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Carne in vitro
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Trabalho Interdisciplinar Orientado III (TIO-III)
Unesp-Araraquara | Setembro-2014
Nas apresentações anteriores...
(TIO-I e II)
Relevância de Demanda
Relevância Ambiental
Relevância Ambiental
(http://calmariatempestade.wordpress.com/2012/06/22/carne-de-laboratorio/)
Relevância Social
Etapas de Produção - Simplificado
Etapas de Produção - Diferenciação II
Tecido Muscular - Tipos
Miogênese
Tipos Celulares
• Células Tronco Embrionárias:– Vantagens:
• Em teoria, tem potencial ilimitado de proliferação; (esse potencial poderia ser limitado por mutações genéticas a longo prazo)
– Desvantagens:• Processo de diferenciação muito longo e complexo;
• Células Satélites:– Vantagens:
• Tem maior tendência à proliferação;
– Desvantagens:• Adicionam uma fase de diferenciação a mais no processo;• São escassas no tecido muscular;
• Mioblastos:– Vantagens:
• Já são diferenciadas;• São abundantes;
– Desvantagens:• Necessitam de engenharia genética para formarem colônias imortalizadas;• Proliferam-se mais lentamente;
Mecanismos de Regulação Gênica em Eucariotos
http://genmol.blogspot.com.br/2011/09/genetica-molecular-sinopse-do-controle.html
Diferenciação do Tecido MuscularIn Vitro
• Necessidade de Estímulos Químicos:– Proteínas reguladoras;
– Fatores de crescimento;
– Nutrientes e oxigênio;
• Necessidade de Estímulos Físicos:– Ancoramento das células;
– Alinhamento correto para a fusão dos Mioblastos;
– Contração das células para a formação dos Sarcômeros;
Meio de Cultura
Telas de Fixação
Meio de Cultura
• Deve conter:
– Nutrientes;
– Hormônios e proteínas de regulação gênica;
– Fator de crescimento;
– Carregadores de oxigênio;
• Desafio:
– Custo viável;
Fator de Crescimento
• Substâncias que controlam o ciclo celular (transição da fase G0 para G1);
• Soro fetal bovino => Implicações éticas inviabilizam o uso em escala
• Meios comerciais livres de soro (Ultroger G) => Caro
• Meios alternativos (extrato de cogumelo) => Necessita de mais pesquisas
Transportadores de Oxigênio
• Atuariam no lugar do sangue para manter concentrações adequadas no meio;
• Opções:
– Versões modificadas de hemoglobina (produzidas a partir de plantas e micro-organismos geneticamente alterados);
– Versões químicas inertes (produzidas artificialmente);
Suporte de Fixação
• Promove a ancoragem da célula;
• Deve possuir uma textura adequada para promover o alinhamento dos mioblastos;
• Poderia ser:– Comestível:
• Dispensa etapa de remoção do tecido;
• Pode incorporar qualidades ao produto;
• Biopolímeros: colágeno, alginato, quitosana etc
– Não comestível:• Etapa adicional de remoção das células
(biodegradação);
Mecanismos de Contração
• Necessários para a diferenciação celular;
• Poderiam ser:– Mecânicos;– Químicos (um material que contraísse com variações no
PH e Temperatura);– Elétricos (choques no tecido);
• Estudos sugerem que estímulos elétricos são a melhor opção, não sendo difíceis de reproduzir em escala industrial;
Espessamento do Tecido – Sistema Vascular Artificial
• Células começam a morrer por falta de nutrientes quando o tecido atinge de 2 a 3 mm de espessura;
• Para superar esse problema, é necessária a criação de um sistema vascular artificial (a partir de colágeno);
• Esse sistema foi possível por meio de processos de microfabricação, difíceis de reproduzir em escala industrial;
No TIO III...
Objetivos
• Geral: Estabelecer técnicas que possam contribuir com a viabilidade de produção de Carne In Vitro em escala laboratorial e comercial.
• Específicos:1) Estudar o efeito de diferentes composições de meios de
cultura na diferenciação e proliferação dos mioblastos, de modo a contribuir com o desenvolvimento de um meio economicamente viável para produção em escala;
2) Estabelecer protocolos básicos no cultivo de células animais, tais como composição e preparação do meio de cultura, avaliação e contagem de células, análise e separação de subprodutos metabólicos, etc;
Metodologia
1º - Isolamento das CS
• Biópsia do tecido muscular;
• Banho enzimático de colagenase tipo II, tripsina e DNAse, diluídas em meio de cultura DMEM pré-aquecido a 37 °C;
• CS encubadas em meio de cultura DMEM, a 37°C e 5% de CO;
2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos
• Marcadores proteicos:– 14 proteínas características expressas na CS:
• MyoD, Myf-5, MNF, c-Met, M-cadherin, Pax7, Miogenina, PCNA, Ki-67, Sox-8, CD-34, c-sky, p-27kip, V-rsc
– Cada proteína está caracterizada de modo a permitir, além de identificar as CS, reconhecer processos metabólicos específicos de cada fase do ciclo celular• Exemplo:
p-27kip - Há uma relação inversa entre a capacidade proliferativa da CS e a abundancia da proteína pk27kip, podendo estar envolvida no crescimento e na hipertrofia muscular.
2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos
• A sequencia de aminoácidos, tamanho da cadeia, peso molecular e outras informações sobre cada proteína pode ser obtida no site da “RCSB ProteinData Bank” (http://www.rcsb.org/)
2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos
• Para identificar os marcadores proteicos na cultura celular => Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos
• Para garantir que a banda é realmente da proteína de interesse => Western blotting seguido por sondagem com anti-corpos marcados.
3° - Proliferação da Cultura Primária
• Encubação a 37°C;• Alta concentração de fatores de crescimento;• Controle de pH:
– O controle é feito por indicador no meio de cultura, de coloração vermelha em pH neutro e laranja ~ amarelo em pH ácido;
• Controle da pressão osmótica:– Atmosfera de CO2 e umidade– Diminui o stress das células, diminuindo a evaporação do meio
de cultura
• Troca parcial periódica do meio de cultura:– Diminuir a concentração de metabólitos (ácido lácteo e
amônia);– Reposição de nutrientes;
Determinação da Concentração de Glicose
• Método de Bergmeyer e Bernt (1974):
– A primeira reação é catalisada pela glucose-oxidase (GOD) e a segunda por peroxidase (POD).
– O o-dianisidina atua como corante, e é reduzido por peróxido de hidrogénio a um produto que tem uma cor-de-rosa na presença de ácido sulfúrico (reação 3) e é medido colorimetricamente a 540 nm.
I) D-glicose + H2O + O2 -> Ácido D-glucónico + H2O2
II) H2O2 + o-dianisidina reduzida -> 2H2O + o-dianisidina oxidada (castanho)
III) o-dianisidina oxidada (castanho) + H2SO4 + -> o-dianisidina oxidada (rosa)
YSI Industrial Analyzer
• Análise automatizada de várias alíquotas em simultâneo;
• Permite quantificação de glicose, ácido lácteo, amido, glicina etc;
• Baseado em métodos amperimétricos
Contagem das células
• Hemocitômetro ou contador de partículas eletrônico;
• Fases de crescimento da cultura:
4° - Proliferação em escala
• Biorreator adequado para cultura de células animais:– Controle automatizado dos parâmetros;
– Sistema de aeração que não cause o cisalhamento das células;
• Microcarreadores para células dependentes de ancoragem:– Microesferas de colágeno;
• Fator limitante do tamanho do biorreator:– Baixa capacidade de diluição de O2 no meio de cultura;
Cisalhamento em Biorreatores com Aeração Direta
5° - Diferenciação do Tecido Muscular
• As células são semeadas nos suportes;
• Dois grupos de ensaios:– Suportes de Colágeno;
– Suportes de Alginato;
• Os suportes vão para um biorreator especialmente concebido para este fim;
• A concentração dos fatores de crescimento é diminuída no meio, o que desencadeia o processo de diferenciação;
Biorreator para a Diferenciação
Biorreator de Fibra Oca Adaptado
• Objetivo: maximizar a produção contornando as limitações de oxigenação e fornecimento de nutrientes, que limitam o desenvolvimento máximo do tecido à espessura de 2~3 mm.
Biorreator de Fibra Oca Adaptado
• Dois meios de cultura:
– Extracapilar: moléculas grandes;
– Intracapilar: moléculas pequenas e alta concentração de O2; fluxo mais intenso;
• Os capilares seriam confeccionados com o biomaterial comestível do suporte;
– Ensaios para avaliar a capacidade dessa confecção (plasticidade, elasticidade, permeabilidade, afinidade com as células etc)
Perspectivas do TIO
• Conhecer melhor cada etapa do processo de produção da carne in vitro, e os conceitos práticos e teóricos relacionados;
• Contribuir de alguma forma para o desenvolvimento de novas tecnologias;
O trabalho que será desenvolvido nos próximos 5 semestres em TIO é de natureza teórica, mas sempre
visado uma aplicabilidade prática.
Referências Bibliográficas• BHAT et all, “Prospects for In Vitro Cultured Meat – A Future Harvest”, Principles of Tissue Engineering (cap. 79), 4ª ed, 2014.
• POST et all, “Principles of Tissue Engenering for Food”, Principles of Tissue Engineering (cap. 78), 4ª ed, 2014.
• BUTLER, Michael. Animal Cell Culture and Technology, 2ª ed, 2004;
• FOSCHINI et all. “Células Satélites Musculares”, Arq Bras Oftalmol. 2004; 67(4):681-7;
• SANTIAGO et all, “Performance of a vortex flow bioreactor for cultivation of CHO-K1 cells on microcarriers”, Process Biochemistry vol. 46, Jan/2011
• DRURY et all. “Mooney Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications Biomaterials”, 24 (2003), pp. 4337–4351;
• ALBERTS et all. “Biologia Molecular da Célula”, 5ª edição, 2008;
• DATAR et all. “Possibilities for an in vitro meat production system”, IFSET – Innovative Food Science and Emerging Tecnologies, n° 11, 2010;
• POST et all. “Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects” , Meat Science, n° 92, 2012;
• TAVARES, Adriana Alexandre dos Santos. “Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células”, Tese de Mestrado em Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, Julho de 2008;
• “Inside the Meat Lab”, Revista Scientific American, n° 108, Junho de 2011;
Grupo
• Caio Ricardo
• Camile Pedrosa
• Euclides Formica
• Larissa Gomes
• Lucas Nakamura
• Lucas Zamian
• Lucas Henares
• Murilo Oliveira
Unesp Araraquara
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
3° Semestre - 2014