidade da ponta do rotor óptima a que os aumentos na ruptura são equilibradas por aumentos na retromistura.

Em geral, o aumento da carga de esferas aumenta a taxa de libertação de proteína, mas também aumenta a produção de calor e o consumo de energia. A produção de calor é o principal problema na utilização de moinhos de esferas para a libertação da enzima, particularmente em um (por exemplo 20 litros) em grande escala. As embarcações mais pequenas pode ser arrefecido adequadamente através de jaquetas de refrigeração em torno da câmara talão mas as usinas maiores requerem refrigeração através do eixo agitador e impulsores. No entanto, se o arrefecimento é eficaz há pouco dano para as enzimas libertadas.

Uso de Freeze-prensas

A imprensa Hughes eo ' X press 'habilitar pastas de células congeladas de ser forçado sob alta pressão (150-230 MPa, 10 - 15 toneladas por polegada quadrada), através de orifícios estreitos, o rompimento sendo produzido por fase e de volume e por cisalhamento sólido devido aos cristais de gelo. A prensa Hughes só pode ser utilizado de forma descontínua numa escala pequena. O ' X imprensa "pode ser utilizado semi-contínua e é passível de aumento de escala, mas, embora o método permite a quebra do mesmo os organismos mais robustos e a recuperação eficiente de enzimas sensíveis ao calor, congelar-prensagem não é utilizada em um grande escala para liberar enzimas a partir de células.

A utilização de métodos líticas

A quebra das células através de métodos não-mecânicos é atraente na medida em que oferece a perspectiva de liberação de enzimas em condições que são suaves, não se sujeitam a enzima ao calor ou de cisalhamento, pode ser muito barato, e são tranquilos para o usuário. Os métodos que estão disponíveis incluem choque osmótico, congelamento seguido de descongelamento, choque frio, dessecação, lise enzimática e lise química. Cada método tem os seus inconvenientes, mas pode ser particularmente útil em certas circunstâncias específicas.

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Certos tipos de células podem ser causado para lisar por choque osmótico. Isto seria um método barato, suave e conveniente de libertação de enzimas, mas aparentemente não tem sido utilizado em grande escala. Alguns tipos de células podem ser causados a autolyse, em particular leveduras e Bacillusespécies. Preparações de invertase de levedura utilizadas na fabricação industrial de açúcares invertidos são produzidos desta maneira. A autólise é um processo lento, em comparação com os métodos mecânicos, e contaminação microbiana é um perigo potencial, mas pode ser utilizado em larga escala, se necessário. Se for caso disso, dessecação pode ser muito útil na preparação de enzimas em larga escala.A taxa de secagem é muito importante nestes casos, os métodos lentos sendo preferíveis em relação às rápidas como liofilização.

Lise enzimática utilizando enzimas adicionadas tem sido amplamente utilizado na escala de laboratório, mas é menos popular para fins industriais. Lisozima, de ovo de galinha branca, é a única enzima lítica disponível numa escala comercial. Foi utilizado muitas vezes para lisar as bactérias Gram-positivas em uma hora a cerca de 50.000 Kg L -1 (peso seco). A principal objeção à sua utilização em larga escala é o seu custo. Sempre que os custos são reduzidos pela utilização do relativamente barato, rico em lisozima de clara de ovo seca, um importante problema de separação pode ser introduzido. Enzimas de levedura-lítica de Cytophaga espécies têm sido estudados com

algum pormenor e outras enzimas líticas estão sob desenvolvimento. Se forem identificadas mercados significativos para as enzimas líticas, a escala da sua produção irá aumentar e o seu custo é provável que decrease.Lysis por ácidos, alcalinos, surfactantes e solventes pode ser eficaz na libertação de enzimas, desde que as enzimas são suficientemente robustas.Detergentes, tais como Triton X-100, utilizados sozinhos ou em combinação com certos agentes caotrópicos, tais como cloridrato de guanidina, são eficazes na liberação de enzimas ligadas à membrana.No entanto, estes materiais são caros e podem ser difíceis de remover do produto final.

Preparação de enzimas a partir da solução

clarificada

Em muitos casos, especialmente quando as enzimas extracelulares estão a ser preparados para

venda, a solução clarificada é concentrada, simplesmente, materiais conservantes adicionados, e

vendido como uma solução ou como uma preparação seca. O processo de concentração escolhida será o mais barato, que é compatível com a manutenção da actividade da enzima. Para algumas

enzimas evaporação rotativa podem ser considerados, seguido se necessário por secagem por

pulverização. O método mais popular, apesar de, é ultrafiltração , pelo que a água e materiais de baixo peso molecular são removidos pela passagem através de uma membrana sob pressão, que

está sendo mantido enzima. A ultrafiltração é diferente de filtração convencional e microfiltração

em relação ao tamanho das partículas retidas (<50 nm de diâmetro). Ele usa membranas microporosas assimétricos com uma pele relativamente densa mas fino, contendo poros, apoiados

por uma subestrutura forte grosseiro. As membranas que possuem peso molecular cut-off de 1000

a 100.000 e utilizável em pressão até 2 MPa estão disponíveis.

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Existem tipos de número de aparelhos disponíveis. Mexido células representam a configuração

mais simples de célula de ultrafiltração. A membrana assenta sobre um suporte rígido na base de

um recipiente cilíndrico, que está equipado com um agitador magnético para combater a

polarização da concentração. Não é adequado para utilização em grande escala, mas é útil para estudos preliminares e para a concentração de eluatos de colunas de laboratório. Várias unidades

de grande escala são disponíveis em que as membranas são formados em tubos de diâmetro de

largura (1 - 2 cm de diâmetro) e os tubos agrupados em cartuchos. Estes não são tão compacto como sistemas capilares (área / volume de cerca de 25 m -1 ) e são muito caros, mas são menos

sujeitos ao bloqueio por partículas grandes vadios na corrente de alimentação. Sistemas de canais

fina mais baratas estão disponíveis (área / volume de cerca de 500 m -1 ) que usam sanduíches membrana plana em arranjos de imprensa do filtro de vários desenhos escolhidos para produzir

fluxo laminar através da membrana e minimizar polarização de concentração. Membranas

capilares representam um tipo de sistema de ultrafiltração relativamente barato e cada vez mais

popular que utiliza membranas de micro-tubulares 0,2-1,1 mm de diâmetro e fornece grandes áreas de membrana dentro de uma pequena unidade de volume (área / volume de cerca de 1000

m -1 ). As membranas são geralmente montados em módulos para manipulação conveniente. Esta

configuração de membranas pode ser aumentado sem problemas. Modelos comerciais estão disponíveis que dão taxas de ultrafiltração de até 600 L h -1 .

A melhoria constante do desempenho, durabilidade e confiabilidade das membranas tem sido uma benção para enzima tecnólogos, incentivando ampla utilização das várias configurações de

ultrafiltração. Problemas com o bloqueio da membrana e a incrustação normalmente pode ser

superado por tratamento das membranas com detergentes, ou proteases, com cuidado, ácidos ou álcalis. O custo inicial de membranas continua a ser considerável, mas membranas modernos são

duráveis e de baixo custo. Ultrafiltração, feito de forma eficiente, resulta em pouca perda de

atividade enzimática. No entanto, algumas configurações do aparelho, em especial em que as

soluções são reciclados, pode produzir cisalhamento suficiente para danificar algumas enzimas.

A remoção de ácido nucleico

Preparações de enzimas intracelulares contêm ácidos nucleicos que podem dar origem a um aumento da viscosidade interferir com os procedimentos de purificação de enzimas, em particular, ultrafiltração. Alguns organismos contêm actividade de nuclease suficiente para eliminar este problema, mas, de outro modo, os ácidos nucleicos devem ser removidos por precipitação ou degradação pela adição de nucleases exógenas. Precipitação com sulfato de amónio (ver mais tarde ) pode ser eficaz na remoção de ácidos nucleicos mas irá remover alguma proteína, ao mesmo tempo. Vários agentes precipitantes mais específicos têm sido utilizados, normalmente materiais carregados positivamente que formam complexos com os resíduos de fosfato de carga negativa dos ácidos nucleicos. Estas incluem, em ordem decrescente de aproximadamente eficácia, polietilenoimina, o brometo de amónio detergente catiónico cetiltrimetil, sulfato de estreptomicina e sulfato de protamina. Todos estes são caros e possivelmente tóxico, particularmente o sulfato de estreptomicina. Além disso, eles podem se complexar indesejavelmente com determinadas enzimas. Eles podem ser

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necessárias, no entanto, sempre que possível contaminação do produto de enzima deve ser evitada, tal como na preparação de endonucleases de restrição. Caso contrário, o tratamento com nucleases pancreática bovina é provavelmente o método mais rentável para remoção de ácido nucleico.

A concentração por precipitação

A precipitação de enzimas é um método útil de concentração e é ideal como um passo inicial na sua purificação. Ele pode ser utilizado em larga escala e é menos afectado pela presença de materiais interferentes do que qualquer um dos métodos cromatográficos descritos mais tarde.

Salting out de proteínas, particularmente por utilização de sulfato de amónio, é um dos métodos mais conhecidos e usados, de purificação e concentração de enzimas, particularmente na escala de laboratório.Os aumentos na força iónica da solução de provocar uma redução no efeito repulsivo de cargas iguais entre moléculas idênticas de uma proteína. Ele também reduz as forças que mantêm a camada de solvatação em torno das moléculas de proteína. Quando estas forças são suficientemente reduzida, a proteína irá precipitar; proteínas hidrofóbicas de precipitação em concentrações de sal mais baixas do que as proteínas hidrofílicas. O sulfato de amónio é conveniente e eficaz devido à sua elevada solubilidade, barateza, falta de toxicidade para a maioria das enzimas e o seu efeito estabilizador sobre algumas enzimas (ver Tabela 2.4 ). A sua utilização em grande escala, no entanto, é limitada, uma vez que é corrosivo, excepto com aço inoxidável, que forma soluções densas apresentam problemas para a recolha do precipitado por centrifugação, e que pode libertar amoníaco gasoso, particularmente a um pH alcalino.A prática de usar a precipitação de sulfato de amónio é mais simples do que a teoria. Resultados reprodutíveis apenas pode ser obtido desde que a concentração de proteína, temperatura e pH são mantidos constantes. A concentração de sal necessária para precipitar uma enzima variará com a concentração da enzima. No entanto, o fraccionamento de misturas de proteína, pelo aumento gradual na força iónica pode ser um meio muito eficaz para a purificação de enzimas em parte.

A solubilidade de uma enzima pode ser descrito pela equação

(2.11)

onde S é a solubilidade da enzima, K intercepção é a constante de intercepção, K sal é a

constante de salinização e é a força iónica que é proporcional à concentração de um sal precipitante. K intercepção é independente do sal utilizado, mas depende do pH, temperatura, enzimas e outros componentes na solução. K sal depende tanto da enzima requerida e do tipo de sal, mas é largamente independente de outros factores. Esta equação ( 2.11 ) também pode ser utilizada para dar a concentração mínima de sal necessária antes da enzima vai começar a precipitar; a mudança necessária

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concentração para precipitar a enzima variando de acordo com a magnitude da constante de salinização.

Algumas enzimas não sobrevivem amônio precipitação com sulfato. Outros sais podem ser substituídos, mas a alternativa mais preferida é a utilização de solventes orgânicos tais como metanol, etanol, propan-2-ol e acetona. Estes actuam por redução do dieléctrico do meio e, consequentemente, reduzir a solubilidade de proteínas, favorecendo proteína-proteína, em vez de interacções proteína-solvente. Os solventes orgânicos não são amplamente utilizados em grande escala devido ao seu custo, a sua inflamabilidade, e a tendência de se submeter a desnaturação de proteínas rápida por estes solventes, se a temperatura é deixada subir muito acima de 0 ° C. Por razões de segurança, quando são utilizados solventes orgânicos, zonas especiais de laboratório à prova de fogo são usadas e as temperaturas mantida abaixo de seus focos.

Excepto quando as enzimas são apresentados para venda como precipitados de sulfato de amónio, o sal ou solvente de precipitação deve ser removido. Isto pode ser realizado por diálise, ultrafiltração ou usando uma coluna de dessalinização de, por exemplo, Sephadex G-25

Tratamento térmico

Em muitos casos, as actividades enzimáticas indesejadas pode ser removido por tratamento térmico.Diferentes enzimas têm diferentes susceptibilidade para aquecer a desnaturação e precipitação. Onde a enzima necessária é relativamente estável ao calor presente permite a sua purificação fácil e rápida em termos de actividade enzimática. Para essas enzimas de tratamento térmico é sempre considerada como uma opção em uma fase inicial em sua purificação. Este método tem sido aplicado com sucesso em particular para a produção de glicose isomerase, onde uma curta incubação a uma temperatura relativamente elevada é utilizada (por exemplo, 60 - 85 ° C durante 10 min). Nenhuma actividade interferir permanece após este tratamento e a, e, portanto, permeável tratado termicamente, as células podem ser imobilizadas e utilizadas directamente.

Cromatografia

Preparações de enzimas que têm sido clarificado e concentrado está agora em um estado adequado para posterior purificação por cromatografia. Para a purificação da enzima existem três principais tipos de cromatografia, utilizando as propriedades de permuta iónica, de afinidade e de exclusão de gel de enzima, normalmente naquela ordem. De troca iônica e de afinidade métodos cromatográficos tanto pode lidar rapidamente grandes quantidades de enzima bruta mas os materiais de troca iônica são geralmente mais baratos e, portanto, preferível, numa fase anterior na purificação, onde a escala da operação é um pouco maior. Cromatografia de exclusão em gel (também

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por vezes chamado «de filtração em gel" ou apenas "cromatografia em gel de 'embora não se separa por um mecanismo de filtragem, as moléculas maiores que passa mais rapidamente através da matriz do que as moléculas mais pequenas) é relativamente lenta e tem a menor capacidade e resolução. É geralmente deixado até último como um importante passo final de purificação e também como um método de alteração da solução tampão antes da concentração, acabamento e venda. Caso exista informação suficiente tenham sido recolhidas em relação ao tamanho e variação de carga com pH da enzima necessária e os seus principais contaminantes, um esquema de purificação racional pode ser concebido. Um método analítico relativamente rápido para a obtenção de tais dados utiliza um processo bi-dimensional em que ocorre a electroforese numa direcção e uma gama de pH é produzido na outra; movimento no campo eléctrico determinada pelo tamanho e pela carga de sinal de uma proteína, que ambos dependem do pH. À medida que a amostra é aplicada em toda a gama de pH, este método produz curvas de titulação de carga (isto é, em relação ao pH) para todas as proteínas presentes.

Um grande esforço tem sido aplicado para o desenvolvimento de matrizes de cromatografia adequadas para a separação de proteínas. O principal problema que teve de ser superado é o de assegurar a matriz tem suficientemente grande área de superfície disponível para moléculas grandes como proteínas (ou seja, são macroporous) estando a rígida e incompressível sob condições de eluição rápidos. Além disso, as matrizes devem ser geralmente hidrofílico e inerte. Embora os diâmetros de grânulo padrão da maioria destas matrizes são não-uniforme e relativamente grande (50

- 150 m), muitos são agora fornecidos tamanho uniforme como pequenas esferas (por

exemplo, 4-6 m de diâmetro), o que permite a sua utilização em muito processos eficientes de separação (cromatografia líquida de alta performance, HPLC), mas a custo crescente exponencialmente com a diminuição de tamanho do grânulo. Relativamente altas pressões são necessários para operar tais colunas que requeiram equipamentos especializados e uma considerável despesa adicional. Eles são utilizados apenas para a produção em pequena escala de enzimas caras, onde é necessário um alto grau de pureza (endonucleases de restrição por exemplo, e enzimas terapêuticas).

Fabricantes Coluna agora fornecer equipamentos para monitorar e controlar sistemas de cromatografia de modo que é possível ter aparelhos automatizados que carrega a amostra, coleta frações e regenera a coluna. Estes equipamentos devem, é claro, tem prova de falhas dispositivos para proteger tanto da coluna e do produto.

Cromatografia de troca Ion

As enzimas possuem uma carga líquida em solução, dependente do pH e a sua estrutura e ponto isoeléctrico. Em soluções de pH abaixo de seu ponto isoelétrico eles serão carregados positivamente e se ligam a permuta catiónica enquanto em soluções de pH acima do seu ponto isoelétrico eles serão carregados negativamente e se ligam aos trocadores de ânions. O pH escolhido deve ser suficiente para manter um nível

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elevado, mas oposta, carregar sobre a proteína e permutador de iões e da força iónica deve ser suficiente para manter a solubilidade da proteína sem sal a serem capazes de competir com sucesso com a proteína para iónica sites de troca. A ligação é reversível e predominantemente a sua força é determinada pelo pH e força iónica da solução, e as estruturas da enzima e permutador de iões.Normalmente, o pH é mantido constante e enzimas são eluídas por aumento da força iónica da solução.Uma ampla gama de resinas de permuta iónica, derivados de celulose e géis grande de poros estão disponíveis para uso cromatográfica.

Materiais de troca iônica são geralmente polímeros insolúveis em água contendo grupos catiônicos ou aniônicos. Matrizes de permuta catiónica têm grupos funcionais aniónicos tais como -SO 3

- , -OPO 3 - e -COO - e matrizes de permuta aniónica geralmente contêm

os grupos amónio terciários e quaternários catiónicos, com as fórmulas gerais NHR 2 + -

NR e 3 + . As proteínas tornam-se vinculados por troca com os contra-íons associados.

Resinas de poliestireno de troca iônica são eminentemente adequado para o uso de cromatografia em grande escala, mas têm baixas capacidades de proteínas, devido ao seu pequeno tamanho dos poros. A ligação é frequentemente forte, devido à hidrofobicidade da resina, e as condições necessárias para eluir as proteínas são geralmente grave e pode ser desnaturante. Não obstante tais resinas são um meio potencial de se concentrar ou purificar enzimas.

Celulose de troca iônica e grandes géis poros são muito mais geralmente adequado para purificação de enzimas e, de fato, muitos foram projetados para essa tarefa. Uma variedade de grupos carregados, aniónico ou catiónico, pode ser introduzido. O nível prático de substituição de celulose é limitada como derivatização acima de uma mole por quilograma pode levar à dissolução da celulose. Por conseguinte, as proteínas podem ser eluídas a partir deles sob condições suaves. Celulose de permuta de iões pode ser utilizada em ambos os processos descontínuos e de coluna, mas em grande escala, eles são utilizados principalmente em descontínuo. Isso ocorre porque o aumento da velocidade de processamento em batelada em larga escala e evitar as características de filtragem deep-cama de colunas superam qualquer vantagem devido ao aumento da resolução sobre colunas. A preparação cuidadosa antes de usar e regeneração após o uso é essencial para a sua utilização efectiva.

Operações de carga a carga, implicam a agitação permutador de iões pré-tratada e equilibrada com a solução de enzima em um recipiente adequado arrefecida. Adsorção para os permutadores é normalmente rápida (por exemplo, menos de 30 minutos) mas algumas proteínas podem demorar muito mais tempo para absorver completamente. A agitação é essencial, mas é preciso ter cuidado para não gerar partículas finas (multas). O material não adsorvido pode ser removido de uma variedade de maneiras. Cesto centrífugas são um meio particularmente conveniente de acelerar a remoção do sobrenadante inicial e a eluição do material adsorvido. Isto é normalmente feito usando aumentos graduais na intensidade e / ou mudanças de pH iónico, mas é possível colocar os permutadores, além de material adsorvido, em uma coluna e eluir

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utilizando um gradiente adequado. No entanto, ao passo que a celulose de troca iónica são amplamente utilizadas para a cromatografia de coluna em escala laboratorial, a sua compressibilidade provoca dificuldade quando são feitas tentativas para utilizar colunas de grande escala.

Alguns dos problemas com a celulose derivatizada podem ser ultrapassadas pela utilização de materiais mais recentemente introduzidos. Derivados de agarose reticulada (Sepharose CL-6B) e do polímero sintético Trisacryl têm capacidades elevadas (até 150 mg de proteína ml -1 ) ainda não são significativamente compressível. Além disso, elas não mudam o volume de pH e de força iónica que lhes permite ser regenerado sem a remoção a partir da coluna cromatográfica.

A cromatografia de afinidade

Este é um termo que abrange agora uma variedade de métodos de purificação de enzimas, o factor comum dos quais é a interacção, mais ou menos específicos entre a enzima e o ligando imobilizado. Na sua forma mais específica, ao ligando imobilizado é um substrato ou inibidor competitivo da enzima.Idealmente, deveria ser possível purificar uma enzima a partir de uma mistura complexa em um único passo e, de facto, factores de purificação de até vários milhares de vezes foram alcançados. Uma abordagem alternativa, igualmente específico é a utilização de um anticorpo para a enzima, como o ligando. Tais matrizes específicas, no entanto, são muito caros e não podem ser geralmente utilizados em larga escala. Além disso, eles muitas vezes não funciona tão bem como seria de esperar, devido aos efeitos de ligação não específicos. Em geral, a cromatografia de afinidade atinge um factor de purificação mais elevado (com um valor médio em purificações relatados de cerca de dez vezes) do que a cromatografia de permuta iónica (com um rendimento médio de cerca de três vezes), apesar de geralmente ser utilizados numa fase posterior na purificação, quando há menos de purificação possível.

Uma abordagem menos específico, apropriado para muitas enzimas, é a utilização de análogos de coenzimas NAD, tais como + , como o ligando. Este método tem sido utilizado com sucesso, mas agora foi substituído pelo emprego de uma série de corantes solúveis em água como ligantes. Estes são muito mais barato e, geralmente, por tentativa e erro, verificou-se que têm graus de surpreendentes especificidade para uma vasta gama de enzimas. Esta cromatografia de afinidade corante-se alegadamente descoberto por acaso, sendo certas enzimas que se ligam ao dextrano azul-tingido utilizado, como um padrão de peso molecular, para calibrar as colunas de exclusão de gel.

Outra descoberta fortuita foi a cromatografia de interacção hidrofóbica, encontrado quando foi observado que certas proteínas foram inesperadamente retida em colunas de afinidade contendo braços espaçadores hidrofóbicos. Adsorventes hidrófobos agora disponíveis incluem grupos octil ou fenil.Interacções hidrófobas são fortes em alta força

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iónica da solução assim amostras não necessitam de ser dessalinizada antes da aplicação ao adsorvente. A eluição é alcançada por alteração do pH ou da força iónica ou por modificação da constante dielétrica do eluente utilizando, por exemplo, etanodiol. A recente introdução é derivado de celulose para introduzir ainda mais grupos hidroxila. Este material (Whatman HB1) é concebida para interagir com proteínas de ligação de hidrogénio. As amostras são aplicadas à matriz numa concentrada (mais de 50% saturada,> 2 M) uma solução de sulfato de amónio. As proteínas são eluídas por diluição do sulfato de amónio. Isso introduz mais água que compete com a proteína para os sítios de ligação de hidrogênio. A selectividade de ambos estes métodos é semelhante à da precipitação fraccionada com sulfato de amónio, mas a sua resolução pode ser um pouco melhorada através da sua utilização em colunas de cromatografia, em vez de descontinuo.

Escolha cuidadosa de matrizes para cromatografia de afinidade é necessário. As partículas devem reter propriedades de porosidade e boa fluxo após a fixação dos ligandos e não deve ser capaz de adsorção não específica das proteínas. Agarose cumprir estes critérios e estão prontamente disponíveis como suportes ligando (ver também Capítulo 3 ). A cromatografia de afinidade não é usado extensivamente para o fabrico em grande escala de enzimas, principalmente por causa do custo. Sem dúvida, como os custos relativos dos materiais são reduzidos, e experiência em lidar com estes materiais é adquirida, os fabricantes de enzimas fará aumento da utilização destas técnicas muito poderosas.

Cromatografia de exclusão em gel

Existe agora uma escolha considerável de materiais que pode separar proteínas com base no seu tamanho molecular. Os dextrans originais reticulados (série Sephadex G-, Pharmacia Ltd.) e poliacrilamidas (série Bio-Gel P-, BioRad Ltd.) ainda são, com toda a razão, amplamente utilizado. Ambos os tipos estão disponíveis numa larga gama de tamanhos de poros e distribuição de tamanho de partícula.No entanto, medida que o tamanho dos poros aumenta, para utilização com enzimas de maiores dimensões, estes geles tornaram-se progressivamente menos rígida e, portanto, menos adequados para a utilização em larga escala. Consequentemente alternativa, mas geralmente mais caros, os materiais de gel rígidas têm sido desenvolvidos para o fraccionamento de proteínas de peso molecular maior do que cerca de 75.000. Estes são os derivados reticulados de agarose (Sepharose CL e Superose) e dextrano (Sephacryl S) feitas por Pharmacia Ltd., as misturas de poliacrilamida-agarose reticulados (Ultrogel AcA) feito por LKB Instruments Ltd. e o etileno glicol metacrilato (Fractogel HW) feitas por Toyo Soda Company (TSK). Estes estão disponíveis numa variedade de formas capazes de enzimas de fraccionamento, e outros materiais, com pesos moleculares de até 10 8 e a taxas de fluxo elevadas. Embora estes geles são descritos como "rígida", deve notar-se que este é um termo relativo. Os géis são significativamente melhores compressível assim o aumento de escala de laboratório a partir de colunas de tamanho não pode ser conseguida através da produção de colunas mais longos. Aumento de escala é

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alcançado através do aumento do diâmetro de colunas (até cerca de 1 m de diâmetro), mas mantendo a pequena profundidade. Além disso scale-up é feito ligando essas seções em série para produzir 'pilhas'. Extremo cuidado deve ser tomado em todas as colunas de gel de embalagem, de modo a permitir ainda, bem distribuídos, fluir através do leito de gel. Pela mesma razão, as partes de extremidade das colunas deve permitir uma distribuição uniforme do material sobre a totalidade da superfície da coluna. Os materiais mais recentes são fornecidos em um estado pré-inchado que permitem sua embalagem rápida e eficiente com uma pressão suave.

Cromatografia de exclusão em gel provoca invariavelmente diluição de enzima, o que deve, em seguida, ser concentrado usando um dos métodos descritos anteriormente.

Preparação de enzimas para venda

Uma vez que a enzima foi purificada até ao ponto desejado e concentrou-se, o principal objectivo do fabricante é reter a actividade. Enzimas para uso industrial são vendidos com base na actividade global.Muitas vezes, uma amostra de enzima recentemente fornecido terá uma actividade mais elevada do que o indicado pelo fabricante. Isto é feito para assegurar que a preparação enzimática tem a duração de conservação garantida. O fabricante costumam recomendar as condições de armazenamento e citar a taxa esperada de perda de atividade nessas condições. É de primordial importância para o produtor da enzima e do cliente que as enzimas manter a sua actividade durante o armazenamento e utilização.Algumas enzimas manter a sua actividade em condições operacionais para semanas ou mesmo meses. A maioria não.

Para alcançar a estabilidade, o fabricante utiliza todas as sutilezas à sua disposição. Formulação é uma arte e muitas vezes os pormenores precisos sobre os métodos utilizados para estabilizar as preparações de enzimas são mantidos em segredo ou revelado aos clientes apenas sob a capa de um acordo de confidencialidade. Às vezes é apenas a formulação de uma enzima que dá um fabricante a vantagem competitiva sobre as empresas rivais. Deve ser lembrado que a maioria das enzimas industriais contém relativamente pouco enzima activa (<10% w / w, incluindo as isoenzimas e actividades enzimáticas associadas), sendo o restante devido a proteína inactiva, estabilizantes, conservantes, sais e o diluente, o qual permite a normalização entre a produção lotes de diferentes actividades específicas.

A chave para manter a actividade da enzima é a manutenção da conformação, de modo impedindo desdobramento, agregação e alterações na estrutura covalente. Três abordagens são possíveis:

1. Uso de aditivos, 2. a utilização controlada de modificação covalente, e

3. imobilização de enzimas (discutido no Capítulo 3 ).

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Em geral, as proteínas são estabilizadas por aumentar a sua concentração e a força iónica do ambiente.Sais neutros competir com proteínas para a água e se ligam a grupos ou dipolos carregadas. Isto pode resultar em interacções entre os domínios hidrofóbicos de uma enzima a ser reforçado fazendo com que as moléculas de enzima para comprimir e tornando-os mais resistentes às reacções de desdobramento térmico. Nem todos os sais são igualmente eficazes em estabilizar as interacções hidrofóbicas, alguns são muito mais eficazes na sua desestabilização por se ligar a elas e perturbar a estrutura localizada de água (o efeito caotrópico , Tabela 2.4 ). A partir disto, pode ser visto por sulfato de amónio e fosfato de potássio hidrogénio são um poderoso enquanto estabilizadores de enzimas de tiossulfato de sódio e cloreto de cálcio desestabilizar enzimas. Muitas enzimas são especificamente estabilizada por baixas concentrações de catiões que podem ou não podem fazer parte do local activo,

por exemplo Ca 2+estabiliza -amilases e Co 2+ estabiliza isomerases de glicose. Em altas concentrações (por exemplo, 20% de NaCl), sal desencoraja o crescimento microbiano devido ao seu efeito osmótico. Além íons podem oferecer alguma proteção contra a oxidação de grupos como tióis por salga-out do oxigênio dissolvido da solução.

Tabela 2.4 . Efeito de iões de estabilização de enzimas.

Aumento do efeito caotrópico catiões Al 3+ , Ca 2+ , Mg 2+ , Li + , Na + , K + , NH 4

+ , (CH 3 ) 4 N +

Ânions SCN - , I - , ClO 4 - , Br - , Cl - , SO 4

2- , HPO 4 2- , citrato 3-

aumento de estabilização

Os polióis de baixo peso molecular (por exemplo, glicerol, sorbitol e manitol) também são úteis para a estabilização de enzimas, por reprimir o crescimento microbiano, devido à redução na actividade da água, e por a formação de terminais de protecção que impedem processos de desdobramento. O glicerol pode ser usado para proteger enzimas contra desnaturação devido à formação de gelo-cristal a temperaturas abaixo de zero. Alguns polímeros hidrofílicos (por exemplo, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona e hidroxipropilceluloses estabilizar enzimas) por um processo de compartimentação em que as interacções enzima-enzima e de enzimas em água são um pouco substituída por interacções enzima-polímero menos potencialmente desnaturantes. Eles também podem actuar estabilizando o efeito hidrofóbico dentro das enzimas. Muitas modificações químicas específicas de cadeias laterais de aminoácidos são possíveis, que pode (ou, mais vulgarmente, pode não) resultar na estabilização. Um exemplo útil é a derivação de cadeias laterais de lisina em proteases com anidridos de ácidos N-carboxiamino. Estas enzimas forma com vários graus de substituição e comprimento de cadeias laterais ligadas a amida polyaminoacylated.Esta derivatização é suficiente para disfarçar a natureza proteica e da protease evitar autólise.

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Lições importantes sobre a base molecular da thermostability foram aprendidas por comparação de enzimas a partir de organismos mesófilos e termófilos. Uma diferença frequentemente encontrado é o aumento da percentagem de resíduos de arginina à custa de resíduos de lisina e histidina. Isto pode ser possivelmente explicado pelo facto de a arginina é bidentado e tem um pKa superior a de lisina ou histidina (ver Tabela 1.1 ). Consequentemente, ele forma laços mais fortes com sal aspartato bidentado e cadeias laterais de glutamato, resultando em estruturas mais rígidas. Esta observação, entre outros, deu esperança de que mutagénese específica do local pode levar a enzimas com melhorou significativamente a estabilidade (ver Capítulo 8 ). Enquanto isso continua a ser possível converter resíduos de lisina grupos para arginina-como pela reacção com uréias ativados. Deve notar-se que as enzimas estabilizadas por torná-las mais rígidas normalmente mostram uma actividade mais baixa (isto é, V max ) do que a enzima "natural".

As enzimas são muito mais estáveis no estado seco do que na solução. Preparações de enzimas sólidas consistem, por vezes de proteína seca por congelação. Mais geralmente eles são tornadas volumosas com materiais inertes, tais como amido, lactose, carboximetilcelulose e outros poli-electrólitos, que protegem a enzima durante uma fase de secagem por pulverização mais barato. Outros materiais que são acrescentados às enzimas antes da venda pode consistir de substratos, tióis para criar um ambiente redutor, antibióticos, ésteres de ácido benzóico como conservantes para preparações de enzimas líquidas, inibidores de contaminar as actividades enzimáticas e agentes quelantes. Aditivos deste tipo deve, claro, ser compatível com a utilização final do produto da enzima.

Enzimas liberadas no mercado deve obedecer a uma série de procedimentos de qualidade, incluindo os requisitos regulamentares, que são legal e obrigatório. Este é fornecido pela garantia de qualidade ( QA ) dentro da empresa. Produtos de enzimas deve ser consistente, conforme apropriado para o uso pretendido. Isso pode ser assegurada por boas práticas de fabrico ( BPF ) e mais marcada pelo controle de qualidade ( QC ).

Atendimento ao Cliente

Um cliente que é provável a utilização de grandes quantidades de uma enzima será esperado para especificar a forma e em que a actividade enzimática é fornecido. O desenvolvimento de um novo processo catalisada por enzima é muitas vezes uma questão de trabalho em equipe entre o cliente e os cientistas de desenvolvimento da empresa enzima. Uma vez que o processo está em execução, a empresa enzima provavelmente estará em contato com o cliente através de três tipos de indivíduos:

1. Vendedores que garantir que o fornecimento de enzima continua e que o custo da enzima é mutuamente aceitável.

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2. Vendedores técnicos que assegurar a ligação com os gestores técnicos para garantir que seu produto está realizando até especificação. Isto muitas vezes leva a associação sugestões para o aperfeiçoamento do processo. A equipe de vendas técnica será esperado pelo cliente para lidar com problemas relacionados com a enzima. Eles podem ser capazes de resolver por si próprios problemas ou podem requerer os serviços de um terceiro grupo, o laboratório ou planta piloto cientistas.

3. Os cientistas de laboratório e planta-piloto vai passar algum tempo de resolução de problemas como e quando necessário. Eles podem testar materiais para os clientes, por exemplo, se uma nova fonte de matéria-prima está sob consideração.

Todos os funcionários da empresa enzima deve, é claro, trabalhar em equipe e é do interesse de ambos cliente e fabricante se os seus especialistas técnicos também cooperar estreitamente. Ambas as organizações irão aprender uns com os outros. Os avanços técnicos devem acumular como resultado de sugestões de ambos os lados.

Segurança e aspectos regulatórios do uso de enzimas

Só muito poucos enzimas presentes perigos, por causa de sua atividade catalítica, para aqueles que manipulam-los em circunstâncias normais, mas há várias áreas de risco potencial decorrentes da sua origem e natureza química. Trata-se de alergenicidade, toxicidade associada à actividade, actividade microbiológica residual e toxicidade química.

Todas as enzimas, sendo proteínas, são potenciais alérgenos e têm efeitos especialmente potentes se inalado como um pó. Uma vez que um indivíduo tem desenvolvido uma resposta imune como resultado da inalação ou contato com a pele com a enzima, re-exposição produz respostas cada vez mais graves se tornar perigoso ou até mesmo fatal. Devido a isso, as preparações de enzimas secas foram substituídos, em grande medida, por preparações líquidas, por vezes, deliberadamente feito viscoso para reduzir a probabilidade de formação de aerossol durante o manuseamento. Se uma preparação seca deve ser utilizado, como na formulação de muitos detergentes enzimáticos, respostas alérgicas por trabalhadores industriais são um problema muito significativo em especial quando os pós fino para polvilhar são empregues. Trabalhadores em tais ambientes são geralmente selecionados para alergias e problemas respiratórios. O problema tem sido largamente ultrapassados por meio do encapsulamento e preparações de enzima secas granulação, um processo que tem sido aplicado com sucesso para a maioria das proteases e outras enzimas utilizadas nos detergentes. Produtores e usuários de enzimas reconhecem que alergenicidade será sempre um problema em potencial e fornecer informações de segurança relativas ao tratamento de preparações enzimáticas. Eles salientam que a poeira no ar deve ser evitada para pesagem e manipulação de pós secos devem ser realizados em sistemas fechados. Qualquer pó enzima derramado deve ser removido

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imediatamente, após a primeira umedecendo-o com água. Qualquer pó enzima lixo deveria ser dissolvido em água antes de ser descartado na rede de esgoto. Enzima na pele ou inalado deve ser lavado com água em abundância. As preparações líquidas são inerentemente mais seguros, mas é importante que qualquer enzima derramado não é deixada a secar como a formação de poeira podem então ocorrer. A formação de aerossóis (por exemplo, procedimentos operacionais pobres na centrifugação) devem ser evitados, pois são pelo menos tão prejudicial como pós.

Toxicidade relacionada com a atividade é muito mais raro, mas é preciso lembrar que as proteases são potencialmente perigosos, particularmente em formas concentradas e, especialmente, se for inalado.Nenhuma enzima foi encontrado para ser tóxico, mutagénicos ou carcinogénicos, por si só, como pode ser esperado a partir da sua estrutura proteica. No entanto, as preparações de enzimas não pode ser considerado como completamente seguro tais como materiais perigosos podem estar presentes como contaminantes, derivadas da fonte de enzima ou produzidos durante o processamento ou armazenamento.

Os organismos utilizados na produção de enzimas podem, eles próprios ser fontes de materiais perigosos e têm sido o principal foco de atenção por parte das autoridades reguladoras. Nos EUA, as enzimas devem ser geralmente considerado como seguro (GRAS) pelo FDA (Food and Drug Administration) para ser usado como um

ingrediente alimentar. Tais enzimas incluem -amilase, -amilase, bromelina,

catalase, celulase, ficina, p-galactosidase, glucoamilase, isomerase de glicose, glicose-oxidase, invertase, lactase, lipases, papaína, pectinase, pepsina, tripsina e coalho. No Reino Unido, Aditivos e Contaminantes Comitê de Alimentos (FACC), do Ministério da Agricultura, Pescas e Alimentação enzimas classificados em cinco classes, com base em sua segurança para a presença nos alimentos e utilizar no seu fabrico.

Grupo A . Substâncias que a evidência disponível sugere são aceitáveis para uso em alimentos.

Grupo B . Substâncias que nas evidências disponíveis podem ser consideradas provisoriamente aceitáveis para o uso em alimentos, mas sobre o qual devem ser disponibilizadas mais informações dentro de um prazo determinado para a revisão.

Grupo C . As substâncias para as quais a evidência disponível sugere toxicidade e que não deveria ser permitido para utilização em alimentos, até prova adequada da sua segurança tenha sido fornecida para estabelecer a sua aceitabilidade.

Grupo D . As substâncias para as quais a informação disponível indica toxicidade definida ou provável e que não deveria ser permitido para utilização em alimentos.

Grupo E . As substâncias para as quais existem dados disponíveis inadequados ou não toxicológicos e para os quais não é possível expressar uma opinião sobre a sua aceitabilidade para uso em alimentos.

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Esta classificação tem em conta a toxicidade potencial químico de metabolitos secundários microbianos tais como micotoxinas e aflotoxins. O crescente corpo de conhecimento sobre os efeitos a longo prazo da exposição a estas toxinas é uma das principais razões para o reforço dos controlos legislativas.

As enzimas que se enquadram no grupo A são exclusivamente enzimas de plantas e animais, tais como a papaína, catalase, lipase, coalho e várias outras proteases. Grupo B contém uma gama muito ampla de enzimas a partir de fontes microbianas, muitas das quais têm sido utilizados em alimentos ou de processamento de alimentos para muitas centenas de anos. A Associação de produtores de enzimas microbianas Food (AMFEP) sugeriu subdivisões da FACC grupo B em:

Classe um microorganismos IN8 que têm sido tradicionalmente utilizados em alimentos ou no processamento de alimentos, incluindo Bacillus subtilis , Aspergillus niger , Aspergillus oryzae , Rhizopusoryzae , Saccharomyces cerevisiae , Kluyveromyces fragilis , Kluyveromyces lactis and Mucor javanicus .

Classe b microorganismos IN8 que são aceitos como contaminantes inofensivos presentes nos alimentos, incluindo Bacillus stearothermophilus , Bacillus licheniformis , Bacillus coagulans , e Klebsiella in8aerogenes .

Classe C microorganismos IN8 que não estão incluídos nas classes b e c, incluindo Mucor miehei ,Streptomyces albus , Trichoderma reesei , Actinoplanes missouriensis , e Penicillium emersonii .

Propôs-se que a classe não deve ser submetido a ensaios e que classes B e C devem ser submetidos aos seguintes testes:

1. toxicidade oral aguda em camundongos e ratos, 2. toxicidade oral durante 4 semanas subaguda em ratos, 3. toxicidade oral durante 3 meses em ratos, e 4. in vitro de mutagenicidade.

Além Classe c deve ser testado para microorganismo patogenicidade e, em circunstâncias excepcionais,in vivo de mutagenicidade, teratogenicidade e carcinogenicidade.

O custo dos vários testes necessários para satisfazer as exigências legais são muito importantes e devem ser considerados durante a determinação de custos do processo. Claramente a introdução de uma enzima de uma forma totalmente nova fonte será um assunto muito caro. Pode revelar-se mais satisfatório para clonar tal enzima em uma das classes de AMFEP uma organismos, mas isso vai exigir primeiro uma nova legislação para regular o uso de micróbios clonados nos géneros alimentícios. Alguns dos problemas de segurança associados com a utilização de enzimas livres pode ser

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ultrapassada pela utilização de enzimas imobilizadas (ver Capítulo 3 ). Esta é uma técnica extremamente segura, desde que os materiais utilizados são aceitáveis e nem eles, nem as enzimas imobilizadas, vazar para a corrente de produto.

A produção de enzimas está sujeita, no Reino Unido, para a Saúde e Segurança no Trabalho de 1974, para garantir a saúde e segurança dos empregados. Boas práticas de fabrico e controlo é empregue assegurar que a produção de enzima é realizada por uma cultura pura dos microorganismos que produzem.

Resumo e Bibliografia do Capítulo 2

a. As enzimas podem ser preparados a partir de muitas fontes, mas a maioria são obtidos por fermentação de micro-organismos.

b. O uso industrial de enzimas depende da sua eficácia, custo e segurança. c. A taxa de enzima libertada por qualquer homogeneização mecânica das células é

normalmente proporcional à quantidade de enzima disponível. d. A centrifugação é geralmente utilizado para a recolha de material sólido

enzimática filtração enquanto é preferido para recuperação da enzima líquida. Sistemas bifásicos aquosos estão se tornando mais comumente encontradas nas operações de recuperação de enzimas.

e. Preparação de enzimas industriais envolve o número mínimo de etapas de purificação que é compatível com a sua utilização. Purificação extensiva é um processo muito caro. Cuidados devem ser tomados sobre a prevenção da inativação durante a preparação da enzima.

f. Enzimas oferecidos para venda deve ser tão estável quanto pode ser necessário e seguro de manusear.

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12. O argumento econômico para a imobilização

13. Um fator importante que determina o uso de enzimas em um processo tecnológico é a sua despesa.Várias centenas de enzimas encontram-se comercialmente disponíveis a preços de cerca de 1 mg -1 , embora alguns são muito mais baratos e muitos são muito mais caros. Como enzimas são moléculas catalíticas, eles não são usados directamente por cima dos processos em que são utilizadas. Seu alto custo inicial, portanto, deve ser apenas incidental à sua utilização. No entanto, devido à desnaturação, eles perdem a atividade com o tempo. Se possível, eles devem ser estabilizados contra a desnaturação e utilizada de uma maneira eficiente. Quando são usados numa forma solúvel, que retêm alguma actividade após a reacção que não pode ser economicamente recuperada para re-utilização, e é geralmente desperdiçado. Este resíduo actividade continua a contaminar o produto e a sua remoção pode envolver custos de purificação adicionais. A fim de eliminar este desperdício, e dar uma produtividade melhorada, métodos simples e económicas deve ser utilizado, que permitem a separação da enzima a partir do produto de reacção. A maneira mais fácil de conseguir isso é através da separação da enzima e do produto durante a reacção utilizando um sistema de duas fases; uma fase contendo a enzima e a outra fase que contém o produto. A enzima é preso dentro de sua fase permitindo a sua reutilização ou uso contínuo, mas impedindo-a de contaminar o produto; outras moléculas, incluindo os reagentes, são capazes de mover-se livremente entre as duas fases. Isto é conhecido como a imobilização e pode ser conseguida através da fixação da enzima a, ou dentro, de um outro material. O termo "imobilização" não significa necessariamente que a enzima não pode mover-se livremente dentro de sua fase particular, embora este é frequentemente o caso. Uma grande variedade de materiais insolúveis, também conhecido como substratos (não devem ser

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confundidas com as enzimas reagentes '), pode ser utilizado para imobilizar as enzimas, tornando-os insolúveis. Estes são geralmente matrizes poliméricas ou inorgânicos inertes.

14. A imobilização de enzimas frequentemente sujeito uma despesa adicional e só é realizado se há uma vantagem económica ou processo de som no uso do imobilizada, em vez de livres (solúveis), enzimas. O benefício mais importante derivado de imobilização é a facilidade de separação da enzima a partir dos produtos da reacção catalisada. Isto impede que o enzima contaminar o produto, minimizando os custos de processamento a jusante e possíveis problemas de manuseamento de efluentes, sobretudo se a enzima é notavelmente tóxico ou antigénico. Ele também permite que processos contínuos de ser possível, com uma economia considerável no enzima, trabalho e custos indiretos. Immobilisation muitas vezes afeta a estabilidade ea atividade da enzima, mas as condições são geralmente disponíveis em que essas propriedades são pouco alterados ou mesmo reforçada. A produtividade de uma enzima, assim imobilizada, é grandemente aumentada, uma vez que pode ser mais totalmente utilizada em concentrações de substrato mais elevadas durante períodos mais longos do que a enzima livre. Enzimas imobilizadas insolúveis são de pouco uso, no entanto, onde qualquer dos reagentes também são insolúveis, devido a dificuldades de natureza espacial.

Métodos de imobilização

Existem quatro principais métodos disponíveis para imobilizar enzimas ( Figura 3.1 ):

a. absorção

b. ligação covalente c. aprisionamento

d. confinamento membrana

93

Figura 3.1. sistemas de enzimas imobilizadas. (A) não covalentemente enzima adsorvida a uma partícula insolúvel; (B) enzima ligada de forma covalente a uma partícula insolúvel; (C) a enzima encapsulada dentro de uma partícula insolúvel por um polímero de ligação cruzada; (D) a enzima confinado dentro de uma membrana semi-permeável.

Matrizes de veículos para imobilização de enzima por adsorção e ligação covalente deve ser escolhido com cuidado. De particular relevância para a sua utilização em processos industriais é seus custos em relação aos custos globais do processo; idealmente, devem ser barato o suficiente para descartar. A fabricação de produtos de alto valor em pequena escala podem autorizar a utilização de suportes relativamente caros e técnicas de imobilização Considerando que estas não seria rentável para a produção em larga escala de materiais de baixo valor agregado. Uma poupança substancial em custos ocorre onde o transportador pode ser regenerada após o tempo de vida útil da enzima imobilizada. A densidade superficial dos locais de ligação em conjunto com a área de superfície disponível para estericamente volumétrica da enzima, determinação da capacidade de ligação máxima. A capacidade real será afectada pelo número de potenciais sítios de acoplamento nas moléculas de enzima e a distribuição de carga electrostática e superfície polaridade (isto é, o equilíbrio hidrofóbico-hidrofílico) sobre a enzima e suporte. A natureza do suporte terá também um

94

considerável efeito sobre a actividade de uma enzima expressa e cinéticas aparentes. A distribuição de tamanho de forma, forma, densidade, porosidade, distribuição de tamanho de poro, a estabilidade operacional e de partículas da matriz de suporte irá influenciar a configuração do reactor em que o biocatalisador imobilizado pode ser utilizado. O suporte ideal é barato, inerte, fisicamente forte e estável. Ela vai aumentar a especificidade da enzima (k cat / K m), reduzindo simultaneamente a inibição pelo produto, mudar o pH óptimo para o valor desejado para o processo, e desencorajar o crescimento microbiano e a adsorção não específica. Algumas matrizes possuem outras propriedades que são úteis para fins particulares tais como ferromagnetismo (por exemplo, óxido de ferro magnético, que permitam a transferência do biocatalisador por meio de campos magnéticos), uma superfície catalítica (por exemplo, dióxido de manganês, que remove cataliticamente o peróxido de hidrogénio produzido pela inactivação mais oxidases), ou uma superfície redutora ambiente (por exemplo, óxido de titânio, para as enzimas inactivadas por oxidação). Claramente a maioria dos suportes possuem apenas alguns desses recursos, mas uma profunda compreensão das propriedades de enzimas imobilizadas não permite engenharia adequado do sistema de abordar essas qualidades ideais.

Adsorção de enzimas em suportes insolúveis é um método muito simples de grande aplicabilidade e capacidade de carga elevada da enzima (cerca de um grama por grama de matriz). Simplesmente misturando o enzima com um adsorvente adequado, em condições apropriadas de pH e força iónica, seguido, após um período de incubação suficiente, por lavando enzima frouxamente ligado e não ligado irá produzir a enzima imobilizada numa forma imediatamente utilizável ( Figura 3.2 ). A força motriz provocando essa ligação é geralmente devido a uma combinação de efeitos hidrofóbicos e a formação de vários elos de sal por molécula enzima. A escolha particular de adsorvente depende principalmente minimizando as fugas da enzima durante a utilização. Embora a relação física entre as moléculas de enzima e o suporte são frequentemente muito forte, que pode ser reduzido por muitos factores, incluindo a introdução do substrato. Cuidados devem ser tomados para que as forças de ligação não são enfraquecidas durante o uso por alterações inadequadas em pH ou força iônica. Exemplos de adsorventes adequados são matrizes de troca iônica ( Tabela 3.1 ), carbono poroso, argilas, óxidos metálicos hidratados, copos e resinas aromáticas poliméricos. Matrizes de permuta iónica, embora mais dispendioso do que estes outros suportes, podem ser utilizados economicamente devido à facilidade com que eles podem ser regeneradas quando a sua enzima ligada tenha chegado ao fim da sua vida activa; um processo que pode envolver simplesmente a lavagem da enzima utilizada com soluções salinas concentradas e re-suspensão do permutador de iões em uma solução de enzima activa.

95

Figura 3.2. Diagrama esquemático que mostra o efeito da concentração de enzima solúvel sobre a actividade da enzima imobilizada por adsorção a uma matriz adequada. A quantidade adsorvida depende do tempo de incubação, o pH, a força iónica, a área de superfície, a porosidade, e as características físicas de ambos a enzima e o suporte.

Tabela 3.1 Preparação de invertase imobilizado por adsorção ( Woodward 1985 )

Tipo de Suporte

% Ligada a DEAE-Sephadex

permutador de

aniões

CM-Sephadex permutador de

catiões

pH 2,5 0 100

pH 4,7 100 75

pH 7,0 100 34

A imobilização de enzimas por seu acoplamento covalente a matrizes insolúveis é uma técnica amplamente pesquisado. Apenas pequenas quantidades de enzimas podem ser imobilizadas por este método (cerca de 0,02 grama por grama de matriz), embora, em casos excepcionais, tanto quanto 0,3 g por grama de matriz tem sido relatada. A força de ligação é muito forte, no entanto, e muito pouco de fuga de enzima do suporte ocorre. A utilidade relativa dos vários grupos, encontrado em enzimas, para a formação de ligação covalente depende da sua disponibilidade e reactividade (nucleofilicidade), para além da estabilidade da ligação covalente, uma vez formado ( Tabela 3.2 ). A reactividade da proteína nucleófilos de cadeia lateral é determinado pelo seu estado de protonação (isto é, carregada de estado) e segue aproximadamente a relação -S - > -SH> -O - > -NH 2 > -COO - > -OH >> - NH 3

+ onde as cargas podem ser estimadas a

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partir de um conhecimento do pK a valores dos grupos ionizantes ( Tabela 1.1 ) e o pH da solução. Os resíduos de lisina são considerados os grupos mais geralmente útil para a ligação covalente de enzimas a suportes insolúveis, devido à sua exposição generalizado da superfície e reactividade alta, especialmente em soluções ligeiramente alcalinas. Eles também parecem ser só muito raramente envolvidos nos sítios ativos das enzimas.

Tabela 3.2 utilidade relativa dos resíduos de enzimas para o acoplamento covalente

Resíduo Conteúdo Exposição Reatividade Estabilidade

de casal Uso

Aspartato + ++ + + +

Arginina + ++ - -

Cisteína - ++ - -

Cistina + - -

Glutamato + ++ + + +

Histidina ++ + + +

Lisina ++ ++ ++ ++ ++

Metionina - - - -

Serina ++ + +

Treonina ++ +

Triptofano - - - -

Tirosina + - + _ + +

C terminal - ++ + + +

N terminus - ++ ++ ++ +

Hidrato de carbono

- ~ ++ ++ + +

Outros - ~ ++ - - - ~ ++ -

O método mais vulgarmente utilizado para imobilização de enzimas sobre a escala de investigação (por exemplo, usando menos do que um grama de enzima) envolve Sepharose activada por brometo de cianogénio. Este é um método simples, leve e, muitas vezes bem-sucedida de uma ampla aplicabilidade.Sepharose é um polímero frisado disponível comercialmente que é altamente hidrofílico e geralmente inerte a

ataque microbiológico. Quimicamente é uma agarose (poli- { -D-galactose -1,3 -1,4- (3,6-anidro) -L-galactose}) em gel. Os grupos hidroxilo do polissacárido combinar este com brometo de cianogénio para dar a imida cíclica-carbonato reactivo. Este reage com grupos amino primários (isto é, principalmente resíduos de lisina) com a enzima sob condições moderadamente básicas (pH 9-11,5,Figura 3.3a ). A elevada toxicidade do brometo de cianogénio levou à comercial, se bastante caro, produção de pronto-

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Sepharose activada e a investigação de métodos alternativos, envolvendo muitas vezes cloroformatos, para produzir intermediários semelhantes ( Figura 3.3b ). Carbodiimidas ( Figura 3.3C ) são reagentes bifuncionais muito úteis, pois permitem o acoplamento de aminas a ácidos carboxílicos. O controlo cuidadoso das condições e escolha de reacção carbodiimida permitir um elevado grau de selectividade na presente reacção. O glutaraldeído é outro reagente bifuncional que pode ser usado para enzimas cross-link ou vinculá-los aos suportes ( Figura 3.3d ). É particularmente útil para a produção de membranas de enzimas imobilizadas, por utilização de um biossensor, por ligação cruzada da enzima além de uma proteína de diluente não-catalítica dentro de uma folha porosa (por exemplo, papel de seda lente ou tecido de rede de nylon). O uso de trialcoxissilanos permite que mesmo esses materiais aparentemente inertes como o vidro a ser acoplados a enzimas ( Figura 3.3e ). Existem numerosos outros métodos disponíveis para a ligação covalente de enzimas (por exemplo, a ligação de grupos diazo-tirosina através de ligações, e grupos de lisina através da formação de amida com cloretos de acilo ou anidridos).

(A) brometo de cianogénio

[3.1]

(B) cloroformato de etilo

98

[3.2]

(C) carbodiimida

[3.3]

(D) glutaraldeído

[3,4]

(E) 3-aminopropiltrietoxissilano

99

[3,5]

Figura 3.3. métodos vulgarmente utilizados para a imobilização covalente de enzimas. (A) Activação de Sefarose por brometo de cianogénio. As condições são escolhidas para minimizar a formação do carbamato inerte. (B) Os cloroformiatos pode ser usado para produzir intermediários semelhantes aos produzidos por brometo de cianogénio, mas sem a sua toxicidade inerente. (C) carbodiimidas podem ser utilizados para fixar os grupos amino no enzima de grupos carboxilato no suporte, ou por grupos carboxilato na enzima com grupos amino sobre o suporte. As condições são escolhidas para minimizar a formação de ureia substituído o inerte. (D) O glutaraldeído é usado para enzimas cross-link ou vinculá-los aos suportes. É normalmente constituído por uma mistura de equilíbrio de monómero e oligómeros. O produto de condensação de

100

glutaraldeído e enzima podem ser estabilizadas contra a dissociação por redução com boro-hidreto de sódio. (E) A utilização de trialcoxissilano para derivatise vidro. O vidro reactivo pode ser ligado a enzimas por uma série de métodos, incluindo a utilização de tiofosgénio, como mostrado.

É evidente que é importante que a enzima imobilizada retém actividade catalítica tanto quanto possível, após a reacção. Isto pode, em parte, ser assegurado, reduzindo a quantidade de enzima ligada em conformações não catalíticos ( Figura 3.4 ). A imobilização da enzima na presença de concentrações saturantes de substrato, produto ou um inibidor competitivo garante que o local activo permanece não reagido durante o acoplamento covalente e reduz a ocorrência de ligação em conformações improdutivas.A actividade da enzima imobilizada é então simplesmente restaurada por lavagem da enzima imobilizada para remover estas moléculas.

Figura 3.4. O efeito de acoplamento covalente sobre a actividade expressa de uma enzima imobilizada.(A) enzima imobilizada (E) com o seu centro activo inalterado e pronto para aceitar a molécula de substrato (S), como mostrado em (b). (C) a enzima ligada em um modo não-produtiva, devido à inacessibilidade do sítio ativo. (D) A distorção do local activo produz uma enzima imobilizada inactivo.Modos não produtivos são melhor evitada pelo uso de grandes moléculas ligadas reversivelmente em ou

101

próximo do sítio activo. A distorção pode ser prevenida pela utilização de moléculas que podem sentar-se no sítio activo no processo de acoplamento, ou por utilização de um método livremente reversível para o acoplamento que incentiva a ligação à forma mais energeticamente estável (isto é, nativo) da enzima.Ambos (c) e (d) podem ser reduzidos pela utilização de grupos de espaçadores "entre a enzima e o suporte, eficaz deslocando a enzima para longe da influência estérica da superfície.

O aprisionamento de enzimas dentro géis ou fibras é um método conveniente para utilização em processos envolvendo substratos de baixo peso molecular e produtos. Quantidades em excesso de 1 g de enzima por grama de gel ou de fibra pode ser retido. No entanto, a dificuldade que temos em grandes moléculas aproximando os sítios catalíticos de enzimas aprisionadas opõe-se à utilização de enzimas aprisionadas com substratos de elevado peso molecular. O processo de aprisionamento pode ser um enjaulamento puramente física ou envolvem a ligação covalente. Como exemplo deste último método, os resíduos de lisina de superfície enzimas 'pode ser derivatizado por reacção com cloreto de acriloilo (CH 2= CH-CO-Cl), para dar as amidas de acriloílo. Este produto pode então ser co-polimerizado e reticulado com acrilamida (CH 2 = CH-CO-NH 2 ) e bisacrilamida (H 2 N-CO-CH = CH-CH = CH-CO-NH 2 ) para formar um gel. As enzimas podem ser aprisionados em fibras de acetato de celulose de, por exemplo, fazendo-se uma emulsão de a enzima mais de acetato de celulose em cloreto de metileno, seguido por extrusão através de uma fieira para uma solução aquosa de um agente precipitante. O aprisionamento é o método de escolha para a imobilização de células microbianas, vegetais e animais, em que o alginato de cálcio é amplamente usado.

Membrana confinamento de enzimas pode ser conseguida por um número de métodos bastante diferentes, os quais dependem para a sua utilidade na natureza semipermeável da membrana. Isso deve limitar a enzima, enquanto permitindo a passagem livre para os produtos da reação e, na maioria das configurações, os substratos. O mais simples destes métodos é conseguida pela colocação da enzima de um lado da membrana semi-permeável enquanto que a corrente de reagente e produto está presente no outro lado. Unidades de membranas de fibras ocas estão disponíveis comercialmente com grandes áreas de superfície em relação aos seus volumes constantes (> 20 m 2 l -1 ) e permeáveis a substâncias de peso molecular substancialmente menos do que as enzimas. Apesar de caro, estes são muito fáceis de usar para uma ampla variedade de enzimas (incluindo sistemas de regeneração de coenzima, ver Capítulo 8 ), sem os custos de pesquisa e desenvolvimento adicionais associados a outros métodos de imobilização.As enzimas, encapsuladas dentro de pequenas gotículas ou lipossomas (ver ligadas à membrana Capítulo 7 ), também podem ser usadas dentro de tais reactores. Como um exemplo do primeiro caso, a enzima é dissolvida numa solução aquosa de 1,6-diamino-hexano. Este é então disperso numa solução de ácido hexanodióico no solvente imiscível, clorofórmio. A reação resultante forma uma fina polimérica (Nylon-6,6) shell em torno das gotículas

102

aquosas que aprisiona a enzima. Os lipossomas são esferas concêntricas de membranas lipídicas, em torno da enzima solúvel. Eles são formados pela adição de enzima a soluções de fosfolípido. As micro-cápsulas são lavadas e lipossomas livres de enzima não-confinado e transferido de volta para solução aquosa antes da utilização.

A Tabela 3.3 apresenta uma comparação entre as características gerais mais importantes destes métodos.

Tabela 3.3 generalizadas comparação de diferentes técnicas de imobilização de enzimas.

Características Absorção Covalente obrigatório

Armadilha Membrana

confinamento

Preparação Simples Difícil Difícil Simples

Custo Baixo Alto Moderado Alto

Força obrigatória Variável Forte Fraco Forte

Vazamento Enzyme Sim Não Sim Não

Aplicabilidade Grande Seletivo Grande Muito ampla

Correndo Problemas Alto Baixo Alto Alto

Os efeitos da matriz Sim Sim Sim Não

As grandes barreiras de

difusão Não Não Sim Sim

Protecção microbiana Não Não Sim Sim

A cinética de enzimas imobilizadas

O comportamento cinético de uma enzima ligada pode ser significativamente diferente daquela da mesma enzima em solução livre. As propriedades de uma enzima pode ser modificada pela escolha apropriada do protocolo de imobilização, ao passo que o mesmo método pode ter efeitos sensivelmente diferentes em diferentes enzimas. Estas alterações podem ser devido a alterações conformacionais na enzima devido ao procedimento de imobilização, ou a presença e natureza do suporte de imobilização.

A imobilização pode efectuar muito a estabilidade de uma enzima. Se o processo de imobilização introduz qualquer tensão na enzima, esta é susceptível de encorajar a inativação das enzimas em condições de desnaturação (por exemplo, temperaturas mais altas ou extremos de pH). No entanto, quando existe uma ligação entre a enzima e o apoio multiponto unstrained, estabilização substancial pode ocorrer ( Figura 3.5). Isto é principalmente devido à prevenção física de grandes alterações conformacionais na estrutura da proteína, que geralmente precede a sua inactivação. Muitos processos de imobilização covalente bem sucedidas envolvem uma fase-reversível livremente inicial,

103

em que as ligações covalentes são permitidos para formar, quebrar e re-forma até uma estrutura ligada covalentemente unstrained é criado, de modo a estabilizar a enzima imobilizada resultante. Estabilização adicional é derivado, impedindo as moléculas de enzima de interagir umas com as outras, e a protecção que proporciona imobilização no sentido proteolítica e ataque microbiológico. Este último efeito é devido a uma combinação de difusão e de dificuldades da camuflagem ao ataque enzimático produzido pelas alterações estruturais. A fim de conseguir a estabilização máxima das enzimas, as superfícies de suporte e a enzima deve ser complementar com a formação de muitos covalente ou não esticado interacções não-covalentes. Muitas vezes, no entanto, este factor tem de ser equilibrado contra os outros, tais como o custo do processo, a necessidade de um material de suporte específico, e assegurar que os substratos não estão estericamente impedidos de difusão para o local activo da enzima imobilizada, de modo a reagir com um caudal suficiente.

Figura 3.5 . Ilustração da utilização de interacções multiponto para a estabilização de enzimas ( Martineket ai , 1977a, b ). (A) atividade de quimotripsina underivatised livre. (B ) actividade de quimotripsina derivatizado com cloreto de acriloílo. (C) -------- actividade de quimotripsina acriloílo copolimerizado dentro de um gel de polimetacrilato. Até 12 resíduos estão ligados covalentemente por molécula de enzima.Baixa derivatização leva a um menor estabilização. (D) ----- actividade de quimotripsina de forma não covalente, retido dentro de um gel de polimetacrilato. O grau de estabilização é determinada pela força do gel, e, portanto, o número de interacções não covalentes. Todas as reacções foram realizadas a 60 ° C usando substratos artificiais de baixo peso molecular. As preparações quimotripsina imobilizadas mostraram estabilização de até 100.000 vezes, mais do que é devido à sua natureza multiponto embora o consequente prevenção da perda de actividade da enzima autolítica seja um factor contributivo significativo.

104

As constantes cinéticas (por exemplo, K m , V max ) de enzimas pode ser modificado pelo processo de imobilização devido a mudanças estruturais internos e restringido o acesso ao local de acção. Assim, a especificidade intrínseca (k . / K m ) de tais enzimas podem também ser alteradas em relação à enzima solúvel. Um exemplo disto consiste em que a enzima tripsina livremente solúvel quinze hidrolisa ligações peptídicas na pepsinogénios proteína mas a enzima imobilizada hidrolisa apenas dez. O valor aparente desses parâmetros cinéticos, quando determinada experimentalmente, podem diferir dos valores intrínsecos. Isto pode ser devido a alterações nas propriedades da solução na proximidade imediata da enzima imobilizada, ou os efeitos de difusão molecular dentro do ambiente local ( Figura 3.6 ). A relação entre estes parâmetros é mostrado abaixo.

Parâmetros intrínsecos da enzima solúvel parâmetros intrínsecos da enzima

imobilizada parâmetros evidente devido à partição e difusão

105

Figura 3.6. A secção transversal esquemática de uma partícula de enzima imobilizada (a) mostra o macroenvironment e microambiente. pontos triangulares representam as moléculas de enzima. O microambiente consiste da solução interna mais que uma parte da solução circundante que é influenciada pelas características da superfície da enzima imobilizada. Partitioning de substâncias irá ocorrer entre esses dois ambientes. Moléculas de substrato (S) deve difundir-se através da camada circundante (transporte externo), a fim de atingir a superfície catalítica e ser convertido em produto (P). A fim de que toda a enzima a ser utilizada, o substrato também têm de se propagar dentro dos poros na superfície das partículas de enzima imobilizadas (transporte

interno). A porosidade ( ) da partícula é a relação entre o volume da solução contida

dentro da partícula para o volume total da partícula. A tortuosidade ( ) é a razão média do comprimento do percurso, através dos poros, entre quaisquer pontos dentro da partícula com a sua distância absoluta à parte. A tortuosidade, que é sempre maior do que ou igual à unidade, claramente depende da geometria dos poros. O diagrama exagera dimensões para efeitos de clareza.Tipicamente, o diâmetro de moléculas de enzima (2-10 nm) são 1-2 décadas menores do que os diâmetros de poro que são 2 - 4

décadas menores do que os diâmetros de partícula (10-2000 de m); o microambiente

106

que consiste de uma camada de difusão (~ 10 m de espessura) e uma camada mais fina de

partição (~ 20 nm de espessura). (B) A concentração do substrato à superfície das partículas de raio (R) é [S R ] Considerando que a concentração interna em qualquer raio menor (r) é o valor

inferior representado por [S r ].

Efeito de partição de soluto sobre a cinética de enzimas imobilizadas

A solução encontra-se dentro de alguns diâmetros moleculares ( 10 nm) a partir da superfície de uma enzima imobilizada será influenciada tanto pela carga e hidrofobicidade de superfície. Os encargos estão sempre presentes na superfície de partículas de enzima imobilizadas devido à natureza anfotérica de enzimas. Quando estas cargas positivas e negativas são igualmente não equilibrada, a carga líquida na superfície exerce um efeito considerável sobre as propriedades do microambiente. Esta carga de superfície, facilmente produzida pela utilização de troca iónica ou de matrizes carregadas semelhantes para a imobilização, repele as moléculas de carga semelhantes, enquanto a atrair os que possuem cargas opostas. A força de atracção ou de repulsão, devido a esta carga é significativa em distâncias moleculares mas decai rapidamente com o quadrado da distância a partir da superfície. A partição de moléculas carregadas (por exemplo, substratos e produtos) ocorre entre a solução a granel e do microambiente;moléculas de carga oposta à da superfície de enzima imobilizada a ser cindida no microambiente, enquanto que moléculas que possuem carga semelhante à superfície da enzima imobilizada são expulsos, com igual efeito, em solução em massa. A partição do soluto pode ser quantificada por meio da introdução

do coeficiente de partição electrostática ( ) definida por,

(3.1)

onde [C 0 n + ] e [A 0

n- ] representam cada concentração de cátion e ânion granel, [C n + ] e [A n- ] representam a sua concentração dentro do microambiente e n é o número de

comissões de cada íon. tem Verificou-se que variam dentro da gama de cerca de 0,01

a 100; ser maior do que a unidade para superfícies carregadas positivamente enzimáticos e menos do que a unidade para superfícies carregadas negativamente. O efeito da partição em moléculas positivamente e negativamente carregadas é igual, mas oposto. Para um suporte carregado positivamente, catiões são divididas longe do microambiente enquanto que a concentração de aniões é maior dentro desse volume

em comparação com o que na solução de banho. depende da densidade da carga e no interior da partícula de enzima imobilizada. É grandemente influenciado pela força iónica da solução. No força iónica elevada a elevada concentração de moléculas de soluto carregadas neutraliza a carga das partículas, reduzindo as forças electrostáticas

e causando para aproximar a unidade. Assumindo que a cinética de Michaelis-

107

Menten, a velocidade da reacção catalisada por uma enzima imobilizada é dada pela equação 1.9 , onde a concentração de substrato é a concentração no interior do microambiente.

(3.2)

Se o substrato é carregado positivamente, segue-se a partir da equação que 3.1

(3,3)

(3,4)

onde

(3,5)

K m app é a constante de Michaelis aparente que ser determinada experimentalmente

usando as concentrações de substrato grandes quantidades conhecidas. Se o substrato é carregado negativamente, as seguintes relações segurar:

(3.6)

(3.7)

O K m de uma enzima para um substrato é aparentemente reduzida se a concentração de substrato na vizinhança do local activo da enzima é mais elevada do que a medida na maior parte da solução ( Figura 3.7 ). Isso é porque uma concentração em massa inferior do substrato é necessário a fim de proporcionar a maior concentração de substrato localizada necessária para metade-saturar a enzima com o substrato.Efeitos semelhantes sobre a concentração local de produtos, inibidores, cofatores e ativadores pode mudar as constantes cinéticas aparentes envolvendo essas moléculas. Por exemplo, a constante de inibição aparente de um inibidor competitivo carregado positivamente é dado por,

108

(3.8)

Figura 3.7. O efeito de imobilização e força iónica na K m de bromelaína para o seu

substrato positivamente carregado, N- éster etílico de benzoil-L-arginina. O suporte é o polímero poli-aniónico carregado negativamente, carboximetilcelulose ( Engasser & Horvath, 1976 ). enzima livre; ------ enzima imobilizada.

Se a enzima imobilizada contém um número de grupos capazes de quelar catiões a partição de tais catiões dentro do microambiente é muito maior do que aquela descrita

pelo coeficiente de partição electrostática ( ). Por exemplo, isomerase da glicose solúvel tem uma maior concentração de iões de magnésio, do que aqueles requeridos pela enzima imobilizada. Ela também requer a presença de iões de cobalto, que não precisam de ser adicionados a processos que envolvem a enzima imobilizada devido ao seu forte quelação pela matriz imobilizada. A alta concentração de grupos ionizantes pode causar uma compartimentação dos gases de distância do microambiente com os consequentes efeitos sobre seus parâmetros cinéticos aparentes. É também um método útil para proteger as enzimas de oxigénio lábil por "salting out" o oxigénio a partir da vizinhança da enzima.

Particionamento diferencial dos componentes pares redox pode ter um efeito significativo sobre a actividade e a estabilidade de determinadas enzimas. Por exemplo, a papaína é estabilizada pela presença de tióis, que actuam como agentes redutores eficazes. No entanto, tióis possuem cargas negativas parciais em pHs neutros que faz com que a sua expulsão do microambiente da papaína se for imobilizado na argila carregado negativamente, caulinite. Com efeito, a par redox envolvendo tiol e dissulfeto descarregada, o que não está particionado, torna-se mais oxidante em torno desta

109

enzima imobilizada. O efeito líquido é uma desestabilização da papaína imobilizada em relação à enzima livre.

pK a ~ 8

2H + + 2R-S - 2R-SH RSSR + 2H + + 2e - [3.6] reduzido oxidado

(enzima estabilizada) (enzima desestabilizado)

Partition de íons de hidrogênio representa um caso importante de partição do soluto. O pH do microambiente pode diferir consideravelmente o pH da solução a granel, se os iões de hidrogénio são divididas em ou fora da matriz de enzima imobilizada. A ligação de substrato e a actividade da enzima imobilizada ambos dependem do pH microambiental locais enquanto o pH, tal como medido por um medidor de pH, sempre reflete o pH da solução do banho. Isto provoca mudanças aparentes no comportamento das constantes cinéticas em relação ao pH da solução ( Figura 3.8 ). É um processo muito simples para alterar o pH óptimo de uma enzima imobilizada por 1 - 2 unidades de pH que dão benefícios tecnológicos importantes (por exemplo, permitindo a operação de um processo afastado o pH óptimo da enzima solúvel, mas a um pH mais adequado para a solubilidade ou a estabilidade dos reagentes ou dos produtos).

Figura 3.8. Diagrama esquemático da variação nos perfis de actividade de uma enzima, imobilizada em suportes carregados, com o pH da solução. enzima livre. ------- enzima

ligada a um suporte catiónico carregado positivamente ; um pH de 5 a granel é necessária para produzir um pH de 7, no microambiente. ------- enzima ligada a um suporte aniónico carregado

negativamente; um pH de 7, no microambiente é produzido por um pH de 9 a granel.

110

Em adição ao seu efeito sobre a partição de soluto, o gradiente electrostático localizado podem afetar tanto a K m e V max ao encorajar ou desencorajar a abordagem intramolecular de grupos carregados na enzima, ou um complexo enzima-substrato, durante a ligação e catálise. Um grande número de pequenos ganhos e perdas energéticas pode complicar a análise de tais efeitos globais ( Tabela 3.4 ). Como as alterações resultantes são também reduzidos pelo aumento da força iónica da solução, estes efeitos electrostáticos podem ser difíceis de distinguir dos efeitos de partição.

Tabela 3.4 O efeito de ligação covalente a uma matriz carregada sobre as constantes cinéticas de quimotripsina de éster etílico de N-acetil-L-tirosina ( Goldstein 1972 )

Força iônica

(M) k cat

(s -1 ) Km (mM

especificidade (k cat / K m )

Enzima livre 0,05 184 0,74 249

1.00 230 0,55 418

Enzima ligada a um

suporte carregado negativamente

0,05 300 2.50 120

1.00 280 1.93 145

Enzima ligada a um suporte carregado positivamente

0,05 119 7.10 17

1.00 1.65 5,82 28

As mudanças em k gato pode ser devido à aproximação de dois grupos carregados positivamente durante o passo de controlo da velocidade na catálise

Interacções hidrófobas desempenhar um papel central na estrutura das membranas lipídicas e a conformação de macromoléculas, incluindo enzimas. Eles são responsáveis pela solubilidade relativa de moléculas orgânicas em solventes aquosos e orgânicos. Estas interações envolvem um rearranjo ordenada de moléculas de água com a aproximação de superfícies hidrofóbicas. A força de atração entre superfícies hidrofóbicas decai exponencialmente com a sua distância entre si, reduzir para metade a cada separação nanômetros. Estas interacções hidrofóbicas reduzir eficazmente a constante dielétrica do microambiente com consequente alteração das constantes de acidez de grupos de ácido e de base sobre as enzimas, substratos e produtos, tampões ( Figura 3.9 ). Efeitos semelhantes podem alterar as constantes de acidez dos grupos principais do substrato de ligação, de modo a afectar K m de enzima imobilizada para os seus substratos. Interacções hidrófobas não são afectadas pela força iónica ou no pH da solução, mas pode ser neutralizada pela presença de grupos hidrofílicos vizinhos, onde eles são suficientes para dominar a estrutura localizada das moléculas de água. Interacções hidrófobas podem, por conseguinte, fazer com que a partição de moléculas entre a fase de massa e o microambiente. Se a superfície das partículas de

111

enzima imobilizadas é predominantemente hidrofóbica, moléculas hidrofóbicas irá particionar no microambiente da enzima e moléculas hidrófilas será cindida para fora na solução de banho. O caso inverso aplica-se a superfície biocatalítico é hidrofílico. Partição provoca alterações na concentração local das moléculas que, por sua vez, afecta as constantes cinéticas aparentes da enzima de um modo semelhante ao descrito para as partículas de enzima imobilizadas possuindo uma carga líquida. Um exemplo deste efeito é a redução do K m imobilizada de enzima álcool desidrogenase por butanol. Se o suporte é de poliacrilamida a K m é de 0,1 mM, mas se o copolímero de metacrilato de mais hidrófoba com a acrilamida é utilizada como o suporte, o K m é reduzida a 0,025 mM. Neste exemplo, não é notada diferença nos valores aparentes de K m usando etanol, um substrato mais hidrofílico. Um efeito similar pode ser vista no caso dos inibidores competitivos ( Tabela 3.5 ). Gases particionados para fora a partir do microambiente pela presença de um suporte carregado (por exemplo, oxigénio) são geralmente divididos em microambiente por suportes hidrófobos

Figura 3.9. Diagrama esquemático que mostra o efeito de um suporte hidrofóbico no perfil de pH da actividade de enzimas imobilizadas em soluções de baixa carga iónica. enzima livre; ------- enzima imobilizada num suporte hidrofóbico. A redução efectiva na constante dieléctrica para o microambiente reduz a dissociação de grupos carregados, aumentando o pK um dos ácidos carboxílicos e reduzir o pKade um de alguns grupos básicos.

Tabela 3.5 O efeito de imobilização utilizando um suporte hidrofóbico sobre a inibição competitiva relativa de invertase

112

Invertase

Constante de inibição (K i , mM) Solúvel Limite para o poliestireno

(hidrofóbico)

Anilina (hidrofóbico) 0,94 0,39

Tris (hidroximetil) -aminometano

(hidrofílica) 0,45 1.10

O K i é reduzido em que tanto o inibidor e apoio são hidrofóbicos.

Outros efeitos partição específica estão associados a determinados suportes de imobilização. Como exemplos: (a) O Km aparente m de glucoamilase de maltose é consideravelmente reduzida quando a enzima é imobilizada em suportes de titânio activado; tais suportes com uma afinidade específica para algumas poli-álcoois. (B) Algumas resinas polifenólicos têm afinidades específicas para polissacarídeos que assistem a sua partição no microambiente.

Efeitos de difusão do soluto sobre a cinética de enzimas imobilizadas

Para que uma enzima imobilizada para catalisar uma reacção, os substratos devem ser capazes de se difundir através da solução para os locais cataliticamente activos e os produtos difundir para dentro da solução a granel. A força motriz para o processo é difusivo líquida devido aos gradientes de concentração, solutos a avançar na direcção de maior a menor concentração. Os substratos aproximam da superfície das partículas de enzima através da camada não agitada circundante estagnada fina da solução e, em seguida, difundir-se quaisquer poros, onde eles podem ser encontrados enzima activa. A circulação líquida dos solutos é descrito em termos de estas duas etapas;

difusão externa onde o transporte de substratos no sentido da superfície, e produtos de distância, está em série com a conversão catalítica dos substratos com os produtos que ocorrem na superfície (sendo os processos consecutivos)

difusão interna , onde o transporte dos substratos e produtos, dentro dos poros de partículas de enzima imobilizadas, está em paralelo com a reacção catalisada (sendo os processos simultânea).

Os gradientes de concentração provocadas pela difusão e partição são mostrados esquematicamente naFigura 3.10 . A taxa de uma reacção catalisada por uma enzima imobilizada (v) é, normalmente, mais baixa do que a taxa devido à mesma quantidade de enzima livre em solução (v livre ). Isto é devido à necessidade de controlo para o substrato de se difundir a partir da fase em massa para a superfície catalítica. A

113

concentração de substrato no interior do microambiente ([S]) é menor do que na massa ([S 0]), devido à sua deterioração, pela reacção. A alteração na velocidade de reacção

pode ser expresso quantitativamente através da introdução do factor de eficácia ( ), em que:

= v / v livre (3,9)

O factor de eficácia situa-se geralmente entre 0 e 1 e é dependente da concentração do substrato em massa, entre outros factores (ver mais tarde). Por vezes, pode ser maior do que a unidade devido a operação não-isotérmico, por causa de efeitos inibitórios ou de partição, ou se o enzima imobilizado é estabilizado em relação à sua forma livre ao longo do seu tempo de ensaio.

Figura 3.10. Diagrama esquemático mostrando os gradientes de concentração do substrato e do produto que podem ser produzidos em torno de uma partícula porosa de uma enzima imobilizada. (A) gradiente de concentração unicamente devido a reação e difusão interna dentro da partícula; (B) como (a), mas com gradientes de concentração adicionais devido à partição de substrato e produto no microambiente; (C) como (a), mas com um gradiente de concentração adicionais devido à difusão externa para a superfície da partícula; (D) gradientes de concentração devido aos efeitos combinados

114

de partição e difusão. A camada limite de partição é normalmente de cerca de mil vezes mais fina do que a camada limite de difuso. Os gradientes de concentração reais não vai mostrar as descontinuidades afiadas que são mostrados aqui para simplicidade.

O efeito de difusão externa sobre a taxa de uma reacção catalisada por enzima pode ser derivada simplesmente, assumindo que (1) a cinética de Michaelis-Menten (2), a enzima é imobilizado a um suporte impermeável plana, e (3) a ausência de qualquer ou de particionamento efeitos eletrostáticos. Se a reacção está a ocorrer sob condições de estado estacionário, a taxa de aumento do produto no interior do volume da solução deve ser igual as taxas de três processos consecutivos; a taxa a que se difunde para o substrato de superfície, a taxa de catálise enzimática, e da taxa à qual o produto se difunde para fora da superfície. A suposição de estado estacionário é geralmente válido se o volume do seio da solução é suficientemente grande de modo a que a variação no [S 0 ] com o tempo pode ser ignorado. Enzimas imobilizadas são sistemas abertos, onde tanto a energia e material são trocadas através da fronteira com o meio ambiente. Isto permite a operação em estado estacionário, mesmo a muito elevada carga de enzima. Em qualquer circunstância, é claro que a concentração de substrato à superfície catalítica não é possível aumentar ou diminuir a uma taxa substancial em comparação com a taxa de reacção continuamente.

Portanto, a partir de 1,8 equação ,

(3.10)

onde A é a área de superfície total e V max é a taxa máxima de reacção catalisada por unidade de área de superfície. Combinando as equações 1.8 e 3.10 , dá

(3.11)

Como varia de acordo com [S 0 ], a enzima imobilizada não será mais exibido cinética hiperbólicas.Parcelas Eadie-Hofstee (ver Figura 3.18 ) derivados da relação de 3,11 não são lineares porque obedecem a equação de transformação,

(3.12)

Como isto também envolve um termo em que varia, igualando unidade quando v é igual a V max para a intercepção com o eixo v vertical, mas que pode ser muito menor quando v é muito menos do que V maxna intersecção com o v horizontal / [S 0 ] eixo.

115

Partindo do princípio de que toda a superfície é acessível igualmente, a taxa de fluxo de substrato à superfície foi encontrado para ser proporcional tanto à área de superfície e a diferença em concentração de substrato entre o seio da solução e do micro-ambiente próximo da superfície. Ele é dado pela relação,

(3.13)

A constante de proporcionalidade (k L ) é conhecido como (fase líquida local) coeficiente de transferência de massa (com unidades de ms -1 ) que depende da difusividade do substrato e a distância efectiva entre a superfície e a fase em massa.

(3.14)

onde SD é a difusividade substrato (coeficiente de difusão) em solução livre (com

unidades de m 2 s -1 ) eé a espessura efectiva da camada sem agitação, por meio do qual o substrato tem de se difundir. A difusividade é definida pela lei de Fick como a taxa à qual a unidade de massa do composto (m) viaja através de uma unidade de área superficial (A), devido a um gradiente de concentração de densidade unitária

( mudança).

(3.15)

depende do peso e das dimensões do substrato molecular, e a temperatura, viscosidade e composição da fase líquida ( Tabela 3.6 ). Em termos gerais, quanto maior o peso

molecular e a viscosidade da solução, menor será a difusividade. pode ser efectivamente considerado como um raio, embora não seja precisamente definida pela espessura da camada não agitada estagnado como líquido movimento pode ser

detectável em distancia inferior a a partir da superfície. Sob condições de fluxo

estagnado é igual ao raio de partículas para partículas esféricas. Isso depende das condições hidrodinâmicas, sendo reduzida pelo aumento da taxa de agitação e consequente aumento da velocidade relativa de partículas de líquido .; esta

redução causando um aumento no coeficiente de transferência de massa (k L ). Por

exemplo, usando partículas de 400 m de diâmetro, foi encontrado para ser de

5 m quando utilizado num reactor de leito empacotado (ver Capítulo 5 ), a uma taxa

de fluxo de corrente de reagente de 1 ms -1. Dependente das condições, também podem variar com a difusividade e a densidade e viscosidade do líquido; aumentando com o aumento da difusividade e viscosidade, mas a redução com o aumento da diferença de densidade entre o biocatalisador imobilizado e o meio. Ele pode ser reduzido para metade por utilização de ultra-som, que pode ser particularmente útil para partículas maiores. Para as partículas pequenas biocatalíticas utilizadas normalmente, a

116

redução máxima que é realizável pelo aumento da turbulência da solução em torno da enzima imobilizada é cerca de dez vezes.

A taxa de difusão é significativamente afectada onde ocorre particionamento. Para moléculas carregadas, isto depende do gradiente de potencial electrostático em adição ao gradiente de concentração. O gradiente de potencial electrostático provoca

alterações aparentes em ambos e D S na vizinhança imediata da superfície (isto é, a

distâncias muito menor do que ). Isto pode ser particularmente relevante no caso da difusão de íons de hidrogênio (ver mais adiante), como os íons de hidrogênio se mover rapidamente através de soluções em diferentes gradientes eletrostáticas, devido à sua capacidade de mudar rapidamente sua associação com moléculas de água.

Tabela 3.6 Difusividade de moléculas em solução aquosa, a 20,

Substância Peso

molecular

Difusividade

(m 2 s -1 )

Oxigênio 32 21,0 x10 -10

Glicose 180 6.7 x10 -10

Sacarose 342 4.5 x10 -10

A inulina 5.200 2.3 x10 -10

Albumina 67.000 0.7 x10 -10

A urease 480000 0.3 x10 -10

Virus enfezamento vermelho

10700000 0.1 x10 -10

Devido à natureza do processo consecutivo a velocidade da reacção enzimática (dada por v na equação 3.10 ) deve ser igual à taxa de difusão do substrato à superfície catalítica (dada por v na equação 3.13 );os termos de um anulando.

(3.16)

Esta equação é quadrático em relação à concentração de substrato microambiental ([S]), cujo valor é muito difícil estabelecer por meios independentes. Ele pode ser simplificado sob valores extremos da relação de K [S] m da enzima para o substrate.If [S] é muito maior do que K m , do lado esquerdo daequação 3,16 simplifica para dar apenas V max

(3.17)

117

onde v Uma é a velocidade da reacção catalisada por unidade de área da superfície de enzima imobilizada.Daqui resulta que a velocidade da reacção é igual à taxa máxima de reacção da enzima não imobilizado quando a [S] e, portanto, [S 0 ], é muito maior do que o K m . Muitas vezes, no entanto, verifica-se que [S] é muito menos do que K m . Sob tais condições, 3,16 equação dá

(3,18)

coleta de termos em [S],

(3,19)

(3,20)

Da equação 3.10 , quando o [S] é muito menos do que K m ,

(3,21)

Substituindo [S] da equação 3.20 ,

(3,22)

(3,23)

Os valores relativos dos dois componentes do denominador, na equação 3.23 , determinar se a reacção está essencialmente controlada pela difusão do substrato (k L prazo) ou pela capacidade catalítica da enzima imobilizada (V max / K m prazo). A comparação pode ser efectuada por meio da introdução de um módulo de substrato

118

( , também conhecidas como o número Damkhler e é a relação adimensional de velocidade de reacção para o transporte de velocidade) definida por,

(3,24)

onde V max é a taxa máxima de reacção catalisada por unidade de área superficial. Substituindo isso naequação 3.22 ,

(3,25)

As relações entre as velocidades de reacção e a enzima imobilizada e concentrações de substrato a granel são mostrados na Figuras 3.11 e 3.12 . Quando k L é muito maior do

que V max / K m (isto é, a zero, quando o transporte de massa é capaz de atingir uma taxa muito mais rápida do que a reacção da enzima catalizada), a taxa global do processo está sob o controlo da cinética enzima, que é, em seguida, tão eficaz como a

enzima livre (isto é, = 1). Isto permite a simplificação da equação de 3,23 para produzir

(3,26)

No entanto, quando k L é muito menos do que V max / K m , (isto é, elevado módulo de substrato, em que o transporte de massa é muito mais lenta do que a taxa intrínseca da enzima reacção catalizada), a taxa global do processo está sob o controlo de . a taxa de difusão do substrato Equação 3,23 então simplifica para dar:

(3.27)

Esta última relação, para além da sua utilidade óbvia como um método para determinar os coeficientes de transporte de massa, é muito importante para a compreensão do comportamento de enzimas imobilizadas no âmbito do controlo de difusão de transporte externo do substrato. A velocidade da reacção é mostrado para ser independente da actividade da enzima. Isto significa que não é afectada por alterações no pH, temperatura (excepto no que pode afectar a viscosidade) ou a força iónica da solução, nem é afectada pela presença de inibidores ou activadores. Se, contudo, a proporção V max / K m é reduzido substancialmente por estas mudanças em condições de se aproximar o valor de k L , a relação mostrada na equação 3,27 deixará de ser verdadeiras. Conforme as limitações difusionais aproximar uma posição de controlo

119

total, o comportamento da enzima no que diz respeito a estes factores, que muda gradualmente a partir de uma enzima livre em solução para o estado de ser afectada. Por exemplo, aumentando o controlo de difusão provoca um alargamento do perfil de pH da actividade e uma diminuição da energia de activação (e o Q relacionada 10 ), ambos os quais serão mais evidentes para concentrações de substrato mais baixas. Sob tais condições, a concentração de substrato a granel que dá metade da taxa máxima de reacção ([S 1/2 ], equivalente à aparente K m , K m

app ) é maior do que o K mde enzima livre (ver Figura 3.12 ) . Isto está em contraste com o caso de a enzima livre, onde [S 1/2 ] é idêntico ao K m . A concentração do substrato dando microambiental equivalente taxa de reacção semi-máxima permanece igual ao K m .

Figura 3.11. A variação na velocidade da reacção catalisada por uma enzima imobilizada com a sua concentração. A relação mostra três fases; (A) controle cinético da enzima, extrapolada (-----) para mostrar a actividade de quantidades equivalentes de enzima livre; (B) misturado controle intermediário; (C) controlo da taxa de transporte externo de substrato.

120

Figura 3.12. Isto mostra a variação na taxa de reacção catalisada por uma enzima

imobilizada e a concentração de substrato grandes quantidades sem dimensão ( 0 ,

que é igual a [S 0 ] / K m ) com o módulo de substrato ( , definida pela equação

3,24 ). (A) enzima livre; (B) = 1; (C) = 3; (D) = 10; (E)= 100. Também são desenhadas as taxas máximas de substrato de difusão para a superfície, dada por vA /

V máx = k L0 (b ', c', d 'e e', mostrando o efeito de diminuir coeficientes de transferência de massa, k L= 1,00, 0,33, 0,10 e 0,01, o que corresponde a curvas b, c, d e e, respectivamente). Deve ser notado que as curvas b, c, d e e são limitadas tanto por uma curva e por as linhas b ', c', d 'e E', respectivamente.Controlo por difusão aumentou estende a gama de linearidade a concentrações de substrato mais baixas, mas a mesma V max é atingido em todos os casos, se uma concentração suficientemente alta de substrato pode ser conseguida (ver Figura 3.27a ).

v A pode ser substituído por V max / 2 na equação 3.13 quando [S] é igual a K m , dando:

(3,28)

Portanto:

(3,29)

Portanto:

121

(3,30)

O K m aparentemente aumenta com o módulo de substrato. Isto provoca uma redução na aparente especificidade. A introdução das concentrações de substrato adimensional (= [S] / K m ) e 0 (= [S 0 ] / Km ) em 3,16 equação dá,

(3,31)

Substituindo a partir da equação 3,24,

(3,32)

Isto pode ser simplificado para baixo 0, quando se aproxima de zero,

(3,33)

e,

(3,34)

Por conseguinte, se o valor de é conhecido, a concentração do substrato à superfície da enzima imobilizada pode ser obtido.

Os factores mais importantes que surgem a partir desta análise de preocupação as consequências de imobilização sobre a capacidade catalítica eficaz da enzima. É

evidente que o factor de eficácia ( ) deve variar tanto com 0 e , sendo reduzida

por baixo 0 e alta ; esta relação tenha sido ilustrado na Figura 3.13. As condições que produzem um aumento da probabilidade de controlo de difusão externa sobre a taxa de uma reacção catalisada por enzima imobilizada pode ser resumido como se segue:

1. Enzimática alta carregamento sobre a superfície. 2. Baixa concentração de substrato granel. 3. Baixa difusividade substrato. 4. Baixa K m . 5. Especificidade enzimática alta. 6. Baixa taxa de agitação ou mistura.

122

7. As superfícies planas (por exemplo, grande diâmetro médio das partículas, ver Figura 3.14 ).

Figura 3.13. O efeito combinado da concentração de substrato a granel ( 0 ) e o

módulo de substrato ( ) sobre o factor de eficácia ( ). O patamar (um) é uma área de controlo cinético, a superfície caindo através de uma área de controle intermediário (b) para uma zona de controlo de difusão (c).

123

Figura 3.14. diagrama esquemático que mostra o efeito do diâmetro da partícula no

factor de eficácia ( ) de enzimas imobilizadas. concentração pequena superfície de enzima; --------- concentração elevada superfície de enzima.

Cinética da enzima livre em difusão pode ser determinada simplesmente por diminuição da carga de enzima sobre o suporte de imobilização ou baixando a temperatura. Muitas vezes, é necessário para determinar os parâmetros cinéticos de uma enzima imobilizada na presença de efeitos difusionais externas. Este pode ser, a fim de investigar o efeito de imobilização na estabilidade intrínseca ou a actividade da enzima. O V intrínseco máximo pode ser determinado se as concentrações de substrato suficientemente alta microambiente pode ser conseguida (ver Figura 3.27a ) mas a determinação das vias intrínseca K m depende do conhecimento da concentração de substrato microambiental. Isso pode ser graficamente determinado se o coeficiente de transferência de massa é conhecida ( Figura 3.15 ).

124

Figura 3.15. Diagrama que ilustra um método para a determinação dos parâmetros cinéticos intrínsecos (V max e de K m ). O valor de k L pode ser determinado a partir da tangente da curva experimental na origem (uma linha). Para cada determinado experimentalmente (taxa de: a concentração de substrato a granel) de ponto de dados (x, na curva b), é desenhada uma linha de gradiente -k L a partir da posição adequada no eixo horizontal. A concentração de substrato microambiental é dado pela intercepção desta linha com a posição vertical que representa a velocidade da reacção. Estes determinado graficamente (taxa de: a concentração de substrato microambiental) pontos de dados ( o , na curva c) pode ser utilizado para calcular os parâmetros cinéticos intrínsecos.

O gradiente de concentração do substrato, dentro do microambiente, é só no próximo perfeitamente linear em superfícies planas (ver equação 3.13 ). A situação mais usual é a de enzimas ligados a superfícies curvas (por exemplo, partículas esféricas, o interior dos tubos cilíndricos ou o exterior das fibras cilíndricas). Estes são encontrados para produzir perfis de concentração não-lineares ( Figura 3.16 ). Isto deve-se às moléculas de substrato que se aproximam da superfície por meio de vias convergentes ou divergentes (por exemplo, moléculas de substrato se difundem para a superfície de uma partícula esférica passar através sucessivamente decrescentes volumes e áreas, o gradiente de concentração aumentando com a diminuição do raio, a fim de reter o mesmo fluxo ao longo de moléculas).

125

Figura 3.16. Os perfis de concentração de moléculas de substrato que se aproximam da superfície curva de enzimas imobilizadas, em que r é o raio de curvatura. (A) enzima ligada a partículas esféricas; (B) enzima fixada no exterior de fibras cilíndricos; (C) a

enzima ligado ao interior de tubos cilíndricos. r / = 9;---------- r / = 0,11. Em cada caso, = 10 -3 , 1 10 e 3 para o topo, meio e fundo par de curvas, respectivamente.

126

Os inibidores podem afectar a velocidade de uma reacção catalisada por enzima imobilizada de um modo diferente daquele em que eles afectam a enzima livre. A relativa afeta de inibidores competitivos, não competitivas e não-competitivas reversíveis podem ser compreendidos por conta das mudanças resultantes na constantes cinéticas

K aparente m app e V max

app . Se i representa o valor do módulo de substrato ( ), na presença do inibidor e usando a equação 3,24 , para inibição competitiva, a partir de1,84 equação ,

(3.35)

para a inibição não competitiva, a partir de equações 1.93 e 1.94 ,

(3,36)

para a inibição não competitiva, a partir de 1,98 equação ,

(3,37)

Competitivo e não-competitivo de inibição mostram ambas uma redução na i em

relação ao . Substrato resistência à difusão vai, por conseguinte, têm menos efeito sobre estes processos inibidos em que a enzima imobilizada desinibida. Isto é porque estas reacções inibidas são inerentemente mais lento e menor probabilidade de ser controlada pela taxa de difusão do substrato. Sem efeito é observado no caso da inibição não competitiva como esta tem efeito insignificante sobre a taxa de reacção a concentrações baixas de substrato. Mesmo nos dois primeiros casos, o efeito do grau

de inibição torna-se insignificante no alto módulo de substrato ( > 50), quando a equação 3,27 segura.

Inibição do produto podem ser mais grave no caso de enzimas imobilizadas devido ao produto ter de se difundir para fora do local de reacção. A sua concentração é provável que seja muito mais elevada dentro do microambiente do que no seio da solução ( Figura 3.10 ). No início da reacção, a concentração dos produtos vai acumular-se até que o gradiente de concentração ao macroenvironment massa é suficiente para permitir que a difundir fora a uma taxa igual a sua produção pela reacção. Se k L

S e K L

Prepresentam o substrato e os coeficientes de transferência de massa do produto, e [P] e [P 0 ] representam as concentrações do produto no microambiente e volume, respectivamente, em seguida, a partir de equação 3.13 ,

(3,38)

127

Sob o controle de difusão, [P] e [S 0 ] são muito maiores do que [P 0 ] e [S], respectivamente.

(3,39)

Substituindo [P] na equação 1,85 e assumindo que K m é muito maior do que [S],

(3,40)

O efeito de inibição pelo produto (o segundo termo no denominador) depende da concentração de substrato a granel e a relação de K m k G

S / (K P K L P ), que expressa a

competição entre o substrato e o produto pela superfície enzimática. A acumulação de produto na superfície aumenta com este rácio causando uma redução tanto a velocidade da reacção e o factor de eficácia. O efeito é maior quando K m / K P ou K L

S /

k G P são grandes e é pequena (<50). k G

S é geralmente aproximadamente igual a k G

Pmas pode ser mais elevada, onde a reacção envolvida produz um produto de peso molecular mais elevado de mais de uma molécula de substrato, ou substancialmente inferior em uma despolimerização (por exemplo hidrólise) da reacção.

Inibição pelo substrato apresenta um cenário um tanto mais complexo. As Equações 1.96 e 3.13 podem ser combinados para dar,

(3,41)

Esta equação é a terceira ordem em relação à concentração de substrato microambiental ([S]). Por este motivo, não é surpreendente que vários estados estáveis são possíveis, desde que a difusão do substrato para o enzima é suficientemente lenta ( Figura 3.17 ). A mesma concentração de substrato a granel pode dar duas concentrações estáveis diferentes dentro do microambiente; (1) uma concentração baixa, o que dá uma velocidade relativamente rápida de reacção, sem muito inibição pelo substrato, e igualmente rápida taxa de difusão para o interior do substrato, devido ao gradiente de concentração íngreme, e (2) uma concentração muito mais elevada que dá uma taxa relativamente lenta de reação, devido à inibição do substrato, e igualmente taxa lenta de difusão para dentro do substrato para baixo relativamente ligeiro gradiente de concentração. Uma terceira possibilidade existe de uma concentração intermediária representando um estado instável que não é naturalmente estabelecida e é de nenhuma conseqüência prática ( Figura 3.17 ). A escolha de qual estado estável existe depende das condições iniciais. A adição do substrato sob condições de baixo módulo de

128

substrato (por exemplo, a uma temperatura baixa ou com agitação vigorosa) permitindo uma concentração de substrato inicial elevada microambiental a ser alcançado e favorecendo o estado estável envolvendo superior [S], tal como a temperatura do substrato e o módulo são levantadas. O estado estável alternativa pode ser alcançado pela adição de um substrato sob condições de elevado módulo de substrato onde a concentração de substrato é inicialmente zero microambiental e mantido baixo.

Figura 3.17. O efeito de inibição pelo substrato na taxa de reacções enzimáticas imobilizadas. enzima imobilizada vs concentração de substrato microambiental (ou enzima livre versus a concentração de substrato a granel). A linha ---------- representa a

taxa de difusão do substrato de a maior parte ( 0 = 8) para o microambiente (isto é,

taxa de k = L ( 0 - ); baixa concentração de substrato microambiental, em relação à concentração de grandes quantidades, dando a taxa mais elevada.

Reacções reversíveis catalisadas por enzimas imobilizadas podem ser gravemente afectado pela difusão lenta do produto para fora da superfície catalítica. Mesmo uma ligeira acumulação da concentração do produto microambiental vai aumentar a taxa de reacção inversa, reduzindo seriamente a produtividade da enzima. Uma análise do efeito de resistência à difusão esta pode ser feita pela combinação de equações de 1,68 e 3,38, os quais descrevem em seguida, a resultante redução das velocidades de reacção e o factor de eficácia. A Figura 3.18 apresenta Eadie-Hofstee terrenos para comparar o efeito da reversibilidade da reacção de aumentar externo módulo de substrato.

129

Figura 3.18. Eadie-Hofstee traça que ilustra o efeito da resistência à difusão externa sobre a cinética de uma enzima imobilizada. Essencialmente não-reversível (a) e (b) reacções reversíveis são mostrados. A situação reversível foi modelada sobre a reacção de isomerase de glucose usando valores de 1,14 para o K eq e 42% e 51% (w / w, de hidrato de carbono presente) para a concentração inicial de grandes quantidades de frutose e glucose, respectivamente. As linhas representam a reacção cineticamente

controlado e o aumento de substrato módulo ( ), conforme mostrado. (A) corresponde à Figura 3.12 .

Resistência à difusão pode conduzir a um aumento aparente na estabilidade das enzimas imobilizadas. A razão para isto é o limite máximo da resistência à difusão que impõe a actividade. A uma carga elevada de enzima activa, a actividade obedece a equação 3,27 e é independente da actividade inerente da enzima imobilizada. Sob estas condições, não é sempre suficiente reacção ocorra para remover o substrato, uma vez que chega a partir de uma solução a granel, a maioria das moléculas de enzimas, sendo efectivamente redundante (factor de eficácia próxima de zero). A produtividade do biocatalisador imobilizado permanece constante até que a actividade específica da enzima tenha decaído suficientemente que a reacção não é mais diffusionally controlada ( Figura 3.19 ). Alguns dos primeiros pesquisadores da área que utilizou dados coletados apenas durante o período diffusionally controlado inicial foram levados a acreditar que o processo de imobilização era mais provável para estabilizar uma enzima do que agora é realizado.

130

Figura 3.19. A aparente estabilização de uma enzima imobilizada, quando diffusionally controlada.atividade utilisable; ---------- atividade intrínseca, não percebeu acima do teto atividade imposta pela difusão (que controla a velocidade) mais lento do substrato para a enzima.

Um caso especial de controle de difusão de reações enzimáticas imobilizadas diz respeito íons de hidrogênio. Muitos enzima catalisada reações envolvem a liberação ou o consumo de H + (por exemplo, desidrogenases, peptidases e esterases). Isto pode incluir qualquer reacção que envolve moléculas contendo grupos ionizáveis como o pK um de tais grupos s sobre os substratos e os produtos podem ser diferentes. Por vezes, a reacção pode produzir ou consumir os iões de hidrogénio que dependem do pH da reacção (por exemplo, urease, ver Tabela 6.2 ). Os iões hidrogénio difundir de forma relativamente lenta, semelhante a outros iões monovalentes, na ausência de um campo eléctrico. Isto é devido a quatro causas principais, (1) H + está normalmente hidratado (H 3 0 + , H 9 0 4

+ ) aumentar o seu peso molecular aparente e, consequentemente, reduzir o seu coeficiente de difusão, (2) a necessidade de electroneutralidade localizada exige a co-difusão de espécies carregadas positivamente e negativamente, de novo causando um aumento no peso molecular efectivo (isto é, cada um, H + difunde-se com um contra-ião aniónico), (3) os iões de hidrogénio são tamponados por histidina e outros grupos sobre as partículas de enzima imobilizadas que reduzem a sua capacidade de se difundir para a fase líquida a granel, (4) normalmente o H + na concentração de grandes quantidades de solução é baixo (por exemplo, pH 7 é equivalente a 10 -7 MH + ), que só permite a produção de muito pequenos gradientes de concentração mesmo as diferenças de 1 ou 2. O pH superficialidade da H + gradientes de concentração são especialmente perceptível quando comparados com aqueles que normalmente se verificam para outros substratos ou produtos (maior que mM). Por estas razões, muitas reacções pode ser controlada pela difusão de iões de hidrogénio para, ou para longe, superfícies de enzimas imobilizadas. O efeito deste controlo de difusão

131

pode ser examinada através da combinação de equações de 1,17 e 3,13 para uma reacção que envolve a produção de H + .

(3,42)

onde V * é a taxa máxima de reacção se pK a1 e pK a2 estão bem separadas, k G H é o

coeficiente de transferência de massa de H + , [H + ] é a concentração de microambiental H + , e [H + , 80] é a concentração de grandes quantidades de H + . Se a reacção envolve o consumo de iões de hidrogénio, a reacção obedece à seguinte equação relacionada

(3,43)

A magnitude da resistência à difusão é dada pelo módulo de protões ( H), onde

(3,44)

Observe a semelhança nas definições do próton e do substrato módulos (equação 3.24).

132

Figura 3.20. O efeito de controlo de difusão sobre o perfil de pH e pH-actividade local de uma enzima imobilizada reacção catalisada. (A), a variação do pH da superfície com

pH granel em vários módulos de protões ( ); H H <= 10 -5 ; --------H = 10 -4 , H =

10 - 3 , = H 10 -1 e H = 10. A redução no pH microambiental é mais perceptível a pH elevado devido aos gradientes de concentração de iões de hidrogénio muito mais baixas, e as taxas de difusão dos iões de hidrogénio, presente (por exemplo, uma diferença de pH de 1 a pH 12 produz um gradiente de concentração de um milionésimo da produzida a pH 6). (B) o efeito do pH da superfície sobre o perfil de pH da

actividade. Note-se que H e, por conseguinte, o perfil de pH da actividade irá variar

com a taxa de fluxo e o grau de turbulência. Se a reacção é iniciada a pH = 10 e = 0,1 H, a taxa de produção de iões de hidrogénio é inicialmente baixa (taxa inicial mostrada), mas mais rapidamente do que a taxa de que os iões de hidrogénio pode difundir-se para longe.Isto provoca uma queda no pH microambiental para o pH ideal, aumentar a taxa de reacção. Este processo continua até que o gradiente de concentração entre a microambiental e fases em massa é suficiente para que a taxa de difusão é igual à velocidade da reacção (taxa final mostrada).

Verificou-se que iões hidrogénio se acumulam na superfície quando o módulo de protões é superior a cerca de 10.000 ( Figura 3.20 ). Tais reacções podem ser operado a uma taxa significativa, bem longe do óptimo da enzima livre pH. Isto pode ser muito útil nos casos em que um tal pH permite que as solubilidades de substrato mais elevadas ou um ambiente mais favorável para o processo da reacção. A difusão dos iões de hidrogénio pode ser facilitada por pares ácido-base conjugados, mesmo em concentrações consideravelmente mais baixas do que as necessárias para a sua acção de tampão convencional. A razão para isto é que os "amortecedores" são capazes de muito maiores gradientes de concentração do que os iões de hidrogénio, sem afectar necessariamente o pH a granel ( Figura 3.21 ).Neste caso, a equação 3.42 deve ser estendida para incluir o transporte de difusão de íons de hidrogênio pelo ácido conjugado. Para uma reacção de produção de H + isto torna-se,

(3,45)

onde k G HB é o coeficiente de transferência de massa de HB, [HB] é a concentração de

micro-ambientais do ácido conjugado (HB) e [HB 0 ] é a concentração de grandes quantidades de HB. Em um pH maior de 7 de cerca de mil vezes mais íons de hidrogênio são transportados por um buffer mil imolar com um pK a de 7 de íon hidrogênio como livre. A presença destes íons tampão podem afetar significativamente o perfil de reações limitadas por difusão de íons de hidrogênio (pH-atividade Figura 3.22 ).

133

Figura 3.21. Diagrama esquemático mostrando o transporte facilitado de iões de hidrogénio para longe de uma enzima imobilizada catalisar uma reacção produzindo iões de hidrogénio. O gradiente de concentração de iões de hidrogénio é pequena devido à baixa concentração de iões de hidrogénio em grandes quantidades e a incapacidade para produzir uma concentração de iões de hidrogénio substancial (por exemplo, pH <3) no microambiente. O tampão, representada pelo par conjugado HB / B - , remove protões a partir da superfície para baixo gradientes de concentração muito mais acentuada, dependendo da sua concentração e pK um em relação ao pH da microambiental fases e a granel. A remoção de protões e de entrega reacções que ocorrem nestas fases do microambiente e a granel, respectivamente, são mostradas na parte inferior.

134

Figura 3.22. O efeito do transporte facilitado de íons de hidrogênio de distância de uma enzima imobilizada catalisar uma reacção produzindo íons de hidrogênio no perfil de

pH-atividade (em condições quando é 10). nenhum buffer; ------- --- concentração do tampão de alta, pK a = 7; concentração do tampão baixo, pK a = 7. O tampão é apenas eficaz, para facilitar o transporte, perto de sua pk uma como a baixo pH lá está presente base de insuficiente, que liga os íons de hidrogênio e de alto pH muito pouca ligação pode ocorrer devido aos equilíbrios desfavoráveis.

Análise dos efeitos difusionais em suportes porosos

Até agora, só um controlo externo difusional de enzima imobilizada reacções catalisadas foi descrito. Isto tem sido mais devido à facilidade da análise, em vez de usar a escala da sua aplicação. Embora seja, sem dúvida, extremamente importante, os catalisadores enzimáticos imobilizados são mais porosa, em certa medida, que requer a análise do efeito de resistência à difusão interna. Partículas porosas, geralmente têm grandes áreas de superfície de até várias centenas de metros quadrados por grama, permitindo muito elevada carga de enzima imobilizada. No caso de estes biocatalisadores operam sob o controlo de difusão externa total (isto é equação 3,27 detém), em seguida, a concentração de substrato de superfície é efectivamente zero, nenhum substrato está disponível para a penetração em quaisquer poros e difusão interna pode ser ignorada como sendo de menor importância. No entanto, em todos os outros casos, pode muito bem ser relevante. Isto é porque os caminhos através dos quais o curso do substrato internamente no interior das partículas são geralmente muito maiores do que as envolvidas no controlo de difusão externa (isto é, o comprimento do poro é várias

135

ordens de magnitude maior do que a profundidade da camada estagnante

circundante, ). Deve notar-se que o efeito das limitações difusionais externas podem ser moderadas, e, por vezes, completamente removido, mudando a velocidade de fluxo da solução de substrato sobre a superfície biocatalítica, mas tais modificações não têm qualquer influência sobre a difusão do substrato dentro do ambiente protegido do interior das partículas.

A difusão do substrato e produto dentro de um biocatalisador poroso ocorre em paralelo com a reacção catalisada. Quanto mais a reacção catalisada por enzima reduz a concentração de substrato no interior das partículas, maior será o gradiente de concentração do substrato criado entre o microambiente interno e a maior parte da solução. Este, por sua vez, vai aumentar a taxa à qual o substrato é fornecido às moléculas de enzima para o exterior das partículas, aumentar a sua eficácia. A produtividade da reacção é, portanto, consideravelmente reduzida pela grave de depleção do substrato profundo dentro da partícula e as consequentes elevadas concentrações de produto que lá se encontram, possivelmente causando a inibição ou inversão da reacção. Até um certo ponto, no entanto, isso é compensado pelo aumento do fluxo de substrato para a parte exterior das partículas enzimáticas imobilizadas devido ao aumento do gradiente de concentração do substrato.

Análise do efeito de difusão interna é complicada por factores tais como a forma das partículas, a distribuição de tamanho e a forma dos poros, o volume total dos poros com

respeito ao volume da partícula ( porosidade , ), para a profundidade que penetram os poros das partículas (por exemplo peliculares partículas têm apenas uma fina

camada de poros contendo enzimas na sua superfície), atortuosidade ( ) do percurso, através dos poros que os encontros de substrato, a difusividade efectiva dos reagentes e dos produtos dentro os poros e o grau de uniformidade da distribuição da enzima dentro das partículas (muitos métodos de imobilização produzir uma concentração em volume mais elevado de enzima para o exterior das partículas de enzima imobilizadas, devido à natureza rápida da reacção de imobilização, que imobiliza o enzima, antes de totalmente penetra nos poros). A fim de examinar o efeito desses factores no sistema real, é útil começar com a análise do efeito de resistência à difusão interna sobre a produtividade de partícula porosa biocatalítica um "modelo". Pelotas são frisados os biocatalisadores porosos mais vulgarmente encontrados e pode ser considerada como perfeitamente esféricas para o efeito. A cinética de outros tipos de biocatalisador poroso (por exemplo, folhas planas, membranosas pastilhas cilíndricas e fibras) pode ser analisada utilizando um método semelhante ao descrito aqui.

Uma partícula esférica poroso de enzima imobilizada pode ser representada como se mostra na figura 3.6. O modelo simplificado utilizado nesta análise também requer que

1. a enzima imobilizada é uniformemente distribuída por toda a partícula totalmente

porosa (ou seja, esão ambos unidade), 2. o modelo de Michaelis-Menten descreve a cinética da enzima, 3. o sistema está operando sob condições de estado estacionário e é isotérmico,

136

4. a difusão do substrato e produto obedece à lei de Fick (isto é, são proporcionais aos seus gradientes de concentração), e os coeficientes de difusão eficazes são constantes ao longo da partícula,

5. não há nenhuma resistência à difusão externa (isto é a concentração de substrato na superfície da partícula ([S R ]) é igual em que a maior parte da solução ([S 0 ]), e

6. nem partição nem inibição ocorrer.

Sob condições de estado estacionário, a taxa de líquido de difusão do substrato através

de uma fatia concêntrico de largura r em um "modelo" partícula esférica enzima imobilizada na posição radial r desde o seu centro deve ser igual à velocidade de reacção do substrato dentro que fatia . A taxa de difusão para o substrato fatia a partir

do exterior é igual ao fluxo ( ) vezes a área do lado de fora da fatia

( ). A taxa de difusão para fora do substrato que fatia para o interior da

partícula é igual ao fluxo ( ) vezes a área do interior da fatia (4 r 2 ). A taxa

de reacção do substrato dentro da fatia igual à actividade volumétrica ( ) vezes

o volume ( ). Portanto, através da combinação desses processos e ignorando os desprezível em termos r 2 e r 3 :

(3,46)

Simplificar e usando a identidade entre ( e

(3,47)

Isso pode ser ainda mais simplificada por substituição com as unidades adimensionais; para r / R, S para [S r ] / [S R ], e para [S R ] / K m .

(3,48)

Os efeitos relativos de difusão interna e a cinética da reacção pode ser descrita através

da utilização de um módulo de substrato para a difusão interna ( ), que é

137

conceptualmente semelhante ao para difusão externa. , no entanto, é definido de modo diferente para cada tipo de biocatalisador poroso ( por exemplo, esferas porosas,

membranas porosas planas, partículas peliculares). Substituindo for ( ) e combinando os termos da mão esquerda na equação 3.48 dá,

(3,49)

Portanto, como a largura da fatia tende a zero

(3,50)

Uma definição alternativa de ( ) que é linear em relação ao comprimento característico do sistema (neste caso, esta é a razão do volume para a área de superfície (R / 3)) é por vezes usado, onde:

(3.51)

e, portanto, os dois módulos estão relacionadas pela expressão:

(3,52)

Esta definição corresponde mais próxima da de , o módulo de substrato para a difusão externa, na medida em que é linear em relação ao comprimento. Deste modo, os aumentos no raio de partículas porosas são mostrados como sendo um factor adicional que pode causar o controlo de difusão numa reacção catalisada por enzima imobilizada. A equação de 3,50 não pode ser resolvido analiticamente mas podem ser

resolvidos por métodos numéricos utilizando as condições de contorno que S e são

unidade na superfície exterior da partícula, e e dS / d são iguais a zero no centro da partícula. Esta última condição é necessária, por razões de simetria através do centro da partícula. A solução é obtida por uma escolha iterativa da concentração do substrato no centro da partícula e usando a relação de 3,49 para descrever as alterações de concentração do substrato, em pequenas etapas, a partir do centro para fora, para a superfície da partícula até à primeira fronteira condição é satisfeita para dentro da precisão necessária. O perfil de concentração resultante, que pode ser obtida rapidamente utilizando um microcomputador bastante simples, permite que a taxa de

138

eficácia global e de reacção, catalisada pela partícula, deve ser calculado. Claramente, apenas se a concentração de substrato é inalterada ao longo da partícula será a eficácia

da enzima ser relativamente inalterada a enzima livremente solúvel (isto é, = 1). Isso é improvável de ser abordado, exceto no caso de muito baixa carga enzima ou

partículas muito pequenas. O módulo de substrato ( ) indica a importância destes factores, sendo proporcional à carga de enzima e o quadrado do diâmetro das partículas e inversamente proporcional ao coeficiente de difusão.Neste exemplo, é também inversamente proporcional à concentração de substrato a granel como este regula o valor extremo obtenível pelo gradiente de concentração.

Figura 3.23. Os perfis de concentração de substrato através de partículas porosas esféricas biocatalíticas.Os eixos representam a concentração do substrato em relação à concentração de substrato externo (S, que representa [S r ] / [S R ]), a posição

adimensional radial ( , representando r / R) e o factor de eficácia ( ). Os perfis

foram obtidos alterando o módulo de substrato ( ) mantendo ([S R ] / K m ) constante (e igual a 0,1). Perfis de concentração do produto também são mostrados; calculadas considerando a concentração do produto zero em massa e que os coeficientes de difusão de substrato e produto são iguais.

139

Figura 3.24 . Isto mostra a variação da concentração do substrato no centro de

partículas de enzima imobilizadas com o factor de eficácia ( ). Os valores de (representando [S R ] / K m ) de 10, 1 e 10 -3são ilustrados.

Figura 3.25. A variação na taxa de reacção catalisada por partículas esféricas porosas contendo enzima imobilizada com a concentração à superfície do substrato

adimensional, (representando [S R ] / K m ). A curva superior representa o caso em

que não existe um controlo de difusão (isto é, de zero '), enquanto que as curvas inferiores mostram o efeito de progressivamente maior módulo de substrato normalizada

para a difusão interna, '(correspondendo a 10, 30, 100, 300 e 1000). 'é o módulo de

140

substrato para a difusão interna ( ) normalizados com respeito ao K m (isto

é, '= ) de modo a torná-la independente do valor absoluto da concentração de substrato exterior. As formas das curvas indicadas devem ser comparados com aqueles encontrados em condições de controlo de difusão externa ( Figura 3.12 ). Notar em

particular a ausência de aqui a porção linear significativa a baixa e alto módulo substrato.

Os perfis de concentração do substrato através das partículas em vários factores de

eficácia estão apresentados na Figura 3.23 . Pode ser visto que mesmo a elevada a concentração do substrato é reduzido significativamente em direcção ao centro das

partículas e a baixa essa queda é tão grave que os centros das partículas encontram

muito pouco do substrato ( Figura 3.24 ). Isto é particularmente evidente a alta ([S R ] / K m ) como a velocidade de reacção está próximo de V max e pequenas alterações de concentração do substrato não baixam significativamente o factor de eficácia. A variação na taxa de reacção, com a concentração de substrato e substrato módulo é mostrado na Figura 3.25 . No factores baixa eficácia, apenas a camada exterior da partícula biocatalítica é utilizado fazendo com que as partículas de mostrar uma impressionante estabilidade aparente com o tempo; enzima relativamente não utilizado no núcleo de partículas só sua entrada em funcionamento, como a enzima imobilizada superfície inativa devido a desnaturação.

A variação do factor de eficácia com o módulo de substrato e a concentração de substrato adimensional é mostrado na Figura 3.26 , que deve ser comparada com a relação de equivalente de difusão externo mostrado na Figura 3.13 . A partir disto, pode ser visto que os valores do módulo de substrato abaixo unidade tem pouco efeito sobre a produtividade das partículas de enzima imobilizadas, mas valores mais elevados devido a uma redução considerável da eficácia da enzima especialmente a concentrações baixas de substrato.

141

Figura 3.26. O efeito combinado da concentração de substrato a

granel (representando [S R ] / K m ) e módulo de substrato para a difusão interna ( )

sobre o factor de eficácia ( ) de partículas porosas esféricas biocatalíticas. O patamar (um) é uma área de controlo cinético, a superfície gráfica caindo através de uma área de controle intermediário (b) para uma zona de controlo de difusão (c).

142

Figura 3.27 . Parcelas semi-logarítmicas para externamente (a, b; = 0, 0,1, 0,3, 1, 3 e

10) e internamente (c, d, '= = 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 e 1000) reações controlados envolvendo biocatalisadores imobilizados. (A) e (c) mostram as reacções não-reversíveis, enquanto (b) e (d) foram calculados para a reacção reversível que envolve isomerase de glucose (K eq = 1,14, concentração de grandes quantidades de glucose (S) e frutose (P), sendo 51 % e 42% (w / w), respectivamente, do hidrato de carbono no total).

143

Figura 3.28. parcelas de Eadie-Hofstee para internamente ( '= = 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 e 1000), as reacções que envolvem controladas biocatalisadores imobilizados. (A) reacção não-reversível, (b) reacção reversível que envolve isomerase de glucose (K eq = 1,14, concentração de grandes quantidades de glucose (S) e frutose (P), sendo 51% e 42%, respectivamente, do hidrato de carbono no total). Estas tramas correspondem aos mostrados na Figura 3.27 (c, d). Figura 3.18 (a, b) mostra gráficos de equivalentes Figura 3.27 (a, b).

Em sistemas reais, o fator eficácia é ainda mais reduzido por efeitos estéricos que foram ignorados na análise acima. Quando o substrato é grande em comparação com o diâmetro dos poros, a difusividade efectiva do substrato dentro dos poros será

significativamente reduzida, aumentando . Esta redução é geralmente proporcional à

tortuosidade da geometria do poro ( ) e inversamente proporcional à porosidade da

partícula ( ; ver Figura 3.6 para as definições de e ). O coeficiente de difusão eficaz é adicionalmente reduzida como a razão entre o diâmetro efectivo das substrato aumenta em relação ao diâmetro dos poros, em particular quando esta proporção excede 0,02. Esta relação geralmente provoca uma diminuição na difusividade efectiva com a profundidade penetrada pelo substrato. O sítio activo do enzima pode, adicionalmente, ser mascarado a partir da ligação do substrato pela dificuldade com a qual o substrato pode rodar dentro do espaço confinado de poros para se obter a conformação correcta eficaz. O factor de eficácia pode ser aumentada em condições não-isotérmicas em que a reacção gera calor no interior das partículas, que é então incapaz de escapar rapidamente para a fase em massa. Operação não-isotérmica é raramente encontrado como mais enzima reações catalisadas gerar pouco calor e as partículas catalíticas são relativamente pequeno, tendo grandes áreas de superfície, através do qual o calor pode escapar, por seu volume.

Em circunstâncias em que ambos os gradientes de difusão externas e internas são

encontrados, o fluxo de substrato através da camada estagnante ( )

deve ser igual ao fluxo de entrar na superfície das partículas ( ),

(3,53)

Como o coeficiente de difusão eficaz do substrato no interior das partículas (D S ) é geralmente menor do que em solução livre, o gradiente de concentração do substrato (d [S] / dr) no interior das partículas deve ser maior do que a que ocorre no exterior.

144

Determinação da constante cinética intrínseca (K m ) é mais complexa no caso de que o controlo interno difusional externo devido à complexidade adicional de variação da

difusividade no substrato eficaz. É melhor determinada sob condições em que é menor do que a unidade, quando pouco efeito difusional é aparente. Tais condições podem ser alcançadas por utilização de partículas suficientemente pequenas ou baixa carga de enzima. O conhecimento da intrínseca K m valor (es) e V max (obtido a concentrações elevadas de substrato, ver Figura 3.27 ) permite que os coeficientes de difusão eficazes para ser calculado.

O efeito de controlo de difusão interna sobre as reacções reversíveis ou inibidos é semelhante ao encontrado sob controlo de difusão externa. Pode ser analisados como descrito anteriormente para reacções não inibidas, não-reversíveis, mas substituindo a equação para a actividade volumétrica, por um envolvendo reversibilidade ou inibição. Por exemplo, no caso de a reacção de isomerase de glicose reversível, o termo actividade volumétrica de Michaelis-Menten em 3,46 equação pode ser substituída pela equação de 1,56. Isto dá a seguinte relação, depois de uma derivação similar à mostrada em equações de 3,46 a 3,49 ,

(3,54)

onde P representa [P r ] / [S R ], [P r ] representa a concentração do produto na posição radial r e K SPsubstitui K m

S / K m P . Sob condições de estado estacionário, a difusão

para o interior do substrato, e produto para o exterior são ligadas por o relacionamento

(3,55)

D, onde P é o coeficiente de difusão do produto.

( 3,56)

Este valor de P pode ser substituído na equação de 3,54 e a equação resultante resolvido por um método numérico iterativo tal como descrito anteriormente.

Uma comparação entre as taxas de reacção para as reacções não-reversíveis e reversíveis sob controlo tanto de difusão interna e externa são mostrados na Figuras 3,27 e 3,28 . Figura 3.27 sublinha o facto de que o controlo de difusão de uma reacção pode ser superada em concentrações suficientemente elevadas, qualquer que seja o substrato tipo de controlo ou módulo de substrato (desde que o substrato permanece solúvel e não ocorre inibição pelo substrato). Os dois tipos de controlo de difusão podem ser distinguidas com os maiores valores de módulo de substrato pelas diferenças

145

acentuadas na inclinação da curva sigmoidal no intervalo intermediário de taxas de reacção (por exemplo, entre 10% e 90% de V max ).Isto é porque a taxa de reacções internamente difusão controladas em concentrações baixas de substrato são um pouco aumentado pelo fluxo de substrato mais elevada através das camadas exteriores dos biocatalisadores porosos. Este efeito também pode ser observado nos gráficos Eadie-Hofstee ( Figura 3.28 ) com baixas taxas de reacção. Na prática, estes gráficos sofrem de inconvenientes se forem para ser usado para distinguir interna e do controlo de difusão externa. As parcelas semi-logarítmica precisa concentrações elevadas de substrato a ser possível sem afectar estes adversamente a reacção, ao passo que as parcelas de Eadie-Hofstee são mais propensas a erros dentro da área de interesse.

A diferença entre o controlo de difusão interna e externa é mais visível na variação da taxa de reacção com a temperatura. As reações catalisadas em condições de obey controle de difusão externa equação 3.27 . As taxas são independentes da actividade da enzima e são, por conseguinte, também quase independentes da temperatura. Claramente, as alterações na temperatura violentas podem afectar a enzima suficientemente que a taxa de reacção é reduzida abaixo da taxa a que o substrato se pode difundir a partir do seio da solução, mas, em seguida, a reacção não é mais diffusionally controlada. As reações catalisadas em condições de controle de difusão interna não obedecem a equação 3.27 . O aumento da temperatura aumentará a taxa a que as enzimas imobilizadas catalisar a reacção. Isto aumenta o gradiente de concentração do substrato causar um aumento no fluxo do substrato através da camada exterior das partículas biocatalíticas. Efetivamente, isso reduz pela metade o de energia livre padrão de ativação da reação em relação ao que catalisada pela enzima livre em solução. Deve notar-se que essa redução na energia de activação irá reduzir o efeito do aumento da temperatura sobre as velocidades de reacção de enzimas imobilizadas. A relação entre a taxa de reacção e a temperatura é mostrada esquematicamente na Figura 3.29 .

146

Figura 3.29. parcelas Arrhenius esquemática mostrando o efeito progressivo das limitações difusionais sobre a velocidade da reacção catalisada por partículas porosas contendo a enzima imobilizada. À medida que a temperatura aumenta a actividade progride através de três fases (a), (b) e (c), por esta ordem. (A) representa enzima controle cinético da reacção. A velocidade de reacção é suficientemente lento que não há limitações difusionais são perceptíveis. A energia livre padrão de activação pode ser obtida a partir do gradiente de esta linha. (B) representa o controlo da velocidade de reacção pela difusão interna do substrato (isto é, a taxa intrínseca da reacção aumentou para mais do que a taxa à qual substrato pode difundir-se nas partículas). (C) representa o controlo da velocidade de reacção pela difusão do substrato à superfície (isto é, a taxa intrínseca da reacção aumentou para mais do que a taxa à qual substrato pode difundir-se através da camada estagnante em torno das partículas). Nenhuma substrato está disponível para a penetração nos poros. ----------- baixo carregamento enzima, enzima carga intermédia, uma carga elevada da enzima. Uma representação de Arrhenius utilizando dados reais de uma enzima imobilizada mostraria curvatura pronunciada entre as três fases. A transição entre as secções lineares não seria prontamente perceptível, ao longo da gama de temperaturas normalmente encontradas durante a utilização de enzimas imobilizadas, a menos que a energia livre padrão de activação para a reacção foi invulgarmente elevado (por exemplo, acima de 75.000 J mol -1 para uma das as transições ou acima de 100.000 J mol -1 para ambas as transições).

Despolimerização enzimática (incluindo hidrólise) de macromoléculas possa ser afectada por controlo de difusão. As grandes moléculas só difundir de forma relativamente lenta. Após a reacção, catalisada pelo biocatalisador, os fragmentos clivados normalmente conservam a sua capacidade de actuar como substratos para a

147

enzima. Eles podem difundir para longe mas são susceptíveis de ser clivada por várias vezes, enquanto na vizinhança da enzima imobilizada. Isto provoca uma diferença significativa entre os perfis de peso molecular dos fragmentos produzidos pela utilização de enzimas livres e imobilizadas. Após um pequeno grau de hidrólise, a maioria das moléculas de substrato são clivados pela enzima solúvel livre, ao passo que a enzima imobilizada produz uma pequena quantidade de bem-hidrolisada de baixo peso molecular do produto com a maioria das moléculas de substrato inalteradas. Este processo é agravado pela utilização de biocatalisadores porosos onde existe alguma restrição adicional à difusão interna de moléculas grandes. Uso de enzima imobilizada é, portanto, indicado em circunstâncias em que apenas uma proporção mínima de produto parcialmente hidrolisado é necessária, uma vez que produz geralmente uma mistura de porções de quase totalmente hidrolisadas e polímero inalterada.

O aumento da concentração do produto no interior do micro-ambiente pode resultar num aumento da subprodutos causadas por reacções secundárias, especialmente quando a reacção inversa catalisada por enzima não mostram especificidade completa para a re-formação dos substratos. Isto é particularmente evidente na ação de alguns carboidrases. O aumento da concentração do produto microambiental pode ser utilizada, contudo, onde é necessária uma via de reacção. Co-imobilização das enzimas necessárias para os resultados da via em que uma rápida conversão através da via devido às elevadas concentrações localizadas de os intermediários ( Figura 30 ).

Figura 3.30. Diagrama esquemático que mostra o efeito da co-imobilização sobre a taxa de produção através de uma via de reacção curto. ---------- mistura de enzimas livres, em solução, co-enzimas imobilizadas mostrando um muito fase de latência reduzida. A redução na aparente fase lag é mais perceptível quando há mais enzimas na via. Ele é menos pronunciado quando o fluxo através da via é controlado pelo primeiro passo

148

como a concentração microambiental do substrato inicial não pode ser maior do que a sua concentração em massa, mas de todos os intermediários podem ser feitos devido à restrição de difusão na sua taxa de efluxo.

Uma extensão lógica do uso de sistemas multi-enzima imobilizada é a utilização de sistemas de células imobilizadas. Estes podem ser apresentados numa forma que ainda permite a respiração e a reprodução ou, de uma forma restrita, que não pode controlar estas funções, mas que retêm a actividade catalítica. Às vezes, eles são tratados com inibidores ou por meios físicos (por exemplo, calor) para assegurar que apenas um sub-conjunto das suas enzimas naturais permanecer activo. Comparado com os sistemas multi-enzima imobilizada, células imobilizadas são geralmente mais barato, mais fácil de preparar com elevada actividade, mostram pouca alteração no desempenho, a imobilização, no que diz respeito ao pH, força iónica e temperatura, e são geralmente preferidos para utilização com vias metabólicas envolvendo enzimas intracelulares ou cofactores ou coenzimas dissociáveis. No entanto, eles apresentam um certo número de inconvenientes de ordem prática. Eles são mais propensos a contaminação microbiana, menos eficiente no que se refere ao substrato a conversão do produto, muito mais difícil de controlar e apresentam problemas difusionais devido às suas membranas celulares.

Resumo e Bibliografia do Capítulo 3

a. A imobilização de enzimas permite a sua utilização eficiente e contínuo. A lógica por trás da separação é a imobilização fácil do produto a partir do biocatalisador.

b. As enzimas podem ser imobilizadas por adsorção, covalente, aprisionamento e confinamento membrana, cada método tem seus prós e contras. A adsorção é rápido, simples e barato, mas pode ser reversível. A ligação covalente é permanente, mas caro. O encarceramento é de aplicação geral, mas pode causar problemas de difusão. Membrana confinamento é um método flexível, mas caro para configurar.

c. A imobilização de enzimas podem ter um efeito considerável sobre a sua cinética. Isto pode ser devido a mudanças estruturais do enzima e a criação de um microambiente em torno distinta da enzima. A actividade de uma enzima imobilizada é governado pelas condições físicas neste micro não os que prevalecem na fase em massa. A matriz de imobilização afecta a partição de material entre a fase de produto e a fase de enzima e impõe restrições sobre a velocidade de difusão do material.

d. Alguns efeitos de imobilização de enzimas são vistos como sendo benéficas, enquanto outras são prejudiciais para a economia da sua utilização.

Referências e Bibliografia

149

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150

14. A utilização em larga escala de enzimas em

solução 15. Muitas das enzimas úteis industrialmente mais importantes têm sido referidos

anteriormente (ver Tabela 2.1 ). O valor do mercado de enzimas mundo tem aumentado rapidamente recentemente de 110M em 1960, 200 milhões em 1970, 270M em 1980, 500 milhões em 1985 para uma 1000M estimada para 1990, o que representa um aumento de 10% do mercado total de catalisador em 1980, para quase 20% na década de 1990. Esse aumento refletiu o aumento do número de enzimas disponíveis em escala industrial a relativamente diminuindo custos e aumentando a riqueza de enzimas o conhecimento sobre e suas potenciais aplicações. Como os custos da enzima geralmente representam uma pequena percentagem, no máximo, do custo do produto final, pode-se deduzir que as enzimas estão presentemente envolvidas em processos industriais com facturação anuais totalizando muitos milhares de milhões de quilos. Várias enzimas, especialmente aqueles utilizados na formulação de processamento de amido, de alta frutose xarope de fabricação, desengomagem de produtos têxteis e detergente, agora são negociados como produtos de commodities nos mercados de todo o mundo. Embora o custo de enzimas para utilização na escala de investigação é frequentemente muito importante, onde existe uma necessidade clara em larga escala para uma enzima seu custo relativo reduz dramaticamente com o aumento da produção.

16. Relativamente poucas enzimas, nomeadamente aqueles em detergentes, amaciadores de carne e agentes de compostagem de jardim, são vendidos diretamente ao público. A maioria é usada pela indústria para produzir produtos novos ou melhorados, para contornar as vias químicas sintéticas longas e complicadas ou para uso na separação e purificação de misturas isoméricas. Muitas das utilizações mais úteis, mas menos compreendidos, de enzimas livres são na indústria alimentar. Aqui eles são usados, juntamente com enzimas endógenas, para produzir ou processo de géneros alimentícios, que só raramente são substancialmente refinados. Sua ação, no entanto, aparentemente simples, é complicado devido ao efeito que pequenas quantidades de subprodutos ou produtos de reacção associados têm em tais efeitos subjetivos como sabor, aroma, cor e textura.

17. A utilização de enzimas no não alimentar (produtos químicos e farmacêuticos) setor é relativamente simples. Os produtos são geralmente separados e purificados e, portanto, eles não são propensos a subtilezas disponíveis para os produtos alimentares. A maioria dos tais conversões enzimáticas se beneficiar do uso de enzimas imobilizadas ou sistemas bifásicos e será analisada em pormenor nos capítulos 5 e 7 .

18. A utilização de enzimas em detergentes 19. A utilização de enzimas em formulações de detergentes agora é comum em

países desenvolvidos, com mais de metade de todos os detergentes

151

presentemente disponíveis que contêm enzimas. Apesar do fato de que a indústria de detergentes é o maior mercado único de enzimas a 25 - 30% do total de vendas.detalhes das enzimas utilizadas e as formas pelas quais eles são usados, raramente foram publicados.

20. A sujeira vem em muitas formas e inclui proteínas, amidos e lipídios. Além disso, as roupas que tenham sido engomados deve ser libertado do amido. A utilização de detergentes em água a altas temperaturas e com agitação vigorosa, é possível remover a maioria dos tipos de sujidade, mas o custo do aquecimento da água é elevada e prolongada de mistura ou batimento irá encurtar a vida de roupa e outros materiais. O uso de enzimas permite temperaturas mais baixas para ser empregue e são necessários períodos mais curtos de agitação, muitas vezes depois de um período prévio de imersão. Em geral, os detergentes enzimáticos remover a proteína de roupas sujas de sangue, leite, suor, grama, etc. muito mais eficaz do que os detergentes não-enzimáticos. No entanto, por meio de agentes de branqueamento e de avivamento modernos, a diferença entre olhar limpo e ser limpo pode ser difícil de discernir. Actualmente, apenas proteases e amilases são comumente usados. Apesar de uma vasta gama de lipases é conhecido, é apenas muito recentemente que as lipases adequados para utilização em preparações de detergentes foram descritos.

21. Enzimas para detergentes deve ser custo-efetivo e seguro de usar. As primeiras tentativas de usar proteases fracassaram por causa de produtores e usuários de desenvolvimento de hipersensibilidade.Este foi combatida através do desenvolvimento de granulados isentos de poeiras (cerca de 0,5 mm de diâmetro), no qual a enzima é incorporada num núcleo interno, contendo sais inorgânicos (por exemplo, NaCl) e açúcares como conservante, ligado com o reforço, fibras de carboximetilcelulose ou semelhante protectora colóide. Este núcleo é revestido com materiais cerosos inertes feitos a partir de óleo de parafina ou polietileno-glicol e vários tipos de ligantes hidrófilos, que mais tarde se dispersam na lavagem. Esta combinação de materiais, tanto previne a formação de poeira e protege as enzimas contra os danos por parte de outros componentes do detergente durante o armazenamento.

22. As enzimas são usadas em surpreendentemente pequenas quantidades na maioria preparações detergentes, apenas 0,4-0,8% em peso de enzima em bruto (cerca de 1% em custo). Daqui resulta que a capacidade de suportar as condições de utilização é um critério mais importante do que a extrema barateza. Uma vez libertada da sua forma granulada a enzima deve suportar detergentes aniónicos e não iónicos, sabões, oxidantes, tais como perborato de sódio, que geram o peróxido de hidrogénio, abrilhantadores ópticos e vários materiais menos reactivos ( Tabela 4.1 ), todos a valores de pH entre 8,0 e 10,5 . Embora um efeito de incorporar enzimas é que as temperaturas de lavagem mais baixas podem ser empregues, com as consequentes poupanças no consumo de energia, as enzimas devem reter a actividade até 60C.

23.

24. Tabela 4.1 Composições de um detergente enzimático

152

Constituinte Composição (%)

Sódio (água amaciante, solta a sujeira) um 38,0

Alcano sulfonato de sódio (agente tensioactivo) 25,0

O perborato de sódio tetra-hidratado (agente oxidante) 25,0

Sabão (alcano carboxilatos de sódio) 3.0

Sulfato de sódio (enchimento, purificador de água) 2,5

Carboximetilcelulose de sódio (agente de suspensão de sujeira) 1.6

Metassilicato de sódio (aglutinante, solta a sujeira) 1.0

Protease de Bacillus (3% activo) 0,8

Branqueamento fluorescentes 0,3

Agentes de controlo de espuma Traço

Perfume Traço

Água para 100%

25. um Uma tendência recente é para reduzir este conteúdo de fosfato por razões ambientais. Ela pode ser substituída por carbonato de sódio acrescido de protease extra.

26.

27. As enzimas utilizadas são todos produzidos utilizando espécies de Bacillus ,

principalmente, por apenas duas empresas. Novo Industri A / S produzir e fornecer três proteases, Alcalase, a partir de B. licheniformis, Esperase, a partir de uma estirpe de um alcalofílica B. licheniformis e Savinase, a partir de uma estirpe de alkalophilic B. amyloliquefaciens (muitas vezes erroneamente atribuídos a B. subtilis ). GistBrocades produzir e fornecer Maxatase, de B. licheniformis . Alcalase e Maxatase (ambos principalmente subtilisina) são

recomendados para uso em 10-65C e pH 7-10,5. Savinase e Esperase pode ser

utilizada em até pH 11 e 12, respectivamente. A amilase fornecido para utilização detergente é Termamyl, a enzima de B.licheniformis que também é

utilizado na produção de xaropes de glucose. amilase é particularmente útil em máquinas de lavar louça e DE-starching detergentes.

28. Em adição às formas de granulados destinados a serem utilizados em detergentes em pó, as preparações líquidas em solução em água e lamas da enzima em um agente tensioactivo não iónico estão disponíveis para a formulação de líquido em "manchas" concentrados, utilizados para a remoção de manchas mais resistentes. As preparações que contenham tanto Termamyl e Alcalase são produzidos, Termamyl ser suficientemente resistente à proteólise para manter a atividade por tempo suficiente para cumprir a sua função.

29. Deve notar-se que todas as enzimas proteolíticas são descritos de forma justa endoproteases serina não específicos, dando clivagem preferido no lado carboxilo dos resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, mas capaz de hidrolisar a maioria das ligações peptídicas. Eles convertem os seus substratos em fragmentos pequenos, facilmente solúveis que podem ser facilmente removidos a partir de

153

tecidos. Apenas serina-protease; pode ser utilizado em formulações de detergentes: tiol-proteases (por exemplo, papaína) iria ser oxidados por agentes de branqueamento, e metaloproteases (por exemplo, termolisina) perderiam seus co-factores de metal devido a complexação com os agentes amaciadores de água ou iões hidroxilo.

30. As enzimas são fornecidos em formas (como descrito acima) apropriada para a formulação por fabricantes de detergentes. Usuários domésticos estão familiarizados com preparações em pó, mas preparações líquidas para uso doméstico estão cada vez mais disponíveis. Lavagem de Domicílios apresenta problemas muito diferentes dos de lavagem industrial: a lavagem do agregado familiar é composto por uma grande variedade de tecidos sujos com uma gama de materiais e que o usuário requer comodidade e eficácia com menos consideração do custo. Início detergentes provavelmente irá incluir tanto uma amilase e uma protease e um longo tempo de imersão em água quente será recomendada. Lavagem industrial exige eficácia a um custo mínimo de água tão aquecida serão reutilizados, se possível. Grandes lavanderias pode separar sua 'lavagem' em categorias e, assim, minimizar o uso de água e maximizar a eficácia dos detergentes. Assim uniformes de algodão branco de um matadouro pode ser segregados para lavar, apenas protease a ser exigido. Um pré-lavagem de imersão durante 10-20 min a pH acima de 11 e 30-40C é seguido por uma lavagem principal durante 10-20 min a pH 11 e 60-65C. A água proveniente destas fases é descartada para o esgoto. A terceira lavagem inclui hipoclorito como água sanitária que inativar as enzimas rapidamente. A água a partir desta fase é usado novamente para a pré-lavagem, mas, até lá, a concentração de hipoclorito é insuficiente para prejudicar a enzima. Este é essencialmente um processo em descontínuo: lavandarias hospitalares pode empregar máquinas de lavar contínuas, que transferem linho menos inicialmente-sujo a partir de um estágio inicial de pré-lavagem, a 32C e pH 8,5, na primeira lavagem a 60 ° C e pH 11 , em seguida, para uma segunda lavagem, contendo peróxido de hidrogénio, a 71C e pH 11, em seguida, para uma fase de branqueamento e lavagem. Para além da fase de pré-lavagem, a partir do qual a água é dirigida para os resíduos, o processo funciona em contra-corrente. As enzimas são usadas na pré-lavagem e na primeira lavagem, os níveis de peróxido, nesta fase, ser insuficiente para inactivar as enzimas.

31. Há oportunidades para ampliar o uso de enzimas em detergentes, tanto geográfica e numericamente. Eles não encontraram o uso difundido em países que são muitas vezes quente e empoeirado em desenvolvimento, fazendo a lavagem freqüente de roupas necessárias. A recente disponibilidade de uma lipase adequada podem aumentar as quantidades de enzimas empregues de forma muito significativa.Não são, talvez, as oportunidades de enzimas, tais como glicose-oxidase, lipoxigenase e oxidase de glicerol como meios de geração de peróxido de hidrogénio in situ . Peroxidases Adicionado pode ajudar a eficácia de

branqueamento deste peróxido.

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32. Um desenvolvimento recente na enzimas detergentes tem sido a introdução de uma preparação de celulase fúngica alcalino-estável para utilização na lavagem de tecidos de algodão. Durante a utilização, as fibras pequenas são levantadas a partir da superfície do fio de algodão, o que resulta em uma mudança na "sensação" do tecido e, particularmente, na redução do brilho das cores. O tratamento com celulase remove as pequenas fibras aparentemente sem danificar os principais fibras e restaura o tecido para sua 'como novo' condição. A celulase também auxilia a remoção de partículas do solo a partir da lavagem por hidrólise de fibras de celulose associadas.

33. Aplicações de proteases na indústria de alimentos

34. Certas proteases têm sido utilizados no processamento de alimentos por séculos e qualquer registro da descoberta da sua actividade se perdeu nas brumas do tempo. Coalho (principalmente quimosina), obtido a partir do quarto estômago (abomaso) de novilhos tem sido tradicionalmente usada na produção de queijo. Da mesma forma, a papaína a partir das folhas e frutos verdes da papaia ( Carica papaya ) tem sido utilizada para amaciar carnes. Estas descobertas

antigos levaram ao desenvolvimento de várias aplicações alimentares para uma vasta gama de proteases disponíveis a partir de muitas fontes, geralmente microbiana. As proteases podem ser utilizados em vários valores de pH, e eles podem ser altamente específicos na escolha das ligações peptídicas quebráveis ou não específica bastante. A proteólise geralmente aumenta a solubilidade de proteínas nos seus pontos isoeléctricos.

35. A acção do coalho no fabrico de queijo é um exemplo da hidrólise de uma ligação peptídica específica, entre resíduos de fenilalanina e metionina (-Phe 105- Met 106 -)

na -caseína de proteínas presentes no leite (ver esquema de reacção [1,3] )

. O -caseína actua estabilizando a natureza coloidal do leite, a sua região N-terminal hidrofóbica associar-se com as regiões lipofílicas dos insolúveis em

contrário - e -caseína moléculas, enquanto que a sua carregado negativamente associados das regiões C-terminais com a água e impede que as micelas de caseína de crescer muito grande. A hidrólise da ligação peptídica lábil entre estes dois domínios, resultando na libertação de um oligopéptido glicosilada

e fosforilada hidrofílico (caseíno macropéptido) e o hidrófobo para- -caseína, remove o efeito de protecção, permitindo que a coagulação do leite para formar coalho, o que são, então, comprimido e transformado em queijo (Figura 4.1). O processo de coagulação depende da presença de Ca 2+ e é muito dependente da temperatura (Q 10 = 11) e assim pode ser controlada facilmente. Coalho de vitelo, que consiste principalmente de quimosina com uma proporção pequena mas variável de pepsina, uma enzima é relativamente caro e várias tentativas têm sido feitas para encontrar alternativas mais baratas a partir de fontes microbianas, em última análise Estes provaram ser bem sucedidas e coalhos microbianos são utilizados para cerca de 70% de queijo nos EUA e 33% da produção de queijo à escala mundial.

155

36.

37. 38. Figura 4.1. Esboço método para a preparação de queijo.

39.

40. O problema principal que teve de ser superado no desenvolvimento de os coalhos microbianos foi a temperatura labilidade. Quimosina é uma enzima relativamente instável e uma vez que ele tem feito o seu trabalho principal, pouca atividade permanece. No entanto, a enzima de Mucor miehei mantém actividade durante os

estágios de maturação de fabricação de queijos e produz amargo off-flavors. O tratamento da enzima com os agentes de oxidação (por exemplo H 2 O 2 , perácidos), que convertem os resíduos de metionina para as suas sulfóxidos, reduz a sua estabilidade térmica em cerca de 10C e torna-o mais comparável com coalho de vitela. Este é um caso raro de tecnologia enzima a ser usado para desestabilizar uma enzima Têm sido feitas tentativas para clonar quimosina em Escherichia coli eSaccharomyces cerevisiae , mas, até agora, a enzima foi

segregada na forma activa apenas a partir desta última. 41. O desenvolvimento de amargura indesejado na maturação do queijo é um

exemplo do papel de proteases na produção de aroma em produtos alimentares. A ação de proteases endógenas na carne após o abate é complexa, mas 'pendurado' carne permite sabor a desenvolver, além de amaciamento-lo. Verificou-se que os péptidos com terminais ácidas resíduos de aminoácidos dar carne, sabores apetitosos semelhante à de glutamato monossódico. Resíduos

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de aminoácidos hidrofóbicos não-terminal em oligopeptidos médias dar sabores amargos, a amargura de ser menos intensa, com peptídeos menores e desaparecendo com peptídeos maiores. A aplicação deste conhecimento permite a adaptação do sabor de hidrolisados protéicos. A presença de proteases durante a maturação dos queijos não é totalmente indesejável e uma protease de Bacillus amyloliquefaciens podem ser utilizados para promover a produção de aroma em queijo cheddar. As lipases de Mucor miehei ou Aspergillus niger são por vezes usados para dar sabores mais fortes em queijos italianos lipólise por um modesto, o aumento da quantidade de ácido butírico livre.Eles são adicionados para o leite (30 L l -1 ) antes da adição do coalho.

42. Quando as proteases são utilizadas para depolymerise proteínas, geralmente não-especificamente, a extensão da hidrólise (grau de hidrólise) é descrito em unidades de DH onde:

43. (4.1) 44. Comercialmente, utilizando enzimas tais como a subtilisina, DH valores de até 30

são produzidos usando preparações de proteína de 8-12% (w / w). As enzimas são formuladas de modo a que o valor da proporção de enzima: substrato utilizado é de 2-4% (w / w). Ao pH elevado necessário para a utilização eficaz de subtilisina, protões são libertados durante a proteólise e deve ser neutralizado:

45. subtilisina (pH 8,5), H 2 N-aa-aa-aa-aa-aa-COO - H 2 N-aa-aa-aa-COO - + H 2 N-aa-aa-COO - +

H + [4.1] 46. em que aa é um resíduo de aminoácido. 47. Correctamente aplicado proteólise de materiais de baixo custo, tais como a

proteína de soja pode aumentar a gama de valor e a sua utilização, como, aliás, ocorre naturalmente na produção de molho de soja. Hidrólise parcial da proteína de soja, para cerca de 3,5 DH aumenta muito a sua "expansão chicotadas ', ainda mais hidrólise, para cerca de 6 DH melhora a sua capacidade de emulsificação. Se os seus sabores são corretas, hidrolisados de proteína de soja pode ser adicionado a carnes curadas. As proteínas hidrolisadas podem desenvolver propriedades que contribuem para o evasivo, mas valioso, fenômeno da "sensação de boca 'em refrigerantes.

48. As proteases são usados para recuperar a proteína a partir de partes de animais (e peixes), caso contrário, ir para o lixo depois de massacrar. Cerca de 5% da carne pode ser removido mecanicamente a partir do osso. Para recuperar este, os ossos são purê incubados a 60 ° C com proteases neutras ou alcalinas para até 4 h. A pasta de carne produzida é usada em carnes e sopas enlatadas.

49. Grandes quantidades de sangue estão disponíveis, mas, com excepção dos produtos tais pudins preto, eles não são geralmente aceitáveis em produtos alimentares por causa da sua cor. A proteína é de alta qualidade e é nutricionalmente de-haemed usando subtilisina. Os glóbulos vermelhos são recolhidos e hemolisou na água. A subtilisina é adicionada e a hidrólise é deixada prosseguir de maneira descontínua, com a neutralização dos protões, para cerca

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de 18 DH, quando as moléculas de heme hidrofóbicos precipitar. Degradação excessiva é evitada para evitar a formação de péptidos amargos. A enzima é inactivada por um breve tratamento com calor a 85 ° C e o produto é centrifugado; nenhuma atividade residual permitida em produtos à base de carne. O precipitado contendo heme é reciclada e o sobrenadante castanho claro é processado através de grânulos de carvão ativado para remover qualquer haem residual. O hidrolisado purificado, obtido em rendimento de 60%, pode ser seca por pulverização e é usado em carnes curadas, salsichas e carnes do almoço.

50. Meat amaciamento pelas proteases endógenas no músculo após o abate é um processo complexo, que varia de acordo com o estado nutricional, fisiológico e até psicológica (ou seja, com medo ou não) do animal no momento do abate. A carne de animais mais velhos continua a ser difícil, mas pode ser tenro pela injeção de papaína inativo na veia jugular dos animais vivos pouco antes do abate. Injecção da enzima activa mataria rapidamente o animal de uma forma tão inaceitável dolorosa a forma de dissulfureto oxidado inactivo da enzima é utilizada. No abate, a resultante condições redutoras causar tióis livres se acumular no músculo, activando a papaína e portanto amaciamento da carne. Este é um processo muito eficaz, uma vez que apenas 2-5 ppm da enzima inactiva precisa ser injectada. Recentemente, no entanto, ele foi encontrado desfavor, pois destrói a animais coração, fígado e rins, que de outra forma poderiam ser vendidos e, por ser razoavelmente estável ao calor, a sua acção é difícil de controlar e persistir no processo de cozimento.

51. As proteases são também utilizadas na indústria da panificação. Se for caso disso, a massa pode ser preparada mais rapidamente se o seu glúten é parcialmente hidrolisado. Uma protease fúngica lábil ao calor é usada de modo que é inactivado no início da cozedura subsequente. Farinha de glúten fraco é necessário para biscoitos, a fim de que a massa pode ser espalhada pouco e reter impressões decorativas. No passado, isso foi obtido a partir de trigo doméstico europeu, mas isso está sendo substituída por variedades de alta glúten de trigo. O glúten na farinha derivados destes deve ser extensivamente degradado, se tal farinha deve ser utilizado de forma eficiente para fazer biscoitos ou para prevenir o encolhimento da massa de pizza comercial longe dos seus pratos de alumínio.

52. O uso de proteases nas indústrias de couro e lã

53. A indústria do couro consome uma parte significativa da produção de enzimas do mundo. Proteases alcalinas são usados para remover os pêlos do couro. Este processo é muito mais segura e mais agradável do que os métodos tradicionais envolvendo o sulfureto de sódio. Relativamente são necessárias grandes quantidades de enzima (0.1-1.0% (w / w)) e o processo deve ser cuidadosamente controlada para evitar a redução da qualidade do couro. Depois de depilação, peles, os quais são para ser utilizados para a produção de vestuário de couro macio e as mercadorias são bated, um processo, muitas vezes envolvendo

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enzimas pancreáticas, que aumenta a sua flexibilidade e melhora a suavidade da sua aparência.

54. As proteases têm sido utilizadas, no passado, a lã 'shrinkproof'. As fibras de lã são cobertos por escamas sobrepostas apontando para a ponta da fibra. Estes dão as fibras propriedades de fricção altamente direcionais, um movimento na direção de distância da ponta ser favorecido em relação ao movimento em direção a ela. Esta propensão para um movimento apenas na direcção um pode levar ao encolhimento e muitos métodos têm sido utilizados em tentativas para eliminar os problemas (por exemplo, oxidação química ou revestindo as fibras de polímero). Um método bem sucedido envolve a hidrólise parcial das pontas escala com a protease papaína. Este método também deu a lã de um brilho de seda e adicionado ao seu valor. O método foi abandonado há alguns anos, principalmente por razões económicas. Não é razoável esperar que o seu uso deve ser restabelecida agora que as fontes de enzimas mais baratas estão disponíveis.

A utilização de enzimas na hidrólise de amido

O amido é o mais comum de armazenamento de hidratos de carbono em plantas. Ele é usado pelos próprios plantas, por micróbios e por organismos superiores para que haja uma grande diversidade de enzimas capazes de catalisar a sua hidrólise. O amido a partir de todas as fontes de plantas ocorre sob a forma de grânulos que diferem significativamente em tamanho e características físicas de espécie para espécie. Diferenças químicas são menos acentuadas. A principal diferença é a proporção de amilose para amilopectina; por exemplo, amido de milho de milho ceroso contém apenas 2% de amilose, mas que a partir de amylomaize é cerca de 80% de amilose. Alguns amidos, por exemplo a partir de batata, contêm fosfato ligado covalentemente, em pequenas quantidades (0,2%, aproximadamente), o que tem efeitos significativos sobre as propriedades físicas do amido, mas não interfere com a sua hidrólise. A hidrólise ácida do amido tem tido uso generalizado no passado. É agora amplamente substituídos por processos enzimáticos, em que exigia a utilização de materiais resistentes à corrosão, deu origem a cor e elevado teor saltash (após neutralização), necessária mais energia para o aquecimento e foi relativamente difícil de controlar.

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Figura 4.2. A utilização de enzimas no processamento de amido. As condições típicas são apresentadas.

Dos dois componentes do amido, amilopectina apresenta o grande desafio para os

sistemas de enzimas hidrolíticas. Isto é devido aos resíduos envolvidos em -1,6-glicosídicas pontos de ramificação, que constituem cerca de 4 - 6% da glicose

presente. A maioria das enzimas hidrolíticas são específicos paraligações -1,4-

glucosídicas ainda os ligações de -1,6-glucosídicas deve também ser clivado por hidrólise completa de amilopectina em glicose. Alguns dos exercícios recentes mais impressionantes do desenvolvimento de novas enzimas possuem enzimas desramificadas causa.

É necessário para hidrolisar o amido em uma ampla variedade de processos que m ser condensado em duas classes básicas:

1. processos em que o hidrolisado de amido é para ser utilizado por micróbios ou homem, e

2. processos em que é necessária para eliminar o amido.

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Nos anteriores processos, tais como a produção de xarope de glicose, o amido é geralmente o principal componente das misturas de reacção, ao passo que nos últimos processos, como o processamento de sumo de cana-de-açúcar, pequenas quantidades de amido que contaminam os materiais não feculento são removidos. As enzimas de vários tipos, são utilizados nestes processos. Embora os amidos de diversas plantas pode ser utilizada, o milho é a fonte mais abundante do mundo e fornece a maior parte do substrato utilizado para a preparação de hidrolisados de amido.

Existem três fases da conversão do amido ( Figura 4.2 ):

1. gelatinização, envolvendo a dissolução dos grânulos de amido de tamanho de nanogramas para formar uma suspensão viscosa;

2. liquefacção, que envolve a hidrólise parcial do amido, com a perda concomitante da viscosidade; e

3. sacarificação, envolvendo a produção de glicose e maltose por hidrólise adicional.

Gelatinização é conseguida por aquecimento de amido com a água, e ocorre necessariamente e, naturalmente, quando os alimentos são cozinhados em amido. Amido gelatinizada é liquefeita prontamente por hidrólise parcial com enzimas ou ácidos e sacarificado por mais hidrólise ácida ou enzimática.

A indústria do amido e xarope de glicose utiliza a expressão equivalente de dextrose ou DE, semelhante na definição das unidades DH de proteólise, para descrever os seus produtos, onde:

(4 .2)

Na prática, este é geralmente determinada analiticamente por utilização da intimamente relacionada, mas não idênticas, a expressão:

(4 .3)

Assim, DE representa a percentagem de hidrólise das ligações glicosídicas presentes. Glucose pura tem um DE igual a 100, maltose pura tem um DE de cerca de 50 (dependendo dos métodos analíticos utilizados; ver equação ( 4.3 )) e amido tem um DE de praticamente zero. Durante a hidrólise do amido, DE indica a medida em que o amido tenha sido clivada. A hidrólise ácida do amido tem sido muito utilizado para a produção de xaropes de glucose '' e até mesmo glicose cristalina (dextrose mono-hidrato).Quantidades consideráveis de 42 DE xaropes são produzidos a partir do ácido e são usados em muitas aplicações em produtos de confeitaria. Além disso hidrólise usando ácido não é satisfatória porque dos produtos de degradação indesejavelmente

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coloridos e aromatizados. A hidrólise ácida parece ser um processo totalmente aleatório

que não é influenciada pela presença de ligações -1,6-glucosídicas.

Tabela 4.2 As enzimas utilizadas na hidrólise do amido

Enzima Número

CE Fonte Ação

amilase 3.2.1.1

Bacillus amyloliquefaciens

Apenas ligações -1,4-

oligossacarídeos são cortados para dar-

dextrina e predominantemente maltose (G2), G3, G6 e

G7 oligossacarídeos

B. licheniformis

Apenas ligações -1,4-

oligossacarídeos são cortados para dar-

dextrina e predominantemente

maltose, G3, G4 e G5 oligossacarídeos

Aspergillus oryzae ,A. Níger

Apenas -1,4 ligações

de oligossacáridos são clivados para dar -

dextrina e predominantemente

maltose e oligossacáridos G3

Sacarificaçãoamilase 3.2.1.1 B.

subtilis (amylosacchariticus)

Apenas de

oligossacarídeos ligações -1,4-se clivada para

dar -dextrina com

maltose, G3, G4 e até

50% (w / w) de glucose

-amilase 3.2.1.2 Cevada maltada

Somente -1,4-links

são cortados, de extremidades não redutoras, para dar

dextrina limite e -

maltose

Glucoamilase 3.2.1.3 A. niger

-1,4 e -1,6-

ligações são clivadas, a

partir do termina não redutora, para dar -

glucose

162

Pululanase 3.2.1.41 B. acidopullulyticus

Apenas -1,6-links

são clivada para dar maltodextrinas de cadeia linear

A nomenclatura das enzimas utilizadas comercialmente para a hidrólise do amido é um pouco confuso e os números CE, por vezes, amontoar enzimas com sutilmente

diferentes atividades ( Tabela 4.2 ). Por exemplo, a-amilase pode ser subclassificados como liquefacção ou sacarificação amilases, mas mesmo esta classificação é inadequada para abranger todas as enzimas que são utilizados na hidrólise de amido comercial. Uma razão para a confusão na nomenclatura é a utilização de formas anoméricas de reduzir o grupo libertado no produto, em vez do que

a da ligação a ser hidrolisada; os produtos de bactérias e fungos -amilases são

no configuração a e os produtos de -amilases são na configuração-, apesar de todas estas enzimas clivar entre resíduos de glicose-1,4-ligadas.

A amilases (1,4- glucanohydrolases -D-glucana) são endohydrolases que clivam

1,4- bônus -D-glucosidíca e pode ignorar, mas não pode hidrolisar 1,6-

branchpoints -D-glucosidíca. Enzimas comerciais utilizados para a hidrólise industrial de amido são produzidas por Bacillus amyloliquefaciens(fornecidos por vários fabricantes) e por B. licheniformis (fornecidos por Novo Industri A / S como Termamyl). Eles diferem principalmente na sua tolerância de altas temperaturas, Termamyl retendo mais actividade de até 110 ° C, na presença de amido, do que

o B. amyloliquefaciens amilase. O máximo obtenível usando DE

bacteriana amilases é de cerca de 40, mas o tratamento prolongado conduz à

formação de maltulose (4- -D-glucopiranosil-D-frutose), que é resistente à hidrólise

pela glucoamilase e-amilases. Os valores de ED de 12/08 são usados na maioria dos processos comerciais que requerem maior sacarificação é para ocorrer. O principal requisito para liquefacção para esta medida consiste em reduzir a viscosidade do amido gelatinizado para facilitar o processamento subsequente.

Vários fabricantes utilizam diferentes abordagens para a liquefacção de amido,

usando amilases, mas os princípios são os mesmos. O amido granular é transformado em pasta a 30-40% (w / w) com água fria, a pH 6,0-6,5, contendo 20-80 ppm de Ca 2+ (que estabiliza e ativa a enzima) e a enzima é adicionada (através de uma

bomba doseadora ). A amilase é normalmente fornecido em actividades elevadas de modo a que a dose de enzima é 0,5-0,6 kg por tonelada -1 (cerca de 1500 L kg -1 de matéria seca) de amido. Quando é utilizada a Termamyl, a pasta de amido com enzima é bombeado continuamente através de um cozedor a jacto, que é aquecida a 105C utilizando vapor vivo. Gelatinização ocorre muito rapidamente e a actividade enzimática, combinado com as forças de cisalhamento significativos, começa a hidrólise. O tempo de residência na panela de jacto é muito breve. O amido parcialmente gelatinizado é passada para uma série de sustentação de tubos mantidos a 100-105C e mantidas

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durante 5 minutos para completar o processo de gelatinização. A hidrólise ao DE exigidas sejam concluídas nos reservatórios de retenção na 90-100C para 1-2 h. Estes tanques conter defletores para desencorajar retromistura.Processos semelhantes

podem ser utilizados com B. amyloliquefaciens amilase, mas a temperatura máxima de 95 ° C não deve ser ultrapassada. Isto tem a desvantagem de que uma "cozedura" fase final tem de ser introduzido quando o DE necessária tenha sido atingida, a fim de gelatinizar os grãos de amido recalcitrantes presentes em alguns tipos de amido, que de outra forma poderiam causar turvação em soluções do produto final.

O amido liquefeito é normalmente sacarificado mas comparativamente pequenas quantidades estão à venda como "maltodextrinas 'para a indústria de alimentos, principalmente para uso como agentes de volume e em alimentos para bebés spray-dried. Neste caso, a actividade enzimática residual pode ser destruído por abaixamento do pH no final do período de aquecimento.

Fúngica amilase também encontra uso na indústria de panificação. É muitas vezes tem de ser adicionado à farinha de panificação para promover a produção de gás adequado e a modificação do amido durante a fermentação. Isto tornou-se necessária uma vez que a introdução de colheitadeiras. Eles reduzem o tempo entre a ceifa e debulha do trigo, que, anteriormente, era suficiente para permitir a germinação limitado, aumentando as quantidades de enzimas endógenas. As enzimas de fungos são utilizados em vez daqueles de bactérias como a sua acção é mais fácil de controlar, devido à sua labilidade relativa de calor, desnaturação rapidamente durante o cozimento

Produção de xarope de glucose

O amido liquefeito a -12 DE 8 é adequado para a sacarificação para produzir xaropes com valores de DE de 45 a 98 ou mais. As maiores quantidades produzidas são os xaropes com valores de ED de cerca de 97. Actualmente, estes são produzidos usando

a exoamilase, glucana 1,4 alfa-glicosidase (1,4 glucohidrolase -D-glucana,

comumente chamado de glucoamilase, mas também chamado amyloglucosidase e -

amilase), que libera -D-glicose a partir de 1,4 -, 1,6- - e 1,3 glucanas -Conectado. Em teoria, cuidadosamente amido liquefeito a -12 DE 8 pode ser completamente hidrolisada para produzir uma mistura de reacção final de glucoamilase com DE 100 mas, na prática, isto pode ser conseguido apenas em concentrações relativamente baixas de substrato. O custo de concentrar o produto por evaporação decretos que uma concentração de substrato de 30% é utilizado. Segue-se que o máximo atingível DE é 96-98 com composição de xarope 95-97% de glicose, 1 - 2% de

maltose e 0,5 - 2% (w / w) de isomaltose ( D-glucopiranosil- (1,6) -D -glucose). Este material é utilizado depois de concentração, directamente para a produção de xaropes de frutose-alto ou para a produção de glucose cristalina.

Considerando liquefacção é geralmente um processo contínuo, a sacarificação é mais frequentemente realizada como um processo em descontínuo. A glucoamilase usado na

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maioria das vezes é produzida porAspergillus niger cepas. Isto tem um óptimo de pH de

4,0 - 4,5 e opera de forma mais eficaz a 60 ° C, de modo que o amido liquefeito deve ser arrefecida e o seu pH foi ajustado antes da adição da glucoamilase.O arrefecimento deve b rápida, para evitar a retrogradação (a formação de agregados insolúveis intratáveis de amilose, o processo que dá origem à pele em creme). Qualquer

remanescente bacterianoamilase serão desativadas quando o pH é reduzido; no

entanto, este pode ser substituído mais tarde por um ácido estável a-amilase, que está normalmente presente nas preparações de glucoamilase.Quando as condições estão corretas glucoamilase é adicionado, geralmente na dosagem de 0,65 - 0,80 litros enzima preparation.tonne -1 amido (200 L kg -1 ). Sacarificação normalmente é realizado em grandes tanques agitados, o que pode levar várias horas para encher (e vazia), assim que o tempo será desperdiçado se a enzima é adicionado apenas quando os reatores estão cheios. As alternativas são para medir a enzima numa proporção fixa ou para adicionar toda a dose de enzima no início da fase de enchimento. Este último deve dar o uso mais econômico da enzima.

Figura 4.3 . A glicose% formados a partir de 30% (w / w) 12 DE maltodextrina, a 60 ° C e pH 4,3, utilizando várias soluções de enzima. 200 L kg -1 Aspergillus niger glucoamilase; --------- - 400 L kg -1 A.niger glucoamilase; 200 U kg -

1 A. niger glucoamilase mais 200 L kg -1 Bacillus acidopullulyticuspullulanase. A melhoria

em relação à adição de pululanase é ainda maior para concentrações de substrato mais elevadas.

165

O processo de sacarificação leva cerca de 72 horas para se completar mas podem, evidentemente, ser acelerada pelo uso de mais enzima. Sacarificação contínua é possível e praticável se pelo menos seis tanques são usados na série. É necessário para parar a reacção, por aquecimento a 85C durante 5 minutos, quando um máximo DE tenha sido atingida. Além disso incubação resultará numa queda na DE, a cerca de 90 DE eventualmente, provocado pela formação de isomaltose como acumulados glicose re-polimeriza com a abordagem de equilíbrio termodinâmico ( Figura 4.3 ).

O xarope sacarificado é filtrada para remover a proteína desnaturada e a gordura libertada a partir dos grânulos de amido e, em seguida, pode ser purificado por passagem através de carvão vegetal e resinas de permuta de iões activados. Deve-se lembrar que as secas concentração aumenta substância por cerca de 11% durante a sacarificação, porque uma molécula de água é retomado para cada ligação glicosídica hidrolisado (molécula de glicose produzido).

Embora a glucoamilase catalisa a hidrólise de 1,6- -linkages, a sua desagregação

é lento em comparação com a de 1,4- -linkages (por exemplo, as taxas de hidrólise

do 1,4 , 1,6- e 1, 3- -links em tetrassacáridos estão nas proporções de 300: 6: 1). É claro que o uso de uma enzima de desramificação que acelerar o processo global, mas de sacarificação, para uso industrial uma tal enzima deve ser compatível com glucoamilase. Dois tipos de enzimas desramificadas estão disponíveis: pululanase, que actua como um exo-hidrolase de dextrina de amido; e isoamilase (EC.3.2.1.68), que é um verdadeiro endohydrolase. Novo Industri A / S introduziram recentemente uma pululanase adequado, produzido por uma estirpe de Bacillus acidopullulyticus . A pululanase de Klebsiella aerogenes que se encontra disponível comercialmente de

algum tempo é instável a temperaturas superiores a 45C, mas a B.acidopullulyticus enzimas pode ser utilizado sob as mesmas condições como o Aspergillus glucoamilase (60C, pH 4,0-4,5). A vantagem prática de utilizar em conjunto

com glucoamilase pululanase é menos que a glucoamilase é necessário utilizar Isto não dar-se em qualquer vantagem de custo mas por causa menos glucoamilase é usado e menos oligossacáridos ramificados acumular no final da sacarificação, o ponto em que se torna isomaltose produção significativa ocorre em maior DE (Figura 4.3). Segue-se que elevados valores de DE e conteúdo de glucose pode ser alcançada quando a pululanase é a utilização (98 - 99 DE e 95-97% (w / w) de glucose, em vez de 97-98 DE) e as concentrações de substrato mais elevadas (30 - 40% seco sólidos em vez de 25 - 30%) podem ser tratados. O custo adicional da utilização pullulanase é recuperado pela poupança nos custos de evaporação e glucoamilase. Além disso, quando o produto é para ser usado para o fabrico de xaropes de frutose-alta, existe uma poupança nos custos de processamento adicional.

O desenvolvimento da B. acidopullulyticus pullulanase é um excelente exemplo do que

pode ser feito se puxar comercial suficiente existe para uma nova enzima. O

desenvolvimento de um adequado -D-glucosidase, de modo a reduzir a reversão, seria igualmente um passo útil para a produção industrial de glucose. Triagem de novas

166

estirpes de bactérias para uma nova enzima deste tipo é uma grande empresa.Não é de estranhar que mais detalhes sobre os procedimentos de triagem utilizados não estão prontamente disponíveis.

Produção de xarope contendo maltose

Tradicionalmente, xaropes contendo maltose como um componente principal ter sido

produzido por tratamento de amido de cevada com cevada -amilase. (1,4-

amilases maltohydrolases -D-glucano) são exohydrolases que libertam maltose a

partir do 1,4- -Conectado glucanas, mas nem desvio nem hydrolyse 1,6- -linkages. Xaropes de elevado teor de maltose (40 - 50 DE, 45-60% (w / w) de maltose, 2-7% (w / w) de glucose) tendem a não cristalizam, mesmo abaixo de 0 ° C e são relativamente não-higroscópico. Eles são usados para a produção de rebuçados duros e sobremesas congeladas. Xaropes de alta conversão (60-70 DE, 30-37% de maltose, 35 - 43% de glicose, 10% de maltotriose, 15% de outros oligossacarídeos, todos em peso) resistem cristalização acima 4C e são mais doces ( Tabela 4.3 ). Eles são usados para doces macios e nas indústrias de panificação, fabricação de cerveja e

refrigerantes. Pode esperar-se que -amilase seria utilizada para produzir xaropes rico

em maltose a partir de amido de milho, especialmente como a acção combinada de -amilase e pululanase dão rendimentos quase quantitativos de maltose. Isto não é feito a

uma escala significativa nos dias de hoje, pois actualmente disponíveis amilases são relativamente caros, não são suficientemente estáveis de temperatura (embora alguns

termoestável amilases de espécies de Clostridium têm sido relatados recentemente) e são facilmente inibidas por cobre e outros iões de metais pesados . Em vez disso

fúngica amilases, caracterizados pela sua capacidade de hidrolisar a maltotriose (G 3 ) em vez de maltose (G 2 ) são empregados, muitas vezes em combinação com glucoamilase. Enzimas presentemente disponíveis, no entanto, não são totalmente

compatíveis; fúngica amilases exigindo um pH não inferior a 5,0 e uma temperatura reaccional não superior a 55C.

Xaropes de alta maltose (ver figura 4.2 ) são produzidos a partir do amido liquefeito de cerca de 11 DE a uma concentração de 35% de sólidos secos que utilizam

fúngica amilase sozinho. Sacarificação ocorre ao longo de 48 h, altura em que o

fúngica amilase perdeu a sua actividade. Agora que um bom pululanase está

disponível, é possível utilizar em combinação com este fúngica amilases para produzir xaropes, mesmo com maior teor de maltose.

Xaropes de alta conversão são produzidas utilizando combinações de fungos amilase e glucoamilase.Estas podem ser adaptadas para as especificações dos clientes, ajustando as actividades das duas enzimas utilizadas mas inevitavelmente, como a glucoamilase é empregue, o conteúdo de glicose do produto final será mais elevada do que a de xaropes de alta maltose. A estabilidade da glucoamilase necessita da paragem da reacção, por meio de aquecimento, quando a composição desejada é atingida. É

167

agora possível produzir hidrolisados de amido com qualquer DE compreendido entre 1 e 100 e com praticamente qualquer composição bacteriana utilizando combinações

de amilases, fúngica amilases, glucoamilase e da pululanase.

Tabela 4.3 A doçura relativa de ingredientes alimentares

Ingrediente Doçura relativa (em

peso, de sólidos)

Sacarose 1.0

Glicose 0,7

Frutose 1.3

Galactose 0,7

Maltose 0,3

Lactose 0,2

Rafinose 0,2

Sacarose hidrolisada 1.1

Lactose hidrolisada 0,7

O xarope de glucose 11 DE <0,1

O xarope de glucose 42 DE 0,3

O xarope de glucose 97 DE 0,7

Xarope de maltose 44 DE 0,3

Xarope de alta conversão 65 DE

0,5

HFCS (42% de frutose) um 1.0

HFCS (55% de frutose) 1.1

Aspartame 180

uma HFCS, xarope de milho de alta frutose.

Enzimas na indústria de sacarose

A indústria de sacarose é um usuário comparativamente menor de enzimas, mas oferece alguns exemplos historicamente significativos e instrutivos de tecnologia enzimática A hidrólise ("inversão") de sacarose, total ou parcialmente, em glicose e frutose fornece xaropes doces que são mais estável (ou seja, menos provável cristalizar) do que os xaropes de sacarose pura. O mais familiar "Syrup Golden 'produzido por hidrólise ácida de um dos córregos menos puras da refinaria de açúcar de cana, mas outros tipos de xarope são produzidos a partir de leveduras ( Saccharomyces cerevisiae ) invertase. Embora esta enzima é invulgar na medida em

168

que sofre de inibição pelo substrato em níveis elevados de sacarose (> 20% (w / w)), isto não impede que a sua utilização comercial em concentrações ainda mais elevadas:

[4,2]

Tradicionalmente, invertase foi produzido no local por autolysing células de levedura. O autolisado foi adicionado ao xarope (70% de sacarose (w / w)) a ser invertido em conjunto com pequenas quantidades de xileno para evitar o crescimento microbiano. Inversão estava completa em 48-72 horas a 50C e pH 4,5.A enzima e o xileno foi removido durante a refinação e subsequente evaporação. Xaropes parcialmente invertida eram (e ainda são) produzido pela mistura de xaropes totalmente invertidos com os xaropes de sacarose. Agora, concentrados invertase produzidas comercialmente são empregadas.

A produção de hidrolisados de um composto de baixo peso molecular em solução essencialmente puro parece evidente a oportunidade para o uso de uma enzima imobilizada, contudo isto não for feito a uma escala significativa, provavelmente por causa da extrema simplicidade de utilização da enzima em solução e o conservadorismo básico da indústria açucareira.

Invertase encontra outro uso na produção de produtos de confeitaria com centros de líquidos ou moles.Estes centros são formulados a partir de sacarose cristalina e pequena (cerca de 100 L kg -1 , 0,3 ppm (w / w)) quantidades de invertase. A este nível de enzima, inversão de sacarose é muito lenta de modo que o centro permanece sólido tempo suficiente para enrobing com chocolate para ser completada. Em seguida, ao longo de um período de dias ou semanas, ocorre a hidrólise de sacarose e o aumento da solubilidade faz com que os centros de se tornar mole ou líquida, dependendo do teor de água da preparação centro.

Outras enzimas são usadas como auxiliares de produção e refinação de açúcar através da remoção de materiais que inibem a cristalização ou causam alta viscosidade. Em algumas partes do mundo, cana-de-açúcar contém quantidades significativas de amido, o que se torna viscoso, diminuindo, assim, os processos de filtração e tornar a solução turva quando a sacarose é dissolvido. Este problema pode ser superado usando as

mais termoestáveis amilases (por exemplo a cerca de 5 Termamyl L kg -1 ) que são totalmente compatíveis com as altas temperaturas e valores de pH que prevalecem durante a fase de evaporação a vácuo inicial da produção de açúcar.

169

Outros problemas que envolvem dextrano e rafinose necessário o desenvolvimento de novas enzimas industriais. Um dextrano é produzido pela acção de dextrano (CE 2.4.1.5) a partir de Leuconostoc mesenteroides em sacarose e encontrado como um

limo na cana danificada e tecido de beterraba, especialmente quando o tratamento foi retardado em climas quentes e húmidos. Rafinose, que consiste em sacarose

com galactose ligado através do seu átomo de C-1 para a posição 6, no resíduo de glicose, é produzida a baixas temperaturas em beterraba sacarina. Ambos dextrano e rafinose têm a molécula de sacarose como parte da sua estrutura e inibem o crescimento de cristais de sacarose. Isso produz cristais em forma de placa ou em forma de agulha, que não são facilmente colhidas por equipamentos concebidos para os cristais de aproximadamente cúbicos obtidos de outra forma. Dextrano pode produzir extrema viscosidade fluxos a processo e até mesmo trazer planta a parar. Extrema problemas dextrano arco frequentemente resolvido pela utilização de dextranases fúngicas produzidas a partir de Penicillium espécies. Estes são utilizados (por exemplo,

10 L kg -1 suco cru, 55C, pH 5,5, 1 h), apenas em tempos de crise, pois não são suficientemente resistentes à desnaturação térmica para uso a longo prazo e estão inativos em altas concentrações de sacarose. Uma vez que apenas pequenas quantidades são produzidas para uso, esta enzima é relativamente caro. Uma enzima suficientemente estável para uso profilático seria necessário, a fim de beneficiar de economias de escala. Rafinose podem ser hidrolisados em galactose e sacarose por um raffinase fúngica (ver Capítulo 5) .

Glicose a partir de celulose

Há muito mais celulose disponível, como uma potencial fonte de glicose, que o amido, a celulose ainda não é uma fonte significativa de glicose pura. As razões para isso são muitas, algumas técnicas, outras comercial. A razão fundamental é que o amido é produzido em formas relativamente puros por plantas para uso como um armazenamento de energia e carbono facilmente biodegradável. A celulose é estrutural e é propositadamente combinadas e associada com a lignina e pentosanos, de modo a resistir a biodegradação; árvores mortas levar vários anos para se decompor, mesmo em florestas tropicais. Um material típico celulolítica resíduos contém menos do que metade de celulose, a maior parte do restante composto por quantidades aproximadamente iguais de lignina e pentosanos. Uma combinação de enzimas é necessária para degradar a esta mistura. Estas enzimas são relativamente instável de baixa atividade contra lignocelulose nativa e sujeito a ambos substrato e inibição do produto. Por conseguinte, apesar de existirem muitas enzimas celulolíticas e é possível converter a celulose em glicose pura utilizando apenas as enzimas, o custo deste tipo de conversão é excessiva. As enzimas pode ser melhorada por selecção da estirpe selvagem ou por mutação, mas os problemas causados pela natureza física de celulose não são assim passíveis de solução. O amido granular é rapidamente agitada em pastas contendo 40% (w / v) de sólidos e é facilmente solubilizado, mas, mesmo quando as formas puras de celulose fibrosos, bolos imóveis em 10% de sólidos e permanece insolúvel em todos, mas o mais exótico (e) desnaturação enzima solventes . Celulose

170

impuro frequentemente contém quase uma massa igual de lignina, que é de pouco ou nenhum valor como um subproduto e é difícil uma cara de remover.

Preparações de celulase comerciais a partir de Trichoderma reesei consistem de misturas de enzimas sinérgicos:

a. celulase (EC 3.2.1.4), uma endo-1,4-D -glucanase;

b. glucano 1,4- -glucosidase (CE 3.2.1.74), exo-1,4- e -glucosidase; e

c. celulose 1,4 -cellobiosidase (CE 3.2.1.91), um exo-celobiohidrolase (ver Figura 4.4 ).

Eles são usados para a remoção de concentrações relativamente pequenas de complexos de celulose que tenham sido encontrados para interferir no processamento de material vegetal em, por exemplo, as indústrias de fabricação de cerveja e sumo de fruta.

A figura 4.4. Esboço da relação entre as actividades de enzimas na hidrólise da

celulose. || Representa efeitos inibitórios. Endo-1,4- glucanase é a actividade de controlo da velocidade e pode ser constituído por uma mistura de enzimas que actuam sobre a celulose de diferentes graus de cristalinidade. Ele atua sinergicamente com

tanto exo-1,4- -glucosidase e exo-celobiohidrolase. Exo-1,4- é uma enzima alfa-glicosidase produto inibido. Oxalato de exo-celobio-hidrolase é inibida e além disso o produto parece ser inactivado na ligação à superfície da celulose cristalina.

Análise econômica adequada revela que fontes baratas de celulose revelar-se geralmente mais caros como fontes de glicose do que o amido aparentemente mais caro. Relativamente celulose pura é valioso em seu próprio direito, como uma pasta de papel e matéria-prima de madeira prensada, que atualmente comanda um preço de mais de duas vezes maior que o amido de milho. Com a crescente escassez mundial de pasta de papel que não pode ser visto de forma realista como uma fonte alternativa de glicose no futuro previsível. O conhecimento de sistemas de enzimas capazes de lignocelulose degradante está a avançar rapidamente, mas é improvável que

171

lignocelulose vai substituir amido como fonte de xaropes de glucose para uso alimentar. É, no entanto, bem possível que ele pode ser usado, em um processo que envolve a utilização simultânea de ambas as enzimas e leveduras fermentativas, para a produção de etanol; a utilização da glucose pela levedura removendo o seu efeito inibidor sobre as enzimas. Deve notar-se que a celobiose é um açúcar não fermentável

e deve ser hidrolisado por adicional -glucosidase (EC 3.2.1.21, também chamado celobiase para a máxima eficiência do processo ( Figura 4.4 ).

O uso de lactase na indústria de lacticínios

A lactose está presente em concentrações de cerca de 4,7% (w / v) de leite e do soro do leite (sobrenadante) depois deixado a fase de coagulação de fabricação de queijos. A sua presença no leite torna inadequado para a maioria da população adulta do mundo, especialmente nas áreas que tradicionalmente não tiveram uma indústria de laticínios. Tolerância à lactose real limita-se principalmente aos povos cujas origens estão no Norte da Europa ou do subcontinente indiano e é devido a "persistência lactase '; o jovem de todos os mamíferos são claramente capazes de digerir leite, mas na maioria dos casos essa capacidade diminui após o desmame. Da Thai, populações americanas chinesas e preto, 97%, 90% e 73%, respectivamente, são relatados para ser intolerante à lactose, enquanto que 84% e 96% do Branco EU e populações suecas, respectivamente, são tolerantes. Além disso, e apenas muito raramente, algumas pessoas sofrem de intolerância à lactose ou deficiência em lactase metabólico inato, ambos os quais podem ser observados no momento do nascimento. A necessidade de leite com baixo teor de lactose é particularmente importante em programas de ajuda alimentar, como a desidratação dos tecidos grave, diarréia e até mesmo a morte pode resultar de alimentação lactose contendo leite para crianças e adultos com intolerância à lactose que sofrem de desnutrição protéico-calórica. Em todos estes casos, a hidrólise da lactose em glucose e galactose impediria os (graves) problemas digestivos.

Um outro problema apresentado pela lactose é a sua baixa solubilidade, resultando na formação de cristais em concentrações acima de 11% (w / v) (4C). Isso impede a utilização de xaropes de concentrados de soro de leite em muitos processos de alimentos, pois têm uma textura arenosa desagradável e são facilmente propenso a deterioração microbiológica. Somando-se a este problema, a eliminação de tais resíduos de soro de leite é caro (muitas vezes de forma punitiva), devido a sua alta demanda biológica de oxigênio. Estes problemas podem ser ultrapassados por hidrólise da lactose no soro do leite; o produto ser cerca de quatro vezes mais doce do que (ver Tabela 4.3 ), muito mais solúvel e capaz de formar concentrada, microbiologicamente seguro, xaropes (70% (w / v)).

A lactose pode ser hidrolisada pela lactase, uma -galactosidase.

172

[4.3]

Comercialmente, este pode ser preparado a partir das leveduras leiteiro Kluyveromyces fragilis ( K. marxianus var. marxianus), com um óptimo de pH (pH 6,5-7,0) apropriado para o tratamento de leite, ou dos fungos Aspergillus oryzae ou A. niger, com óptimos

de pH (pH 4,5-6,0 e 3,0-4,0, respectivamente) mais adequado para a hidrólise de soro de leite. Estas enzimas estão sujeitos a diferentes graus de inibição produto por galactose. Além disso, em concentrações de galactose e lactose elevada, lactase

mostra a capacidade de transferase significativa e produz oligossacáridos galactosilo -1,6-ligados.

Lactases agora são usados na produção de sorvetes e leites com sabor adocicado e condensadas.Quando adicionado ao leite líquido ou soro de leite (2000 L kg -1 ) e deixado durante cerca de um dia a 5 ° C a cerca de 50% da lactose é hidrolisada, dando um produto mais doce que não irá cristalizar se condensado ou congelado. Este método permite-soro de outra forma desperdiçado para substituir parte ou a totalidade do leite desnatado em pó utilizado em receitas de gelados tradicionais. Além disso, melhora a 'scoopability' e cremosidade do produto. Quantidades menores de lactase pode ser adicionada a longa vida o leite esterilizado para produzir um produto com lactose reduzida relativamente baratos (por exemplo, 20 L kg -1 , 20C, de 1 mês de armazenamento). Geralmente, no entanto, o uso de lactase tenha não atingiu o seu potencial, como enzimas presentes são relativamente caros e só pode ser utilizado a baixas temperaturas.

Enzimas nas indústrias de sucos de frutas, vinho, cerveja e das destilarias

Um dos principais problemas na preparação de sumos de frutos e vinho é nebulosidade devido principalmente à presença de pectinas. Estas consistem essencialmente

de polímeros de ácido -1,4-anhydrogalacturonic, com diferentes graus de esterificação de metilo. Eles são associados com outros polímeros de plantas e, depois de homogeneização, com os restos celulares. A nebulosidade que eles causam é difícil de remover, excepto por hidrólise enzimática. Esse tratamento também tem as vantagens adicionais de reduzir a viscosidade da solução, aumentando o volume de suco produzido (por exemplo, o rendimento de sumo de uvas brancas pode ser aumentado de 15%), alterações subtis mas geralmente benéficos no sabor e, no caso de vinificação, tempos de fermentação mais curtos. Material de planta insolúvel é

173

facilmente removido por filtração, decantação ou sedimentação e, uma vez que o efeito de estabilização das pectinas no neblina coloidal foi removido.

Preparações de enzimas pectolíticas comercial são produzidos a partir de Aspergillus niger e consistem de uma mistura sinérgica de enzimas:

a. poligalacturonase (EC 3.2.1.15), responsável pela hidrólise aleatória de

1,4 ligações -D-galactosiduronic; b. pectinesterase (EC 3.2.1.11), que liberta o metanol a partir dos ésteres metílicos

pectyl, uma etapa necessária antes da poligalacturonase pode actuar completamente (o aumento do teor de metanol de tal caldo tratado é geralmente menor do que as concentrações naturais e não coloca qualquer risco para a saúde) ;

c. pectina liase (EC 4.2.2.10), que cliva a pectina, por uma reacção de eliminação

libertar oligossacáridos com terminais não redutores 4-deoxymethyl- resíduos -D-galática-4-enuronosyl, sem a necessidade de pectina esterase acção metilo; e

d. hemicelulase (uma mistura de enzimas hidrolíticas, incluindo: endo-xilana 1,3- -

xilosidase, EC 3.2.1.32; xilano 1,4- -xilosidase, EC 3.2.1.37, e -L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55 ), estritamente não uma pectinase, mas a sua presença acidental é incentivada, a fim de reduzir os níveis de hemicelulose.

A actividade óptima destas enzimas é a um pH entre 4 e 5 e, geralmente, abaixo de 50C. Eles são adequados para adição direta para as polpas de frutas em níveis em torno de 20 U l -1 (atividade net).Enzimas com características melhoradas de maior estabilidade térmica e menor pH ótimo estão sendo procurados.

Na fabricação de cerveja, malte de cevada fornece a maior parte da enzima necessária para a sacarificação antes da fermentação. Frequentemente o outro amido contendo materiais (adjuvantes) são utilizados para aumentar o açúcar fermentável e reduzir os custos relativos da fermentação. Embora enzima malte também pode ser usado para hidrolisar estes adjuntos, para retorno econômico enzimas máximos extras são adicionados para alcançar o seu sacarificação rápida. Ele não é necessário nem desejável para sacarificação do amido totalmente, como dextrina não fermentáveis são necessários para dar a bebida "corpo" e estabilizar a sua "cabeça" de espuma. Por esta razão, o processo de sacarificação é parada, por ebulição o 'mosto', depois de cerca de 75% do amido foi convertido em açúcares fermentáveis.

As enzimas usadas na fabricação de cerveja são necessários para sacarificação do

amido (bactérias e fungos amilases) e destruição de cevada -1,4- e -1,3

glucana vinculado ( -glucanase) e hidrólise de proteínas (protease neutra ) para aumentar a posterior) na taxa de fermentação (, particularmente na produção de cerveja de alta densidade, onde é adicionada proteína extra. As celulases também são usados ocasionalmente, particularmente onde o trigo é usado como complemento, mas também

para ajudar a repartição a cevada -glucanos. Devido à estabilidade ao calor extremo

174

do B. amyloliquefaciensa-amilase, em que este é usado o mosto deve ser fervida

durante um período muito mais longo (por exemplo, 30 minutos) para inactivar lo antes da fermentação. A papaína é utilizado nas fases posteriores de pós-fermentação de prevenir a ocorrência de proteína-e-tanino 'chill haze-'-fabricação da cerveja formado de outra forma ao arrefecer a cerveja.

Recentemente, cervejas "light", de menor teor calórico, tornaram-se mais popular. Estes requerem um maior grau de sacarificação do amido em concentrações mais baixas para reduzir o conteúdo de álcool e de sólidos totais da cerveja. Isto pode ser conseguido

pela utilização de glucoamilase e / ou fúngica a-amilase durante a fermentação.

Uma grande variedade de fontes de carboidratos são usados em todo o mundo para a produção de bebidas alcoólicas destiladas. Muitos deles contêm quantidades suficientes de açúcar fermentável (por exemplo rum de melaço e aguardente de uva), outros contêm amido, principalmente, e deve ser sacarificado antes do uso (por exemplo whisky de malte de cevada, milho ou centeio). Na indústria de destilação, sacarificação continua durante todo o período de fermentação. Em alguns casos (por exemplo, whisky escocês fabrico de malte, malte de cevada utiliza exclusivamente) os enzimas estão presentes naturalmente, mas nos outros (por exemplo, produção de bebidas

espirituosas grão) quanto mais estáveis ao calor bacterianas -amilases podem ser utilizadas na sacarificação.

A glucose oxidase e catalase na indústria alimentar

A glicose oxidase é uma enzima altamente específico (por D-glucose, mas ver o Capítulo 8) , a partir do fungo Aspergillus niger e Penicillium , que catalisa a oxidação

de -glucose ao glucono-1,5-lactona (que provoca a hidrólise espontânea não enzimáticos ao ácido glucônico) em uso de oxigênio molecular e liberação de peróxido de hidrogênio (ver esquema de reação [1.1] ). Ele encontra utilizações na remoção de glicose ou de oxigénio de produtos alimentares, a fim de melhorar a sua capacidade de armazenamento. O peróxido de hidrogénio é um bactericida eficaz e pode ser removido, após a utilização, por tratamento com catalase (derivadas das mesmas fermentações fúngicas como a glicose oxidase), que converte-lo em água e oxigénio molecular:

catalase 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 [4,4]

Para a maioria das aplicações em larga escala as duas atividades enzimáticas não são separados. A glucose oxidase e catalase podem ser usados em conjunto, quando a produção de peróxido de hidrogénio líquido é para ser evitado.

175

Uma das principais aplicações do sistema glucose-oxidase / catalase é na remoção de glucose a partir de clara de ovo antes da secagem para uso na indústria da panificação. Uma mistura de enzimas é utilizada (165 L kg -1 ) em conjunto com peróxido de hidrogénio adicional (cerca de 0,1% (w / w)) para garantir que suficiente oxigénio molecular está disponível, por acção da catalase, para oxidar a glicose. Outros usos são na remoção do oxigênio do cabeça-espaço acima mineral e bebidas em lata e reduzir o escurecimento não-enzimática em vinhos e maioneses.

Aplicações médicas de enzimas

Desenvolvimento de aplicações médicas para as enzimas foram pelo menos tão grande como aqueles para aplicações industriais, refletindo a magnitude dos potenciais recompensas: por exemplo, enzimas pancreáticas têm sido utilizados desde o século XIX para o tratamento de distúrbios digestivos. A variedade de enzimas e as suas potenciais aplicações terapêuticas são consideráveis. A selecção das enzimas que realizaram tal potencial para se tornarem agentes terapêuticos importantes é mostrada na Tabela 4.4. No presente, as aplicações mais bem sucedidos são extracelular: usos puramente tópicas, as substâncias tóxicas c remoção e o tratamento de doenças com risco de vida no interior da circulação sanguínea.

Tabela 4.4 Algumas enzimas terapêuticas importantes

Enzima Número

CE Reação Uso

Asparaginase 3.5.1.1 L-Asparagina H 2 O L-aspartato +

NH 3 Leucemia

Colagenase 3.4.24.3 Collagen hidrólise Úlceras

cutâneas

Glutaminase 3.5.1.2 L-Glutamina H 2 O L-glutamato +

NH3 Leucemia

Hyaluronidaseum 3.2.1.35 Hidrólise Hyaluronate Ataque cardíaco

A lisozima 3.2.1.17 Hidrólise da parede celular bacteriana Antibiótico

Rodanase b 2.8.1.1 S 2 O 3 2- + CN - SO 3 2- + SCN - Envenenamento

por cianeto

Ribonuclease 3.1.26.4 Hidrólise RNA Antiviral

-lactamase 3.5.2.6 Penicilina peniciloato Alergia à

penicilina

Streptokinasec 3.4.22.10 Plasminogen plasmina Os coágulos de

sangue

Tripsina 3.4.21.4 Hidrólise de proteínas Inflamação

Uricase d 1.7.3.3 Urate + O 2 alantoína Gota

176

Urokinase e 3.4.21.31 Plasminogen plasmina Os coágulos de

sangue

um Hyaluronoglucosaminidase b sulfurtransferase tiossulfato c proteinase cisteína estreptocócica d urato oxidase e activador de plasminogénio

Como enzimas são catalisadores biológicos específicos, eles devem fazer os agentes terapêuticos mais desejáveis para o tratamento de doenças metabólicas. Infelizmente, uma série de fatores reduz severamente este potencial utilidade:

a. Eles são demasiado grandes para serem distribuídos simplesmente dentro das células do corpo.Esta é a principal razão pela qual as enzimas ainda não foram bem sucedidos aplicada ao grande número de doenças genéticas humanas. Um número de métodos estão a ser desenvolvidas de modo a ultrapassar este direccionamento por enzimas; como exemplos, com enzimas externas ligadas

covalentemente resíduos de galactose em hepatócitos são segmentados e enzimas covalentemente acoplado a anticorpos monoclonais como alvo específico estão a ser utilizados para evitar reacções secundárias não específicas.

b. Sendo geralmente proteínas estranhas ao organismo, eles são antigênica e pode provocar uma resposta imune que pode causar reações alérgicas graves e com risco de vida, uso particularmente apreciado continuou. Tem sido possível, para contornar este problema, em alguns casos, por dissimular a enzima como uma molécula aparentemente não proteico por modificação covalente.Asparaginase, modificados por ligação covalente de polietileno glicol, tem sido demonstrado que retêm o seu efeito anti-tumoral mesmo tempo que possuem nenhuma imunogenicidade. É evidente que a presença de toxinas, agentes pirogénicos e outros materiais nocivos dentro de uma preparação enzimática terapêutico é totalmente vedado. Na prática, isto encoraja a utilização de enzimas de origem animal, apesar do seu elevado custo, em relação aos de origem microbiana.

c. O seu tempo de vida eficaz dentro da circulação pode ser apenas uma questão de minutos. Isto provou ser mais fácil do que o problema imunológico para combater, por disfarce com modificação covalente. Outros métodos também têm demonstrado ser bem sucedida, particularmente aqueles que envolvem o aprisionamento da enzima dentro de lipossomas, microesferas sintéticos artificiais e os fantasmas de glóbulos vermelhos. No entanto, embora estes métodos são eficazes para estender o tempo de vida circulatório de enzimas, que muitas vezes causam aumento da resposta imunológica e, adicionalmente, podem causar a formação de coágulos sanguíneos.

Em contraste com o uso industrial de enzimas, as enzimas terapeuticamente úteis são necessários em quantidades relativamente pequenas, mas a um grau muito elevado de

177

pureza e de (geralmente) especificidade. As propriedades cinéticas favorecidas destas enzimas são baixas de K m e V alta máxima , a fim de ser maximamente eficaz, mesmo em concentrações muito baixas de enzima e substrato. Assim, as fontes de tais enzimas são escolhidos com cuidado para evitar qualquer possibilidade de contaminação indesejada por materiais incompatíveis e permitir purificação pronto. Preparações de enzimas terapêuticas são geralmente colocados à venda como preparações puras liofilizado com sais tamponantes só biocompatíveis e manitol diluente adicionados. Os custos de tais enzimas pode ser bastante elevada, mas ainda comparáveis com as de agentes terapêuticos ou de tratamentos concorrentes. Como um exemplo, a uroquinase (uma serina-protease, ver Tabela 4.4 ) é preparado a partir de urina humana (algumas preparações geneticamente modificadas estão a ser desenvolvidos) e utilizada para dissolver coágulos de sangue. O custo da enzima é de cerca de 100 mg -1 , com o custo de tratamento de um caso de embolia pulmonar sendo cerca de 10000 para a enzima sozinha. Apesar disso, o mercado para a enzima vale cerca de ano 70M -1 .

Uma importante aplicação potencial terapêutico de enzimas é, no tratamento do cancro. Asparaginase provou ser particularmente promissora para o tratamento de leucemia linfocítica aguda. A sua acção depende do facto de as células tumorais são deficientes em actividade de ligase de aspartato-amónia, o que restringe a sua capacidade para sintetizar o aminoácido L-asparagina normalmente não essencial.Portanto, eles são forçados a extraí-lo de fluidos corporais. A acção da asparaginase não afecta o funcionamento das células normais, que são capazes de sintetizar o suficiente para as suas próprias exigências, mas reduzir a concentração livre exógeno e assim induz um estado de inanição fatal em células tumorais susceptíveis. A incidência de 60% de remissão completa foi relatado em um estudo com quase 6.000 casos de leucemia linfocítica aguda. A enzima é administrado por via intravenosa. Ela só é eficaz na redução dos níveis de asparagina dentro da corrente sanguínea, que mostra uma meia-vida de cerca de um dia (num cão). Esta meia-vida pode ser aumentada 20 vezes através do uso de polietileno glicol-modificado asparaginase.

Resumo e Bibliogaphy do Capítulo 4

a. Muitos processos de enzimas importantes envolvem o uso de enzimas livremente dissolvidos em solução.

b. As proteases são particularmente importantes para a sua utilização no processamento de alimentos, a indústria do couro e detergentes.

c. Hidrólise de amido é o principal bioconversão enzimática industrial. Diferentes produtos e condições de processo resultar na produção de materiais diferentes com várias propriedades e utilizações.

d. Um número de enzimas tem propriedades terapêuticas úteis. Ways estão sendo encontrados para apresentá-los com sucesso para os pacientes.

178

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Reactores enzimáticos

179

Um reactor de enzima constituído por um recipiente ou série de recipientes, utilizado para executar uma conversão desejado por meios enzimáticos. Um certo número de tipos importantes de tais reactor são mostrados esquematicamente na Figura 5.1 . Há vários factores importantes que determinam a escolha do reactor para um processo particular. Em geral, a escolha depende do custo de uma produtividade predeterminado dentro das especificações do produto. Este deve ser inclusiva dos custos associados com o substrato (s), processamento a jusante, de trabalho, depreciação, despesas gerais e desenvolvimento de processos, para além dos custos mais óbvios em causa com a construção e funcionamento do reactor enzima. Outros factores que contribuem são a forma da enzima de escolha (isto é, livre ou imobilizada), a cinética da reacção e das propriedades químicas e físicas de um suporte de imobilização incluindo quer partículas, membranoso ou fibroso, e a sua densidade, compressibilidade, robustez , tamanho de partícula e regenerabilidade. A atenção também deve ser dada à escala de operação, a eventual necessidade de pH e controle de temperatura, o fornecimento e remoção de gases e a estabilidade da enzima, substrato e produto. Estes factores irão ser discutidos em mais detalhe no que diz respeito aos diferentes tipos de reactor.

Reactores descontínuos consistem geralmente de um tanque contendo um agitador (reactor de tanque agitado, STR). O tanque está normalmente equipado com deflectores fixos que melhoram a eficiência de agitação. Um reactor descontínuo é aquele em que todo o produto é removido, tão rapidamente quanto é praticamente possível, depois de um tempo fixo. Geralmente isto significa que as moléculas de enzima e substrato ter tempos de residência idênticos dentro do reactor, embora em algumas circunstâncias pode haver uma necessidade de novas adições de enzima e / ou o substrato (ou seja, operação -batch alimentados). Os custos de funcionamento dos reatores em batelada são mais elevados do que para processos contínuos, devido à necessidade de os reatores para ser esvaziado e enchido tanto regulares.Este procedimento não é só caro em si, mas significa que existem períodos consideráveis quando esses reatores não são produtivas; ele também faz exigências irregulares, tanto de trabalho e serviços. STR pode ser utilizado para processos que envolvem enzimas não-imobilizado, se as consequências destes contaminar o produto não são graves. Reactores descontínuos também sofrem de pronunciadas variações de lote para lote, como as condições de reacção variam com o tempo, e pode ser difícil de adaptar-se, devido aos requisitos de energia de mudança de fixação eficiente. Eles têm, no entanto, têm uma série de características vantajosas. Principalmente por estar sua simplicidade tanto no uso e no desenvolvimento de processos. Por essa razão eles são preferidos para a produção em pequena escala de produtos de preço elevado, especialmente quando o mesmo equipamento é para ser utilizado para um número de diferentes conversões. Eles oferecem um ambiente estreitamente controlável que é útil para reacções lentas, em que a composição pode ser monitorados com precisão, e condições (por exemplo, temperatura, pH, concentrações de co-enzima) variou ao longo da reacção. Eles são também de utilização quando a operação contínua de um processo revela-se difícil devido à natureza intratável viscoso ou da mistura de reacção.

180

Figura 5.1 . Diagramas de vários tipos de reatores de enzimas importantes.

a. Agitada tanque reactor descontínuo (STR), que contém todas as enzimas e substratos) até que a conversão é completa;

b. batch reactor de membrana (MR), em que a enzima é mantida dentro de tubos de membrana, que permitem que o substrato a ser difundida e o produto a difundir para fora. Este reactor pode ser muitas vezes utilizados de uma forma semi-contínua, utilizando a mesma solução de enzima durante vários lotes;

c. embalada reator de leito (PBR), também chamado de plugue -flow reactor (PFR), contendo uma cama resolvida de partículas enzima imobilizada;

d. fluxo de reactor de tanque agitado contínuo (CSTR), que é uma versão operado continuamente de (a);

e. um reactor contínuo de membrana de fluxo (CMR), que é uma versão operado continuamente de (b);

f. reactor de leito fluidizado (FBR), onde o fluxo de gás e / ou substrato mantém as partículas de enzima imobilizadas num estado fluidizado.

Todos os reactores que adicionalmente tem bobinas de aquecimento / arrefecimento (interior em reactores (a), e (d), e exterior, geralmente, em reactores (b), (c), (e) e (f)) e os reactores agitados pode conter deflectores, a fim de aumentar (reactores (a), (b), (d) e (e) ou diminuir (reactor (f)) a eficácia de agitação Os reactores contínuos (c) (-. (f)) pode ser tudo utilizado num modo de reciclagem, onde alguns, ou mais, da corrente de produto é misturado com o fluxo de entrada do substrato. Todos os reactores podem utilizar enzimas imobilizadas. Além disso, os reactores (a), (b) e (e) (mais reactores (d ) e (f), se membranas semipermeáveis são utilizados nos seus pontos de venda) pode ser usado com a enzima solúvel.

181

A produtividade esperada de um reactor descontínuo pode ser calculada por, pressupondo a validade do esquema de reacção reversível não Michaelis -Menten sem controlo de difusão, a inibição ou a desnaturação (ver esquema de reacção [1.7] e a equação (1.7) . A taxa de reacção (v) pode ser expressa em termos do volume de solução de substrato no interior do reactor (Vol S ) e o tempo (t):

(5.1)

Portanto:

(5.2)

Na integração usando a condição de contorno que [S] = [S] 0 no tempo (t) = 0:

(5.3)

Deixe a conversão fraccionada ser X, onde:

(5.4)

Portanto;

(5.4a)

e

(5.4b)

Também

(5.4c)

Portanto substituindo usando (5.4c) e (5.4b) em (5.3):

182

(5.5)

A mudança na conversão fraccionada, e as concentrações do substrato e do produto com o tempo num reactor fechado é mostrada na Figura 5.2 (a) .

Figura 5.2. Esta figura mostra dois comportamentos relacionados.

(A) A alteração das concentrações do substrato e do produto com o tempo, num reactor fechado. A reacção S P assume-se, com a condição inicial [S] 0 / K m = 10. As concentrações de substrato ( e produto ( ----------- ) são ambos normalizados com respeito aos [S] 0 . O tempo normalizado (isto é, t = Vmax / [S] 0 ) é em relação ao tempo (t = 1) que seria necessário para converter todo o substrato, se a enzima actuado em V max ao longo , o tempo real para a conversão completa de ser mais longo, devido à redução da concentração do substrato em que a reacção progride. A linha a tracejado indica também a variação da conversão fraccionai ( X ) com t.

(B) A alteração das concentrações do substrato e dos produtos com um comprimento de reactor para PBR. A reacção S P é assumido com a condição inicial, [S] 0 / K m = 10. As concentrações de substrato ( ) e produto ( ----------- ) são ambos normalizados com respeito a [S] ". O comprimento do reactor normalizada (isto é, I = lV max / F, onde V max é a máxima velocidade de unidade de comprimento do reactor e I é o comprimento do reactor) é em relação ao comprimento (isto é, quando a I = 1 ) que contém enzima suficiente para converter todo o substrato para o caudal determinado se a enzima

183

actuado na sua velocidade máxima durante todo, o comprimento real do reactor necessária para a conversão completa de ser mais longo, devido à redução na concentração de substrato medida que a reacção progride P pode. ser considerada como a posição relativa dentro de um ou PBR comprimento absoluto do reactor.

Reactores de membrana

O principal requisito para um reactor de membrana (MR) é uma membrana semipermeável que permite a passagem livre das moléculas de produto, mas contém as moléculas de enzima. Um exemplo de um tal barato membrana é a membrana de diálise utilizada para a remoção de espécies de baixo peso molecular a partir de preparações de proteína. A escolha usual para um reactor de membrana é um reactor de fibra oca consistindo de um módulo de pré-formado contendo centenas de fibras tubulares finas,

tendo cada um diâmetro de cerca de 200 m e uma espessura de membrana de cerca

de 50 m. Reactores de membrana pode ser utilizado no modo contínuo ou em lote e permite a fácil separação da enzima a partir do produto. Eles são normalmente utilizados com as enzimas solúveis, evitando os custos e problemas associados com outros métodos de imobilização e algumas das limitações de difusão de enzimas imobilizadas. Se o substrato é capaz de se difundir através da membrana, pode ser introduzido em ambos os lados da membrana em relação à enzima, caso contrário, deve estar dentro do mesmo compartimento, tal como a enzima, uma configuração que impõe uma restrição severa no caudal através do reactor, se for utilizado em modo contínuo. Devido à facilidade com a qual podem ser estabelecidos sistemas de reactor de membrana, que são muitas vezes utilizados para a produção em pequena escala (g kg a), especialmente quando é necessária uma via multi-enzima ou coenzima regeneração. Eles permitem a substituição fácil da enzima em processos envolvendo enzimas particularmente lábil e também pode ser utilizado para reacções bifásicos (ver Capítulo 7 ). A principal desvantagem destes reactores diz respeito ao custo das membranas e à sua necessidade de ser substituído em intervalos regulares.

A cinética de reactores de membrana são semelhantes às do lote STR, no modo de lote, ou o CSTR, em modo contínuo (ver mais tarde ). Os desvios destes modelos ocorrem principalmente em configurações onde o fluxo de substrato está no lado da membrana oposto ao da enzima e a reacção é severamente limitada pela sua difusão através da membrana e a difusão dos produtos no sentido inverso. Nestas circunstâncias, a reação pode ser ainda mais gravemente afectado pela inibição do produto ou as limitações de reversibilidade do que é indicado por estes modelos.

Reatores de fluxo contínuo

As vantagens de enzimas imobilizadas como catalisadores de processamento são marcadamente mais apreciada em reactores de fluxo contínuo. Nestes, o tempo de permanência médio dos moléculas de substrato dentro do reactor é muito mais curto do

184

que o do catalisador de enzima imobilizada. Isso resulta em uma muito maior produtividade de uma quantidade fixa de enzima que é conseguida em processos descontínuos. Também permite que o reactor para lidar com substratos de baixa solubilidade, permitindo a utilização de grandes volumes contendo baixas concentrações de substrato. As condições de reacção constante pode ser esperada para resultar num produto mais puro e mais reprodutível. Há dois extremos da cinética do processo em relação aos reatores de fluxo contínuo;

a. o reactor ideal de fluxo contínuo em tanque agitado ( CSTR ), na qual o fluxo de reacção é completa e rapidamente misturado com a totalidade do conteúdo do reactor e os contactos de enzima e substrato baixo concentrações elevadas de produtos ;. e

b. o ideal operado continuamente embalado reator de leito ( PBR ), onde há mistura ocorre eo contatos enzima alta substrato e baixas concentrações de produtos.

As propriedades do operado continuamente reactor de leito fluidizado ( FBR lie), em geral, em algum ponto entre estes dois extremos. Uma série ordenada de CSTR ou FBRs podem aproximar, em utilização, onde a saída de um reactor de forma a entrada para o reactor seguinte, a uma PBR equivalente.

O transporte de momentum, calor e massa nesses reatores contínuos são fatores importantes que contribuem para a produtividade resultante. Eles são, devido ao fluxo de fluido e movimentos moleculares e turbulentas, e muitas vezes descrita por meio de um certo número de relações empíricas, envolvendo números sem dimensão. O mais importante destes é o número de Reynolds ( Re ), o qual se relaciona a força de inércia, devido ao fluxo de solução para a força de resistência que o fluxo viscoso. Baixa Reindica o fluxo aerodinâmico superior enquanto Re indica progressivamente mais turbulência, não sendo um valor crítico para Re , dependente da configuração do sistema, no qual existe uma transição de fluxo simplificado de fluxo

turbulento. Re é definido em termos de L f m / ou L f / , em que L é o comprimento característico do sistema, f m é a taxa de fluxo de massa (gm -2 s -1 ), f é a velocidade do

fluido (ms -1 ), é a dinâmica viscosidade (gm -1 s -1 ) e é a viscosidade cinemática (m 2 s -1 ). Exemplos dos comprimentos característicos nestas definições de Re são o diâmetro das partículas para o fluxo passado partículas esféricas, e o diâmetro do tubo de escoamento no interior de tubos ocos. O valor de a (comprimento característico do sistema) x (velocidade) de fluido para um sistema de tanque de agitação pode ser tomado como a (velocidade do agitador) x (diâmetro do agitador) 2 . Re é, portanto, mais elevada a taxas de fluxo elevadas e baixas viscosidades . Outro número adimensional que é de utilização na descrição e comparando reactores contínuos de enzimas é o número Le Goff ( Lf ), que expressa a eficiência com que a energia dissipada na produção do fluxo de fluido é usado para transportar o material (e calor) até à superfície catalítica . Valores baixos para Lf indicar um custo energético e financeiro relativamente alto, em conseguir contato entre a superfície cataliticamente ativa a enzima imobilizada e o fluxo de substrato, e a conseqüente redução de quaisquer limitações de difusão externos. O Lf é maior para baixa pressão cai através do reator, altas taxas de fluxo e

185

altas conversões. A relação entre o Lf e oRe é mostrada esquematicamente por um PBR e um CSTR, em Figura 5.3 , onde pode ser visto que o PBR é mais eficiente no relativamente baixo Re mas muito menos na maior Re , reflectindo a necessidade de agitar o CSTR, mesmo em baixas taxas de fluxo e do aumento da contrapressão em PBRs em altas vazões.

Figura 5.3. Um diagrama que compara a variação de Re com Lf para uma PBR ( ) e um CSTR ( -----------). Um FBR se comporta de forma semelhante ao CSTR.

Reactores de leito fixo

A característica mais importante de um PBR é que o material flui através do reactor sob a forma de um tampão; eles também são chamados de reatores de fluxo de bujão (PFR). Idealmente, toda a corrente flui substrato com a mesma velocidade, paralela ao eixo do reactor sem volta -mixing. Todo o material presente em dado cruz -seção reactor teve um tempo de residência idênticas. A posição longitudinal, no interior do PBR é, por conseguinte, proporcional ao tempo de permanência no interior do reactor; todo produto emergente com o mesmo tempo de residência e todos molécula de substrato tendo uma oportunidade igual para reação. A eficiência de conversão de um PBR, no que diz respeito ao seu comprimento, comporta-se de um modo semelhante ao de um reactor descontínuo, bem -stirred no que diz respeito ao seu tempo de reacção (Figura 5.2 (b)) Cada elemento de volume se comporta como um reactor descontínuo, tal como passa através do PBR. Qualquer grau requerido de reacção pode ser conseguido pela utilização de um PBR ideia de comprimento adequado.

186

A taxa de fluxo ( F ) é equivalente a Vol S / t para um reactor descontínuo. Portanto, a

equação ( 5.5 ) pode ser convertido para representar um PBR ideal, dado o pressuposto, muitas vezes não é realizado na prática, que não há limitações de difusão:

(5.6)

A fim de produzir bujão -flow ideal dentro PBRs, um regime de fluxo turbulento é o preferido para o fluxo laminar, como o que provoca uma melhor mistura e transferência de calor normal ao fluxo axial reduzida e retro-mistura. Realização de alta o suficiente Re pode, no entanto, ser difícil devido a taxas de alimentação inaceitavelmente elevados. Na sequência da ficha -flow característica do PBR que é a concentração de substrato é maximizada, e a concentração do produto minimizado, em relação à conversão final em cada ponto dentro do reactor; o fator de eficácia sendo alto na entrada do reator e baixa perto da saída. Isto significa que PBRs são os reatores preferenciais, todos os outros factores iguais, para os processos que envolvem a inibição de produtos, ativação substrato e reversibilidade reação. Em baixo Re o caudal é proporcional à queda de pressão através do PBR. Esta queda de pressão é, por sua vez, geralmente encontrada proporcional à altura do leito, a taxa de fluxo linear e

viscosidade dinâmica da corrente de substrato e (1 - ) 2 / 3 (em que é a porosidade do reactor, ou seja a fracção do volume do PBR retomado pela fase líquida), mas inversamente proporcional à área da secção transversal dos peletes de enzimas imobilizadas. Em PBRs gerais são usados com catalisadores à enzima imobilizada bastante rígidos (1 -3 mm de diâmetro), porque aumentos excessivos este caudal pode distorcer partículas compressíveis ou fisicamente fracos. Resultados de deformação de partículas na reduzida área de superfície catalítica de partículas em contacto com a solução contendo o substrato, as características de transferência de massa externa pobres e uma restrição do fluxo, provocando um aumento da queda de pressão. Um círculo vicioso de aumento da contra-pressão, deformação das partículas e fluxo restrito podem, eventualmente, resultar em ausência de fluxo em tudo através da PBR.

PBRs comportar-se como filtros de profundidade do leito no que diz respeito ao fluxo de substrato. É necessária a utilização de um leito de protecção, se ligar o reactor de por pequenas partículas é mais rápida do que a desactivação dos biocatalisadores. Eles também são facilmente derrubado por material coloidal ou precipitação. O design de PBRs não permitem um controlo do pH, através da adição de ácidos ou bases, ou para controle de temperatura fácil onde não há produção de calor excessivo, um problema que pode ser particularmente perceptível em reactores de largura (> 15 cm de diâmetro). Os desvios plug-flow ideal são devido ao back-mistura dentro dos reatores, as correntes de produto resultante, com uma distribuição de tempos de residência. Num caso extremo, retro-mistura pode resultar no comportamento cinético do reactor aproximando-se do CSTR (ver abaixo), e a consequente dificuldade em atingir um elevado grau de conversão. Estes desvios são causados por canalização, onde alguns substrato passa através do reactor mais rapidamente, e mantenha-up, que envolve

187

áreas estagnadas com vazão insignificante. Os canais podem formar-se no leito do reactor, devido à queda de pressão excessiva, embalagem irregular ou aplicação desigual do fluxo de substrato, fazendo com que as diferenças de taxas de fluxo através do leito. O uso de um catalisador de tamanho uniforme num reactor com um fluxo para cima do substrato de fluxo reduz a possibilidade e gravidade de comportamento não-ideal.

Fluxo de reactores de tanque agitado contínuo

Este reactor consiste de um tanque bem -stirred contendo a enzima, o que está normalmente imobilizado.A corrente de substrato é continuamente bombeada para dentro do reactor ao mesmo tempo que o fluxo de produto é removido. Se o reactor se comporta de uma forma ideal, não é retro-mistura total e a corrente do produto é idêntica com a fase líquida no interior do reactor e invariante no que respeita ao tempo.Algumas moléculas de substrato podem ser rapidamente removido a partir do reactor, ao passo que outras podem permanecer por períodos substanciais. A distribuição de tempos de residência para as moléculas na corrente de substrato é mostrada na Figura 5.4 .

O CSTR é um facilmente construídos, versátil e barato reator, que permite catalisador simples carregamento e substituição. A sua natureza bem -mixed permite o controlo directo sobre a temperatura e o pH da reacção e o fornecimento ou a remoção de gases. CSTR tendem a ser bastante grande, como a: necessidade de ser eficientemente misturadas. Os seus volumes são geralmente cerca de cinco a dez vezes o volume da enzima imobilizada contido. Isto, no entanto, tem a vantagem de que existe muito pouca resistência ao fluxo da corrente de substrato, o qual pode conter substratos insolúveis ou coloidais, desde que as partículas insolúveis que não são capazes de varrer a enzima imobilizada do reactor. A natureza mecânica da agitação limita os suportes para as enzimas imobilizadas a materiais que não são facilmente se desintegram para dar «multas» que podem entrar na corrente do produto. No entanto,

relativamente pequeno das partículas (para baixo a cerca de 10 m de diâmetro) podem ser utilizados, se forem suficientemente densa para ficar no interior do reactor. Isto minimiza os problemas devidos a resistência à difusão.

Um CSTR ideal tem completar volta -mixing resultando numa minimização da concentração de substrato, e a maximização da concentração do produto, em relação à conversão final, em todos os pontos no interior do reactor o factor de eficácia de ser uniforme. Assim, CSTRs são os reatores preferidos, tudo o resto é igual, por processos que envolvem a inibição substrato ou a ativação do produto. Eles também são úteis quando o fluxo de substrato contém um inibidor de enzima, uma vez que é diluído no interior do reactor. Este efeito é mais visível se a concentração de inibidor que é maior do que a constante de inibição e [S] 0 / K m é baixa para inibição competitiva ou alta para

188

inibição não competitiva, quando o inibidor de diluição tem mais efeito do que o substrato de diluição. Os desvios do comportamento ideal CSTR ocorrer quando existe um regime de mistura menos eficaz e pode geralmente ser ultrapassado pelo aumento da velocidade do agitador, diminuição da concentração a viscosidade da solução ou biocatalisador ou por desconcertante reactor mais eficaz.

A velocidade de reacção dentro de um CSTR pode ser derivada a partir de um balanço de massa simples de ser a taxa de fluxo (F) vezes a diferença na concentração do substrato entre a entrada e a saída do reactor. Assim:

(5.7)

Portanto:

(5,8)

a partir da equação ( 5.4 ):

(5,9)

Portanto:

(5.10)

Esta equação deve ser comparada com a do PBR (equação ( 5.6 )). Juntas estas equações podem ser utilizadas para comparar as produtividades dos dois reactores (Figuras 5.5 e 5.6).

189

Figura 5.4. A distribuição de um CSTR, o tempo de residência. O número relativo de moléculas residentes no interior do reactor para um determinado tempo de N, é representada graficamente contra o tempo de residência normalizado (isto é, tF / V, em que V é o volume do reactor, e F é o caudal, que é o tempo em relação à que é requerida para um volume de reactor, para passar através do reactor). A distribuição do tempo de residência de moléculas de comunicação não -reacting ( ----------- que

obedece à relação , onde [M] é a concentração de moléculas de comunicação social, dando uma meia-vida para que restou no reactor

de , produto ( ) e de substrato ( ) são mostrados. A reacção S P é assumida, e substrato moléculas que têm tempos de residência longos são convertidos em produto, o tempo médio de permanência do produto sendo maior do que aquela para o substrato. A composição da corrente de produto é idêntico ao da fase líquida no interior do reactor. Esta composição pode ser calculada a partir das áreas relativas sob as curvas e, neste caso, representa uma conversão de 90%. Sob condições de funcionamento contínuo (tempo de operação> 4V / F), o tempo médio de permanência no interior do reactor é V / F. No entanto, pode-se notar a partir do gráfico que apenas algumas moléculas têm um tempo de residência próximo a este valor (apenas 7% entre 0.9V / F e 1,1 V / F), enquanto que 20% das moléculas possuem tempos de residência de menos de 0,1 V / M ou superior a 2.3V / F. Deve notar-se que 100% das moléculas em um PBR ideal equivalente pode ser esperado ter tempos de residência igual ao seu tempo de residência médio.

190

Figura 5.5. A comparação das alterações na conversão fraccionada com taxa de fluxo entre o PBR ( ) e CSTR ( ----------- ) a diferentes valores de [S] 0 / K m (10, 1 e 0,1, mais elevadas [S] 0 / K m dando as curvas superiores). A taxa de fluxo é normalizada em relação ao teor de enzima volumétrica do reactor (= FK m / V máx . Pode ver-se que há pouca diferença entre os dois reactores a caudais mais rápidos e conversões mais baixas, especialmente em altos valores de [S] 0 / K m .

Figura 5.6. A comparação das alterações na conversão fraccionada com um tempo de residência entre a PBR ( ) e CSTR ( ----------- ) a diferentes valores de [S] 0 / K m (10, 1 e 0,1; mais elevado [S] 0 / K m os valores que dão curvas inferiores). O tempo de

191

residência é o recíproco da taxa de fluxo normalizado (verfigura 5.5 ). Se a taxa de fluxo é então inalterado o "tempo de residência normalizado", pode ser pensado como o volume do reactor necessária para produzir o necessário grau de conversão.

As equações que descrevem o comportamento do CSTR e PBRs utilizando reacções reversíveis ou submetidos a inibição do produto ou substrato podem ser derivados de um modo semelhante, utilizando as equações ( 1.68 ), ( 1.85 ) e ( 1,96 ) em vez de ( 1.8 ):

Substrato -inhibited PBR:

(5.11)

Substrato -inhibited CSTR:

(5,12)

Produto -inhibited PBR:

(5.13)

Produto -inhibited CSTR:

(5,14)

Reacção reversível de uma PBR:

(5,15)

Reacção reversível num CSTR:

(5,16)

X nas equações (5,15) e (5,16) é a conversão fraccionada para uma reacção reversível.

192

(5,17)

O significado de outros símbolos utilizados nas equações (5,11) - (5,17) são dadas Capítulo 1 Estas equações podem ser utilizadas para comparar o tamanho de PBR e CSTR necessário para atingir a mesma conversão sob várias condições (. A Figura 5.7 ). Outro parâmetro útil para a comparação destes reactores é a produtividade. Isto pode ser derivada para cada reactor assumindo uma inactivação de primeira ordem da enzima (equação ( 1.26 )). Combinada com a equação ( 5.6 ) para PBR, ou ( 5.10 ) para o CSTR, as seguintes relações são obtidas na integração:

PBR: (5.18)

CSTR: (5.19)

k onde d é a constante de inactivação -order primeiro (isto é, k d1 , na equação ( 1.25 )) e os índices referem-se a conversão fraccionais tempo = 0 ou t. A mudança na produtividade ( Figura 5.8 ) e conversão fraccionada ( Figura 5.9 ) destes reactores com o tempo podem ser comparadas usando estas equações.

Estes reactores podem ser operados por períodos consideravelmente mais longos do que o determinado pela sua inactivação de enzima imobilizada contida, particularmente se eles são capazes de conversão elevada em baixas concentrações de substrato ( Figura 5.9 ). Isto é independente de qualquer estabilização de enzima e é simplesmente devido a tais reactores inicialmente, que contenham grandes quantidades de enzima redundante.

193

Figura 5.7. A comparação da proporção, do teor de enzima em um CSTR, para que, em um PBR, necessário para conseguir vários graus de conversão para uma gama de condições de processo. O tamanho real do CSTR será de cinco a dez vezes maior do que o indicado, devido à necessidade de manter a agitação dentro do vaso. reação desinibida; produto inibiu; --- ------ substrato inibida. (Curva a) [S]0 / K m = 100; (Curva b) [S] 0 / K m = 1; (Curva c) [S] 0 / K m <0,01; (Curva d), [S] 0 / K m = 1, o produto inibiu K P / K m = 0,1; (Curva e) [S] 0 / K m = 1, o produto inibiu K P / K m = 0,01; (Curva f) [S] 0 / K m = 1, inibiu substrato [S] 0 / K S = 10; (Curva g) [S] 0 / K m = 100; inibida substrato [S] 0 / K S = 10. O tamanho de um CSTR, torna-se proibitivamente grande de conversões elevadas (por exemplo, usando curva b, um CSTR, contém três vezes a enzima em um PBR para alcançar uma conversão de 90%, mas isso aumenta a 18 vezes para a conversão de 99%. A diferença entre os dois tipos de reactor é aumentada se o factor

de eficácia ( ) é inferior a um, devido a efeitos difusionais.

194

Figura 5.8. A mudança na produtividade de um PBR ( --------- ) e CSTR ( ) com o tempo, assumindo uma conversão inicial fracionário (X 0 ) = 0,99 e [S] 0 / K m = 100. As unidades de tempo são -lives meio da enzima livre ( ) e a produtividade é dada em termos de Fxt ( 1/2 ). Embora a produtividade total é 1,6 vezes maior do que para um CSTR, uma PBR, deve notar-se que o CSTR contém 1,9 vezes mais enzima.

Em geral, há pouca ou nenhuma -pressão de volta para o aumento da taxa de fluxo através do CSTR. Tais reactores pode ser iniciado como reactores descontínuos até que o necessário grau de conversão é atingido, quando o processo pode ser feito contínua. CSTR não são geralmente utilizados em processos envolvendo altas conversões mas um trem de CSTR pode aproximar-se o desempenho PBR. Esta composição pode ser um número (mais de três) de reactores ligados em série ou num único vaso dividido em compartimentos, a fim de minimizar a retro-mistura CSTR pode ser usado com solúvel em vez de enzima imobilizada se uma membrana de ultrafiltração é utilizada para separar o reactor de fluxo de saída a partir do conteúdo do reactor. Isto faz com que um certo número de dificuldades do processo, incluindo polarização de concentração ou a inactivação da enzima na membrana, mas pode ser preferível, a fim de obter um processo de reacção e separação combinado ou de uma enzima imobilizada adequada não está prontamente disponível.

195

Figura 5.9. A alteração na conversão fraccionada de PBRs CSTR e com o tempo, assumindo conversão fraccionada inicial (X 0 ) de 0,99 ou 0,80 . CSTR, [S] o / K m = 0,01; - - - - - - CSTR, [S] 0 / K m = 100;PBR [S] 0 / K m = 0,01; ---- --- PBR [S] 0 / K m = 100. O tempo é dada em termos de uma semivida plasmática da enzima livre ( ). Embora o CSTR mantém a sua conversão fraccionada por um período maior do que o PBR, sobretudo em grandes X 0 . Deve notar-se que um CSTR, capaz de X 0 = 0,99, a uma concentração de alimentação de substrato [S] 0 / K m = 0,01 contém 22 vezes mais enzima do que um equivalente PBR, mas gera apenas 2,2 vezes mais produto. A estabilidade inicial na conversão fraccionada ao longo de um período de tempo considerável, devido à redundância enzima, não deve ser confundida com qualquer

efeito devido à estabilização da enzima imobilizada.

Os reactores de leito fluidizado

Estes reatores geralmente se comportam de uma forma intermediária entre CSTRs e PBRs. Eles consistem de uma cama de enzima imobilizada, que é fluidizado pelo fluxo ascendente do fluxo rápidos substrato sozinho ou em combinação com uma corrente de gás ou líquido secundário, cada um dos quais pode ser inerte ou conter materiais relevantes para a reacção. Um fluxo de gás é geralmente preferido, pois não dilui a corrente de produto. Há uma velocidade mínima de fluidização necessária para alcançar a expansão do leito, o que depende do tamanho, forma, porosidade e densidade das partículas e a densidade e viscosidade do líquido. Esta velocidade mínima de fluidização é geralmente bastante baixos (cerca de 0,2 cm -I.0 s -1 ) como a maioria das partículas de enzima imobilizada ter densidades perto para que grandes quantidades de líquido. Neste caso, a expansão do leito relativa é proporcional à velocidade superficial do gás e inversamente proporcional à raiz quadrada do diâmetro do reactor. Fluidização do leito exige uma entrada de grande potência, mas, uma vez fluidizado, há pouca energia de entrada mais necessária para aumentar a taxa de fluxo da corrente através

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do substrato no reactor ( figura 5.3 ). Em altas taxas de fluxo e baixos diâmetros reator pode ser conseguido características de plug quase ideal -flow. No entanto, o desempenho cinética da FBR normalmente se situa entre a do PBR e do CSTR, tal como as pequenas velocidades lineares de fluido permitidos pela maioria das partículas biocatalíticas provoca um grau de retro-mistura, que é frequentemente substancial, embora nunca total. O desenho real da FBR irá determinar se ele se comporta de uma forma que é mais próxima da de um CSTR ou PBR (verFiguras 5.5 -5.9 ). Ele pode, por exemplo, ser feita a comportar-se de uma maneira muito semelhante à de um PBR, se for confundido de tal maneira que retromistura substancial seja evitada. FBRs são escolhidos quando são necessárias estas características intermédias, por exemplo, onde é necessária uma alta conversão, mas o fluxo de substrato é coloidal ou a reacção produz uma mudança de pH ou calor de saída substancial. Eles são particularmente úteis se a reacção envolve a utilização ou a libertação de material gasoso.

A FBR é normalmente usado com bastante pequenas partículas de enzima imobilizadas

(20-40 m de diâmetro) a fim de alcançar uma alta área de superfície catalítica. Estas partículas devem ser suficientemente denso, em relação ao fluxo de substrato, que não são arrastadas para fora do reactor.Partículas menos densas deve ser um pouco maior. Para uma operação eficiente das partículas deve ser de cerca de tamanho uniforme de outra forma um gradiente de concentração biocatalítico não uniforme será formada-se o reactor. FBRs são geralmente afunilada para o exterior, na saída para permitir uma vasta gama de caudais. Vazões muito elevadas são evitados, pois causar canalização e catalisador perda.A maior desvantagem do desenvolvimento do processo FBR é a dificuldade de aumento de escala destes reactores. PBRs permitir factores superiores a 50000 de aumento de escala, mas, por causa das características de fluidização marcadamente diferentes de reactores de tamanho diferentes, FBRs apenas podem ser incrementados por um factor de 10 -100 de cada vez. Além disso, as alterações na taxa de fluxo da corrente do substrato provoca complexas alterações do padrão de fluxo dentro destes reactores que possam ter os consequentes efeitos inesperados sobre a taxa de conversão.

Processos de enzima imobilizada

Imobilizar -enzyme sistemas são usados onde eles oferecem vantagens de custo para os usuários com base em custos totais de produção. O tamanho da planta necessária para processos contínuos é de duas ordens de grandeza menor do que a necessária para processos em batelada utilizando enzimas livres. Os custos de capital são, portanto, consideravelmente menor e a planta pode ser pré-fabricados de forma barata fora do local imobilizada enzimas oferecem grande aumento de produtividade em uma base peso enzima e também costumam oferecer vantagens do processo (ver Capítulo 3 ) usado atualmente processos de enzima imobilizada são dadas em Tabela 5.1 .

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Tabela 5.1 Alguns dos usos industriais mais importantes de enzimas imobilizadas

Enzima Número CE Produto

Aminocilase 3.5.1.14 Os ácidos L-amino

Aspartato de amônia-liase 4.3.1.1 L-ácido aspártico

Aspartato 4-descarboxilase 4.1.1.12 L-alanina

Cyanidase 3.5.5.x O ácido fórmico (a partir de cianeto de resíduos)

Glucoamilase 3.2.1.3 D-Glicose

Isomerase de glucose 5.3.1.5 Xarope de milho de alta -fructose

Histidina amônia-liase 4.3.1.3 Ácido uroc�ico

Hidantoinase um 3.5.2.2 D- e L-amino ácidos

Invertase 3.2.1.26 Açúcar invertido

Lactase 3.2.1.23 Leite livre de lactose e de soro de

leite

Lipase 3.1.1.3 Substitutos da manteiga de cacau

Nitrílica hidratase 4.2.Ix A acrilamida

Amidases Penicilina 3.5.1.11 Penicilinas

Raffinase 3.2.1.22 Soluções isentas de rafinose

Termolisina 3.2.24.4 Aspartame

um Dihydropyrimidinase.

Xaropes de milho de alta frutose (HFCS)

Com o desenvolvimento da glicoamilase nas décadas de 1940 e 1950, tornou-se uma questão simples para produzir altos xaropes de glicose DE. No entanto, estes têm deficiências como objectos de comércio: D-glicose tem apenas cerca de 70% da doçura da sacarose, numa base de peso, e é relativamente insolúvel. Os lotes de xarope de glicose 97 DE, na concentração final comercial (71% (w / w)) deve ser mantido quente para prevenir a cristalização ou diluída para concentrações que são microbiologicamente insegura. A frutose é 30% mais doce do que a sacarose, numa base de peso, e duas vezes mais solúvel em glucose, a baixas temperaturas assim uma conversão de 50% de glicose para frutose supera os problemas que deram um xarope estável que é tão doce como uma solução de sacarose a mesma concentração (ver Tabela 4.3 ). A isomerização é possível por meios químicos, mas não econômico, dando pequenos rendimentos e muitos subprodutos (por exemplo, 0,1 M glucose 'isomerizada' com 1,22 M KOH a 5ºC em azoto durante 3,5 meses dá um rendimento de 5% de frutose, mas apenas 7 % da glicose permanece inalterada, a maioria sendo convertido em vários ácidos hidroxilo).

198

Um dos triunfos da tecnologia enzimática até agora tem sido o desenvolvimento de 'isomerase glucose'. A glucose é isomerizada para frutose normalmente durante a glicólise, mas ambos os açúcares são fosforilados. A utilização deste isomerase phosphohexose pode ser descartada como uma enzima comercial por causa do custo do ATP necessária para activar a glicose e por duas outras enzimas (hexoquinase e frutose-6-fosfatase) seriam necessários para completar a conversão. Apenas uma isomerase que iria usar a glicose como substrato underivatised seria comercialmente útil, mas, até o final da década de 1950, a existência de tal enzima não era suspeito. Em volta dessa época, as enzimas foram encontrados que catalisam a conversão da D-xilose a uma mistura em equilíbrio de D-xilulose e D-xilose em bactérias. Quando fornecido com íons de cobalto, estes isomerases xilose foram encontrados para

isomerizar D-glicopiranose para -fructofuranose -D (ver esquema de reação

[ 1,5 ]), o equilíbrio do mais abundante -D-glicopiranose e para o principal produto - D-frutopiranose ocorrendo naturalmente e não enzimáticos. Agora, sabe-se que vários géneros de micróbios, principalmente as bactérias, podem produzir tais isomerases de glicose: Os enzimas comerciais são produzidas por Actinoplanes missouriensis , Bacillus coagulans e vários Streptomyces espécie; como eles têm

especificidades de glicose e frutose, que não são muito diferentes do que para a xilose e formas estão sendo encontradas para evitar a necessidade de xilose como indutor, estes devem, talvez, agora já não ser considerado como isomerases xilose. Eles são extremamente passíveis de enzimas que eles são resistentes à desnaturação térmica e que actuam em concentrações muito elevadas de substrato, que têm o benefício adicional de estabilizar as enzimas substancialmente a temperaturas operacionais mais altas. A grande maioria de isomerases de glicose são retidos no interior das células que as produzem, mas não precisam de ser separados e purificados antes da sua utilização.

Todas as isomerases de glicose, são usadas em formas imobilizadas. Embora os métodos de imobilização differerent têm sido usados para as enzimas de organismos differerent, os princípios de utilização são muito semelhantes. A imobilização é, geralmente, através de ligação cruzada com glutaraldeído, além de em alguns casos, um diluente proteína, após a lise celular ou de homogeneização.

Originalmente, glucose isomerase imobilizada foi utilizado num processo de lote. Isto provou ser caro como a reatividade relativa de frutose durante os longos tempos de permanência deu origem a significativa pela produção -product. Além disso, foram encontradas dificuldades na remoção do Mg adicionado 2+ e Co 2+ e a recuperação do catalisador. Hoje em dia a maioria isomerização é realizada em PBRs ( Tabela 5.2 ). Eles são utilizados com elevada concentração de substrato (35-45% de sólidos secos, 93-97% de glucose) a 55-60C. O pH é ajustado a 7,5-8,0 utilizando carbonato de sódio e sulfato de magnésio é adicionado para manter a actividade da enzima (Mg 2+ e Co 2+ são co-factores). O Ca 2+ concentração do material de alimentação de glucose é

geralmente cerca de 25 m, deixou de processamento anterior, e isto apresenta um problema. Ca 2+ compete com sucesso para o Mg 2+ local de ligação da enzima, causando a inibição. A este nível, o fluxo de substrato é normalmente feita de 3 mm em

199

relação ao Mg 2+ .A concentrações mais elevadas de cálcio por Mg 2+ : Ca 2+ proporção de 12 é recomendado. O excesso de Mg 2+ não é rentável, uma vez que contribui para a purificação, bem como os custos de isomerização.A necessidade de Co 2+ não foi eliminado completamente, mas os métodos de imobilização agora utilizados fixar os iões de cobalto, de modo que nenhum pode ser adicionada aos fluxos de substrato.

Tabela 5.2. Comparação de métodos de isomerização de glicose

Parâmetro Batch

(GI solúvel) Batch

(imobilizado Gl) Contínuo

(PBR)

Volume de reactor (m 3 ) 1100 1100 15

Consumo de enzima (em toneladas)

180 11 2

Atividade, meia-vida (h) 30 300 1500

Vida ativa, meias-vidas 0,7 2 3

O tempo de permanência (h) 20 20 0,5

Co 2+ (em toneladas) 2 1 0

Mg 2+ (em toneladas) 40 40 7

Temperatura (C) 65 65 60

pH 6,8 6,8 7.6

Formação de Cor (A 420 ) 0,7 0,2 <0,1

Refino do produto

Filtração

C-tratamentouma troca de catiões

de permuta aniónica

- C-tratamento

de troca catiônica

troca Anion

-

C -tratamento

- -

Capital, trabalho e

custos de energia, tonelada -1 5 5 1

Custo de conversão, tonelada-

1 500 30 5

Todos os processos de começar com 45% (w / w) de xarope de glicose DE 97 e produzir 10 mil toneladas por mês de 42% de frutose xarope seco. Alguns dos melhoria que pode ser visto para PBR produtividade é devido ao desenvolvimento substancial deste processo.

um tratamento com carvão activado.

É essencial para a utilização eficaz de glicose isomerase imobilizado que a solução de substrato é adequadamente purificado de modo que é livre de material insolúvel e

200

outras impurezas que possam inactivar a enzima por meios químicos (inibidora) ou física (poro bloquear) significa. Com efeito, isto significa que a glucose produzida por hidrólise ácida não pode ser utilizado, tal como a sua baixa qualidade necessita de purificação extensos e dispendiosos. O material insolúvel é removido por filtração, por vezes após o tratamento com agentes de floculação, e os materiais solúveis são removidas por resinas de permuta iónica e grânulos de carvão activado. Isto feito, ainda há a possibilidade de inibição devido a oxidado subprodutos causados por oxigênio molecular. Este pode ser removido por vácuo de extracção de ar do substrato à temperatura de isomerização ou por adição de concentrações baixas (<50 ppm) de sulfito.

Em condições de equilíbrio a 60 ° C cerca de 51% da glucose na mistura reaccional é convertido para frutose (ver o Capítulo 1 para uma discussão completa de tais reacções reversíveis). No entanto, devido ao tempo excessivo necessário para o equilíbrio a ser atingido e a presença de oligossacáridos no fluxo de substrato, a maioria dos fabricantes de ajustar as taxas de fluxo, de modo a produzir 42-46% (w / w) de frutose (deixando 47-51% (w / w) de glucose). Para produzir 100 toneladas (substância seca) de 42% HFCS por dia, um volume de leito de enzima de cerca de 4 m 3 é necessária. Atividade diminui, seguindo uma equação de decaimento de primeira ordem. A semi-vida da maior parte das preparações de enzima situa-se entre 50 e 100 dias a 55C. Tipicamente, um lote de enzima é descartado quando a actividade caiu para um oitavo do valor inicial (ou seja, depois de três -lives meia). Para manter um teor de frutose constante no produto, a taxa de fluxo de alimentação é ajustada de acordo com a actividade da enzima.Diversos reatores contendo preparações de enzimas de diferentes idades são necessárias para manter a produção global uniforme pela planta ( Figura 5.10 ). Em seu tempo de vida 1 kg de glicose isomerase imobilizada (exemplificado por Sweetzyme T da Novo) vai produzir 10 -11 toneladas de 42% de xarope de frutose (matéria seca).

201

Figura 5.10. Diagrama que mostra a taxa de produção de uma unidade de PBR sete coluna sobre -up início, assumindo decaimento exponencial da atividade reactor. As colunas são introduzidos um de cada vez. A qualquer momento, um máximo de seis PBRs estão operando em paralelo, enquanto o sétimo, exausto, reactor está sendo recarregados com biocatalisador fresco. atividades PBR deixa-se cair por três meias-vidas (para 12,5%) antes da atividade inicial de substituição. A produtividade média final é de 2,51 vezes a produtividade inicial de uma coluna. - - - - - - actividades PBR deixa-se cair por meio de duas semi-vidas (a 25% de actividade) inicial antes da substituição. A produtividade média final é de 3,23 vezes a produtividade inicial de uma coluna. Pode ser visto que a taxa de produção média final é maior quando os PBRs são operadas individualmente por períodos mais curtos, mas este aumento de 29% na produtividade é conseguida a um custo de 50% mais enzima, devido à mais rápida substituição do biocatalisador na PBRs. Um tempo de operação mais curto PBR também resulta num período breve de arranque e uma produtividade mais uniforme.

Após a isomerização, o pH do xarope é reduzido para 4-5 e é purificado por cromatografia e tratamento com carvão activado de permuta iónica. Em seguida, ele é normalmente concentrada por evaporação até cerca de 70% de sólidos secos.

Para muitos propósitos um xarope de frutose de 42% é perfeitamente satisfatório para o uso, mas não correspondem aos critérios exigentes de qualidade dos fabricantes de refrigerantes como um substituto para a sacarose em refrigerantes ácidos. Para utilização nas melhores colas, 55% de frutose é necessária.Este é produzido usando vastas colunas cromatográficas de zeólitos ou os sais de cálcio de resinas de permuta

202

catiónica para adsorver e separar a frutose de outros componentes. O processo de fraccionamento, embora basicamente muito simples, é só econômica, se funcionar continuamente. O fluxo de frutose (90% (w / w) frutose, 9% de glucose) é misturado com 42% de xarope de frutose a dar 55% de frutose (42% de glucose) do produto desejado. A rica em glicose stream 'refinado' pode ser reciclado, mas se isso for feito oligossacarídeos indesejáveis acumular-se no sistema. Glucoamilase imobilizada é usado em algumas plantas para hidrolisar oligossacarídeos presentes no refinado; aqui a concentração de substrato é relativamente baixo (cerca de 20% de sólidos secos), de modo a formação de i somai pela enzima é insignificante.

Claramente a necessidade de uma segunda grande planta frutose enriquecimento para além da planta isomerase de glucose é indesejável e é dada atenção aos meios de produção de xaropes de frutose de 55% utilizando apenas a enzima. A termodinâmica da produção sistema favor frutose em temperaturas mais altas e 55% de xaropes de frutose pode ser produzido diretamente se os reactores enzimáticos foram operados em torno de 95C. A utilização de orgânicos miscíveis -solvents co pode também produzir o efeito desejado. Ambas as alternativas apresentar mais do que um considerável desafio à enzima tecnologia!

O mercado mundial presente para HFCS é de mais de 5 milhões de toneladas, das quais cerca de 60% é para 55% xarope de frutose, com a maior parte do restante para 42% de xarope de frutose. Este mercado ainda está em expansão e garante que a produção de HFCS é o maior pedido de tecnologia de enzima imobilizada.

Os xaropes de elevada frutose pode ser utilizada para substituir a sacarose em que a sacarose é usada em solução, mas são inadequadas para substituir a sacarose cristalina. Outra ambição da indústria do xarope de milho é produzir sacarose a partir do amido. Isto pode ser feito usando uma combinação de enzimas fosforilase (CE 2.4.1.1), isomerase de glucose e sacarose-fosforilase (CE 2.4.1.7), mas a termodinâmica não favorecem a conversão tão meios devem ser encontrados de remoção de sacarose a partir do sistema como logo que é formado. Isso não vai ser fácil, mas é possível se a força comercial (ou seja, o dinheiro disponível) é suficiente:

fosforilase

de amido (L n ) + ortofosfato de amido (L n-1 ) + -glucose-1-fosfato [5,1]

glucose isomerase

de glicose frutose [5,2]

sacarose-fosforilase

-glucose-1-fosfato de frutose + sacarose + ortofosfato [5,3]

Uma outra abordagem possível para a produção de sacarose a partir da glucose é a fornecer glucose a altas concentrações de micróbios cuja resposta ao stress osmótico é

203

acumular sacarose intracelularmente.Desde que sejam capazes de libertar sacarose sem hidrólise quando a tensão é libertada, tais micróbios podem ser a base de totalmente novos processos.

Uso de raffinase imobilizada

O desenvolvimento de um raffinase ( -D-galactosidase) adequado para uso comercial é outra vitória de tecnologia enzima. Claramente, seria totalmente inaceitável utilizar uma preparação de enzimas contendo invertase para remover este material durante a produção de sacarose (ver capítulo 4 ). Tem sido necessário encontrar um

organismo capaz de produzir um galactosidase mas não uma invertase. Um molde, Mortierella vinacea var. raffinoseutilizer , preenche os requisitos. Esta é crescida

numa forma de partículas e as partículas recolhidas, secas e usadas directamente como preparação-enzima imobilizado.Agita-se com o suco de beterraba sacarina em lote agitada reactores de tanque. Quando a remoção de rafinose é completa, a agitação é interrompida e o suco bombeada para fora do leito assente do enzima.Enzima, perdeu por desgaste físico, passa a ter nova enzima adicionado com o próximo lote de suco. A galactose libertada é destruído em condições alcalinas das primeiras etapas de purificação do caldo, e não causa quaisquer problemas quando a sacarose é recuperada. Este processo resulta em um aumento de 3% na produtividade e uma redução significativa nos custos de eliminação de resíduos de melaço.

Raffinase imobilizada também pode ser utilizada para remover a rafinose e estaquiose a partir de leite de soja. Estes açúcares são responsáveis para a flatulência que pode ser causada quando o leite de soja é usada como um substituto do leite em dietas especiais.

Uso de invertase imobilizada

Invertase foi provavelmente a primeira enzima a ser utilizada em grande escala de uma forma imobilizado (por Tate & Lyle). No período 1941 -1946 o ácido, utilizado anteriormente no fabrico do xarope dourado, não estava disponível, de modo invertase de levedura foi usada em vez disso. As células de levedura foram autolisado e a autolisado clarificado por ajuste do pH a 4,7, seguido por filtração através de um leito de sulfato de cálcio e de adsorção em carvão ósseo. Uma camada do osso char contendo invertase foi incluído na cama de osso char já usado para descorar o xarope. A escala utilizada foi grande, a cama de ser dois pés (60 centímetros) de profundidade em uma cama do char 20 pés (610 cm) de profundidade invertase no carvão. A preparação era muito estável, sendo os factores de limitação de contaminação ou perda de energia, em vez de perda de actividade enzimática descolorante microbiana. O processo foi o custo-benefício, mas, não surpreendentemente, o produto não tem a sutileza do sabor do material hidrolisado ácido e o processo de enzima imobilizada foi abandonada quando o ácido tornou-se mais uma vez disponível. Recentemente, no entanto, foi relançado

204

usando Brimac TM , onde a mistura da invertase -char é estabilizado através de ligação cruzada e tem uma meia-vida de 90 dias de utilização (pH 5,5, 50C).O renascimento é devido, em parte, para o sucesso de HFCS como um de alta qualidade a baixo cor adoçante. É impossível produzir xaropes invertidos de qualidade equivalente por hidrólise ácida. Inversão enzimática evita o alto-cor, elevado teor de sal de sódio, de conversão e de variabilidade lote problemas relativamente baixos de hidrólise ácida. Embora invertase livre pode ser utilizado (com tempos de residência de cerca de um dia), a utilização de enzimas imobilizadas num PBR (com um tempo de residência de cerca de 15 min) faz com que o processo competitivo; a inversão custo de 95% (em 50% (w / w)) não ser mais do que os custos finais de evaporação (a 75% (w / w)). A produtividade de 16 toneladas de xarope invertido (peso seco) pode ser conseguido usando um litro de enzima granular.

A produção de ácidos aminados

Outra aplicação precoce de uma enzima imobilizada foi o uso do aminocilase de Aspergillus oryzae para resolver misturas racémicas de aminoácidos.

[5.4]

Os ácidos N-acil-aminoácidos racémicos DL-quimicamente sintetizados são hidrolisados a pH 8,5 para se obter os L-aminoácidos livres, além dos ácidos N-acil-D-aminoácidos não hidrolisados. Estes produtos são facilmente separados por cristalização diferencial e os ácidos N-acil-D-aminoácidos quimicamente racemizado (ou enzimáticos) e reprocessado. A enzima é imobilizado por adsorção a resinas de permuta de aniões (por exemplo DEAE-Sephadex) e tem uma semi-vida operacional de cerca de 65 dias a 50C em PBRs com tempos de residência de cerca de 30 min. Os reactores podem ser re-activada in situ , simplesmente adicionando mais enzima. A enzima imobilizada provou

ser um processo mais económico do que a utilização da enzima livre, principalmente devido a uma utilização mais eficiente do substrato e reduções no custo da enzima e do trabalho.

Novel e L-aminoácidos naturais pode ser produzido por conversão química de aldeídos através de nitritos DL-amino para racémicas DL-hidantoínas esquema de reacção ( [5,5] ), seguido por hidrólise enzimática com hidantoínase e um carbamoilase

205

(esquema de reacção [5,6] ) a pH 8,5. Ambas as enzimas podem ser obtidas a partir de Arthrobacter espécies.

D-aminoácidos são componentes importantes em antibióticos e insecticidas. Eles podem ser produzidos de um modo semelhante aos L-aminoácidos, mas utilizando diferentes hydantoinases de especificidade. Ostriata Pseudomonas enzima é específica

para D-hidantoínas, permitindo a sua hidrólise específica de aminoácidos D-carbamoilo que podem ser convertidos para os D-aminoácidos através de tratamento químico com ácido nitroso. Eles restante L-hidantoína pode ser simplesmente racemizado por base e o processo repetido.

[5,5]

[5.6]

-aspártico L é amplamente utilizado nas indústrias alimentar e farmacêutica e que é necessária para a produção de edulcorante aspartame -calorific baixo. Pode ser produzido a partir de ácido fumárico pela utilização de aspartato de amónia-liase (aspartase) a partir de Escherichia coli .

aspartato amoníaco-liase - OOCCh = CHCOO - + NH 4 + - OOCCh 2 CH (NH 3

+ ) COO - [5,7] ácido fumárico ácido L-aspártico

Um aspartato imobilizada amoníaco-liase em bruto (50000 U g -1 ) podem ser

preparadas por aprisionamento de Escherichia coli em células de um -carageenan gel

206

reticulado com glutaraldeído e hexametilenodiamina. O processo é operado numa PBR a pH 8,5 usando fumarato de amónio como substrato, com uma meia-vida operacional relatado de 680 dias a 37 ° C.

Ácido urocânico é um agente de protecção solar que pode ser produzido a partir de L-histidina por histidina na -lyase amoníaco (histidase) de Achromobacter liquidum (ver

esquema de reacção [1,4] ). O organismo não pode ser utilizado directamente, uma vez que tem actividade urocanate hidratase, que remove o ácido urocânico. No entanto, um tratamento breve de aquecimento (70C, 30 min) inactiva esta actividade não desejada, mas tem pouco efeito sobre a histidina amoníaco-liase. Uma preparação bruta-enzima imobilizado composto de células tenha sido tratada com calor aprisionadas num gel de poliacrilamida foi utilizada para efectuar esta convers, que mostra uma meia-vida de 180 dias a 37 ° C.

Uso de lactase imobilizada

A lactase é uma das relativamente poucas enzimas que têm sido usados tanto livres e imobilizadas em processos de grande escala. As razões para a sua utilidade tem sido dada anteriormente (ver Capítulo 4 ), mas o custo relativamente elevado da enzima é um incentivo a mais para o seu uso em um estado imobilizado.

Lactases imobilizados são importantes principalmente no tratamento de soro de leite, como as gorduras e proteínas no leite de emulsão tendem a revestir os biocatalisadores. Isto reduz tanto a sua actividade aparente e aumenta a probabilidade de colonização de microorganismos.

Levedura de lactase foi imobilizada por incorporação de fibras de celulose durante o triacetato de fiação húmida, um processo desenvolvido pela Snamprogetti SpA em Itália. As fibras são cortadas e utilizadas num processo descontinuo STR no 5C ( Kluyveromyces lactis , pH óptimo de 6,4 -6,8, 90 g L -1 ). Lactases fúngicas foram

imobilizadas em 0,5 milímetros de diâmetro sílica porosa (35 nm de diâmetro médio de

poro), utilizando glutaraldeído e -aminopropyltriethoxysilane ( Asperigillus niger , pH ótimo 3.0 -3.5, 500 U g -1 ; A. oryzae , pH ótimo 4.0 -1.5, 400 g L -1 ). Eles são utilizados

em PBRs. Devido à diferente optima de fungos e leveduras lactases pH, as enzimas de levedura são úteis nas condições de pH neutro do leite e do soro de leite doce, enquanto que as enzimas de fungos são mais úteis com soro de leite ácido.

Lactases imobilizados são particularmente afectadas por dois inerentes curta-vindas. Produto inibição por galactose e a formação indesejada de oligossacárido são tanto visíveis sob as condições de difusão controlada geralmente predominante. Ambos os problemas podem ser reduzidos por um aumento no factor de eficácia e uma redução no grau de hidrólise ou a concentração inicial de lactose, mas tais condições também levar a uma redução no rendimento económico. O controlo da contaminação microbiana

207

dentro dos bioreactores é o problema prático mais crítico nestes processos. Em certa medida, isto pode ser superada pelo uso de saneamento regular com detergente de base e uma solução diluída de protease.

Produção de antibióticos

Benzylpenicillins e phenoxymethylpenicillins (penicilinas G e V, respectivamente) são produzidos pela fermentação e são os precursores de base de uma ampla gama de antibióticos semi-sintéticos, por exemplo, a ampicilina. A ligação amida pode ser hidrolisado convencionalmente, mas as condições necessárias para a sua hidrólise específica, enquanto que não provoca a hidrólise do intrinsecamente mais lábil mas

farmacologicamente essencial anel lactâmicos, são difíceis de alcançar. Tal hidrólise específica pode ser alcançada simplesmente por utilização de penicilina-amidases (também chamadas acilases de penicilina). Preparações de enzimas diferentes são geralmente usados para a hidrólise de penicilinas G e V, sendo muito mais específico do que penicilina-G-amidase de penicilina-V-amidase.

A penicilina-amidase pode ser obtido a partir de E. coli e foi imobilizada num certo

número de suportes incluídos com brometo de cianogénio de Sephadex G200. Ela representa um dos primeiros processos bem sucedidas envolvendo enzimas imobilizadas e é geralmente usado em processos batch ou semi-permanente (STR 40.000 ukg -1 penicilina G, 35C, pH 7,8, 2 h), onde pode ser reutilizado mais de 100 vezes. Também tem sido utilizado em PBRs, onde tem uma vida activa de mais de 100 dias, produzindo cerca de duas toneladas de ácido 6-aminopenicilânico kg -1 de enzima immobolised.

[5,8]

[5,9]

208

Os penicilina-G-amidases podem ser utilizados 'ao contrário' para sintetizar penicilina e cefalosporina antibióticos por não -equilibrium reacções cineticamente controladas (ver também Capítulo 7 ). A ampicilina foi produzido pelo uso de penicilina-G-amidase imobilizados por adsorção em DEAE -celulose uma coluna de leito empacotado:

[5.10]

Muitos outros antibióticos potenciais e comprovados foram sintetizados desta maneira,

usando uma variedade de sintéticos -lactamas e ácidos carboxílicos activados.

Preparação de acrilamida

A acrilamida é um monómero importante necessário para a produção de uma gama de materiais poliméricos economicamente úteis. Pode ser produzido por adição de água para acrilonitrilo.

CH 2 = CHCN + H 2 O CH 2 = CHCONH 2 [5,11]

Este processo pode ser conseguido através da utilização de um catalisador de cobre reduzido (Cu + ); no entanto, o rendimento é fraco, a polimerização indesejada ou a conversão em ácido acrílico (CH 2 = CHCOOH) pode ocorrer a temperaturas relativamente elevadas envolvidas (80 -140C) e o catalisador é difícil de se regenerar. Estes problemas podem ser ultrapassados pela utilização de nitrilo hidratase imobilizada (erroneamente denominado uma nitrilase). A enzima de Rhodococcus foi

usado pela Nitto Chemical Industry Co. Ltd, uma vez que contém apenas actividade de amidase muito baixa, o que de outro modo seria produzir ácido acrílico indesejado da acrilamida.

Imobilizada nitrilo hidratase é simplesmente preparadas aprisionando as células intactas em um reticulado 10% (w / v) de poliacrilamida / gel de metacrilato de dimetilaminoetilo e a granulação do produto. É utilizada a 10 ° C e pH 8,0-8,5, num processo semibatchwise, mantendo a concentração de substrato acrilonitrilo abaixo de 3% (w / v). Usando 1% (w / v) concentração imobilizada a enzima (cerca de 50000 L l -1 ) do processo leva cerca de um dia. As concentrações de produtos de até 20% (w / v) de acrilamida foram alcançados, contendo substrato negligenciável e menos do que 0,02% (w / w) de ácido acrílico.Produção de acrilamida usando esse método é de cerca de 4000 toneladas por ano.

209

O enzimas cyanidase intimamente relacionadas e cianeto hidratase (ver esquemas [5.12] e [5.13], respectivamente) são usados para remover o cianeto de resíduos industriais e na desintoxicação de alimentos e alimentos contendo amygdalin (ver equação [6.12] ).

HCN + 2H 2 O HCOO - + NH 4 + [5,12]

HCN + H 2 O HCONH 2 [5,13]

Resumo e Bibliografia do capítulo 5

a. As enzimas podem ser usadas em lotes ou reactores contínuos. A escolha do reactor para aplicações específicas dependem das formas físicas do substrato (s), enzimas) e produtos) em adição à economia de processo.

b. A PBR geralmente torna mais eficiente o uso de enzimas imobilizadas. O CSTR é preferido, principalmente quando o controlo do pH é essencial ou, onde as propriedades físicas do fluxo de substrato são incompatíveis com o funcionamento do PBR. A FBR tem propriedades entre aqueles de um PBR e um CSTR, mas é mais difícil à escala -up. Reactores de membrana são versáteis, mas caro.

c. Enzimas imobilizadas são utilizadas num número cada vez maior o bioconversões economicamente viáveis, o mais importante dos quais é a isomerização de glicose.

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11. A utilização de enzimas em análise 12. As enzimas constituem excelentes reagentes analíticos, devido à sua

especificidade, a selectividade e eficiência. Elas são muitas vezes utilizadas para determinar a concentração dos seus substratos (como analitos) por meio das taxas iniciais de reacção resultantes. Se as condições de reacção e concentrações de enzima são mantidos constantes, estas taxas de reacção (v) é proporcional às concentrações de substrato ([S]) em concentrações baixas de substrato. Quando [S] <0,1 K m , equação 1.8 simplifica a dar

13. v = (V max / K m ) [S] (6,1) 14. As velocidades de reacção são normalmente determinada a partir da diferença na

absorvância óptica entre os reagentes e produtos. Um exemplo disto é o -D-galactose desidrogenase (EC 1.1.1.48) ensaio para a galactose, que envolve a oxidação de galactose pelo redox coenzima, dinucleótido nicotina adenina (NAD + ).

15. -D-galactose + NAD + D-galactono-1,4-lactona + NADH + H + [6.1]

16. Uma solução 0,1 mM de NADH tem uma absorvância a 340 nm, numa proporção de 1 cm de passo de comprimento cuvete, de 0,622, enquanto que o NAD + a partir do qual é derivado tem praticamente zero absorvência a este comprimento de onda. A conversão (NAD + NADH) é, portanto, acompanhada por um grande aumento na absorção de luz neste comprimento de onda. Para que a reacção seja linear relativamente à concentração de galactose, galactose é mantido dentro de uma gama de concentrações bastante abaixo do K m de enzima para galactose. Em contraste, o NAD + a concentração é mantida dentro de uma gama de concentrações bem acima do K m de enzima para o NAD + , a fim de não limitar a velocidade da reacção. Tais ensaios são comumente utilizados em laboratórios de análises e são, de facto, excelente onde uma grande variedade de análises têm de ser realizadas em um relativamente pequeno número de amostras. As desvantagens para este tipo de análise se tornam aparentes quando um grande número de ensaios repetitivos devem ser realizadas. Em seguida, eles são vistos para ser caro em termos de enzima caro e uso coenzima, demorado, trabalhoso e precisa de operação qualificada e reprodutível em laboratórios analíticos devidamente equipadas. Para a operação de rotina ou no local, estas desvantagens devem ser superados. Isto está a ser conseguido através da

211

produção de biossensores que exploram sistemas biológicos, em associação com os avanços da tecnologia micro-eletrônica.

Quais são biossensores?

Um biossensor é um dispositivo que converte analítica uma resposta biológica num sinal eléctrico ( Figura 6.1 ). O termo "biossensor" é muitas vezes utilizado para abranger os dispositivos sensores utilizados a fim de determinar a concentração de substâncias e para outros parâmetros de interesse biológico, mesmo que eles não utilizam um sistema biológico directamente. Esta definição muito ampla é usado por algumas revistas científicas (por exemplo, biossensores, Ciência Aplicada Elsevier), mas não será aplicado à cobertura aqui. A ênfase desta preocupações Capítulo enzimas como o material biologicamente sensível, mas deve ser reconhecido que outros sistemas biológicos podem ser utilizados por biossensores, por exemplo, o metabolismo de células inteiras, a ligação do ligando e a reacção anticorpo-antigénio.Biossensores representam um campo em rápida expansão, no momento atual, com uma taxa de crescimento anual de cerca de 60%; o grande impulso vindo de indústria de cuidados de saúde (por exemplo, 6% do mundo ocidental é diabético e se beneficiariam com a disponibilidade de um biossensor rápida, precisa e simples para a glicose), mas com um pouco de pressão de outras áreas, como a avaliação da qualidade dos alimentos e monitoramento ambiental. O mercado analítico mundial estimada é de cerca de 12.000 milhões ano -1 , dos quais 30% é na área de cuidados de saúde. Há claramente um vasto potencial de expansão do mercado como menos do que 0,1% deste mercado está usando biossensores. Pesquisa e desenvolvimento neste campo é amplo e multidisciplinar, abrangendo bioquímica, ciência biorreator, físico-química, eletroquímica, eletrônica e engenharia de software. A maior parte deste esforço atual diz respeito biossensores potenciométricas e amperométricos e tiras de papel de enzima colorimétricos. No entanto, todos os principais tipos de transdutores são susceptíveis de ser cuidadosamente analisado, para utilização em biossensores, ao longo dos próximos anos.

Um biossensor de sucesso deve possuir, pelo menos, algumas das seguintes características benéficas:

1. O biocatalisador devem ser altamente específicos para o propósito de análises, seja estável sob condições normais de armazenagem e, excepto no caso das fitas e tiras para imersão de enzima colorimétrico (ver mais tarde), apresentam uma boa estabilidade ao longo de um grande número de ensaios (isto é, muito maior do que 100).

2. A reacção deve ser tão independente destes parâmetros físicos como a agitação, o pH e temperatura, como é controlável. Isto iria permitir a análise de amostras com pré-tratamento mínimo.Se a reacção envolve cofactores ou coenzimas estas devem, de preferência, também ser co-imobilizado com a enzima (ver o Capítulo 8 ).

212

3. A resposta deverá ser exato, preciso, reprodutível e lineares ao longo do intervalo analítico útil, sem diluição ou concentração. Ele também deve ser livre de ruído elétrico.

4. Se o biossensor é para ser usado para monitoramento invasivo em situações clínicas, a sonda deve ser pequena e biocompatível, não tendo efeitos tóxicos ou antigênicas. Se é para ser utilizada em fermentadores deve ser esterilizável. Isto é preferencialmente realizado por tratamento em autoclave, mas nenhuma enzima de biossensor pode resistir a tal tratamento presentemente molhado termicamente drástica. Em ambos os casos, o biossensor não deve ter tendência para sujar ou proteólise.

5. O biossensor completo deve ser barato, pequeno, portátil e capaz de ser usado por operadores semi-especializados.

6. Deve haver um mercado para o biossensor. Há claramente pouca finalidade desenvolver um biossensor se outros fatores (por exemplo, subsídios do governo, o emprego continuou de analistas especializados, ou má percepção do cliente) incentivar o uso de métodos tradicionais e desencorajar a descentralização de testes laboratoriais.

A resposta biológica do biossensor é determinada pela membrana biocatalítica que realiza a conversão do reagente ao produto. Enzimas imobilizadas possuem um número de características vantajosas, o que as torna particularmente aplicável para uso em tais sistemas. Eles podem ser reutilizados, o que garante que a mesma actividade catalítica está presente para uma série de análises. Este é um fator importante para garantir resultados reproduzíveis e evita as armadilhas associadas à pipetagem réplica de enzima livre de outra forma necessária protocolos analíticos. Muitas enzimas são intrinsecamente estabilizado pelo processo de imobilização (ver Capítulo 3 ), mas mesmo quando isso não ocorre, há aparente estabilização geralmente considerável. É normal a utilização de um excesso de enzima dentro do sistema de sensor

imobilizada. Isto dá uma redundância catalítica (isto é, << 1), que é suficiente para assegurar um aumento da aparente estabilização da enzima imobilizada (ver, por exemplo, as Figuras 3.11 , 3.19 e 5.8 ).Mesmo quando há alguma inactivação da enzima imobilizada durante um período de tempo, esta inactivação é geralmente estável e previsível. Qualquer deterioração atividade é facilmente incorporado em um esquema analítico interpolando regular de normas entre as análises de amostras desconhecidas.Por estas razões, muitos desses sistemas de enzimas imobilizadas são re-utilizável até 10.000 vezes mais de um período de vários meses. Claramente, isto resulta em uma economia considerável em termos de custo das enzimas 'em relação ao uso de análise de enzimas solúveis livres.

Quando a reacção, que ocorrem na membrana da enzima imobilizada de um biossensor, é limitada pela velocidade de difusão externa, o processo da reacção irá possuir um número de activos valiosos analíticos. Em particular, ele irá obedecer a relação mostrada na equação 3,27 . Daqui resulta que o biocatalisador dá uma variação proporcional na velocidade de reacção em resposta à concentração de reagente (substrato) ao longo de uma gama substancial linear, várias vezes o K

213

intrínseca m (ver Figura 3.12 linha e). Isto é muito útil em termos de concentrações de analito são frequentemente aproximadamente igual a K m s de suas enzimas apropriadas, que é aproximadamente 10 vezes mais concentrada que pode ser normalmente determinada, sem diluição, por utilização da enzima livre em solução. Também a partir da equação seguinte 3.27 é a independência da velocidade de reacção com respeito ao pH, força iónica, temperatura e inibidores. Este simplesmente evita os problemas complicados frequentemente encontradas devido à variabilidade das amostras reais analíticas (por exemplo, caldo de fermentação, sangue e urina) e as condições externas. O controlo da resposta de biossensor pela difusão externa do analito pode ser encorajada através da utilização de membranas permeáveis entre a enzima e a solução a granel. A espessura destes pode ser variada com efeitos associados sobre a constante de proporcionalidade entre a concentração de substrato e a velocidade da reacção (isto é, aumentando a espessura da membrana aumenta a

camada não agitada ( ) que, por sua vez, diminui a constante de proporcionalidade, K L , em equação 3,27 ). Mesmo se total dependência da taxa de difusão externa não é atingida (ou possíveis), qualquer aumento na dependência da velocidade de reacção em difusão externa ou interna irá causar uma redução da dependência em relação ao pH, força iónica, temperatura e concentrações de inibidor.

Figura 6.1 . Diagrama esquemático mostrando os principais componentes de um biossensor. O biocatalisador (a) converte o substrato em produto. Esta reacção é determinada pelo transdutor (b) que o converte num sinal eléctrico. A saída do transdutor é amplificada (c), processados (d) e exibida (e).

A parte principal de um biossensor é o transdutor (mostrado como o "caixa negra" na Figura 6.1), que faz uso de uma mudança física que acompanha a reacção. Isto pode ser

1. a saída de calor (ou absorvido) pela reacção (biossensores calorimétrica),

214

2. mudanças na distribuição de cargas que provocam um potencial eléctrico a ser produzido (biossensores potenciométricos),

3. movimento dos electrões produzidos numa reacção redox (biossensores amperométricos),

4. a saída de luz durante a reacção ou uma diferença de absorvância de luz entre os reagentes e os produtos (biossensores ópticos), ou

5. efeitos devido à massa dos reagentes ou dos produtos (biossensores piezo-eléctrico).

Há três chamadas "gerações" de biossensores; Biossensores de primeira geração em que o produto normal da reacção se difunde para o transdutor e faz com que a resposta eléctrica, biossensores de segunda geração que envolvem '' mediadores específicos entre a reacção e o transdutor de modo a gerar uma melhor resposta e biossensores de terceira geração, onde a reacção propriamente dita faz com que a resposta e nenhum produto ou mediador de difusão é diretamente envolvidos.

O sinal elétrico do transdutor é geralmente baixa e sobreposta a um relativamente alto e barulhento (ou seja, que contém um componente de sinal de alta frequência de natureza aparentemente aleatória, devido à interferência elétrica ou gerados dentro dos componentes eletrônicos do transdutor) da linha de base. O processamento de sinal envolve normalmente subtraindo um sinal de linha de base 'referência', derivado de um transdutor similar sem qualquer membrana biocatalítico, a partir do sinal de amostra, ampliando a diferença sinal resultante e filtrando eletronicamente (suavização) o ruído sinal indesejado. A natureza relativamente lenta da resposta biossensor facilita consideravelmente o problema da filtragem de ruído eléctrico. O sinal analógico produzido nesta fase podem ser impressas directamente mas geralmente é convertido para um sinal digital e transmitido para uma etapa microprocessador onde os dados são processados, convertida em unidades de concentração e de saída para um dispositivo de exibição ou armazenamento de dados.

Biossensores calorimetria

Muitos enzima catalisada reacções são exotérmicas, a geração de calor (Tabela 6.1), que pode ser usado como uma base para a medição da taxa de reacção e, por conseguinte, a concentração do analito. Isso representa o tipo mais geralmente aplicável de biossensor. As mudanças de temperatura são normalmente determinadas por meio de termistores na entrada e saída de pequenas colunas de leito fixo contendo enzimas imobilizadas no interior de um ambiente de temperatura constante (Figura 6.2). Sob tais condições bem controladas, até 80% do calor gerado na reacção pode ser registada como uma variação da temperatura do fluxo de amostra. Isto pode ser simplesmente calculado a partir da variação de entalpia e a quantidade reagiu. Se um reagente de 1 mM é completamente convertido em produto de uma reacção de geração de 100 kJ mol -1 , em seguida, cada ml de solução gera 0,1 J de calor. A 80% de eficiência, isto causará uma mudança na temperatura da solução para cerca de

215

montante 0.02C. Isto é sobre a mudança de temperatura comumente encontradas e exige uma resolução de temperatura de 0.0001C para o biossensor para ser geralmente útil.

Tabela 6.1. saída Heat (entalpias molares) da enzima reações catalisadas.

Reagente Enzima A saída de calor

- H (kJ mol -1 )

Colesterol Colesterol oxidase 53

Ésteres Chymotrypsin 4-16

Glicose A glicose oxidase 80

O peróxido de hidrogênio

Catalase 100

Penicilina G Penicillinase 67

Peptídeos Tripsina 10 - 30

Amido Amylase 8

Sacarose Invertase 20

Uréia A urease 61

O ácido úrico Uricase 49

Figura 6.2. Diagrama esquemático de um biossensor de calorimetria. A corrente de amostra (a), passa através da caixa de isolamento exterior (b) para o permutador de

216

calor (c) dentro de um bloco de alumínio (d). A partir daí, que flui para além do termistor de referência (E) e no biorreactor de leito fixo (f, o volume de 1 ml), contendo o biocatalisador, onde ocorre a reacção. A mudança de temperatura é determinado pelo termistor (g) e a solução passou para o lixo (h). Electrónica externas (l) determina a diferença na resistência, e, consequentemente, a temperatura, entre os termistores.

Os termistores, utilizados para detectar a mudança de temperatura, função, alterando sua resistência elétrica com a temperatura, obedecendo a relação

(6,2)

portanto:

(6.2b)

em que R 1 e R 2 são as resistências dos termistores em valores absolutos de temperatura T 1 e T 2 , respectivamente, e B é uma constante de temperatura característico para o termistor. Quando a variação de temperatura for muito pequeno, tal como no presente caso, B (1 / T 1 ) - (1 / T 2 ) é muito menor do que um e que esta relação pode ser substancialmente simplificada utilizando a aproximação quando x 1 que << e x 1 + x (x aqui ser B (1 / T 1 ) - (1 / T 2 ),

(6.3)

Como T 1 T 2 , que tanto pode ser substituído no denominador por T 1 .

(6,4)

A redução relativa na resistência eléctrica ( R / R) da sonda é proporcional ao

aumento de temperatura (T). Uma constante de proporcionalidade típico (-B / t 1 2 ) é -

4% C -1 . A alteração da resistência é convertido para uma mudança de voltagem proporcional, usando uma ponte de Wheatstone equilibrada incorporando precisão resistências de arame pré-formado, antes da amplificação. A expectativa de que vai haver uma correlação linear entre a resposta e a actividade da enzima foi encontrado para ser confirmada na prática. Um dos principais problemas com este biossensor é a dificuldade encontrada em que segue de perto as constantes temperatura característica

217

da medida e de referência termistores. Um movimento igual de apenas 1C na temperatura de ambos os termistores fundo geralmente provoca uma aparente mudança nas resistências relativas dos termistores equivalentes a 0.01C e igual à mudança em grande escala devido à reação. É evidente que é de grande importância que essas mudanças de temperatura ambiental são evitados, o que explica a inclusão do bloco de alumínio bem isolado na concepção biossensor (verFigura 6.2 ).

A sensibilidade (10 -4 M) e gama (10 -4 - 10 -2 M) de biossensores termistores são ambos muito baixo para a maioria das aplicações, embora uma maior sensibilidade é possível utilizando as reacções exotérmicas mais (por exemplo catalase). A baixa sensibilidade do sistema pode ser substancialmente aumentada através do aumento da produção de calor por meio da reacção. No caso mais simples isso pode ser alcançado pelo encadeamento de várias reacções de uma via de reacção, todos os quais contribuem para a produção de calor. Assim, a sensibilidade da análise de glicose utilizando-se glicose-oxidase pode ser mais do que duplicado pela co-imobilização da catalase no interior do reactor de coluna, a fim de desproporcionada o peróxido de hidrogénio produzido. Um caso extremo desta amplificação é mostrado no seguinte esquema de reciclagem para a detecção de ADP.

[6.2]

ADP está a analisar e excesso de glicose, fosfoenol piruvato acrescentou, NADH e oxigênio estão presentes para garantir a reacção máxima. Quatro enzimas (hexoquinase, piruvato-quinase, lactato desidrogenase e lactato oxidase) são co-imobilizada no interior do reactor de leito com enchimento.Apesar de a entalpia de reacção positiva da piruvato-quinase, o processo resulta em geral de um aumento de 1000 vezes na sensibilidade, principalmente devido à reciclagem entre piruvato e

218

lactato. Limitação de reacção, devido à baixa solubilidade do oxigénio pode ser superado substituindo-a por benzoquinona, o qual é reduzido por hidroquinona para flavo-enzimas. Tais sistemas de reacção que, no entanto, tem a desvantagem séria de que eles aumentam a probabilidade da ocorrência de interferência na determinação da substância a analisar de interesse. As reacções envolvendo a geração de iões de hidrogénio pode ser feito mais sensível através da inclusão de uma base que tem um elevado calor de protonação. Por exemplo, a produção de calor por meio da reacção de penicilinase pode ser quase duplicada pelo uso de Tris (tris (hidroximetil) aminometano) como a conclusão buffer.In, as principais vantagens do biossensor são termistor sua aplicabilidade geral e a possibilidade da sua usar em soluções turvas ou fortemente coloridas. A desvantagem mais importante é a dificuldade em assegurar que a temperatura da corrente de amostra permanece constante (0.01C).

Tecnologia Enzimática

Biossensores potenciométricos

Biossensores potenciométricos fazem uso de eléctrodos selectivos de iões, de modo a transduzir a reacção biológica num sinal eléctrico. Nos termos mais simples, esta consiste de uma membrana de enzima imobilizada em torno da sonda a partir de um medidor de pH ( Figura 6.3 ), em que a reacção catalisada gera ou absorve os iões de hidrogénio ( Tabela 6.2 ). A reacção que ocorre ao lado da membrana de vidro de detecção fina provoca uma alteração no pH que pode ser lida directamente a partir do visor do medidor de pH. Típica da utilização de tais eléctrodos é que o potencial eléctrico é determinado pelo impedância muito alta, permitindo eficazmente fluxo de corrente zero, sem causar interferência com a reacção.

219

Figura 6.3. Um biossensor potenciométrico simples. Uma membrana semi-permeável (a) envolve o biocatalisador (b) retido próximo da membrana de vidro activo (c) de uma sonda de pH (d). O potencial eléctrico (e), é gerado entre o eléctrodo interno de Ag / AgCl (f) banhado em diluída de HCl (g) e um eléctrodo de referência externo (h).

Existem três tipos de eléctrodos selectivos de iões, que são de utilização de um biossensor:

1. Eléctrodos de vidro para catiões (por exemplo, eléctrodos de pH normal), em que o elemento de detecção é uma membrana de vidro hidratado muito finas, o que gera um potencial eléctrico transversal devido à competição dependente da concentração entre os catiões para locais de ligação específicos. A selectividade desta membrana é determinado pela composição do vidro. A sensibilidade a H + é maior do que a alcançável para NH 4

+ ,

220

2. Eléctrodos de pH de vidro revestido com uma membrana permeável ao gás selectivo para o CO 2 , NH 3 ou H 2 S. A difusão do gás através desta membrana causa uma alteração no pH de uma solução de detecção entre a membrana e o eléctrodo que é então determinada.

3. Eléctrodos de estado sólido em que a membrana de vidro é substituída por uma membrana fina de um condutor de iões específica feita a partir de uma mistura de sulfureto de prata e de um halogeneto de prata. O eléctrodo de iodeto é útil para a determinação de I - na reacção de peroxidase ( Tabela 6.2c ) e também responde aos iões cianeto.

Tabela 6.2. As reacções envolvendo a libertação ou a absorção de iões que podem ser utilizadas por biossensores potenciométricos.

(A) H + catião,

glicose oxidase H 2 O D-glicose + O 2 D-glucono-1,5-lactona + H 2 O 2 D-gluconato + H + [6,3]

penicillinase penicilina ácido penicilóico + H + [6,4]

urease (pH 6,0) um

H 2 NCONH 2 + H 2 O + 2H + 2NH 4 + + CO 2 [6,5]

urease (pH 9,5) b

H 2 NCONH 2 + 2H 2 O 2 NH 3 + HCO 3 - + H + [6,6]

lipase lípidos neutros + H 2 O ácidos gordos de glicerol + + H + [6,7]

(B) NH 4 + catião,

Ácido L-amino-oxidase de L-aminoácido + O 2 + H 2 O + NH ceto ácido 4

+ + H 2 O 2 [6,8]

asparaginase ` L-asparagina + H 2 O L-aspartato + NH 4

+ [6,9]

urease (pH 7,5) H 2 NCONH 2 + 2H 2 O + H + 2NH 4

+ + HCO 3 - [6,10]

(C) I - anião,

221

peroxidase de H 2 O 2 + 2H + + 2 I - I 2 + 2H 2 O [6.11]

(D) CN - ânion,

-glucosidase amygdalin + 2H 2 O 2glucose + benzaldeído + H + + CN -

[6.12]

um também pode ser usado em NH 4 + e CO 2 (gás) biossensores potenciométricos.

b Também pode ser usado em um NH 3 (gás) biosensor.es80ll66bp potenciométrica

A resposta de um eléctrodo selectivo de iões é dada pela

(6,5)

onde E é o potencial medido (em volts), E 0 é uma constante característica para o sistema de eléctrodo selectivo de iões e / ou exteriores, R é a constante dos gases, T é a temperatura absoluta (K), z é a carga iónica assinado, F é o de Faraday, e [i] é a concentração das espécies iónicas não complexados livres (estritamente, [i] deve ser a actividade do ião mas nas concentrações normalmente encontradas em biossensores, este é efectivamente igual à concentração). Isto significa, por exemplo, que haja um aumento no potencial eléctrico de 59 mV para cada década aumento na concentração de H + a 25 ° C. A dependência do potencial logarítmica da concentração iónica é responsável tanto pela ampla gama analítica e a exactidão e precisão baixo destes sensores. A sua faixa normal de detecção é de 10 -4 - 10 -2M, apesar de uma minoria são dez vezes mais sensível. Tempo de resposta típica é entre um e cinco minutos, permitindo até 30 analisa a cada hora.

Os biossensores que envolvem H + libertação ou utilização exigem o uso de soluções tamponadas de forma muito fraca (isto é, <5 mm) em caso de uma alteração significativa no potencial é para ser determinada. A relação entre a alteração de pH e concentração de substrato é complexa, incluindo outros efeitos não lineares tais como a variação do pH e de tamponamento actividade da proteína. No entanto, muitas vezes, as condições podem ser encontradas, onde existe uma relação linear entre a aparente mudança no pH e a concentração de substrato. Um recente desenvolvimento de eléctrodos selectivos de iões é a produção de transistores selectivos de iões de efeito de campo ( ISFET s) e à sua utilização como biossensor transistores de efeito de campo com enzimas ligadas ( ENFET s, Figura 6.4 ). Membranas de enzimas são revestidos sobre os portões de íon-seletivo desses dispositivos eletrônicos, o biossensor de responder à mudança potencial elétrico através da saída atual. Assim, estes são

222

dispositivos potenciométricas embora diretamente produzir mudanças na corrente elétrica. A principal vantagem destes dispositivos é o seu tamanho extremamente pequeno (0,1 milímetros << 2 ), que permite o fabrico de produção em massa baratas usando tecnologia de circuito integrado. Como um exemplo, um sensível ao ureia FET (ENFET contendo urease ligado com um eléctrodo de referência que contém a glicina ligado) foi mostrado para mostrar apenas uma variação de 15% em resposta a ureia (0,05-10,0 mg ml -1 ) durante a sua vida activa dos um mês. Vários analitos podem ser determinadas por biossensores miniaturizados contendo matrizes de ISFETs e ENFETs. A sensibilidade dos FETs, no entanto, pode ser influenciada pela composição, força iónica e concentração das soluções analisadas.

Figura 6.4. Diagrama esquemático da secção ao longo da largura de um ENFET. As

dimensões reais da área ativa é de cerca de 500 de comprimento por 50 m m de

largura por 300 m de espessura. O corpo principal do biossensor é uma pastilha de silício do tipo p com duas áreas de silício tipo-n; a fonte negativo eo dreno positivo. O

chip é isolado por uma camada fina (0,1 m de espessura) de sílica (SiO 2 ), que constitui a porta do FET. Acima deste portão é uma camada fina igualmente de H + materiais sensíveis ao (por exemplo, óxido de tântalo), uma membrana selectiva de iões de protecção, o biocatalisador e a solução de analito, que é separada a partir de partes sensíveis do FET por um fotopolímero encapsulante poliimida inerte. Quando é aplicado um potencial entre os eléctrodos, uma corrente flui através dependente do potencial positivo detectado no portão ião-selectivos e a sua consequente atracção de electrões na camada de depleção do FET. Esta corrente (I) é comparada com a de um ISFET semelhante, mas não catalítica imerso na mesma solução. (Note-se que a corrente eléctrica é, por convenção, na direcção oposta ao fluxo de electrões).

Biossensores amperométricos

Biossensores amperométricos função pela produção de uma corrente quando um potencial é aplicado entre dois eléctrodos. Eles geralmente têm tempos de resposta, as dinâmicas e sensibilidades semelhantes aos biossensores potenciométricos. Os mais simples biossensores amperométricos de uso comum envolvem o eletrodo de oxigênio

223

Clark (Figura 6.5). Este é constituído por um cátodo de platina à qual o oxigénio é reduzido e um eléctrodo de referência de prata / cloreto de prata. Quando um potencial de -0,6 V em relação ao eléctrodo de Ag / AgCl é aplicado ao cátodo de platina, uma corrente proporcional à concentração de oxigénio é produzido. Normalmente, ambos os eléctrodos são banhadas numa solução de cloreto de potássio saturado e separada da solução de grandes quantidades por uma membrana de plástico permeável ao oxigénio (por exemplo, Teflon, politetrafluoroetileno). As seguintes reações ocorrer:

Ag ânodo 4Ag 0 + 4Cl - 4AgCl + 4e - [6.13]

Pt cátodo O 2 + 4H + + 4e - 2H 2 O [6.14]

A redução eficiente de oxigénio na superfície do cátodo faz com que a concentração de oxigénio não seja efectivamente zero. A taxa desta redução electroquímica, por conseguinte, depende da taxa de difusão de oxigénio a partir de uma solução a granel, que é dependente do gradiente de concentração e, portanto, a concentração de oxigénio em massa (ver, por exemplo, equação 3.13 ). É claro que uma pequena, mas significativa, a percentagem de oxigénio presente na massa é consumido por este processo; o eléctrodo de oxigénio medindo a velocidade de um processo que é afastado do equilíbrio, enquanto que os eléctrodos selectivos de iões são utilizados perto de condições de equilíbrio. Isto faz com que o eléctrodo de oxigénio a ser muito mais sensível a alterações na temperatura do que um sensor potenciométrico.Uma aplicação típica deste tipo simples de biossensor é a determinação das concentrações de glucose através da utilização de uma membrana de glucose-oxidase imobilizada. A reacção (ver esquema de reacção [1,1] ) resulta numa redução da concentração de oxigénio, uma vez que se difunde através da membrana biocatalítica para o cátodo, sendo esta detectada por uma redução da corrente entre os eléctrodos ( Figura 6.6 ). Outras oxidases podem ser utilizados de uma forma similar para a análise dos seus substratos (por exemplo, álcool oxidase, D- e L-amino ácido oxidase, colesterol-oxidase, galactose-oxidase, e urato oxidase)

224

Figura 6.5. Diagrama esquemático de um biossensor amperométrico simples. É aplicado um potencial entre o cátodo de platina central e o ânodo de prata anelar. Isto gera uma corrente (I) que é realizada entre os eléctrodos por meio de uma solução saturada de KCl. Este compartimento de eléctrodo é separado do biocatalisador (aqui mostrado glicose oxidase, GOD) por uma membrana de plástico fina, permeável apenas ao oxigénio. A solução de analito é separado do biocatalisador por uma outra membrana, permeável ao substrato (s) e produto (s). Este biossensor é normalmente cerca de 1 cm de diâmetro, mas foi reduzida para 0,25 mm de diâmetro, usando um cátodo de arame de Pt dentro de um ânodo de prata banhado agulha de aço e utilizando membranas revestidas por imersão.

225

Figura 6.6. A resposta de um biossensor amperométrico utilizando glicose-oxidase à presença de soluções de glicose. Entre analisa o biossensor é colocado em tampão oxigenado desprovido de glicose.As taxas constantes de consumo de oxigénio pode ser usado para gerar curvas de resposta padrão e determinar as amostras desconhecidas. O tempo necessário para que um ensaio pode ser reduzido consideravelmente se apenas a parte inicial transiente (curvo) da resposta necessita de ser usado, por meio de um modelo e de um software adequado. O tempo de wash-out, que iguala aproximadamente o tempo passa o eléctrodo na solução da amostra, é também reduzida significativamente por este processo.

Um método alternativo para a determinação da taxa de esta reacção é medir a produção de peróxido de hidrogénio directamente pela aplicação de um potencial de 0,68 V para o eléctrodo de platina, em relação ao eléctrodo de Ag / AgCl, e fazendo com que as reacções:

Pt ânodo H 2 O 2 S 2 + 2H + + 2e - [6,15]

Ag cátodo 2AgCl + 2e - 2Ag 0 + 2Cl - [6.16]

O principal problema com estes biossensores é a sua dependência da concentração de oxigénio dissolvido. Isto pode ser superada pelo uso de "mediadores" que transferem os electrões directamente para o eléctrodo ultrapassando a redução do co-substrato de oxigénio. De modo a ser aplicável em geral, estes mediadores deve possuir um número de propriedades úteis.

1. Eles devem reagir rapidamente com a forma reduzida da enzima.

226

2. Eles devem ser suficientemente solúvel, em ambas as formas oxidadas e reduzidas, para ser capaz de difundir-se rapidamente entre o local activo da enzima e a superfície do eléctrodo. Esta solubilidade deve, no entanto, não ser tão grande como para provocar uma perda significativa do mediador da microambiente do biossensor para a maior parte da solução. No entanto solúvel, o mediador deve geralmente ser não-tóxico.

3. A sobretensão para a regeneração do mediador oxidado, no eléctrodo, deve ser baixa e independente do pH.

4. A forma reduzida do mediador não deve reagir facilmente com o oxigénio.

Os ferrocenes representam uma família comumente usado de mediadores ( Figura 6.7a ). As reacções pode ser representada como se segue,

[6.17]

Os eléctrodos foram agora desenvolvidas que podem remover os electrões directamente das enzimas reduzidos, sem a necessidade de tais mediadores. Eles utilizam um revestimento de condutores eléctricos sais orgânicos, tais como N-methylphenazinium catião (NMP + , Figura 6.7b ) com anião radical tetracianoquinodimetano (TCNQ .- Figura 6.7c ). Muitos flavo-enzimas são fortemente absorvidos por esses condutores orgânicos devido à formação de ligações de sal, utilizando as cargas positivas e negativas alternativas, dentro do seu ambiente hidrofóbico. Tais eléctrodos de enzima pode ser preparada simplesmente por imersão do eléctrodo numa solução da enzima e que podem permanecer estável durante vários meses. Estes eléctrodos podem também ser utilizados para reacções envolvendo NAD (P)+ desidrogenases dependentes de como eles também permitir a oxidação electroquímica do que as formas reduzidas destes coenzimas. Os três tipos de biossensor amperométrico utilizando produto, mediador ou condutores orgânicos representam as três gerações no desenvolvimento de biossensores (Figura 6.8 ). A redução do potencial de oxidação, encontrado quando são utilizados os mediadores, reduz grandemente o problema da interferência de material estranho.

227

Figura 6.7. (a) ferroceno ( ferro 5-bis-ciclopentadienilo), o composto progenitor de um número de mediadores. (B) TMP + , a parte catiônica da realização de cristais orgânicos. (C) TCNQ .- , a parte aniônica de realização de cristais orgânicos. Ele é um radical formado pela oxidação de um electrão de ressonância TCNQH estabilizado- 2 .

228

Figura 6.8. biossensores amperométricos para as enzimas oxidase flavo ilustram as três gerações no desenvolvimento de um biosensor. O biocatalisador é mostrado esquematicamente pelo tracejado cruzado. (A) eléctrodo de primeira geração, utilizando o H 2 O 2 produzido pela reacção. (E 0 = 0,68 V). (B) eléctrodo de segunda geração utilizando um mediador (ferroceno) para transferir os electrões produzidos pela reacção, para o eléctrodo. (E 0 = 0,19 V). (C) eléctrodo de terceira geração utilizando directamente os electrões produzidos pela reacção. (E 0 = 0,10 V). Todos os potenciais de eléctrodo (E 0 ) são relativos ao Cl - AgCl, Ag / 0 eléctrodo. A reacção ocorre a seguir a enzima em todos os três biossensores:

Substrato (2H) + FAD-oxidase Produto + FADH 2 -oxidasefi [6.18]

229

Isto é seguido pelos processos:

(A) biocatalisador

FADH 2 -oxidase + O 2 -oxidase FAD + H 2 O 2 [6,19]

elétrodo

H 2 O 2 S 2 + 2H + + 2e - [6,20]

(B) biocatalisador

FADH 2 -oxidase + 2 Ferricinium + FAD-oxidase + 2 Ferroceno + 2H + [6,21]

elétrodo

2 Ferroceno 2 Ferricinium + + 2e - [6,22]

(C) biocatalisador / eletrodo

FADH 2 -oxidase FAD-oxidase + 2H + + 2e - [6.23]

A corrente (i) produzido por tais biossensores amperométricos está relacionada com a taxa de reacção (vA ) pela expressão:

i = nFAv A (6,6)

em que n representa o número de electrões transferidos, A é a área do eléctrodo, e F é de Faraday.Normalmente, a taxa de reacção é feita diffusionally controlada (ver equação de 3,27 ) por utilização de membranas externas. Nestas circunstâncias, a corrente eléctrica produzida é proporcional à concentração de analito e independente tanto da enzima e cinética electroquímicos.

Biossensores ópticos

Existem duas principais áreas de desenvolvimento em biossensores ópticos. Estes envolvem mudanças na absorção de luz que determinam entre os reagentes e produtos de reacção de, ou medir a saída de luz através de um processo luminescente. O ex-geralmente envolvem o amplamente estabelecida, se, em vez de baixo tecnologia, a utilização de tiras de teste colorimétrico. Estes são de uso único almofadas de celulose

230

descartáveis impregnados com enzimas e reagentes. O uso mais comum desta tecnologia é para monitoramento em sangue total no controle de diabetes. Neste caso, as tiras incluem glucose oxidase, peroxidase de rábano (EC 1.11.1.7) e um cromogénio (por exemplo, o -toluidina ou 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina). O peróxido de hidrogénio, produzido através da oxidação aeróbia de glucose (ver esquema de reacção [1,1] ), a oxidação do cromogénio fracamente colorido a um corante altamente colorido.

peroxidase de cromogénio (2H) + H 2 O 2 + corante 2H 2 O [6,24]

A avaliação das tiras tingidas é melhor alcançada pela utilização de medidores portáteis de reflectância, embora comparação visual directa com um quadro colorido é muitas vezes utilizado. Uma grande variedade de tiras de teste que envolvem outras enzimas estão disponíveis comercialmente no presente time.A biossensor mais promissora envolve luminescência utiliza luciferase do pirilampo ( Photinus -luciferin 4-mono-

oxigenase (ATP-hidrólise), 1.13.12.7 CE) para detectar a presença de bactérias em alimentos ou amostras clínicas. As bactérias são especificamente lisadas e o ATP libertado (ou menos proporcional ao número de bactérias presentes) feito reagir com D-luciferina e oxigénio numa reacção que produz luz amarela com elevado rendimento quântico.

luciferase ATP + D-luciferina + O 2 oxiluciferina + AMP + pirofosfato + CO 2 + luz (562

nm) [6.25]

A luz produzida pode ser detectado fotometricamente pelo uso de alta tensão, e caro, tubos fotomultiplicadores ou fotodiodos sistemas barata de baixa tensão. A sensibilidade dos sistemas contendo fotomultiplicador é, no presente, um pouco maiores (<10 4 células mL -1 , <10 -12 M de ATP) do que os detectores de fotões mais simples que utilizam fotodiodos. Firefly luciferase é uma enzima muito caro, só podem ser obtidas a partir das caudas dos pirilampos selvagens. Uso de luciferase imobilizada reduz grandemente o custo dessas análises.

Biossensores Piezo-elétrico

Cristais piezo-eléctricos (por exemplo, quartzo) vibrar sob a influência de um campo eléctrico. A frequência desta oscilação (f) depende da sua espessura e do corte, cada cristal que tem uma frequência ressonante característica. Esta frequência de ressonância altera como moléculas de adsorver ou desadsorver da superfície do cristal, obedecendo as relationshipes

(6,7)

231

onde f é a mudança na frequência de ressonância (Hz), m é a variação da massa de material adsorvido (g), K é uma constante para o cristal em particular depende de factores tais como a sua densidade e de corte, e A é o adsorvente área de superfície (cm 2 ). Para qualquer cristal piezo-eléctrico, a mudança de frequência é proporcional à massa de material de absorção, até cerca de uma mudança de 2%. Esta mudança de frequência é facilmente detectado por circuitos eletrônicos relativamente pouco sofisticadas. Um simples utilização de um tal transdutor é um biossensor de formaldeído, utilizando um revestimento de formaldeído desidrogenase imobilizada para um cristal de quartzo e sensíveis ao formaldeído gasoso. O principal inconveniente destes dispositivos é a interferência de humidade atmosférica e a dificuldade em utilizá-los para a determinação de material em solução. Eles são, no entanto, pouco dispendioso, pequeno e robusto, e é capaz de dar uma resposta rápida.

Imunossensores

Os biossensores podem ser utilizados em conjunto com os ensaios de imunoabsorção enzimática ( ELISA). Os princípios por trás da técnica de ELISA é mostrada na Figura 6.9 . ELISA é utilizada para detectar e amplificar uma reacção antigénio-anticorpo; a quantidade de antigénio ligado a enzima ligada ao anticorpo imobilizado a ser determinada pela concentração relativa do antigénio livre e conjugada e quantificada por a velocidade da reacção enzimática. Enzimas com números elevados de rotatividade são utilizados a fim de obter uma resposta rápida. A sensibilidade de tais ensaios pode ser ainda aumentada através da utilização de reacções catalisadas por enzimas, que dão uma maior resposta intrinsecamente; por exemplo, aquelas que dão origem a produtos altamente coloridas, fluorescentes ou bioluminescentes. Kits de ensaio usando esta técnica estão agora disponíveis para uma vasta gama de análises.

232

Figura 6.9. Princípios de uma ELISA de concorrência directa. (I) O anticorpo, específico para o antigénio de interesse é imobilizado sobre a superfície de um tubo. Uma mistura de uma quantidade conhecida de conjugado de antigénio-enzima mais desconhecido concentração de antigénio da amostra é colocado no tubo e deixada equilibrar. (Ii) Após um período adequado conjugado antígeno e antígeno-enzima será distribuído entre os estados ligados e gratuitos dependentes de suas concentrações relativas. (Iii) O material não ligado é lavado e eliminado. A quantidade de conjugado de antigénio-enzima que é ligado pode ser determinado pela velocidade da reacção enzimática subsequente.

Recentemente técnicas de ELISA foram combinados com biossensores, para formar imunossensores , a fim de aumentar o seu alcance, velocidade e sensibilidade. Uma configuração simples imunossensor é mostrado na Figura 6.10 (a) , em que o biossensor apenas substitui o tradicional sistema de detecção colorimétrica. No entanto imunossensores mais avançados estão a ser desenvolvidas ( figura 6.10 (b) ), que se baseiam na detecção directa do antigénio ligado à superfície revestida de anticorpo do biossensor.Piezoeléctrico e biossensores baseados em FET são particularmente adequados para tais aplicações.

233

Figura 6.10. Princípios de imunossensores. (A) (i) Um tubo é revestida com (imobilizada) antigénio. Um excesso de conjugado anticorpo-enzima específico é colocado no tubo e deixa-se ligar. (A) (ii) Depois de um período adequado de qualquer material não ligado é lavado. (A) (iii) A solução de antigénio analito é passado para dentro do tubo, a ligação e libertar algum do conjugado de anticorpo-enzima dependente da concentração do antigénio. A quantidade de conjugado anticorpo-enzima libertada é determinada pela resposta do biossensor. (B) (i) Um transdutor é revestida com (imobilizada) anticorpo, específico para o antigénio de interesse. O transdutor é imerso numa solução contendo uma mistura de uma quantidade conhecida de conjugado de antigénio-enzima mais desconhecido concentração de antigénio da amostra.(B) (ii) Após um período adequado conjugado antígeno e antígeno-enzima será distribuído entre os estados ligados e gratuitos dependentes de suas concentrações relativas. (B) (iii) O material não ligado é lavado e eliminado. A quantidade de conjugado de antigénio-enzima ligada é determinada directamente a partir do sinal transduzido.

234

Resumo e Bibliografia do Capítulo 6

a. Há um vasto mercado potencial para biossensores que está apenas começando a ser exploradas em excesso.

b. Biossensores geralmente são fáceis de operar, analisar ao longo de uma ampla gama de concentrações de analito úteis e obter resultados reprodutíveis.

c. A limitação de difusão de substrato (s) pode ser um trunfo para ser incentivados em design biosensor devido à conseqüente redução dos efeitos da substância pH, temperatura e inibidores sobre a resposta do biossensor.

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235

15. As reacções enzimáticas em sistemas bifásicos líquidos

16. Seria muitas vezes útil no caso de reacções enzimáticas catalisada pode ser realizada em solventes diferentes da água, como esta não é a forma ideal para a maioria das reacções orgânicas. Muitos reagentes (por exemplo, o oxigénio molecular, esteróides e lípidos) são mais solúveis em solventes orgânicos do que em água e alguns produtos podem ser muito lábeis num meio aquoso. Realizando reacções com tais substratos (por exemplo, a oxidação aeróbica de estrogénios catalisada por lacase fúngica) em meios não aquosos permite um aumento da actividade volumétrica muito a ser alcançado. A contaminação microbiana, por outro lado, é muito menos de um problema em tais solventes, e a consequente ausência de proteases microbianas podem conduzir a uma estabilização aparente no biocatalisador.

17. Algumas reacções de polimerização, por exemplo, a polimerização de fenóis catalisadas pela peroxidase, irá produzir um produto de peso molecular mais elevado, quando realizado em uma solução mais capaz de dissolver os produtos (isto é, os oligómeros) inicialmente formados. Sob condições fisiológicas normais, enzimas hidrolíticas catalisar a degradação de polímeros; ou seja, são hidrolases transferases normalmente transferem uma porção ao aceitante, água. A água está normalmente presente em um grande excesso molar em relação a outras moléculas aceitadoras potenciais, então não ocorre reacção de outro hidrólise. Além disso, a "concentração" normal da água (cerca de 55,5 M) é muito maior do que a sua típica K m (cerca de 50 mM) e a taxa de hidrólise não será afectado que a reacção prossegue. Ao reduzir grandemente a actividade de água nesses sistemas podem ser utilizados para transferir a outros receptores. Exemplos disso podem ser encontrados nas reacções de transesterificação de esterases e lipases, descrita mais detalhadamente mais adiante, e a formação (indesejável) da isomaltose a partir da glucose catalisada por glucoamilase.

18. Restrição da enzima para a fase aquosa imobiliza eficazmente a enzima e permite a sua separação simples, utilizando separadores de fase desenvolvidos para a indústria de processos químicos estabelecida, a partir de fase orgânica que contem o produto. O principal ativo destes sistemas, no entanto, é a sua capacidade de mudar os equilíbrios termodinâmicos das reações. Como foi referido noCapítulo 1 , as enzimas não alteram as constantes de equilíbrio (K eq ) de reações. Embora as alterações nas condições físicas (isto é, temperatura, pH e pressão) afectam a K eq de uma reacção, normalmente este efeito é relativamente ligeiro sobre a gama permitida pela estabilidade física dos biocatalisadores.Uso de um sistema aquoso-orgânico bifásico, no entanto, pode resultar em alterações substanciais na praticamente útil "aparente" K eq . O uso de enzimas dentro de solventes orgânicos, normalmente, resulta num sistema de duas fases, como todas as enzimas solúveis em água possuir uma quantidade significativa de água

236

fortemente ligada, mesmo quando num estado aparentemente seco. Isto é mostrado esquematicamente na Figura 7.1 .

19.

20. 21. Figura 7.1. Diagrama esquemático mostrando duas configurações para uma

enzima dentro de um solvente orgânico. (A) enzima quase-anidro em suspensão no solvente orgânico. A enzima (E) é rodeado por uma fina interfase consiste em água ou água com o apoio de imobilização. (B) enzima dissolvida num meio micelar invertida. As micelas são formadas por moléculas de surfactante com assistência a partir do co-agente tensioactivo (se presente). O agente tensioactivo (por exemplo, brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), cloreto de bis (2-etilhexil) sulfosuccinato de sódio (AOT), fosfatidilcolina, tetraethyleneglycoldodecylether) só é encontrado no limite interfase, enquanto que o co-agente tensioactivo não miscível com a água (por exemplo, butanol, hexanol, octanol), adicionou para variar as propriedades desta interfase, é geralmente menos polar e mais solúvel na fase contínua orgânica. Ambas as preparações (a) e (b) dar soluções opticamente transparentes.

A estabilização de enzimas em sistemas aquosos-orgânicos bifásicos

Deve tornar-se claro a partir da discussão posterior que pode haver uma vantagem substancial para ser adquirida com o uso de sistemas bifásicos em muitas reacções catalisadas por enzimas. Um fator importante deve primeiro ser tratadas; a estabilidade da enzima nestes sistemas. Deverá ser feita uma distinção entre os mais enzimas

237

hidrofílicos solúveis em água e as enzimas mais hidrofóbicos frequentemente associados com lipídios e membranas (por exemplo, lipases). A integridade activa e estabilidade de enzimas hidrófilas parece depender da presença de uma fina camada de água, apenas uma poucas moléculas de espessura, dentro do microambiente. Esta quantidade de água é minúsculo (entre 50 e 500 moléculas de água para cada molécula de enzima) e a enzima pode ser efetivamente operando em um estado quase anidro. Alguns lipases hidrofóbicos manter atividade, mesmo que menos moléculas de água permanecem; presumivelmente, apenas suficiente para estabilizar a conformação do local activo. O pH de tais piscinas minutos de água, que não contenham íons de hidrogênio livres, é impossível medir, ou controlar, diretamente. No entanto, verifica-se que a enzima "lembra-se" o pH da sua solução aquosa último e funciona como se a esse pH. Se a água ligado a enzima é retirado ou diluído pelo uso da mais solúvel em água, ou miscível, solventes orgânicos, em seguida, a enzima é inactivada normalmente. No entanto, sob condições em que isso não ocorrer, a quantidade limitada de água disponível, e a redução associado à atividade de água, reduz consideravelmente a taxa de thermoinactivation. Isto tem um efeito estabilizador sobre a maioria das enzimas; lipase pancreática suína, por exemplo, tem uma meia-vida superior a 12 horas a 100C em água 0,02% em tributirina, enquanto esta cai para 12 minutos a um teor de água de 0,8% e a inactivação é quase instantânea em 100% de água.Além disso, o ponto de congelação da água é reduzida, o que permite a utilização de enzimas particularmente lábil ao calor a temperaturas muito baixas. A redução da actividade da água tende a produzir uma molécula de enzima mais rígida que podem afectar quer a sua K m e V max . Em casos extremos, pode resultar numa mudança nas propriedades catalíticas. Lipase pancreática porcina demonstra este efeito. Quando usado em sistemas bifásicos de baixa actividade de água, já não catalisa reacções de transesterificação que envolvem os álcoois terciários volumosos.

O factor mais importante no equilíbrio entre a estabilização e inactivação, devido a fase orgânica, é a polaridade do solvente. Os solventes de polaridade mais baixa (ou seja, uma maior hidrofobicidade) são menos capazes de perturbar a estrutura das moléculas de água necessárias ligados firmemente. A melhor medida de polaridade é o logaritmo do coeficiente de partição (Log P ) do líquido orgânico entre n-octanol e água; o mais elevado o log P , o mais não-polar (hidrofóbico) é o solvente ( Tabela 7.1 ).

(7,1)

Tabela 7.1. Log P valores dos solventes orgânicos mais comumente usados.

Solvente Log P Solvente Log P

Butanona 0,3 1,1,1-tricloroetano 2.8

238

O acetato de etilo 0,7 Tetracloreto de carbono 2.8

Butanol 0,8 Éter dibutílico 2,9

Éter dietílico 0,8 Ciclohexano 3.1

O cloreto de metileno

1.4 Hexano 3,5

O acetato de butilo 1,7 Éter de petróleo (60-80) 3,5

Éter di-isopropílico 2.0 Éter de petróleo (80-100) 3.8

Benzeno 2.0 Éter dipentil 3.9

Clorofórmio 2.2 Heptano 4

Tetracloroetileno 2.3 Éter de petróleo (100-120) 4.3

Tolueno 2,7 Hexadecane 8,7

Log P valores aumentam em cerca de 0,52 para cada grupo metileno (-CH 2 -) adicionado numa série homóloga. Assim, a Log P de hexanol é o de butanol (0,8), mais 2 x 0,52 (ou seja, aproximadamente 1,8).

Parece haver uma correlação clara entre a atividade de biocatalisadores em sistemas de duas fases e a Log P ( Figura 7.2 ). A forma em S da relação sugere que as enzimas são geralmente inactivado por solventes com log P <2, mas são pouco afectadas por solventes com log P > 4. Existe alguma variação nos efeitos entre diferentes enzimas e solventes diferentes, o que torna a previsão actividade, no Registro de P gama de 2-4, impreciso. Esta gama inclui algumas das fases orgânicas mais utilizados (por exemplo, clorofórmio), que pode ser adequado para algumas aplicações, mas causam a inactivação prejudicial em outras. A solubilidade do reagente (s) e produto (s) pode reduzir consideravelmente a gama de log P que estão disponíveis para uma aplicação particular; muitas moléculas basicamente não polares que possuem algumas regiões polares estruturais que provocam a sua falta de solubilidade em solventes fortemente hidrofóbicos. A escolha da fase orgânica também vai depender de factores adicionais, tais como custo, facilidade de recuperação, e os riscos de fogo e de fumo efeitos inibidores específicos. A curva em forma de S pode ser deslocado para a esquerda através da imobilização da enzima num suporte altamente hidrofílica ( Figura 7.2 ). Uma forma simples de o conseguir consiste em impregnar um polímero hidrofílico frisado (por exemplo, Sephadex, agarose) com a enzima, seguida por suspensão das pérolas húmidas directamente na fase orgânica. Essas mudanças são muito importantes, pois aumentam muito a escolha de fase orgânico adequado. Tais grânulos impregnados têm as vantagens adicionais de que

a. protegem a enzima contida de desnaturação interfacial líquido-líquido a taxas mais elevadas de agitação;

b. eles permitem uma recuperação mais fácil do biocatalisador;

239

c. eles podem ser usados com baixo peso molecular (por exemplo, co-enzimas hidrófilas NAD (P) + ) com o auxílio de um coenzima processo de regeneração; a coenzima sendo efetivamente imobilizada dentro das piscinas aquosas; e

d. eles permitem o uso eficiente e contínuo de PBRs bifásicos, enquanto a fase orgânica continua em movimento saturado com água.

Figura 7.2. Diagrama esquemático que mostra a dependência da actividade de enzimas imobilizadas, em sistemas bifásicos, no Log P da fase orgânica. enzima livre; -------- enzima imobilizada num suporte fortemente hidrofílica.

Sistemas bifásicos pode ser ainda mais estabilizada pela utilização de água deuterada (D 2 O). Isto reduz a taxa de inactivação térmica, embora não causar um aumento na pK um dos grupos ionizantes s em cerca de 0,4 com as alterações associadas no pH-actividade e as relações de pH para a estabilidade. O custo mais elevado da água deuterada é compensado, em certa medida, pela pequena quantidade necessária nestes sistemas e a facilidade com que ele pode ser recuperado no fim de um processo catalítico.

Mesmo nos casos em que o solvente orgânico tem muito baixo Log P e é miscível, o efeito da perda esperada da actividade enzimática pode ser compensado por alterações no valor da constante de equilíbrio. Assim, tem sido proposto que a isomerase de glicose ser usado em solução aquosa de etanol para produzir xarope de milho. A fracção de equilíbrio de frutose pode ser aumentado em cerca de 10% a 55% a 30 ° C em 80% v / v de etanol. Isto é economicamente válida, embora a actividade enzimática diminui em cerca de 10% em relação ao que, na ausência de etanol.

240

Equilíbrio em sistemas bifásicos aquosos-orgânicos

Grande parte da teoria que define o efeito de sistemas bifásicos sobre os equilíbrios aparentes foi delineado por Karel Martinek e seus colegas de trabalho em Lomonosov Moscow State University.Considere o esquema de reacção simples, que envolve o equilíbrio entre o reagente (A) e do produto (B) com K w representa a constante de equilíbrio (K eq ) em água:

[7.1]

Se esta reacção é realizada num sistema bifásico que consiste de uma mistura de uma solução aquosa e um solvente orgânico, ambos A e B ser submetida a partição entre os dois solventes com coeficientes de partição (P, A e P B ) e um equilíbrio separado (K org ) será estabelecido entre A e B na fase orgânica.

[7.2]

onde:

(7,2)

(7.3)

(7,4)

(7,5)

241

Por causa da natureza cíclica destes equilíbrios apenas três destes parâmetros variáveis são '' independentes (isto é, K org depende K w , P A e P B ). Deve ser notado a partir da seguinte discussão que K org não desempenha qualquer outra parte, embora derivações semelhantes poderiam ser feitas envolvendo K org , P A e P B ao invés de K w , P A e P B . A constante de equilíbrio aparente (K bifásica ), este sistema pode ser definido como

(7,6)

onde os subscritos t, org e w se referem à solução total, as fases orgânicas e água, respectivamente. Se V representa os volumes envolvidos, segue-se que

(7,7)

(7,8)

(7,9)

Substituindo a partir das equações 7.7 e 7.8 na equação 7.6 ,

(7,10)

(7,11)

Substituindo os coeficientes de partição a partir de equações 7.3 e 7.4 dá a relação simplificada,

(7.12)

isto é, é a razão entre os volumes das fases orgânicas e água.

(7,13)

242

A constante de equilíbrio aparente (K bifásica ) varia de acordo com os volumes relativos das fases aquosas e orgânicas; aumentar quando o substrato é particionado mais eficientemente fora da fase orgânica e a fase aquosa em relação ao comportamento do produto (isto é, P Um <P B ), e diminuindo quando ocorre o inverso ( Figura 7.3A ). Se existem diferenças suficientes nos coeficientes de partição e ambos substrato e produto são relativamente não-polares, então mudanças substanciais nos equilíbrios ocorrer mesmo em conteúdos relativos de água elevados. Pode ser conseguido um aumento substancial na constante de equilíbrio aparente, quando tanto o substrato e produto têm coeficientes de partição menor que a unidade, quando o rácio entre os coeficientes de

partição é adequado ( Figura 7.3B ).Claramente, se é muito pequena K bifásica tende

a K w , a constante de equilíbrio em solução aquosa.No entanto, se for suficientemente grande, a equação 7,12 simplifica a

(7,14)

Portanto, a partir das equações substituindo 7,2-7,5 ,

(7,15)

Portanto K bifásica tende a K org , a constante de equilíbrio da reacção no líquido orgânico puro.

243

Figura 7.3. A variação nas constantes de equilíbrio aparentes de uma reacção de um

substrato de um produto (A B) com o componente composição relativa de um sistema aquoso-orgânico bifásico. (A) mostra o efeito da razão dos coeficientes de partição P, B / P A . As curvas foram geradas usando equação 7.12 e os seguintes valores para os coeficientes de partição, de cima para baixo; P Um = 0,2, P B = 20; PUm = 0,2, P B = 2; P Um = 0,2, P B = 0,6; P Um = 0,6, P B = 0,2; P A = 2, P B = 0,2; P A = 20, P B = 0,2. (B) mostra o efeito da polaridade de A e B, mantendo-se a razão entre os coeficientes de partição constantes (P B / P A = 100). Os seguintes valores para os coeficientes de partição foram usadas, de cima para baixo;P B = 100, P B = 10, P B = 1, P B = 0,1, P B = 0,01, P B = 0,001, P B = 0,0001.

Muitas reacções são bimolecular, e estes são influenciadas de uma forma mais complexa, o sistema bifásico. Os processos podem ser representados de um modo semelhante ao utilizado para reacções monomolecular;

[7.3]

244

Usando um raciocínio semelhante ao descrito acima, a expressão a seguir podem ser obtidos para as Constantes de equilíbrio aparentes

(7,16)

Como no caso de reações monomolecular, quando o conteúdo de água relativo é muito

baixo (isto é, é elevada) a constante de equilíbrio aparente tende a K org . No

entanto, a equação ( 7.16 ) é quadrática em termos de e em valores intermediários podem produzir um valor máximo ou mínimo para a constante de equilíbrio aparente que é várias décadas diferente tanto K w K ou org (ou seja, a constante de equilíbrio aparente pode ser maior do que a constante de equilíbrio da mesma reacção em qualquer das fases puras, ver figura 7.4 ). Sob algumas circunstâncias, isto pode permitir que a produtividade no sistema de reacção bifásico para ser muito maior do que a atingível quer em fase pura.

Figura 7.4. A variação nas constantes de equilíbrio aparentes de um-dois substratos de

reacção de duas produto (A + B + C D) com a composição de componente relativa de um sistema aquoso-orgânico bifásico. Em todos os casos os coeficientes de partição são P A = 1, P B = 1 e P C = 100. Os seguintes valores para o coeficiente de partição (P D ) têm sido utilizados, de cima para baixo; 1, 0,1, 0,01, 0,001 e 0,0001.

245

Um caso especial e relevante do esquema de reacção biomolecular é, onde um dos reagentes é a água (por exemplo, utilização das hidrolases). Estas reações podem ser escrito de uma forma correspondente ao esquema de reacção [7,3] .

[7.4]

A direcção normal para a reacção em solução aquosa é o processo hidrolítico da direita para a esquerda.No entanto, a constante de equilíbrio aparente pode ser deslocada em soluções bifásicas, conforme descrito acima, e permitir que a hidrolase de agir de forma sintética (isto é, da esquerda para a direita no esquema de reacção [7,4] ), em vez de hidrolítica, forma. Tais reacções prolongar significativamente os processos disponíveis para o técnico da enzima, como reacções de síntese são geralmente muito mais difícil de conseguir através de química orgânica clássica de reacções hidrolíticas, especialmente quando é necessária uma regioespecificidade como, em seguida, existe uma variedade de grupos reactivos nos substratos . Dois factores que afectam o rendimento do produto (C), em tais reacções: (1) a mudança na constante de equilíbrio aparente (K bifásica ); e (2) a concentração de água ([(H 2 O) t ]), como um dos reagentes participantes. [(H 2 O) t ] pode ser obtido a partir do balanço de material,

(7,17)

onde [(H 2 O) w ] é a concentração molar de água pura (= 1000/18 = 55,5 M). Substituindo P w para [(H 2O) org] / [(H 2 O) w],

(7,18)

(7,19)

Substituindo K bifásica a partir da equação 7.16 (com P D conjunto de P igual w ) e

rearranjando, os termos (1 + P w ) cancelar a dar

(7,20)

246

Isto representa uma relação bastante complexo, mas alguns podem ser feitas generalizações. Se o produto (C) é menos polar do que qualquer dos reagentes (A ou B), em seguida, o rendimento geralmente aumenta com a concentração relativa da fase

orgânica ( ) para atingir um patamar. Se ocorre o inverso, então haverá um planalto

a baixo rendimento e elevada em diagrama -yield. Ambos valores mínimos e máximos podem ocorrer, dependente dos parâmetros. A Figura 7.5 mostra a variação da constante de equilíbrio aparente e o rendimento para a síntese enzimática de um éster a partir do seu ácido e álcool num sistema bifásico. A partir disto, pode ser visto que a utilização de um sistema bifásico pode aumentar o rendimento de tais reacções de zero a cerca de 100%. A fim de atingir conversões elevadas, a água produzida deve ser removido do sistema de duas fases. Se não for removido, existe uma queda

contínua em que reduz a extensão do equilíbrio favorável. Não há maneiras simples em que esta água pode ser removida, mas reactores que permitem a adição constante de catalisador fresco e a fase orgânica reduzir o tamanho do problema.

Figura 7.5. A variação na constante de equilíbrio aparente e percentagem de

rendimento de uma reacção hidrolítica reversa (A + B + C H 2 O) com o componente composição relativa de um sistema aquoso-orgânico bifásico. A reacção é retratado a síntese de N-benzoil-L-fenilalanina, a partir de N-benzoil-L-fenilalanina e

álcool etílico, catalisada por quimotripsina num sistema bifásico clorofórmio-água (pH 7).aparente constante de equilíbrio; ------- % de rendimento (enredo semi-logarítmica). As curvas foram calculadas assumindo K w = 0,002, P A = 0,11 (N-benzoil-L-fenilalanina, a pH 7), P B = 0,01 (álcool etílico), P C = éster etílico de 4100 (N-benzoil-L-fenilalanina ), e uma mistura equimolar dos reagentes.

247

A utilização de sistemas de solventes bifásicos também afecta a ionização dos grupos ácidos e básicos.Considere a ionização de um ácido HA, onde apenas a forma não ionizada é solúvel na fase orgânica e as espécies iónicas são apenas solúvel na fase aquosa,

[ 7,5]

(7,21)

(7,22)

A concentração de iões de hidrogénio, tal como determinado, é uma característica da fase aquosa,

(7,23)

A consideração de balanços de massa material para um - e HA dá

(7,24)

(7,25)

Substituindo na equação para pH 7,22 na equação 7.23 dá

(7,26)

Substituindo a partir das equações 7.24 e 7.25 isso simplifica a dar

(7,27)

Da mesma forma, para a protonação de uma base

248

[7,6]

(7,28)

A avaliação qualitativa dos esquemas de reacção [ 7.5 ] e [ 7.6] mostra que o aumento do coeficiente de partição para o ácido ou base sem carga vai puxar a reacção de distância a partir da formação das espécies ionizadas. Segue-se a partir das equações 7,27 e 7,28 que o pKa aparente um s de ácidos aumentam em sistemas bifásicos enquanto aqueles de bases diminuir. Estas alterações podem ser acrescido de várias unidades de pH, dependentes dos coeficientes de partição e a fracção relativa de solvente orgânico presente. Os desvios em pK um estão em adição a qualquer aumento no pK uma função da constante dieléctrica inferior da fase aquosa, como descrito no Capítulo 1 . Isto é susceptível de ser particularmente relevante em condições quase

anidras (ou seja, quando é elevada) que tendem a "congelar" os íons de hidrogênio diminuindo sua atividade. A utilidade da mudança no pKa um pode ser

demonstrado utilizando a síntese de éster catalisada por quimotripsina como um exemplo.

[7,7]

onde RCOOH e RCOO - representam as formas ionizadas e un ionizadas de N-benzoil-L-fenilalanina, RCOOR 'representa N-benzoil-L-fenilalanina e acetato de alcohol.Although R'OH representa a reacção não-iónico numa solução aquosa solução é uniformemente equilibrado (K não iónico, w = 7), a reacção global prossegue para a esquerda, em água a pH neutro, devido à força exercida por ionização do ácido

(pKa um = 3,4). Na solução de clorofórmio-água bifásico ( = 20, P HA = 100), K uma turnos por três décadas para dar um pK uma perto de 7. Isto, juntamente com uma mudança na constante de equilíbrio devido aos efeitos de partição, delineado anterior,

249

produz uma mudança geral na constante de equilíbrio de cerca de cinco décadas ao pH óptimo (7,5) da enzima ( Figura 7.6 ). O uso do sistema bifásico permite que as reacções sejam realizadas a um pH que é termodinamicamente favorável tanto para a direcção de reacção necessária e no ideal para a eficiência catalítica da enzima.

Figura 7.6. dependência do pH da constante de equilíbrio aparente para a síntese de N-benzoil-L-fenilalanina, como determinado pelo esquema de reacção [7,7] . reacção em

apenas solução aquosa (isto é, = 0); - --------- reacção num sistema bifásico água-

clorofórmio ( = 20). O deslocamento para cima é devido à partição mais significativa do éster para a fase orgânica em relação aos reagentes, enquanto que a mudança na dependência do pH para um pH mais elevado é devido à mudança no pKa aparente umdo ácido.

Cinética de enzimas em sistemas aquosos-orgânicos bifásicos

Embora a posição de equilíbrio das reacções pode ser deslocada em sistemas bifásicos, este não tem qualquer consequência prática a menos que a reacção ocorre realmente. A enzima deve ser capaz de converter os reagentes em produtos. Para este proceder, mesmo na presença de enzimas totalmente activas, deve haver algum reagente presente no microambiente circundante aquoso a enzima. Os reagentes podem ter relativamente baixas solubilidades aquosas, nas condições normais

250

associados com tais processos bifásicos. A fase aquosa permanece não agitada eficazmente, mesmo quando a fase orgânica é bem agitada, durante a reacção de modo

a que a espessura da "camada não agitada" ( ) é igual à espessura da camada

aquosa em torno do enzima. Onde é grande, a taxa de reacção é susceptível de ser controlado pela passagem dos reagentes através desta camada aquosa, como os gradientes de concentração será muito raso devido às baixas solubilidades dos

reagentes em água. No entanto, é frequentemente muito fina, no entanto, especialmente onde a enzima é muito solúvel, fazendo com que as reacções de ser eficazmente diffusionally controlada pela passagem dos reagentes da fase orgânica mais concentrada através da fronteira interfase para muito baixas concentrações dentro do microambiente do a enzima. Claramente, a espessura da camada aquosa em torno de uma enzima imobilizada será de grande importância na determinação do grau de resistência à difusão envolvido, e, consequentemente, a redução da taxa de reacção. Tal como com todas as enzimas imobilizadas, a área de superfície volumétrica (A / V) é um parâmetro importante que regula o fluxo global do substrato à superfície biocatalítica, a eficácia da enzima e a produtividade. Considerando que, a reacções envolvendo uma fase líquida única nesta área é a área de superfície apresentada pelo exterior das partículas para o seio do líquido, em sistemas líquidos bifásicos mais prático é a área interfacial entre as duas fases líquidas que são relevantes. Sob condições normais de funcionamento desta área interfacial irá depender do volume da gotícula aquoso circundante e encerrando o biocatalisador enzimática. À medida que o volume relativo da fase orgânica aumenta a área de superfície volumétrica diminui, reduzindo assim a produtividade volumétrica máxima. Isto será particularmente

importante quando precisa de ser muito elevado, a fim de deslocar o equilíbrio de reacção. É evidente que isto irá reduzir a taxa de reacção devido à redução na quantidade de enzima que pode estar presente, devido à sua água associado, e a redução associada da área interfacial. Quando a reacção catalisada gera água, este não deve, geralmente, ser permitida a acumulação, uma vez que não só tem um efeito prejudicial sobre a constante de equilíbrio mas também irá diminuir a taxa de reacção.

Existem algumas regras que permitem a optimização do sistema de duas fases para as reacções catalisadas por enzimas. Eles dependem do conceito de Log P sendo estendido para cobrir os substratos, produtos e interfase (ver Figura 7.1 ).

1. A diferença entre os Log P Os valores do substrato (s) e a interfase deve ser tão pequena quanto possível, enquanto que a do substrato (s) deve ser muito menor do que a da fase orgânica. Estas condições estimulam altas concentrações de substrato (s) dentro da interfase e, portanto, a transferência do substrato a partir da fase orgânica para a fase aquosa.

2. A diferença entre os Log P Os valores de produto (s) e a fase orgânica deve ser tão pequena quanto possível, enquanto que a do produto (s) deve ser muito maior do que a da interfase. Estas condições de favorecer a transferência do produto a partir da fase aquosa através da interfase para a fase orgânica, depois da reacção.

251

O log P da interfase podem ser variadas independentemente da fase orgânica por escolha apropriada de agentes tensioactivos e co-tensioactivos. A estrutura precisa deste interfase podem ser muito mais complexos do que descrito na figura 7.1 . Em particular, quando há um excesso de água e agente tensioactivo presente, o surfactante pode formar múltiplas membranas concêntricas, que consiste em bicamadas de agentes tensioactivos, em torno do núcleo aquoso. Este apresenta uma outra razão para a remoção da água produzida pela utilização de hidrolases (usado como sintetases) em sistemas bifásicos.O controle sobre a quantidade de água em torno do enzima é muitas vezes possível, por meio de crivos moleculares (por exemplo, silicato de potássio e alumínio), que absorvem água. A remoção de água dissolvida na fase orgânica pode ser facilmente alcançado pelo seu uso e isto conduz à depleção de água das piscinas biocatalíticas aquosas por sua partição. Se a fase orgânica tem um ponto de ebulição elevado a remoção de água pode ser conseguido simplesmente por meio de destilação no vácuo; por exemplo, na esterificação de ácidos gordos e álcoois gordos catalisada por lipase e utilizados no fabrico de cera.

A utilização de sistemas aquosos em duas fases

Sistemas aquosa 2-de fase (ver Capítulo 2 ) oferecem a oportunidade de mudar o equilíbrio da reacção no sentido da formação de produto, garantindo que partição da enzima e do substrato em uma fase, enquanto o produto é colocado, e pode ser removido a partir de, o outro. A teoria desenvolvida (anterior) para sistemas bifásicos aquosos / orgânicos é igualmente aplicável a estes sistemas. Um exemplo de um tal bioconversão extractiva é um método para a conversão do amido em glucose usando

bacteriana a-amilase e glucoamilase. Partições substrato de amido quase inteiramente para a mais hidrofílica, a fase inferior, rica em dextrano de um sistema que compreende 3% de polietilenoglicol (PEG 20000) e 5% de dextrano em bruto não fraccionado. As enzimas também em grande parte para dividir a fase de fundo, mas a glucose, produzido pela hidrólise, se distribui mais uniformemente entre as fases. Uma pequena proporção da glucoamilase entra na fase superior e irá converter qualquer oligossacárido entrar fase que a glicose. As concentrações de até 140 gl -1 de glicose pode ser alcançado na fase superior.

Este sistema apresenta algumas das vantagens de um processo enzima imobilizada sem algumas das desvantagens. As enzimas são em grande parte retidas e estão estabilizadas pela presença dos polímeros catálise ainda está em solução homogénea (na fase), de modo não existem limitações de difusão a transferência de massa. Desvantagens incluem a necessidade de separar o produto a partir dos polímeros da fase superior e perda gradual de enzimas que entram na fase superior. Perda de enzima pode ser reduzida, sem introduzir limitações de difusão, ligando-os aos polímeros hidrófilos, de modo a formar complexos solúveis.

252

Exemplos práticos da utilização de enzimas 'ao contrário'

Tem sido desde há muito conhecido que se proteases são fornecidos com elevadas concentrações de proteínas solúveis, péptidos ou aminoácidos, polímeros ( plasteins )

são produzidos com aparentemente aleatório, se em vez hidrofóbico, estruturas. Esta reacção tem sido utilizada, por exemplo, para produzir branda-degustação, plasteins incolores a partir de cores vivas, de sabor desagradável, a biomassa de algas e para a introdução de metionina adicional na proteína de soja de baixa qualidade. No entanto, em geral, o uso não-específico de proteases na síntese de novas estruturas não tem encontrado uso comercial. No entanto, as proteases têm vindo a ser usado como alternativas aos métodos químicos para a síntese de peptídeos com uma estrutura conhecida e predeterminada porque a sua especificidade permite que as reacções para proceder estereoespecificamente e sem protecção dispendiosas de cadeias laterais.

Um método para a síntese do adoçante de alta intensidade aspartame exemplifica o poder de proteases (neste caso, termolisina). O aspartame é o dipéptido de ácido L-

aspártico com o éster metílico de L-fenilalanina ( éster fenilalanil-O-metil-L-aspartil-

L-). A síntese química de aspartame requer protecção tanto a grupo carboxilo e

a grupo a-amino do ácido L-aspártico. Mesmo assim, ela produz aspartame em

baixo rendimento e alto custo. Se a grupo carboxilo não protegido é, uma economia

de custos mas é alcançada cerca de 30% do isómero é formado e, subsequentemente, para ser removido. Quando termolisina é utilizado para catalisar a produção de aspartame a regioespecificidade da enzima elimina a necessidade de

proteger este grupo carboxilo, mas a grupo amino ainda deve ser protegida (normalmente por meio de reacção com cloroformato de benzilo para formar o derivado benziloxicarbonilo, isto é, BOC ácido L-aspártico) para impedir a síntese de ácido poli-L-aspártico. Aminoácidos racémicos mais económicas, também pode ser usado apenas como o isómero desejado de aspartame vai ser formado.

Se as quantidades estequiométricas de ácido BOC-L-aspártico e éster metílico de L-fenilalanina são feitos reagir na presença de termolisina, uma mistura de reacção de equilíbrio é produzido dando relativamente pequenos rendimentos de BOC-aspartame. No entanto, se dois equivalentes do éster metílico de fenilalanina são usados, uma adição insolúvel formas complexas com elevado rendimento em concentrações acima de 1 M. A perda de produto a partir da fase líquida devido a esta precipitação aumenta grandemente o rendimento global do processo. Mais tarde, o BOC-aspartamo pode ser libertada a partir deste aducto simplesmente por alteração do pH. A estereoespecificidade da termolisina determina que apenas o L-isómero de fenilalanina reage, mas o produto de adição é formado igualmente bem tanto a D- e L-isómeros. Este estado de coisas fortuita permite o uso de fenilalanina racémica, o isómero-L ser convertido para o derivado de aspartamo e o D-isómero de formação do complexo insolúvel deslocando o equilíbrio para a formação do produto. Éster etílico de

253

D-fenilalanina libertado do complexo de adição pode ser isomerizada enzimaticamente para reformar a mistura racémica. O BOC-aspartamo pode ser desprotegido por meio de um simples processo de hidrogenação para formar o aspartame.

[7,8]

Termolisina imobilizada não pode ser usado neste processo, uma vez que foi encontrada para co-precipitar com o aducto insolúvel. No entanto, este pode ser contornada pela sua utilização dentro de um sistema bifásico líquido / líquido.

Tabela 7.2 A especificidade de algumas proteases industriais específicas, envolvendo intermediários acilo.

Enzima Locais de clivagem preferido um

(N-terminal , C-terminal)

Bromelina Lys Z; -Arg Z; -Phe Z; -Tyr Z

Chymotrypsin -Trp Z; -Tyr Z; -Phe Z; Leu Z

Papaína -Phe-AA Z; -Val-AA Z; -Leu-AA Z; -Ile-

AA Z

Pepsina -Phe (Ou Tyr, Leu) Trp (ou Phe, Tyr) -

Termolisina -AA Leu; -AA Phe-; AA Ile-; -AA Val-

Tripsina -Arg Z; -Lys Z

um AA representa qualquer resíduo aminoácido e o símbolo Z representa amino ácido

resíduos, ésteres ou amidas. Os locais de clivagem ( ) são os preferidos pela enzima pura; preparações cruas podem ter especificidades muito mais amplas.

254

A síntese do aspartame é um exemplo muito simples de como proteases podem ser utilizados na síntese de péptidos. A maioria das proteases de especificidade mostrar nos seus sítios de clivagem ( Tabela 7.2 ) e pode ser utilizado para sintetizar ligações peptídicas específicas. Os factores que favorecem a síntese de péptidos são correcta escolha do pH, a selecção de resíduos de protecção para os grupos amino e carboxilo que favoreçam a precipitação do produto e a utilização de sistemas bifásicos líquido / líquido, as quais actuam através do controlo do equilíbrio da reacção. Uma estratégia alternativa é cineticamente síntese em que a taxa de síntese do produto péptido (k controlada P ) é elevada em comparação com a taxa de hidrólise de péptido (k H ). Isto pode ser assegurado através de um aminoácido ou peptídeo, que é um nucleófilo mais poderosa do que a água em aceitar uma unidade peptídica de uma enzima-péptido intermédio. Esta reacção pode ser controlado cineticamente representado como

[7,9]

em que X representa um álcool, amina ou outro grupo de activação, isto é, o reagente é um éster, amida (péptido) ou ácido carboxílico activado. A taxa relativa de formação de péptidos em comparação com a hidrólise depende da relação k P / k H , a razão das K m para valores de água e de amina e as concentrações relativas da amina (não protonado) e água (ver equação 1,91 ). Assim, se for caso disso, o rendimento da reacção pode ser melhorado através da redução da actividade da água. Verificou-se que os rendimentos podem ser aumentadas por redução da temperatura para 4 ° C, talvez por um efeito desproporcionado nas K m valores. As concentrações de amina e de enzima deve ser tão alta quanto possível para tais reacções controladas cineticamente e apenas aquelas enzimas que utilizam a intermediários enzima-péptido covalentemente ligados podem ser utilizadas (ver Tabela 7.2 ). Além disso, a reacção é parada bem antes do equilíbrio ser alcançado como, sob tal controlo termodinâmico, o péptido produto será convertido de volta embora a enzima intermediário para o ácido carboxílico, um processo feito quase irreversível por sua ionização em soluções de pH acima do seu pKa um , como mostrado no esquema de reacção [7,10] .

255

[7.10]

Os péptidos podem ser alongado ou através da adição de resíduos de aminoácidos individuais ou por condensação de fragmentos de péptidos. O tamanho do péptido necessário que o produto final pode determinar o tipo de síntese utilizado; condensação de fragmentos pode ser realizada em processos cineticamente controladas enquanto alongamento passo a passo é melhor conseguido usando bifásica sólido / líquido (isto é, a precipitação) ou líquido / líquido processos controladas termodinamicamente.

Em geral, algumas proteases são necessários para tais fins sintéticos. Como eles são bastante caros, especialmente em altas as actividades necessárias para o controlo cinética, que pode ser imobilizado de modo a permitir a sua utilização repetida. Muitos exemplos de síntese de peptídeos enzimática podem ser instalados. A conversão de insulina porcina a insulina humana requer a substituição da alanina no terminal C

( 30) por um resíduo treonina. Isto pode ser conseguido através de um único passo de transpeptidação catalisada pela tripsina usando uma treonina protegido por carboxilo numa solução aquosa com um co-solvente orgânico. O grupo de protecção pode ser simplesmente removido mais tarde, por uma hidrólise suave e o produto foi purificado por cromatografia em gel de sílica (ver esquema [7,11] ).

256

[7.11]

As glicosidases utilizadas em reacções sintéticas

Este é um assunto relativamente negligenciado, provavelmente porque polissacáridos podem ser facilmente obtidos a partir de fontes vegetais ou microbianas, porque a função de polissacárido não é tão especificamente relacionado com a sua estrutura, e porque a teoria que descreve o significado funcional dos oligossacáridos ainda está a ser desenvolvido. Como existe uma abundância de conhecimento sobre glicosidases e suas especificidades, não há nenhuma razão fundamental para que eles não devem ser utilizados para sintetizar oligossacáridos. Existem poucos exemplos na literatura de oligossacáridos a ser construídos utilizando enzimas tais como dextrano (EC 2.4.1.5), levanossacarase (EC 2.4.1.10), cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19)

257

e -galactosidase (EC 3.2.1.23) a construir a glicose, frutose ou resíduos de galactose em receptores adequados. Frutosiltransferases (por exemplo inulosucrase, EC 2.4.1.9) têm sido utilizadas para sintetizar compostos, tais como sacarose-6-acetato,

xylosucrose ( -D-fructofuranosyl- (2,1) - -D-xilopiranosido) e o baixo adoçante

cariogénico, "Neosugar", que consiste de uma mistura de glucose, sacarose e -2,1 frutanos ligados com resíduos de glicose terminais não redutores (composição típica antes refinamento cromatográfica: 2% de frutose, 26% de glucose, 11% de sacarose,

30% de 1- cestose ( -D-fructofuranosyl- (2,1) - -D-fructofuranosyl- (2,1) --D-

glucopiranose), 25% de nistose ( -D-fructofuranosyl- (2,1) - -D-fructofuranosyl- (2,1)

- -D-fructofuranosyl- (2,1) - -D- glucopiranose) e oligossacarídeos 6% mais elevadas).

sacarose + glicose-6-acetato de sacarose-6-acetato de glucose + [7,12]

sacarose xilose + + glicose xylosucrose [7,13]

sacarose + sacarose + 1-cestose glicose [7,14]

1-cestose + sacarose + nistose glicose [7,15]

Como mostrado no esquema de reacção [7,16] , dextrano pode ser utilizado para

produzir dextrano (um polímero de -1,6 resíduos de glucose ligados) a partir de sacarose. O dextrano é usado nos meios cromatográficos em gel, tais como Sephadex, nos sistemas de duas fases aquosas já descritas, e como um extensor de plasma sanguíneo. Por qualquer destas utilizações é desejável ter células restantes no dextrano de modo que o dextrano, produzido extracelularmente por Leuconostoc mesenteroides, é purificado antes da sua utilização. O tamanho das moléculas de

dextrano produzidos pode ser controlada através da inclusão de pequenas concentrações de açúcares tais como a maltose, que competem com sacarose como aceitadores para resíduos de glicose a partir das moléculas de dador de sacarose.

sacarose + dextrano (L n ) frutose + dextrano (G n + 1 ) [7,16]

Síntese de oligossacáridos termodinamicamente controlada, catalisada por glicosidases, é possível através do uso de elevadas concentrações de substrato e uma "armadilha

molecular" para remover os produtos. Por exemplo, -galactosidase pode ser utilizada

para sintetizar a N-acetillactosamina ( -D-galactopiranosil- (1-6) -2-acetamido-2-desoxi-D-glucose), utilizando uma coluna de celite para remover o carbono, como formado.

258

[7.17]

Não parece ter havido tentativa sistemática para construir hetero-oligossacarídeos em um movimento gradual ainda reações termodinamicamente ou cineticamente controlada poderia ser usado apenas como na síntese de peptídeos.

A interesterificação de lípidos

Não há oportunidade ou necessidade estabelecido para construir polímeros ou oligómeros, recorrendo a lipases ou esterases ainda é possível e comercialmente vantajoso usar estas enzimas como transesterificações em transferases (permuta grupo carboxilo entre ésteres), acidolyses (troca grupo carboxilo entre os ésteres e ácidos carboxílicos ) e de alcoólise (permuta entre ésteres de álcool e álcoois). Certos triglicérides, manteiga de cacau é o exemplo notável, tem alto valor devido às suas propriedades físicas e raridade comparativa. Há uma força comercial, portanto, para financiar as rotas para a produção de triglicérides alto valor de matérias-primas mais baratas mais abundantes,. Isso pode ser feito usando lipases (por exemplo ex.Rhizopus ou ex. Mucor Miehei ) atuando como transacylases.

[7.18]

Esta reacção acidólise pode ser utilizado para aumentar o valor do óleo de colza através da troca de ácido linoleico para os resíduos de ácido linolénico e o aumento do valor do óleo de palma e óleo de girassol, aumentando o seu teor de resíduos de ácido oleico. A manteiga de cacau é uma gordura relativamente caro, utilizado em produtos de confeitaria, por causa do seu ponto de fusão bem definido entre a temperatura ambiente e a temperatura corporal; de chocolate, literalmente derrete na boca. Isto é devido à relativamente pequena variação na estrutura dos constituintes triglicéridos; 80% têm o ácido palmítico ou ácido esteárico nas posições 1 e 3 com ácido oleico na posição

259

central 2. Para a produção de substituto de manteiga de cacau a partir de óleo de palma, um processo que aumenta o valor do produto três vezes, a acidólise utiliza ácido esteárico (isto é, R 4 representa C 17 H 35 ) em hexano contendo apenas água suficiente para activar a lipase. O azeite de oliva pode ser igualmente melhorada através da troca de seus resíduos de ácido 1,3-oleico para grupos palmitílico. Os produtos podem ser recuperados por recristalização a partir de acetona aquosa. Estas reacções também podem ser utilizados para a resolução de misturas racémicas de ácidos carboxílicos ou álcoois, a lipase geralmente ser específico para apenas um de um par de isómeros ópticos.

O segredo de sucesso tem sido a selecção de lipases com a especificidade correcta e a selecção das condições de reacção que favorecem transacylation em vez de hidrólise. Porque a actividade hidrolítica de lipases industriais é de 10 - 15 vezes a actividade transacylation, é vantajoso minimizar o teor de água do sistema reaccional e usar os sistemas bifásicos aquosos / orgânicos exemplo descrito earlier.An da lipase a ser utilizado numa reacção de alcoólise é a produção bifásica de acetato de isoamilo, um aroma natural.

lipase CH 3 CH 2 OCOCH 3 +

(CH 3 ) 2 CHCH 2 CH 2 OH (CH 3 ) 2 CHCH 2 CH 2 OCOCH 3 + CH 3 CH 2OH [7,19]

acetato de etilo + álcool isoamílico acetato de isoamilo + etanol

Resumo e Bibliografia do Capítulo 7

a. Equilíbrios de reacção pode ser deslocado através da utilização de sistemas bifásicos. Isto pode ser utilizado por técnicos da enzima assim como as suas longas enzimas são estáveis dentro de tais sistemas.

b. Log P é a melhor medida da polaridade de uma solução para utilização em reacções enzimáticas.

c. Controle cinético pode ser preferido em algumas controle termodinâmico sínteses enzimáticas.

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Para onde a tecnologia enzimática?

Há muitas direções em que tecnólogos de enzimas actualmente aplicável a sua arte e que estão na vanguarda da investigação e do desenvolvimento biotecnológico. Algumas delas já foram examinadas em detalhe antes (ver Capítulos 6 e 7 ). Actualmente, relativamente poucas enzimas estão disponíveis em grande escala (ou seja,> kg) e são adequados para aplicações industriais. Estas deficiências estão sendo tratados em uma série de maneiras:

1. novas enzimas estão sendo procurados no ambiente natural e pela seleção de estirpes (ver Capítulo 2 );

2. enzimas industriais estabelecidas estão a ser utilizados em grande como uma variedade de maneiras como pode ser concebida;

261

3. novas enzimas estão sendo projetados e produzir por engenharia genética; 4. novos catalisadores orgânicos estão sendo projetados e sintetizados usando o

'know-how' estabelecida a partir de enzimologia; e

5. estão sendo utilizados sistemas enzimáticos mais complexos.

Cada uma dessas áreas tem uma extensa literatura e em rápida expansão. Alguns avanços possivelmente pertencem mais propriamente para outras áreas da ciência. Assim, o desenvolvimento de enzimas geneticamente melhoradas, é geralmente realizada por biólogos moleculares e a concepção e síntese de novos catalisadores da enzima é como na proveniência dos químicos orgânicos. Ambos os grupos de trabalhadores, no entanto, basear a sua ciência em dados fornecidos pelo tecnólogo enzima. As necessidades de espaço neste volume não permitem o tratamento completo destas áreas afins, mas será discutida brevemente aqui.

O uso de substratos de "não naturais"

Muitas enzimas não são totalmente específica para os seus substratos naturais. Alguns foram encontrados para catalisar reações bem diferentes daquelas dadas como as reações normais e refletiu em seu nome e número CE. Às vezes é necessário colocar a enzima em um ambiente incomum para exibir novas actividades. Assim, as lipases funcionam como transesterases em ambientes essencialmente não aquosos (ver Capítulo 7 ). Em outros casos, as mudanças no meio ambiente não são necessárias.

A glucose oxidase (ver esquema de reacção [ 1,1 ]) é específico para o substrato redutor (D-glicose), mas relativamente não-específica na sua escolha de oxidante, normalmente oxigénio molecular. Foi estabelecido que a benzoquinona é também um substrato aceitador de electrões eficaz:

[8,1]

-D-glicose + benzoquinona D-glucono-1,5-lactona + hidroquinona

O produto desta reacção, a hidroquinona, é um valioso produto químico orgânico, a ser usada na indústria fotográfica e como um antioxidante. A reacção dá cerca de 100% de rendimento, sem a possibilidade de a inactivação induzida por peróxido que ocorre

262

utilizando oxigénio molecular como oxidante. Devido à solubilidade pronto de benzoquinona e baixa solubilidade do oxigénio molecular, a reacção acima ([ 8,1 ]) pode dar taxas de produtividade várias vezes maior do que a reacção de "natural" ([ 1,1 ]).

A acetilcolinesterase (CE 3.1.1.7) normalmente catalisa a hidrólise da acetilcolina, um neurotransmissor excitatório, nas junções sinápticas de vertebrados.

[8.2] acetilcolina + água colina + ácido acético

A acetilcolinesterase a partir de enguia eléctrica foi encontrado adicionalmente para catalisar a hidrólise estereoespecífica de acetil-D-carnitina mas não acetil-L-carnitina.

[8.3]

acetil-D-carnitina + água D-Carnitina + ácido acético

Embora a reacção que envolve acetil-D-carnitina tem uma velocidade de segunda ordem (especificidade) constantes, quatro ordens de grandeza menor do que a acetilcolina utilizando, as produtividades em concentrações elevadas de substrato são comparáveis, a "natural" substrato, a acetilcolina, causando inibição pelo substrato pronunciada o que não é aparente com acetil-D-carnitina. A reacção "não natural" é útil uma vez que podem ser utilizados na preparação de L-carnitina, uma das vitaminas que tem numerosas aplicações terapêuticas; o D-isómero de ser biologicamente inactivo. A enzima pode, portanto, ser utilizada de um modo semelhante ao modo no qual aminocilase é usado para resolver os aminoácidos racémicos. Sintetizada quimicamente racémica DL-carnitina pode ser acetilado, usando cloreto de acetilo, para dar acetil-DL-carnitina. A acetilcolinesterase pode, então, ser usadas para produzir uma mistura de acetil-L-carnitina e D-carnitina que podem ser simplesmente resolvidos por cromatografia de permuta iónica. A acetil-L-carnitina é tão biologicamente activos como a L-carnitina e pode ser utilizado directamente.

Engenharia Enzyme

263

Um desenvolvimento mais emocionante ao longo dos últimos anos é a técnicas de engenharia genética de aplicativos para enzima tecnologia. Uma descrição completa desta ciência emergente está além do escopo deste texto, mas algumas referências adequadas são dadas no final deste capítulo. Há um número de propriedades que podem ser melhoradas ou alteradas por engenharia genética, incluindo o rendimento e a cinética da enzima, a facilidade de processamento a jusante e diferentes aspectos de segurança. As enzimas de microorganismos perigosos ou não aprovadas e de crescimento lento ou limitada de tecido de planta ou animal pode ser clonado em microrganismos seguras de alta produção. No futuro, as enzimas podem ser redesenhada para caber mais apropriadamente em processos industriais; por exemplo, tornando-isomerase de glucose menos susceptível a inibição pela Ca 2+ presente na corrente de tratamento de sacarificação do amido.

A quantidade de enzima produzida por um microrganismo pode ser aumentada através do aumento do número de cópias dos genes que codificam para ele. Este princípio tem sido utilizado para aumentar a actividade de penicilina-G-amidase em Escherichia coli . O ADN celular de uma estirpe produtora é clivado selectivamente por a endonuclease de restrição Hind III . Este hidrolisa o DNA em locais relativamente raros contendo 'sequência de bases para dar idêntica' a 5'-AAGCTT-3 cambaleava 'termina.

[8,4] ADN intacto ADN clivado

O ADN total é clivada em fragmentos de cerca de 10000, apenas um dos quais contém a informação genética necessária. Estes fragmentos foram clonados individualmente num vector de cosmideo e assim retornada para E. coli . Estas colónias contendo o

gene activo são identificados pela sua inibição de um organismo sensível a ácido 6-amino-penicilânico. Estas colónias são isolados e o gene de penicilina-G-amidase transferido para plasmídeos pBR322 e reclonado em volta E. coli . As células

modificadas, auxiliados pela amplificação plasmídeo em cerca de 50 cópias por célula, produzir penicilina-G-amidase constitutivamente e em quantidades consideravelmente mais elevados do que a estirpe parental totalmente induzido. Tais rendimentos aumentados são economicamente relevantes não apenas para o aumento da produtividade volumétrica, mas também por causa da redução dos custos de processamento a jusante, a enzima bruto resultante sendo que muito mais puro.

264

Figura 8.1 . O ciclo de engenharia de proteínas. O processo começa com o isolamento e caracterização da enzima necessária. Esta informação é analisada em conjunto com a base de dados de efeitos estruturais conhecidos e putativos de substituições de aminoácidos para produzir uma possível estrutura melhorada. Esta enzima artificial é construído por mutagénese dirigida ao local, isolados e caracterizados.Os resultados, com sucesso ou insucesso, são adicionados ao banco de dados, eo processo é repetido até que o resultado desejado seja obtido.

Outra área extremamente promissora da engenharia genética é a engenharia de proteínas. Novas estruturas de enzimas podem ser concebidos e produzidos de forma a melhorar às enzimas existentes ou criar novas atividades. Um esboço do processo de engenharia de proteínas é mostrada na Figura 8.1 .Tais enzimas são produzidas factitious por mutagénese dirigida ao local ( Figura 8.2 ). Infelizmente, do ponto de vista prático, a maior parte do esforço de pesquisa em engenharia de proteínas tem ido para os estudos sobre a estrutura e atividade de enzimas escolhidos pela sua importância teórica ou facilidade de preparação, em vez de relevância industrial. Esta ênfase é provável que mude no futuro.

Tal como indicado pelo método utilizado para a mutagénese dirigida ao local ( Figura 8.2 ), a via preferida para a criação de novas enzimas é por substituição gradual de apenas um ou dois resíduos de aminoácidos para fora da estrutura de proteína total. Apesar de um grande banco de dados de seqüência-estrutura correlações está disponível, e crescendo rapidamente em conjunto com o software necessário, é actualmente insuficiente precisão para prever as mudanças tridimensionais, como resultado de tais substituições. O principal problema está avaliando os efeitos de longo alcance, incluindo interações de solventes, na nova estrutura. Como os diversos resultados relatados que atestam, a ciência está numa fase em que pode explicar as consequências estruturais de substituições de aminoácidos, depois de terem sido determinadas, mas não é possível prever com precisão. Engenharia de proteínas, portanto, é, actualmente, em vez de um processo de acerto ou erro que pode ser utilizado apenas com pouca probabilidade realista de sucesso imediato. Aparentemente bastante pequenas alterações das sequências podem dar origem a grandes alterações

265

conformacionais e mesmo afectar o passo determinante da taxa na catálise enzimática. No entanto, é razoável supor que, dado um banco de dados suficientemente detalhados, além de software adequado, a probabilidade relativa de sucesso irá aumentar nos próximos anos e os produtos da engenharia de proteínas vai fazer um grande impacto sobre a tecnologia enzimática.

Engenharia de proteínas Muito tem sido dirigida a subtilisina (a partir de Bacillus amyloliquefaciens ), principal enzima na preparação de enzima detergente,

Alcalase. Isso tem sido voltada para a melhoria da sua actividade em detergentes, estabilizando-lo ainda mais em força temperaturas, pH e oxidante. A maioria das tentativas de melhorias ter alterações quanto a:

1. o P 1 fissura, a qual mantém o aminoácido no lado do carbonilo da ligação peptídica alvo;

2. o furo oxiani�o (principalmente Asn 155 ), que estabiliza o intermediário tetraédrico;

3. a vizinhança do resíduo catalítico histidil (Sua 64 ), que tem um papel de base geral; e

4. o resíduo de metionina (Met 222 ), que faz com que a labilidade da subtilisina de oxidação.

Verificou-se que o efeito de uma substituição na P 1 fissuras na actividade específica relativa entre os substratos pode ser prevista com bastante precisão, embora predições dos efeitos de tais alterações absolutas são menos bem sucedida. Muitas substituições, em particular para o resíduo de glicina na parte inferior da P 1 fenda (Gli 166 ), foram encontradas para aumentar a especificidade da enzima para determinadas ligações peptídicas enquanto reduzindo-a para outros. Estes efeitos são obtidos principalmente por mudanças no correspondente K m em vez de V max . Aumentos na especificidade relativa pode ser útil para algumas aplicações. Eles não devem ser considerados como o resultado usual de enzimas de engenharia, no entanto, como subtilisina nativa é incomum, sendo bastante não específica nas suas acções, possuindo um grande local de ligação hidrófobo que pode ser feita mais facilmente relativamente específico (por exemplo, reduzindo a sua tamanho). A inactivação de subtilisina em soluções de branqueamento coincide com a conversão de Met 222 para o seu óxido, o consequente aumento no volume de ocluir o orifício oxiani�o. Substituição da metionina por serina ou alanina produz mutantes que são relativamente estáveis, embora possuindo a actividade um pouco reduzida.

266

Figura 8.2. Um esboço do processo de mutagénese dirigida ao local, utilizando-se um exemplo hipotético.(A) A estrutura primária da enzima é derivada da sequência de ADN. Uma estrutura primária da enzima putativa é proposto com um resíduo de asparagina que substitui a serina presente na enzima nativa. Um pequeno pedaço de ADN (o iniciador), complementar de uma secção do gene para além do desemparelhamento de bases, é sintetizada. (B) O iniciador de oligonucleótido é fundido com uma cópia de cadeia simples do gene e é estendida com enzimas e trifosfatos de nucleótidos para dar um gene de cadeia dupla. Na reprodução, o gene dá origem a ambos os clones mutantes e do tipo selvagem. O ADN mutante pode ser identificado através de hibridação com os oligonucleótidos marcados radioactivamente de estrutura complementar.

Um exemplo da natureza imprevisível da engenharia de proteínas é dado pela tripsina, que tem um local activo estreitamente relacionada com a da subtilisina. A substituição do resíduo de ácido aspártico negativamente carregado na parte inferior da sua P 1 fenda (Asp 189 ), que é utilizado para as cadeias laterais de base de lisina ou arginina de ligação, por lisina carregada positivamente dá o resultado previsível de que suprime a sua actividade contra substratos normais, mas também de forma imprevisível dá nenhuma actividade contra substratos onde estes resíduos básicos são substituídos por ácido aspártico ou ácido glutâmico.

Um esforço considerável tem sido gasto em engenharia enzimas mais termófilas. Verificou-se que as enzimas termófilas são geralmente apenas 20-30 kJ mais estáveis do que os seus homólogos mesofílicas.Isto pode ser conseguido através da adição de apenas algumas ligações de hidrogénio adicionais, uma ligação interna sal ou resíduos hidrofóbicos internos adicionais, dando um núcleo ligeiramente mais

267

hidrofóbico. Todas essas modificações são suficientemente pequenos para ser alcançado através de engenharia de proteína. Para assegurar um resultado mais previsível, a estrutura secundária da enzima deve ser conservada e esta geralmente restringe as alterações na superfície exterior da enzima.Adequado para substituições exteriores para aumento da estabilidade térmica foram encontrados para ser aspartato glutamato, lisina glutamina, valina treonina, serina asparagina, isoleucina treonina, asparaginaaspartato e lisina arginina. Tais substituições têm uma probabilidade feira de sucesso. Onde admissíveis, pequenos aumentos no hidrofobia interior, por exemplo, por meio da substituição de glicina ou serina interiores por alanina também pode aumentar a estabilidade térmica. Deve reconhecer-se que fazendo uma enzima termoestável mais reduz a sua flexibilidade geral e, portanto, é provável que a enzima artificial produzida irá ter reduzido a eficiência catalítica.

Enzimas artificiais

Uma série de possibilidades existem agora para a construção de enzimas artificiais. Estes são geralmente polímeros sintéticos ou oligômeros com atividades enzimáticas-like, muitas vezes chamado synzymes.Eles devem possuir duas entidades estruturais, um local de ligação ao substrato e um local cataliticamente eficaz. Verificou-se que a instalação de produção de substrato para a ligação é relativamente simples, mas os sítios catalíticos são um pouco mais difícil. Ambos os locais podem ser concebidas em separado mas parece que, se o synzyme tem um local de ligação para o estado de transição da reacção, isto consegue muitas vezes ambas as funções. Synzymes geralmente obedecer às saturação cinética de Michaelis-Menten tal como descrito no Capítulo 1 . Para uma reacção de um substrato a sequência da reacção é dada pela

synzyme + S (complexo synzyme-S) synzyme + P [8,5]

Alguns synzymes são simplesmente proteínas derivatizadas, embora enzimas imobilizadas covalentemente não são aqui considerados. Um exemplo é a derivatização de mioglobina, o veículo de oxigénio no músculo, anexando (Ru (NH 3 ) 5 ) 3+ de três resíduos de histidina superfície. Isso converte-lo de uma transportadora de oxigênio para uma oxidase, oxidante ácido ascórbico, enquanto a redução do oxigênio molecular. O synzyme é quase tão eficaz como oxidases ascorbato naturais.

É impossível projetar synzymes proteína a partir do zero com qualquer probabilidade de sucesso, como suas conformações não são actualmente previsível a partir de sua estrutura primária. Tais proteínas também irão mostrar os inconvenientes das enzimas naturais, sendo sensível à desnaturação, oxidação e hidrólise. Por exemplo, a polilisina liga corantes aniónicos, mas apenas 10% como fortemente como a proteína de ligação natural, albumina do soro, apesar das muitas cargas e de cadeias laterais apolares.Ácido glutâmico, no entanto, mostra propriedades synzymic. Actua como uma esterase em muito da mesma forma como as proteases ácidas, que mostra uma relação

268

de actividade-pH em forma de sino, com uma actividade óptima a cerca de pH 5,3, e a cinética de Michaelis-Menten, com um K m de 2 mm e Vmáx de 10 -4 10 -5 s -1 para a hidrólise do acetato de 4-nitrofenilo. As ciclodextrinas (dextrina Schardinger) são naturalmente moléculas toroidal constituído por seis, sete, oito, nove ou dez

anos unidades de D-glicose-1, 4-ligados juntou cabeça-de-cauda em um anel ( -

, -, - , - e ciclodextrinas, respectivamente: podem ser sintetizados a partir de amido por cyclomaltodextrin glucanotransferase (CE 2.4.1.19) a partir de Bacillus macerans ). Eles diferem no diâmetro das suas cavidades (cerca de 0,5-1 nm), mas

todos são de cerca de 0,7 nm de profundidade. Estes formam bolsas hidrofóbicas, devido aos átomos de oxigénio glicosidicos e de frente para o interior, grupos CH. Todos os grupos hidroxilo C-6 para projectar uma extremidade e todos os C-2 e C-3 grupos hidroxilo para o outro. A sua característica global é hidrofílico, é solúvel em água, mas a presença da sua bolsa hidrofóbica lhes permite ligar moléculas hidrofóbicas do tamanho apropriado. Synzymic ciclodextrinas são geralmente derivatizados de modo a introduzir grupos cataliticamente competentes. Muitos destes derivados têm sido examinadas. Por

exemplo, um grupo hidroxilo C-6 de -ciclodextrina foi covalentemente derivatizada por um coenzima piridoxal activado. O synzyme resultante não só agiu uma transaminase (ver esquema de reacção [ 1,2 ]), mas também mostrou estereosselectividade para os L-aminoácidos. Não era tão ativo quanto transaminases naturais, no entanto.

A polietilenoimina é formado por polimerização de etilenoimina para se obter uma matriz tridimensional hidrofílico altamente ramificada. Cerca de 25% das aminas resultantes são primário, secundário 50% e 25% superior:

[8,6]

Polietileneimina etileneimina

As aminas primárias podem ser alquilados para formar um certo número de derivados. Se 40% dos quais são alquilados com 1-iodododecano para dar sítios de ligação hidrofóbicos e o restante alquilado com 4 (5) -chloromethylimidazole para dar ácido-base geral sítios catalíticos, o synzyme resultante tem 27% da actividade

de contra quimotripsina ésteres de 4-nitrofenilo. Como seria de esperar da sua estrutura aparentemente aleatória, tem muito baixa especificidade esterase. Outros synzymes podem ser criados de um modo semelhante.

Anticorpos para a transição análogos estaduais da reação necessária pode atuar como synzymes. Por exemplo, os ésteres de fosfonato de fórmula geral (R-PO 2 -OR ') - são análogos estáveis da ocorrência do estado de transição na hidrólise de éster carboxílico. Anticorpos monoclonais criados para a imunização de conjugados de proteína ligados de forma covalente a estes ésteres de fosfonato de agir como

269

esterases. As especificidades destes anticorpos catalíticos (abzimas) também chamados depende da estrutura das cadeias laterais (ou seja, R e R 'em (R-PO 2 -OR ') - ) dos antigénios. Os K m valores podem ser bastante baixa, muitas vezes na região micromolar, enquanto que os V max valores são baixos (abaixo de 1 s -1 ), embora ainda de 1000 vezes maior do que a hidrólise por meio de iões hidroxilo fundo. Uma estratégia semelhante pode ser usada para produzir synzymes por molecular "imprinting" de polímeros, utilizando a presença de análogos do estado de transição para a polimerização de resinas ou de forma não-enzimática de proteínas inactivos durante a desnaturação pelo calor.

Sistemas de regeneração Coenzima

Muitos oxidorredutases e ligases utilizar todos os coenzimas NAD (por exemplo, + , NADP + , NADH, NADPH, ATP), que devem ser regeneradas como cada molécula do produto é formado. Embora estes representam muitos dos catalisadores biológicos mais úteis, a sua aplicação é presentemente severamente limitada pelo elevado custo das coenzimas e dificuldades com a sua regeneração. Estes dois problemas podem ser superados ambos ao mesmo tempo, se o coenzima é imobilizada, juntamente com a enzima, e regenerado in situ .

Uma maneira simples de imobilização / regenerando coenzimas seria a utilização de sistemas de células inteiras e estes são, é claro, em uso generalizado. No entanto, conforme descrito anteriormente, estes são geralmente de menor eficiência e flexibilidade do que os sistemas de enzimas imobilizadas. Reactores de membrana (ver Capítulo 5 ) pode ser utilizado para imobilizar as coenzimas, mas o tamanho dos poros devem ser menores do que o diâmetro coenzima, o que é extremamente restritivas. Coenzimas geralmente deve ser derivatizada para a imobilização e regeneração adequada. Quando aplicado com sucesso, este processo ativa as coenzimas para fixação ao apoio imobilização, mas não interfere com a sua função biológica. As vias sintéticas mais amplamente aplicados envolvem a alquilação do N exocíclico6 -amino azoto do radical adenina presente nas coenzimas NAD + , NADP + , NADH, NADPH, ATP e coenzima A.

Em algumas aplicações, tais como aquelas que utilizam reactores de membrana só é necessário que a coenzima tem tamanho suficiente para serem retidos no interior do sistema. Derivados solúveis em água de alto peso molecular são mais úteis em que causem menos resistência de difusão do que as matrizes de coenzima insolúveis. Os dextranos, polietilenoimina e polietileno glicóis são amplamente utilizados. Níveis relativamente baixos de apego coenzima são geralmente procurado a fim de permitir uma maior liberdade de movimento e evitar possíveis efeitos inibitórios. As propriedades cinéticas das coenzimas derivados variar, dependendo do sistema, mas, geralmente, as constantes de Michaelis são mais elevados e as velocidades máximas são mais baixas do que com as co-enzimas nativas. Coenzimas imobilizados em suportes insolúveis tem atualmente cinética de um pouco menos favoráveis, mesmo quando co-imobilizadas

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perto do sítio ativo de suas enzimas que utilizam. Esta situação deverá melhorar à medida que mais informações sobre a conformação da proteína circundante sítios ativos das enzimas 'torna-se disponível e métodos de imobilização se tornam mais sofisticados. No entanto, o custo de tais derivados é provável que se mantenha sempre alta e só será economicamente viável para a produção de produtos de alto valor.

Existem vários sistemas disponíveis para a regeneração das coenzymes derivatizados por meio enzimáticas química, eletroquímica ou. Regeneração enzimática é vantajoso devido à sua alta especificidade, mas procedimentos eletroquímicos para regenerar o oxidoreductase dinucle�idos estão provando competitivo. Para ser útil na regeneração coenzymes, processos enzimáticos deve utilizar substratos baratos e prontamente disponíveis enzimas e dar a produtos não-interferência e facilmente separados. Desidrogenase de formato e quinase acetato presente exemplos úteis de sua utilização, embora as preparações de enzimas comerciais disponíveis são de baixa atividade:

[8,7]

Conclusões

Tecnologia enzimática está atualmente passando por uma fase de amadurecimento e evolução. A maturação é mostrado pelo desenvolvimento da teoria relativa como enzimas de função e como esta está relacionada com a sua estrutura primária, através da formação e configuração da sua estrutura tridimensional. A evolução é mostrada pela gama cada vez mais amplo de aplicações enzimáticas.

Ainda há muito espaço para o desenvolvimento de processos úteis um material com base nesta compreensão duramente conquistada. Enzimas será claramente mais amplamente utilizado no futuro e isso será refletido nas enzimas de números disponíveis

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em escala industrial (e investigação), a variedade de reações catalisadas e a gama de condições ambientais sob as quais eles operam. Enzimas estabelecidas será posta a novos usos e novas enzimas, descoberto dentro de seus nichos biológicos ou produzidos pelo projeto por meio da engenharia de enzimas, será usado para catalisar reações até então inexploradas. Este é apenas o início da era da tecnologia enzimática.

Resumo e Bibliografia do Capítulo 8

a. Novos processos enzimáticos estão sendo desenvolvidos e novos usos estão sendo elaborados para enzimas industriais atualmente disponíveis.

b. Novas enzimas estão sendo produzidos pela via clássica e "desde a concepção". c. Engenharia de proteínas oferece uma grande promessa para o futuro, mas

precisa do desenvolvimento de uma base teórica mais forte.

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