2014 - Identificación y cuantificación del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking mediante la técnica FISH y estudio de su relación con los parámetros operacionales

Identificación y cuantificación del morfotipo

Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking

mediante la técnica FISH y estudio de su relación con los

parámetros operacionales y físico-químicos en EDAR de la

Comunidad Valenciana

TRABAJO FIN DE MÁSTER TIPO B

MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL

GESTIÓN AMBIENTAL

Autora:

MARTA FERRER ROGLÁN

Director:

DR. JOSÉ LUIS ALONSO MOLINA

Codirector:

DR. LUIS BORRÁS FALOMIR

VALENCIA, SEPTIEMBRE 2014

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quisiera agradecer a mis tutores José Luis Alonso y Luis Borrás Falomir por sus

consejos, dedicación y colaboración en la realización del presente trabajo. Gracias José Luis por

darme la oportunidad de realizar este trabajo en el Instituto Universitario del Agua y Medio

Ambiente (IIAMA) y por la confianza depositada en mí.

A la Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana (EPSAR)

por facilitar los datos para la elaboración de este proyecto y a Andrés Zornoza por ayudarme

siempre en todo aquello que he necesitado.

A todos mis compañeros de laboratorio por toda su ayuda prestada y buenos ratos pasados.

A Yolanda Úbeda y Paula Serrano por su ayuda en mis dudas de estadística.

A mis amigos por estar siempre ahí.

A mis padres, a Marisa y a Antonio por vuestro apoyo incondicional, enseñanza y sacrificio.

Y por último y siempre, a Miguel y en especial a Pablo… Across the Universe.

Muchísimas Gracias a todos.

Ferrer-Roglán., 2014.

i

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN…………………………………………..……………………………………………………….…….. 1

1.1. La depuración de aguas residuales urbanas……………………………………………………………… 1

1.2. Tratamientos biológicos de aguas residuales. Fangos activos…………….........………….…... 2

1.2.1. El flóculo……………………………..……………………………………………………………………….…..……. 2

1.2.2. Problemas en los sistemas de fangos activos producidos por microorganismos……… 3

1.2.3. Composición de la microbiota………………………………………………………………………………... 4

1.3. La importancia de las bacterias filamentosas ………………………………………………………….... 5

1.3.1 Phyllum Bacteroidetes……………………………………………………………………………….…………… 5

1.3.1.1. HalIscomenobacter hydrossis…………………………………………………………………............... 7

1.3.1.2. Identificación de Haliscomenobacter con la técnica FISH……………………………………. 8

1.3.1.3. Ecofisiología…………………………………………………………………………………………………………. 11

1.3.1.4. Operaciones de control…………………………………………………………………….…………………. 12

1.4. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos……………………………… 13

1.4.1 Técnicas convencionales………………………………………………………………………………………….. 13

1.4.2. Técnica FISH……………………………………………………………………………………………………………. 15

1.4.3. Análisis de imagen………………………………………………………………..……………………….……….. 17

1.5. Parámetros operacionales del proceso de depuración………………………………………………. 18

2. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………………………………. 20

3. MATERIAL Y MÉTODOS……………………..…………………………………………………………………………. 21

3.1. Toma de muestras……………………………………………………………………………………………………… 21

3.1.1. EDAR Quart Benàger (QB)………………………………………………………………………………………. 21

3.1.2. EDAR Cuenca del Carraixet (CX)………………………………………………………………………………. 22

3.1.3. EDAR Dénia - Ondara - (DE)…………………………………………………………………………………….. 23


ii

3.1.4. EDAR Castellón de la Plana (CS)………………………………………………………………….…………… 24

3.2. Muestreo…………………………………………………………………………………………………………………… 25

3.3. Parámetros físico-químicos y variables operacionales.……………………………………………… 27

3.3.1 Parámetros físico-químicos……………………………………………………………………………………… 27

3.3.2 Parámetros operacionales……………………………………………………………………………………….. 28

3.4. Fijación y permeabilización de las muestras……………………………………………………………… 29

3.5. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluorófors (FISH).…………………. 30

3.5.1. Preparación de reactivos para FISH ………………………………………………………………………… 30

3.5.2. Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón …………………………………………… 33

3.5.3. Aplicación de las muestras a los portaobjetos ………………………………………………………… 33

3.5.4. Sondas utilizadas…………………………………………………………………………………………………….. 33

3.5.5. Hibridación “in situ” ………………………………………………………………………………………………. 34

3.6. Observación al microscopio de epifluorescencia………………………………………………………… 35

3.7. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos …………………………….. 36

3.7.1. Criterio subjetivo de Eikelboom (2000,2006)………………………………………………………….. 36

3.7.2. Análisis de imagen con el programa Matlab 7.1…………………………………………………….. 37

3.8. Análisis estadístico ……………………………………………………………………………………………………. 38

3.8.1. Análisis de variables categóricas: Tablas de contingencia y Prueba de Chi

cuadrado………………………………………………………………………………………………………………………….. 39

3.8.2. Análisis de la varianza (ANOVA)………………………………………………………………………………. 40

3.8.3. Análisis bivariante………………………………………………………………………………………………….. 42

3.8.4. Análisis multivariante …………………………………………………………………………………………….. 43

4. RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………………… 48

4.1 Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos………………………………. 48


iii


4.2. Toma de imágenes y cuantificación de la señal de hibridación mediante el análisis de

imagen……………………………………………………………………………………………………………………………… 52

4.2.1 Comparación entre EDAR de la cuantificación de bacterias hibridadas……………………. 59

4.3 Análisis Estadístico entre las señales obtenidas para las bacterias hibridadas con las

sondas SAP-309 y HHY y los parámetros operacionales de la EDAR…………………………………. 63

4.3.1 Coeficientes de Pearson y Spearman. Análisis Bivariante…………………………………….. 65

4.3.2. Análisis de Componentes Principales (ACP)…………………………………………………………….. 72

4.3.2.1. ACP para las variables físico-químicas del afluente y las variables biológicas

estudiada…………………………………………………………………………………………………………………………. 72

4.3.2.2. ACP para las variables físico-químicas del licor mezcla y las variables biológicas

estudiadas……………………………………………….…………………………………………………………………….... 75

4.3.2.3. ACP para las variables operacionales y las variables biológicas estudiadas…………… 77

5. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………………………………………. 79

5.1 Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos.……………………………… 79


5.1.2 Cuantificación de la señal de hibridación mediante el análisis de imagen………………… 79

5.1.3 Comparación entre IE y la técnica FISH con análisis de imagen……………………………….. 81

5.2 Ecofisiología de los morfotipos filamentosos ……………………………………………………………. 82

5.2.1. Parámetros físico-químicos del afluente respecto a Haliscomenobacter………………… 82

5.2.2. Parámetros físico-químicos del licor mezcla respecto a Haliscomenobacter…………… 84

5.2.3. Parámetros operacionales respecto a Haliscomenobacter……………………………………… 85

5.2.4. Correlaciones entre las variables biológicas estudiadas………………………………………….. 86

6. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………………….. 88


iv

7. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………………………………….. 90

8. ANEXOS………………………………………………………………………………………………………………………… 98

Anexo 1.1 Tabla de contingencia para El tipo de EDAR estudiada y el índice de Eikelboom

de H. hydrossis…………………………………………………………………………………………………………………. 98

Anexo 1.2 Prueba Chi-cuadrado para IE y Tipo EDAR………………………………………………………. 99

Anexo 2.1. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que

presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación

estándar (SD). EDAR Quart Benáger………………………………………………………………………………… 100



estándar (SD). EDAR Denia- Ondara………………………………………………………………………………….. 101



estándar (SD). EDAR Castellón Línea A+B………………………………………………………………………….. 102



estándar (SD). EDAR Castellón Línea C+D…………………………………………………………………………. 103



estándar (SD). EDAR Carraixet Línea A+B………………………………………………………………………….. 104



estándar (SD). EDAR Carraixet Línea C+D………………………………………………………………………….. 105

Anexo 3.1. Media, desviación típica, error típico e intervalo de confianza para el

promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la

sonda SAP-309 para cada EDAR estudiada……………………………………………………………………….. 106

Anexo 3.2. Prueba de homogeneidad de varianzas para SAP-309…………………………………….. 106


v

Anexo 3.3. Análisis de la varianza (ANOVA) para el promedio del área % ó concentración

(mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada depuradora

estudiada…………………………………………………………………………………………………………………………. 106

Anexo 3.4. Comparaciones múltiples (Bonferroni) del promedio del área % ó

concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada

EDAR estudiada………………………………………………………………………………………………………………… 107

Anexo 3.5. Media, desviación típica, error típico e intervalo de confianza para el

promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la

sonda HHY para cada EDAR estudiada………………………………………………………………………………. 108

Anexo 3.6. Prueba de homogeneidad de varianzas para HHY…………………………………………… 108

Anexo 3.7. Análisis de la varianza (ANOVA) para el promedio del área % ó concentración

(mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada EDAR estudiada…… 108

Anexo 3.8. Comparaciones múltiples (Bonferroni) del promedio del área % ó

concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada

EDAR estudiada ……………………………………………………………………………………………………………….. 109

Anexo.4.1 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda-309. KMO y prueba de Bartlett…………………………………………………… 110

Anexo 4.2 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda-309. Varianza total explicada……………………………………………………… 110

Anexo 4.3. ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda-309. Matriz de componentes rotados………………………………………… 110

Anexo.4.4 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda HHY. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………… 111

Anexo 4.5 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda HHY. Varianza total explicada……………………………………………………… 111

Anexo 4.6. ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda HHY. Matriz de componentes rotados………………………………………… 111


vi

Anexo.4.7 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias

H.hydrossis cuantificados con IE. KMO y prueba de Bartlett…………………………………………….. 112

Anexo 4.8 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias

H.hydrossis cuantificados con IE. Varianza total explicada………………………………………………… 112

Anexo 4.9 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias

H.hydrossis cuantificados con IE. Matriz de componentes rotados…………………………………… 112

Anexo.4.10 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda SAP-309. KMO y prueba de Bartlett……………………………………………. 113

Anexo 4.11 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda SAP-309. Varianza total explicada………………………………………………. 113


hibridadas con la sonda SAP-309. Matriz de componentes rotados………………………………….. 113

Anexo.4.13 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda HHY. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………….. 114


hibridadas con la sonda HHY. Varianza total explicada……………………………………………………… 114


hibridadas con la sonda HHY. Matriz de componentes rotados………………………………………… 114

Anexo.4.16 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias

H.hydrossis cuantificados con IE. KMO y prueba de Bartlett…………………………………………….. 115

Anexo 4.17 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias

H.hydrossis cuantificados con IE. Varianza total explicada………………………………………………… 115

Anexo 4.18 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias

H.hydrossis cuantificados con IE. Matriz de componentes rotados…………………………………… 115

Anexo 4.19. ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con

la sonda SAP-309. KMO y prueba de Bartlett……………………………………………………………………. 116


vii

Anexo 4.20 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con

la sonda SAP-309. Varianza total explicada………………………………………………………………………. 116


la sonda SAP-309. Matriz de componentes rotados………………………………………………………….. 116

Anexo.4.22 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con

la sonda HHY. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………………………………… 117


la sonda HHY. Varianza total explicada……………………………………………………………………………… 117


la sonda HHY. Matriz de componentes rotados………………………………………………………………… 117

Anexo.4.25 ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis

cuantificados con IE. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………………………… 118

Anexo 4.26 ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis

cuantificados con IE. Varianza total explicada…………………………………………………………………… 118

Anexo 4.27 ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis

cuantificados con IE. Matriz de componentes rotados……………………………………………………… 118

Anexo 5.1. Parámetros de crecimiento y operacionales de Haliscomenobacter hydrossis.. 119


viii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Árbol filogenético del Phylum “Bacteroidetes”……………………………………………………….….6

Figura 2. Géneros de la clase “Sphingobacteriia”………………………………………………………………………7

Figura 3. . Filamentos de H. hydrossis con microscopía de contraste de fases, 1500x……………….8

Figura 4. Árbol filogenético del morfotipo filamentoso H. hydrossis basado en las secuencias

del gen 16S rRNA………………………………………………………………………………………………………………………9

Figura 5. Vista aérea EDAR Quart Benàger (QB)………………………………………………………………….…..21

Figura 6. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR QB………………………………………………………22

Figura 7. Vista aérea EDAR Cuenca del Carraixet (CX)………………………………………………………….....22

Figura 8. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CX………………………………………………………23

Figura 9. Vista aérea EDAR Dénia – Ondara – Pedreguer (DE)…………………………………………………24

Figura 10. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR DE………………………………………………….…24

Figura 11. Vista aérea EDAR Castellón de la Plana (CS)……………………………………………………………25

Figura 12. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CS…………………………………………………….25

Figura 13. Fijación de las muestras………………………………………………………………………………………….30

Figura 14. Criterio de valoración de abundancia de filamentos……………………………………………….36

Figura 15. Flujo de procesos para la cuantificación de bacterias………………………………..……………38

Figura 16. Representación esquemática de las matrices del modelo ACP……………………………….44

Figura 17. Ejemplos de muestras de fango activo hibridadas con la sonda HHY mediante FISH

(600x)……………………………………………………………………………………………………………………………………..49

Figura 18. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para la EDAR Quart según FISH para la

sonda HHY………………………………………………………………………………………………………………………………50

Figura 19. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para la EDAR Denia-Ondara-

Pedreguer según FISH para la sonda HHY……………………………………………………………………………….50

Figura 20. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para las dos líneas de tratamiento de

la EDAR Castellón según FISH para la sonda HHY…………………………………………………………………….51


ix

Figura 21. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para las dos líneas de tratamiento de

la EDAR Carraixet según FISH para la sonda HHY………………………………………………………….…………51

Figura 22. Campo de la muestra 07/01/09 de la depuradora Carraixet línea A+B hibridada con

la sonda HHY mediante la técnica FISH (en rojo) y otra correspondiente a toda la comunidad

bacteriana (sonda EUBmix) (en verde)……………………………………………………………………..…………….53

Figura 23. Campo de la muestra 11/02/09 de la depuradora Quart hibridada con la sonda SAP-

309 mediante la técnica FISH (en rojo) y otra correspondiente a toda la comunidad bacteriana

(sonda EUBmix) (en verde)……………………………………………………………………………………………………..53

Figura 24. Hoja de cálculo generada por el programa de cuantificación de señal……………………54

Figura 25. Evolución del porcentaje de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 y HHY

mediante la técnica FISH en la EDAR Quart Benáger. ………………………………………………………….…55


mediante la técnica FISH para la EDAR de Denia…………………………………………………………………….56


mediante la técnica FISH para las dos líneas de tratamiento A+B y C+D de la EDAR de

Castellón…………………………………………………………………………………………………………………………………57


mediante la técnica FISH para las dos líneas de tratamiento A+B y C+D de la EDAR de

Carraixet………………………………………………………………………………………………………………………………...58

Figura 29. Representación gráfica de diagramas de caja y bigotes del promedio del área %

(SAP) ó concentración (mg SSVLM/L) (SAPCONC) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-

309 para cada EDAR estudiada…………………………………………………………………………………………….…60


(HHY) ó concentración (mg SSVLM/L) (HHYCONC) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY

para cada EDAR estudiada………………………………………………………………………………………………………62

Figura 31. Gráficos de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables físico-

químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 (a), HHY

(b) y H. hydrossis cuantificadas con el IE (c)……………………………………………………………………………74

Figura 32. Gráficos de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables físico-

químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 (a),

HHY (b) y H. hydrossis cuantificadas con el IE (c)……………………………………………………………………76

Figura 33. Gráficos de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables

operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 (a), HHY (b) y

H.hydrossis cuantificadas con el IE (c)………………………………………………………………………………….…78


x

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Principales contaminantes de un agua residual…………………………………………………………..1

Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos……………….3

Tabla 3. Sondas del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis……………………………………………………9

Tabla 4. Parámetros de crecimiento de Haliscomenobacter hydrossis…………………………………….11

Tabla 5. Estudios sobre las técnicas y procesado de cuantificación y análisis de imagen…………17

Tabla 6. Número de muestras por depuradora……………………………………………………………….………26

Tabla 7. Relación de muestras estudiadas………………………………………………………………………………27

Tabla 8. Parámetros físico-químicos determinados en el licor mezcla…………………………………….28

Tabla 9. Parámetros físico-químicos determinados en el afluente al reactor y en efluente del

decantador secundario……………………………………………………………………………………………………..……28

Tabla 10. Variables operacionales………………………………………………………………………………………..…28

Tabla 11. Sondas empleadas en la identificación de bacterias filamentosas……………………………34

Tabla 12. Tampón de hibridación según porcentaje de formamida…………………………………………34

Tabla 13. Solución de lavado según porcentaje de formamida……………………………………………….35

Tabla 14. Escala de valoración de organismos filamentosos…………………………………………………...36

Tabla 15. Nomenclatura utilizada en el ACP para las variables físico-químicas……………………….46

Tabla 16. Nomenclatura utilizada en el ACP para los parámetros operacionales…………………….47

Tabla 17. Nomenclatura utilizada en el ACP para las variables biológicas……………………………….47

Tabla 18. Valor medio, mínimo, máximo y desviación típica de los parámetros físico-

químicos…………………………………………………………………………………………………………………………………64

Tabla 19. Valor medio, mínimo, máximo y desviación típica de los parámetros

operacionales..............................................................................................................................65

Tabla 20. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las

sondas SAP-309 y HHY con las variables físico-químicas del afluente……………………………………..67


sondas SAP-309 y HHY con las variables físico-químicas del licor mezcla………………………………..68


sondas SAP-309 y HHY con las variables operacionales del proceso……………………………………….70


xi


sondas SAP-309 y HHY con las variables biológicas del proceso………………………………………………71


xii

ABREVIATURAS y ACRÓNIMOS

ACP: Análisis de Componentes Principales

AGV: Ácidos grasos volátiles

ANOVA: Análisis de varianza de un factor

CCARBO: Carga de carbohidratos

CCD: Charge Coupled Device

CLSM: Microscopio Láser Confocal

CM: Carga Másica

CMdbo3: Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo de LM expresada como

DBO5

CMdqos3: Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo de LM expresada como

DQOs

CS: Castellón de la Plana

CX: Cuenca del Carraixet

DBO5: Demando Bioquímica de Oxígeno total a los 5 días

DBO5NKT: DBO5/NKT

DBOPT: DBO5/PT

DE: Denia-Ondara-Pedreguer

DQO: Demanda Química de Oxígeno

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana

de microorganismos y cultivos celulares)

Dynafilm: Dynamics and composition of filamentous microorganism communities in industrial

water systems

EDAR: Estación Depuradora de Aguas Residuales

EF: Edad de Fango

EPSAR: Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana

Esp: Espumas F: Formamida


xiii

FISH: Hibridación in situ con sondas fluorescentes

he: habitantes equivalentes

H. hydrossis: Haliscomenobacter hydrossis

HHY: Promedio del área % de las bacterias hibridadas con las sondas HHY y EUBmix I, II, II

HHYCONC: concentración (mgSSVLM/l) de las bacterias hibridadas con las sondas HHY y

EUBmix I, II, II

IEHHY: cantidad de H. hydrossis cuantificada por el índice de Eikelboom

IIAMA: Instituto de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente

IF: Índice de Filamentos

IVF: Índice Volumétrico de Fango

Ks: constante de afinidad del substrato

µmax: velocidad específica máxima de crecimiento

QB: Quart Benáger

LM: Licor Mezcla

NH4af: Nitrógeno amoniacal afluente

NTaf: Nitrógeno total afluente

NTSSVLM: Nitrógeno Total del Licor Mezcla (mg/gSSVLM) Oalt: Oxígeno en el reactor biológico >2 ppm

Obajo: Oxígeno en el reactor biológico <0.8 ppm

OD: Oxígeno disuelto

Omed: Oxígeno en el reactor biológico 0.8-2 ppm

PBS: tampón salino fosfato

PFA: paraformaldehido

Phlm: pH del licor mezcla

PO4: Fósforo relativo al ortofosfato

PO4af: Fósforo relativo al ortofosfato del afluente

Prote: Proteínas


xiv

PT: Fósforo Total

PTaf: Fósforo total afluente

PTSSVLM: Fósforo Total del Licor Mezcla (mg/gSSVLM)

R1: reactor 1

R2: reactor 2

SAP: Promedio del área % de las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y EUBmix I, II, II

SAPCONC: concentración (mgSSVLM/l) de las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y

EUBmix I, II, II

SPE: Sustancias Poliméricas Extracelulares

SS: sólidos suspendidos

SSLM: Sólidos en Suspensión del Licor Mezcla

SSVLM: Sólidos en Suspensión Volátiles del Licor Mezcla

T: Temperatura del reactor biológico

TRH: Tiempo de Retención Hidráulico en el reactor biológico

1. INTRODUCCIÓN


1

1. INTRODUCCIÓN

1.1. La depuración de aguas residuales urbanas

La generación de aguas residuales es una consecuencia inevitable de las actividades humanas.

El agua residual se define como aquella constituida por cualquier combinación de aguas

descargadas de actividades domésticas, y de establecimientos industriales o comerciales,

aguas de escorrentía superficial y, accidentalmente, de cualquier agua de infiltración de

alcantarillados (UNE-EN 1085:2007).

La calidad del agua está caracterizada por su composición físico-química y biológica. Siendo la

composición, sin duda, el factor que más influye en el proceso de depuración del agua residual.

A continuación, en la Tabla 1 se describen los principales contaminantes que se pueden

encontrar en el tratamiento de un agua residual y la razón de su importancia.

Tabla 1. Principales contaminantes de un agua residual (Metcalf y Eddy, 1998)

Contaminante Razón de importancia

Sólidos en suspensión Desarrollo de depósitos de fango y condiciones anaerobias en el medio acuático

Materia orgánica biodegradable

Agotamiento de los recursos naturales de oxígeno y desarrollo de condiciones sépticas

Patógenos Posibilidad de transmisión de enfermedades contagiosas

Nutrientes Crecimiento anormal de algas y bacterias (aumento de la turbidez del agua) Eutrofización del agua

Materia orgánica refractaria (agentes tensoactivos, fenoles, pesticidas agrícolas, etc)

Resistencia a la biodegradación y toxicidad

Contaminantes emergentes (productos farmacéuticos y de higiene personal)

Interactuación con el sistema hormonal y endocrino de los organismos de los ecosistemas.

Metales pesados Ecotoxicidad

Sólidos inorgánicos disueltos Reacciones con sustancias disueltas en el agua pasando a formar compuestos peligrosos

Contaminación térmica por descarga de aguas de refrigeración

Modificación de la solubilidad del oxígeno en el agua. Aceleración del metabolismo de la flora y faunas acuáticas (Eutrofización) Alteración de ecosistemas acuáticos

Con el objetivo de prevenir el deterioro de la calidad de los medios receptores de aguas

residuales, así como eliminar, o al menos reducir, los niveles de los contaminantes presentes

en estas aguas, se emplean Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR).

Generalmente las EDAR están compuestas por un tratamiento primario (eliminación de

sólidos), secundario (biológicos) y terciario (desinfección) (Catalán, 1997).


2

1.2. Tratamientos biológicos de aguas residuales. Fangos activos

Los tratamientos biológicos son especialmente utilizados para conseguir una eliminación

eficaz de la materia orgánica, los nutrientes (nitrógeno y fósforo) y los microorganismos

patógenos, utilizando reacciones asociadas a los organismos vivos. Los microorganismos

crecen utilizando los contaminantes del agua como fuente de carbono y/o como fuente de

energía, convirtiéndolos en nuevos microorganismos (biomasa), dióxido de carbono y

otros compuestos inocuos (Ferrer y Seco, 2007).

El proceso de fangos activos es el sistema de tratamiento biológico más extendido en la

depuración de aguas residuales urbanas. Se trata de un tratamiento biológico de cultivo en

suspensión donde una masa activa de microorganismos se encarga de estabilizar un

residuo orgánico por vía aerobia. La matera orgánica se oxida hasta CO2, NH3 y H2O y

nueva biomasa celular.

El aire es aportado por medio de difusores o aireación mecánica. La biomasa celular

obtenida forma flóculos que sedimentan en el tanque de clarificación o sedimentación

(Bitton et al. 1999).

Una parte de la biomasa decantada se recircula al reactor para mantener una

concentración de microorganismos adecuada, mientras que el resto del fango se extrae

del sistema evitando una acumulación excesiva de biomasa y controlando el tiempo de

retención celular (Knobelsdorf et al. 2005).

1.2.1. El flóculo

Un requerimiento esencial para el correcto funcionamiento del proceso de fangos activos

es la formación de un flóculo adecuado de microorganismos en el tanque de aireación,

con el tamaño adecuado para soportar las turbulencias del agua y poder sedimentar

posteriormente, produciendo un sobrenadante fluido y claro.

El flóculo, como unidad fundamental estructural y funcional del fango activo, está

compuesto por la agregación de partículas orgánicas e inorgánicas del agua afluente junto

con microorganismos (bacterias formadoras de flóculo y bacterias filamentosas), todo ello

en un proceso facilitado por la excreción de sustancias poliméricas extracelulares (SPE) de

origen microbiano (Jenkins et al. 2004). Junto al flóculo aparecen asociadas unas

comunidades de organismos superiores (protozoos y metazoos), que desempeñan un

papel fundamental en la depuración.


3

En el flóculo se distinguen dos niveles estructurales: la microestructura y la

macroestructura (Sezgin et al. 1978). La microestructura la confieren los procesos de

agregación y biofloculación, dando lugar a la formación de flóculos pequeños, esféricos,

compactos y débiles. La macroestructura del flóculo está originada por las bacterias

filamentosas, estos organismos forman una “espina dorsal” dentro del flóculo donde las

bacterias formadoras de flóculo (microestructura) se adhieren. Por tanto, generan la

consistencia suficiente para que puedan formarse flóculos más fuertes, grandes y

resistentes a la agitación del reactor biológico.

Cuando la proporción de bacterias filamentosas y formadoras del flóculo crecen en

equilibrio se forma el flóculo ideal, que es compacto, denso, grande y sedimenta bien,

permitiendo obtener un sobrenadante claro y un fango concentrado. En caso contrario,

aparecen problemas de separación de los sólidos del fango activo, relacionados con la

naturaleza del flóculo.

1.2.2. Problemas en los sistemas de fangos activos producidos por microorganismos

Existen algunos tipos de problemas en la separación de sólidos en los sistemas de fangos

activos en los que se ven implicados los microorganismos presentes en el reactor y en el

decantador secundario. A continuación se describen brevemente los principales

problemas detectados y sus posibles causas y efectos (Tabla 2).

Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos (Jenkins et al. 2003; Ferrer y Seco, 2007)

Problema Causa Efecto

Crecimiento disperso

Los microorganismos no forman flóculos, están dispersos, formando pequeños grupos o células aisladas.

Efluente turbio.

Bulking viscoso o no filamentoso

Fallo de la microestructura por exceso de polímeros extracelulares.

Fango viscoso con problemas de sedimentación y compactación.

Flóculo punta de alfiler, “Pin-floc” o “Pinpointfloc”

Fallo de la macroestructura del flóculo debido a la ausencia a una proporción excesivamente baja de bacterias filamentosas.

Flóculos de pequeño tamaño y de consistencia débil que no sedimentan bien, produciendo un sobrenadante turbio con muchos sólidos en suspensión. Índice volumétrico del Fango (IVF) bajo.

Esponjamiento o “Bulking”

Fallo de la macroestructura por un exceso de organismos filamentosos.

Sedimentación y compactación muy

deficientes. En casos severos hay

pérdidas de fango con el efluente. IVF

alto y sobrenadante muy claro.


4

Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos

Formación de espumas y/o natas o “Foaming”

Asociado a determinadas tipos de bacterias filamentosas (Nocardia spp y Microthrix parvicella). Y sobrenadantes no degradables.

Grandes cantidades de sólidos del fango activo flotan formando espuma en la superficie de los elementos de tratamiento, pudiendo salir con el efluente.

Manto ascendente o flotación de fangos

La desnitrificación en el clarificador secundario libra N2 gaseoso poco soluble que se adhiere a los flóculos de fango activo arrastrándolos a la superficie del clarificador.

Se forma una espuma de fango activo en la superficie del clarificador secundario.

1.2.3. Composición de la microbiota

El papel de los microorganismos es fundamental en el proceso de depuración de aguas

residuales. La biomasa del fango activo está constituida por bacterias, protozoos, hongos,

rotíferos, algas y nematodos.

En el fango activo, los microorganismos más abundantes son las bacterias, constituyendo

el 95% de la biomasa. Intervienen principalmente en la eliminación de materia orgánica

por distintas vías y en la eliminación de nutrientes. Sin las bacterias formadoras de flóculo

y las bacterias filamentosas sería imposible la sedimentación y la obtención de un efluente

clarificado y de calidad.

El segundo grupo más importante y numeroso son los protozoos, constituyendo el 5% de

la biomasa (Fernández-Galiano et al. 1996; Serrano et al. 2008). Las funciones principales

del grupo protista son eliminación de patógenos y coliformes, clarificado del efluente y

biofloculación.

Los hongos no son considerados de importancia en el proceso de depuración, debido a

que bajo determinadas condiciones pueden proliferar pero rara vez compiten con las

bacterias en la utilización de la materia orgánica disuelta.

El papel principal de las algas en los sistemas de depuración es el de proporcionar oxígeno

a las bacterias para que éstas puedan participar activamente en la eliminación de materia

orgánica del agua residual (Ferrer, 2007). Por el contrario, la excesiva proliferación de

algas puede dar lugar a graves problemas como atascos en las conducciones.

El último grupo en los sistemas de fangos activos son los rotíferos junto con los nematodos

que constituyen la cima de la cadena trófica. La principal función es la depredación de

organismos inferiores, sin embargo los rotíferos además eliminan bacterias dispersas y


5

contribuyen a la formación del flóculo por la secreción de mucus. Son indicadores de un

buen funcionamiento del proceso de depuración. La presencia de elevadas cantidades de

rotíferos y nematodos indica una edad del fango alta y por lo tanto cambios en la

capacidad de depuración del fango activo.

1.3. La importancia de las bacterias filamentosas

En todos los tipos de Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales con procesos de fangos

activos aparecen las bacterias filamentosas, siendo responsables de la mayoría de los

problemas de bulking y foaming (Jenkins et al. 2004; Seviour y Nielsen, 2010). La excesiva

abundancia de estas bacterias puede ser problemática para la operación de la planta y no

existe una estrategia universal para limitar o prevenir este comportamiento problemático

(Eikelboom, 2000; Jenkins et al. 2004).

Más de 30 morfotipos filamentosos han sido identificados en plantas de tratamiento de

aguas residuales urbanas (Eikelboom, 2000), siendo este número mayor en plantas que

reciben agua de origen industrial (Eikelboom y Geurkink, 2002; Eikelboom, 2006).

Las bacterias filamentosas deben ser consideradas como un miembro más de la

comunidad biológica de los fangos activos, ya que están involucradas en la degradación de

la materia orgánica.

1.3.1 Phylum Bacteroidetes

El phylum Bacteroidetes está compuesto por cuatro grupos filogenéticos: “Bacteroidia”,

“Flavobacteria”, “Sphingobacteria”, y “Cytophagia” según el Bergey’s Manual of Systematic

Bacteriology (Bergey’s, 2011); representando 15 familias y alrededor de 7.000 especies

diferentes (NCBI, 2010). Además, dos grupos están relacionados con el phylum pero no están

realmente asignados a ninguna de las 4 clases existentes. Sin embargo, mientras no exista

nueva información que evidencie a qué clase pertenecen, estos organismos se clasifican como

“Incertae sedis” de la clase “Cytophaga” a día de hoy (Figura 1).


6

Figura 1. Árbol filogenético del Phylum “Bacteroidetes” (Bergey’s, 2011)

Bacterias filamentosas del phylum Bacteroidetes han sido identificadas en diferentes

ambientes como sistemas marinos (Kämpfer, 1995), marismas (Lydell et al. 2004) y en sistemas

de fango activo (Eikelboom, 2002; Jenkins et al. 2004; Kämpfer, 1995; Wagner et al. 1994).

Dentro de la clase “Sphingobacteriia”, está la familia “Saprospiraceae”, donde se encuentra la

especie Haliscomenobacter hydrossis objeto de estudio del presente trabajo (Figura 2). El

genoma de H. hydrossis es la primera secuencia completa de genoma publicada de un

miembro de la familia “Saprospiraceae” (Daligault et al. 2011).

En sistemas de fango activo, Haliscomenobacter hydrossis es la única especie que se ha aislado

dentro de este phylum (Eikelboom, 1975; Kämpfer, 1995; van Veen et al. 1973; Williams y Unz,

1985).


7

Figura 2. Géneros de la clase “Sphingobacteriia” (Bergey’s, 2011)

1.3.1.1 Haliscomenobacter hydrossis

Haliscomenobacetr hydrossis es una bacteria filamentosa que ha sido detectada en distintas

muestras de fangos activos por todo el mundo (Eikelboom, 2006; Van Veen et al. 1973).

H. hydrossis ha sido identificada en diversas muestras de agua con foaming y bulking de EDAR

de EEUU, diversos países europeos, Sudáfrica y Australia, en función de sus características

morfológicas (Jenkins et al. 2004; Seviour y Nielsen 2010).

Se caracterizan morfológicamente por presentar filamentos cortos y rectos (con apariencia de

agujas) o largos y un poco torcidos, normalmente salientes de los flóculos (Figura 3); Pueden

encontrarse en el fóculo o libres en suspensión, presentando una longitud entre 10 y 200 µm.

Ocasionalmente se presentan filamentos largos unidos, no ramificados (observándose

raramente falsas ramificaciones), no móviles, de longitud variable, con un diámetro de célula

en torno a 0,4 µm. Las células están rodeadas por una vaina, pudiendo existir adherencia, no

observándose septos (aunque pueden aparecer espacios vacíos en las células de los

filamentos). Además no presentan almacenamiento de sulfuro, ni oxidación de sulfuro, son

Gram negativas y Neisser negativas (Eikelboom, 2006; Jenkins, 2003).


8

Figura 3. Filamentos de H. hydrossis con microscopía de contraste de fases, 1500x

(Eikelboom, 2008)

Existen diferentes morfotipos que tienen en común que presentan filamentos finos, rectos o

torcidos como H. hydrossis, y células sin septo visible, sin embargo no hibridan con las sondas

de H. hydrossis o con las sondas específicas de este grupo (Eikelboom, 2008):

Tipo IF-33: muchos filamentos cortos, principalmente se presentan dentro de los

flóculos.

Tipo IF-45: Neisser positivo (gránulos pequeños).

Tipo IF-46: Gram and Neisser positivo (gránulos pequeños).

Tipo IF-47: filamentos torcidos libres en la fase acuosa.

Tipo IF-53: comparada con H. hydrossis presenta filamentos más robustos,

ocasionalmente enmarañados.

Tipo 0092: comparada con H. hydrossis presenta filamentos más robusto, y tinción

gris-violeta con Neisser.

1.3.1.2. Identificación de Haliscomenobacter con la técnica FISH

La identificación de bacterias filamentosas a partir de diferencias morfológicas y tamaños de

las células y filamentos, puede ser ambigua, por ello es conveniente utilizar métodos

moleculares como la técnica FISH para una identificación más precisa. Las sondas que se

utilizan en la actualidad para la identificación y cuantificación de H. hydrossis son las que

aparecen descritas en la Tabla 3. En la Figura 4 se muestra el árbol filogenético basado en el

análisis comparativo de las secuencias del gen 16S rRNA de los principales morfotipos de la


9

bacteria filamentosa H. hydrossis. Los corchetes indican la cobertura de las sondas descritas en

la Tabla 3.

Tabla 3. Sondas del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis

Sonda Diana Comentarios Referencias

SAP-309 Mayoría de miembros de la Saprospiraceae

Filamentos y células aisladas

Schauer y Hahn (2005)

HHY-654 H. hydrossis y Aislado 10B Filamentos Kragelund et al. (2008)

HHY H. hydrossis Filamentos Wagner et al. (1994)

Figura 4. Árbol filogenético del morfotipo filamentoso H. hydrossis basado en las secuencias

del gen 16S rRNA (Nielsen et al. 2009).

El proyecto Dynafilm1 de la UE estudió la comunidad de microorganismos filamentosos en

aguas industriales. Wagner et al. (1994) participó en el proyecto y utilizó la sonda HHY en

muestras del licor mezcla de 10 EDAR alemanas. La sonda está basada en la secuencia de

nucleótidos de una cepa de H. hydrossis de la colección de DSMZ2. Se encontró H. hydrossis en

1 Dynamics and composition of filamentous microorganism communities in industrial water systems 2 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares).


10

6 de las 10 depuradoras. Se visualizó en gran medida como filamentos finos teñidos. Éstos,

normalmente se localizaban dentro de los flóculos del fango, tal y como describe van Veen et

al. (1973). Por ello, la cuantificación de Haliscomenobacter ssp. con microscopía convencional

suele estar infravalorada, ya los que finos filamentos son casi indetectables en los flóculos

gruesos de fango activo.

Van der Waarde et al. (2002) realizó un exhaustivo estudio con la sonda HHY en 70 EDAR de 11

tipos de tratamientos industriales en 4 países (Países Bajos, Dinamarca, Alemania e Italia):

industrias de patata, leche, alimentarias, papel, carne, químicas, cerveza, azúcar, textil,

curtiduría y otras. H. hydrossis fue frecuentemente observada (58% de las muestras), sin

embargo su abundancia en estas muestras no fue estudiada.

Posteriormente, se diseñaron nuevas sondas para detectar filamentos con forma de aguja de

apariencia similar a H. hydrossis (Kragelund et al. 2008):

sonda HHY-654: esta nueva sonda hibrida otro aislado de H. hydrossis aparte de la

cepa tipo DSMZ. El nuevo aislado presenta una semejanza de 97,5% con la secuencia

de la cepa DSMZ

sonda HHY-T5-654: esta sonda se basó en un producto de RT-PCR (filamentos

obtenidos mediante micromanipulación) y comparte un 87.8% de semejanza con la

secuencia del gen 16S rRNA respecto a H. hydrossis (cepa DSMZ).

Kragelund et al. (2008) estudiaron la abundancia de H. hydrossis y de filamentos similares a H.

hydrossis en 126 muestras de EDAR diferentes industrias y 5 muestras de EDAR municipales de

Dinamarca, Italia, Polonia, Alemania y los Países Bajos. Para ello utilizó las sondas HHY, HHY-

654, HHY-T5-654 y SAP (309), esta última porque cubre la mayoría de las secuencias de la

familia Saprospiraceae y el género Haliscomenobacter. Pequeñas poblaciones de H. hydrossis y

filamentos similares a H. hydrossis fueron observados en la mayoría de EDAR (68%), sin

embargo sólo en un 13% de las EDAR estudiadas tenían grandes poblaciones de Bacteroidetes

potencialmente responsables de “bulking”. La gran variedad de industrias en las que aparece

demuestra que no es posible relacionar las diferentes cepas de "H. hydrossis" con un agua

residual específica.

Sin embargo, alrededor del 40% de las muestras, donde una gran población de filamentos

semejantes a H. hydrossis fueron observados por microscopía convencional de contraste de

fases, presentaron ninguna o casi ninguna señal de hibridación con FISH para las sondas

empleadas. Es por tanto evidente que el morfotipo de H. hydrossis incluye por lo menos 4


11

especies y son necesarias más sondas para una completa identificación de este morfotipo con

la técnica FISH.

1.3.1.3. Ecofisiología

Un buen conocimiento de la ecología y fisiología de las bacterias filamentosas, junto con las

condiciones del proceso de depuración, proporciona el desarrollo de mejores y más eficientes

estrategias de control (Kragelund et al. 2008).

En la siguiente Tabla 4 se muestran los rangos óptimos de los parámetros de crecimiento para

H. hydrossis (Mulder y Deinema, 2006; van Veen et al. 1973).

Tabla 4. Parámetros de crecimiento de Haliscomenobacter hydrossis

Parámetro Descripción

Categoría nutricional Quimiorganotrofo

Desnitrificación Nitrato reducido a nitrito

Medio de cultivo Requieren: Glucosa y sacarosa y fuentes inorgánicas y orgánicas de N como glutamato, aspartato y casaminoácidos. tiamina y vitamina B12.

pH 7,0-8,0

Tª 8-30 (óptimo 26)

Requerimientos Oxígeno Disuelto (OD)

Aerobio

µmax 1.2-2.2 d-1

Ks mgl-1

5 mgl-1

para glucosa

En general, todos los filamentos de Haliscomenobacter hydrossis y filamentos similares a H.

hydrossis utilizan glucosa y propionico, pero nunca acetato. Parece que estén relativamente

especializados en la degradación aerobia de azucares, debido a su capacidad de tomar glucosa

y N-acetilglucosamina (Kragelund et al. 2008). Sin embargo, presenta una estricta dependencia

ante la presencia de calcio, magnesio y fosfato; altas concentraciones de amonio (>2 g/l)

inhiben el crecimiento de Haliscomenobacter y además prefiere un rango de concentración de

fósforo (0.05-0.2 g/l) y una baja concentración de extracto de levadura y peptona (Kämpfer et

al. 1995b)

Unidades de N-acetilglucosamina se encuentran en lipopolisacáridos y peptoglicanos de la

pared celular, los cuales son componentes liberados por las células en descomposición (Barker

and Stuckey, 1999). Cuando se produce la degradación continua de las células en EDAR,

unidades de N-acetilglucosamina pueden proporcionar el crecimiento de las bacterias

filamentosas del phylum Bacteroidetes y por tanto explicar su presencia en muchas EDAR. La

toma de N-acetilglucosamina y mezcla de aminoácidos por finos filamentos Bacteroidetes

también ha sido observada en biofiltros de una EDAR municipal y cultivados en un reactor en

laboratorio (Kindachi et al. 2004).


12

Kragelund et al. (2008) observaron diferentes exo-enzimas excretados por filamentos similares

a H. hydrossis, como glucuronidasas, esterasas y quitinasas, que servirían para la ruptura de los

polisacáridos. La hidrólisis con exo-enzimas de peptoglicanos y lipopolisacáridos en unidades

de N-acetilglucosamina, puede contribuir como continuo aporte de substrato para las

bacterias y promover un nicho altamente especializado en EDAR. Esta especialización en

polisacáridos ha sido confirmada en estudios de cultivo puro en H. hydrossis ((Kämpfer, 1995;

Krul, 1977; Mulder y Deinema, 1992; van Veen et al. 1973, 1982).

1.3.1.4. Operaciones de control

Finos filamentos de Bacteroidetes están presentes en muchas EDAR, tanto municipales como

industriales, pero raramente están involucrados en incidencias de bulking y foaming, sin

embargo contribuyen en el índice global filamentoso de la muestra. Normalmente, no tiene

una gran importancia realizar acciones preventivas para eliminar estos filamentos de las EDAR.

Sin embargo, en raros casos donde causan problemas, el control es necesario (Kraegelund et

al. 2008; Seviour y Nielsen 2010).

Para resolver un problema de bulking se suelen realizar las siguientes operaciones de control

(Eikelboom, 2002; Jenkins et al. 2004; Tandoi et al. 2005):

Buen mantenimiento.

Eliminar deficiencias de oxígeno: O2 > 2 mg / l y DBO: N:P= 100:5:1.

Configuración en dos etapas (aeróbico/ aeróbico o anaeróbio/aerobio), para eliminar

la mayoría de la fracción fácilmente biodegradable antes de que entre al tanque de

aireación.

Selector aerobio.

Zona anóxica si hay suficiente nitrito/nitrato disponible para eliminar la fracción

disuelta del influente por medio de desnitrificación.

Zona anaerobia con combinación de proceso Bio-P.

Control de síntomas, por ejemplo, aplicando métodos físicos o químicos encaminados

a destruir filamentos o a mejorar la velocidad de sedimentación de los flóculos por

aumentar su peso.

Diferentes autores han propuesto las siguientes condiciones operacionales en las EDAR que

favorecen el crecimiento de H. hydrossis:

Bajos niveles de oxígeno disuelto, aunque valores exactos de estos niveles no son

conocidos (Eikelboom y van Buisen 1983; Jenkins et al. 2004).


13

Elevadas edades de fango o altos tiempos de residencia celular.

Baja Carga másica (CM). Elevadas edades de fango o altos tiempos de residencia

celular. Valores de CM mayores a 0,15 Kg DBO5 /Kg MLSS d (Lemmer y Lind, 2000), en

un rango bastante amplio de CM de 0,1 a 0,75 Kg DBO5 /Kg MLSS d según Richard

(1989) y Eikelboom (2000).

Deficiencia de nitrógeno o fósforo en los licores mezcla.

Sustratos solubles fácilmente biodegradables.

Se ha sugerido como control potencial de muchas bacterias filamentosas la selección

metabólica, con cambios de condiciones aerobias a anóxicas o anaerobias estrictas donde las

bacterias no son capaces de crecer (Wanner, 1994). Sin embargo, no parece ser suficiente para

eliminar completamente la presencia de los finos filamentos de Bacteroidetes. De hecho, en

muchas EDAR estudiadas, con diferente configuración de procesos

(nitrificación/desnitrificación y eliminación biológica del fósforo) se encontraban todavía

poblaciones de H. hydrossis y filamentos similares a H. hydrossis (Kragelund et al. 2008). Esto

puede ser debido su alta resistencia al estrés por falta de nutrientes (Chiesa y Irvine, 1985), y

su capacidad en utilizar N-acetilglucosamina y compuestos similares, que comparten con unas

pocas bacterias como las del phylumChloroflexi (Kindachi et al. 2004).

No existe un protocolo de control específico de H. hydrossis y filamentos similares a H.

hydrossis, por su especialización en la degradación de azúcares procedentes de la

descomposición celular de la pared bacteria, que hace imposible eliminar el contenido de

estos sustratos para reducir su abundancia en las aguas de las EDAR (Kragelound et al. 2008).

Se está investigando en nuevas técnicas de control basadas en la utilización de bacteriófagos

específicos. Recientemente, Kotay et al. (2011) realizaron un estudio donde se controlaba la

biomasa de H. hydrossis mediante la aplicación de un bacteriófago lítico (virus).

1.4. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos

1.4.1 Técnicas convencionales

Los métodos clásicos se basan en la observación microscópica de las muestras para

determinar las características morfológicas, tamaño de la célula y del filamento, y

respuesta a la tinción Gram y Neisser. Eikelboom en 1975 publicó el sistema de

identificación convencional para las bacterias filamentosas más frecuentes en fangos

activos. Posteriormente Eikelboom y van Buijsen (1983) y Jenkins et al. (1993),


14

desarrollaron unas claves de identificación dicotómicas en función de una serie de

características morfológicas y una reactiva a las tinciones diferenciales clásicas.

Los caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación de Eikelboom (1975), y de

Jenkins et al. (2004) son: presencia o ausencia de ramificaciones, movilidad, forma del

filamento (curvo, irregular, enrollado, etc.), color, ubicación respecto al flóculo, existencia

de crecimiento epífitico, vaina, septos, constricciones celulares, dimensiones celulares,

dimensiones del filamento, forma celular (cuadrada, rectangular, ovalada, etc.), presencia

de biopolímeros de azufre y gránulos de polifosfato, reacciones de tinción (Gram y

Neisser) y formación de rosetas y gonidios.

Las versiones más actualizadas, Eikelboom (2000, 2006) y Jenkins et al. (2004), son una

modificación de las claves de identificación de Eikelboom y van Buijsen (1983) donde se

recogen las bacterias filamentosas más frecuentes en fangos activos.

Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de microorganismos

en EDAR de aguas residuales, sin embargo no dan información fiable sobre la identidad

exacta de los filamentos observados, por ello, los filamentos son designados con los

términos “tipo” o “morfotipo” en vez de especie.

La identificación y cuantificación mediante las técnicas convencionales puede resultar

dificultosa por una serie de razones:

Esta metodología es subjetiva y depende del nivel de entrenamiento y de la

experiencia del que realiza la cuantificación e identificación.

Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer

iguales.

Algunos filamentos que se encuentran en el interior de los flóculos son difíciles de

identificar y cuantificar.

Estructura abierta de los flóculos.

Elevada población de filamentos.

Los métodos clásicos complementan a las técnicas moleculares ya que proporcionan

información de interés sobre las características del flóculo y la presencia de protozoos y otros

microorganismos asociados. La microscopía convencional es considerada una herramienta

indispensable para el control del proceso de depuración pero a nivel microbiológico realmente


15

solo unas pocas bacterias filamentosas han podido ser identificadas según sus características

morfológicas, por ello actualmente se sabe que la identificación de las bacterias del fango

activo no puede llevarse a cabo utilizando sólo el método convencional (Nielsen et al. 2009b).

1.4.2. Técnica FISH

Para la identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos, se emplean los

métodos moleculares (Blackall, 1994; Bradford et al. 1996; Erhart et al. 1997; Kanagawa et al.

2000; Wagner et al. 1994), en particular la técnica de hibridación in situ con sondas u

oligonucleótidos 16S rDNA/23S rDNA marcadas con fluoróforos (FISH) ha sido particularmente

productiva a la hora de llevar a cabo dicho objetivo (Nielsen et al. 2009b). Esta técnica es

común para la detección e identificación de microorganismos en diferentes ambientes

microbianos, en los que se incluyen comunidades de bacterias como las presentes en los

sistemas biológicos de depuración con fangos activos (Amann et al. 1995).

La técnica FISH se basa en la hibridación directa de la bacteria a identificar con una sonda

complementaria de una región del gen 16S o 23S ARN ribosómico, que previamente se ha

diseñado para que sea específica de la bacteria que se va identificar. La sonda está marcada

con una molécula fluorescente de tal forma que los híbridos formados se pueden detectar

fácilmente con un microscopio de epifluorescencia. .

La especificad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles taxonómicos como son

dominio, phylum, clase, familia, género o especie para la identificación de las bacterias

presentes en el fango activo. Las sondas deben ser lo suficientemente específicas para unirse

únicamente a la bacteria que se quiere identificar. Para asegurar la especificidad, los dos

parámetros determinantes son la temperatura y la concentración de formamida en el tampón

de hibridación (Alonso et al. 2009). La formamida hace que disminuya la temperatura de unión

de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de hidrógeno, es decir, disminuye la

temperatura de fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72ºC por cada 1% de formamida

utilizada y permite realizar la hibridación a 46ºC (Alonso et al. 2009).

El paso final de la hibridación in situ es la detección de la sonda marcada que hibridó con las

células. Para ello se requiere de un microscopio de epifluorescencia equipado con diferentes

filtros para los diversos espectros de color, en este caso se debe tener en cuenta el tipo de

fluorocromo con el que fue marcada la sonda y de esta manera emplear la longitud de onda

adecuada que excitará el fluorocromo y emitirá la fluorescencia.


16

La técnica de hibridación con sondas marcadas con fluoróforos in situ (FISH), presenta una

serie de ventajas frente a otras técnicas de detección e identificación:

Permite detectar varias especies o géneros en una misma muestra, utilizando una

sonda para cada especie, género o grupo, marcada con fluoróforos distintos.

No se han detectado sustancias inhibidoras que interfieren en la reacción de

hibridación.

Puede determinar directamente la abundancia de los microorganismos detectados.

No necesita cultivo previo de la bacteria ni la extracción de los ácidos nucleicos

(Nielsen et al. 2009b).

Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años).

Se mantiene la morfología de la célula y el flóculo (Nielsen et al. 2009b).

Puede utilizarse junto a la tinción DAPI para determinar si las células estudiadas están

vivas o no, siendo muy útil para la monitorización de estado de la microbiota durante

la adicción de tóxicos para el control de “bulking” y “foaming”.

Sin embargo se aprecian ciertas limitaciones:

La identificación a través de FISH es solo posible si la sonda requerida está disponible.

Se han desarrollado sondas para varias especies filamentosas importantes, pero aún

no para todas las especies que puedan aparecer en el fango activo.

Podría afectar las características morfológicas de las especies filamentosas.

Las bacterias filamentosas con bajo contenido ribosomal no dan una señal fluorescente

clara con la sonda.

Puede ocurrir que una sonda específica para una especie de una señal fluorescente

con otras especies, si sus composiciones de rRNA son muy parecidas. Tales resultados

positivos falsos pueden ser prevenidos mediante la aplicación de sondas

competidoras.

No entrega información sobre características importantes de fango, tales como la

población de protozoos o las características del flóculo.


17

1.4.3. Análisis de imagen

La tecnología de procesamiento digital de imágenes mejora la detección de la señal mediante

la aplicación de técnicas sobre la imagen con el fin de hacerla más adecuada para una

determinada aplicación o procesamiento posterior. Diversas aplicaciones informáticas han sido

desarrolladas en el estudio del monitoreo microbiano en EDAR utilizando técnicas de análisis

cuantitativo de imagen tal y como se recoge en la Tabla 3 (Costa et al. 2013).

Tabla 5. Estudios sobre las técnicas y procesado de cuantificación y análisis de imagen

Microscopio Aumentos Iluminación Adquisición de imágenes

Software Referencias

Stereo X50 Campo oscuro

CCD cámara (±10)

Microsoft Visual C++

Grijspeerdt and Verstraete (1997)

Luz óptica X400 Contraste de fases

CCD cámara

Visilog 5.1 Amaral et al. (1999)

Luz óptica X100 Campo claro Vídeo cámara (70)

Visilog TM 5

da Motta et al. (2001b)

Luz óptica X100 Contraste de

fases

CCD cámara

(50)

Matlab

Image

Processing

Toolbox

Jenné et al.

(2002)

Luz óptica X1000 Contraste de fases

CCD cámara (±12)

Global Lab Image 2.10

Contreras et al. (2004)

Luz óptica (filamentos) y stereo (agregados)

X100 (filamentos), x100 (microagregados), x40 (macroagregados)

Contraste de fases (filamentos) y campo claro (agregados)

CCD cámara (±100)

Matlab Araya-Kroff et al. (2004)

Luz óptica X100 Campo claro Vídeo cámara (70)

Visilog TM5

Pandolfi and Pons (2004)

Micro lens - Iluminador halógeno

CCD cámara (40)

NI Vision Assitant

Yu et al. (2009)

Luz óptica y epifluorescencia

X100, x200 Campo claro CCD cámara (150+100)

Matlab Mesquita et al. (2011a, b)

El análisis de imagen combinado con FISH es un sistema que se está expandiendo como técnica

biológicas de análisis en EDAR. Esta técnica permite una rápida cuantificación de

microorganismos (Hug et al. 2005) y una precisa caracterización de los agregados microbianos

(Liu et al. 2010).


18

El sistema más sensible utilizado en FISH es mediante el empleo de la cámara CCD (Charge

Coupled Device), la cual detecta fotones con una alta eficacia sobre rangos de amplio espectro

de longitud de onda y que además, mediante un paquete informático apropiado para el

análisis de imágenes, permite la digitalización y manipulación de las mismas.

Otro equipo usado para FISH es el microscopio láser confocal (CLSM). Al restringir la señal a

una sección fina de la muestra que se investiga, la fluorescencia desenfocada es removida, lo

cual genera imágenes más definidas. El sistema es usado para muestras densas como fangos

activos, biopelículas o cortes de tejidos. Así mismo, el CLSM ha permitido el recuento de

microorganismos presentes en la muestra (Stoecker et al. 2010; Trujillo et al. 2010).

Daims et al. (2001) desarrolló un protocolo para determinar la concentración de bacterias en

muestras ambientales con la combinación de FISH, CLSM y análisis digital de imagen,

demostrando la utilidad de esta técnica para células no distribuidas homogéneamente.

Otros estudios se han realizado utilizando empleando FISH y análisis de imagen para conocer

cómo la combinación del contenido y densidad de filamentos afecta a la decantación de la

biomasa en sistemas de fango activo. En este caso se empleó el software ImageJ V1.37 (Jassby

et al. 2014).

1.5. Parámetros operacionales del proceso de depuración.

Los parámetros operacionales básicos de diseño más utilizados en el control y seguimiento de

las EDAR son la carga másica (CM) y la edad del fango (EF) (Zornoza et al. 2012).

La carga másica representa la relación existente entre la carga orgánica alimentada al reactor y

los microorganismos presentes en él. Suele definirse como la demanda bioquímica de oxígeno

en 5 días (DBO5) que llega diariamente al tratamiento biológico en relación con la masa de

fangos en el reactor, los sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla (SSVLM) diarios en el

reactor, o incluso puede definirse relacionando dicha DBO con los sólidos suspendidos totales

del licor mezcla (SSLM), por ello es muy importante al hablar de carga másica establecer a qué

concentración de sólidos está referida (Ferrer, 2007).

La EF representa la relación expresada en días entre la masa de fango en el reactor y la masa

de fangos eliminada diariamente de la instalación. Dicho parámetro da una idea acerca del

tiempo de retención de los microorganismos en la EDAR, ya que estos siguen un ciclo desde


19

que son decantados y recirculados al reactor, hasta que salen por la corriente de purga de

fangos en exceso.

Las variables CM y EF conceptualmente guardan entre sí una relación inversa. Recientemente

se ha demostrado que esta relación no siempre tiene lugar en una escala real. El sustrato

puede variar en un espacio corto (días) o largo de tiempo (meses) y la temperatura puede

fluctuar en mayor o menor grado en función de la estacionalidad y de la situación geográfica

de las EDAR (Zornoza et al. 2012).

Otro parámetro operacional es el Tiempo de Retención Hidráulico (TRH). El TRH se define

como el tiempo medio de permanencia del agua o del fango en los reactores de la planta de

eliminación de materia orgánica y nutrientes. Se obtiene a partir del volumen del reactor y del

caudal de alimentación. El TRH de la mezcla de fango activo y afluente es un parámetro

operacional del cual aparecen escasas referencias en los manuales de Eikelboom (2006) y

Jenkins et al. (2004). Este es un parámetro hidráulico está relacionado indirectamente con la

CM.

2. OBJETIVOS


20

2. OBJETIVOS

El desarrollo de este trabajo tiene como objetivo principal la identificación y

cuantificación de la población de bacterias filamentosas del morfotipo

Haliscomenobacter hydrossis en 4 EDAR (Quart Benáger, Castellón, Denia y Carraixet)

de la Comunidad Valenciana, durante un período de un año.

Se estudiará la dinámica poblacional de Haliscomenobacter hydrossis y las relaciones

entre las variables operacionales y físico-químicas, que pueden afectar a su actividad y

crecimiento.

Como último objetivo se comparará el índice de Eikelboom con la técnica de FISH

combinada con el análisis de imagen para la cuantificación de bacterias filamentosas.

De esta forma se tratará de optimizar la metodología de cuantificación de bacterias

filamentosas en muestras de agua de EDAR mediante la técnica de FISH combinada

con el análisis de imagen.

3. MATERIAL Y MÉTODOS


21

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Toma de muestras

En el presente estudio se tomaron muestras del licor mezcla de cuatro EDAR de la Comunidad

Valenciana con una frecuencia quincenal durante un año.

Las muestras analizadas en este proyecto son proporcionadas por el Instituto de Ingeniería del

Agua y Medio Ambiente (IIAMA).

A continuación se presentan algunas de las características de estas depuradoras, así como sus

esquemas de funcionamiento.

3.1.1. EDAR Quart Benàger (QB)

La depuradora de Quart-Benàger (Figura 5) se ubica en la comarca valenciana de L´Horta Oest,

dando servicio a los municipios de Alacuás, Aldaia, Manises, Mislata, Quart de Poblet, Valencia

y Xirivella.

Figura 5. Vista aérea EDAR Quart Benàger (QB)

Según datos del 2013, trata un caudal de agua residual y urbana de 33.785 m3/día,

abasteciendo a una población de 154.421 habitantes equivalentes y presenta unos

rendimientos de eliminación para sólidos suspendidos y DBO5 del 98% y del 95% para DQO.

El tratamiento biológico se desarrolla en cuatro reactores paralelos anóxico-anaerobio de

geometría rectangular (Figura 6).


22

Figura 6. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR QB

3.1.2. EDAR Cuenca del Carraixet (CX) La EDAR Cuenca del Carraixet (Figura 7) está ubicada en la comarca valenciana de L´Horta

Nord, en el municipio de Alboraya. Trata un caudal de agua de 36.843 m3/día, procedente de

13 municipios colindantes (177.666 he) según datos publicados del 2013 de la EPSAR. Para

este mismo año, los rendimientos de eliminación obtenidos fueron para los sólidos

suspendidos del 98%, para DBO5 del 97% y para DQO del 96%.

Figura 7. Vista aérea EDAR Cuenca del Carraixet (CX)


23

La depuradora consta de cuatro líneas de agua residual compuestas de pretratamiento,

tratamiento primario y tratamiento de biológico por el sistema convencional de fangos

activados y desinfección. En cuanto al tratamiento de la línea de fangos primarios y en exceso,

se realiza en cuatro líneas con espesamiento, digestión anaerobia, acondicionamiento químico

y secado mecánico. Para el tratamiento biológico, cuenta con dos líneas aerobias: línea A+B y

línea C+D, ambas con una zona anaerobia (Figura 8).

Figura 8. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CX

3.1.3. EDAR Dénia - Ondara - (DE)

La EDAR Dénia - Ondara – Pedreguer (Figura 9) se ubica en la provincia de Alicante, en la

comarca de La Marina Alta y da servicio a los tres municipios que su nombre indica.


24

Figura 9. Vista aérea EDAR Dénia – Ondara – Pedreguer (DE)

Trata un caudal de 17.086 m3/día con una población servida de 66.414 he (datos EPSAR 2013).

El tratamiento consta de una sola línea con proceso de oxidación total y tiene un rendimiento

de eliminación del 97% para sólidos suspendidos, 97% de DBO5 y 95% de DQO (Figura 10).

Figura 10. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR DE

3.1.4. EDAR Castellón de la Plana (CS)

La EDAR de Castellón de la Plana (Figura 11) se encuentra localizada en la comarca de la Plana

Alta en la provincia de Castellón, abasteciendo únicamente a dicha población.


25

Figura 11. Vista aérea EDAR Castellón de la Plana (CS)

Para el año 2013, la EPSAR da como datos de funcionamiento un caudal tratado de 39.126

m3/d, prestando servicio a 205.650 habitantes equivalentes (he). Los rendimientos de

eliminación son los siguientes: 95% para SS, 96%para DBO5 y 93% para DQO (Figura 12).

Figura 12. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CS

3.2. Muestreo

La campaña de muestreos se realizó quincenalmente desde diciembre de 2008 a diciembre de

2009. Las muestras fueron simples realizadas de forma puntual.

El muestreo se realizó siempre en el mismo punto, generalmente a la salida del reactor

biológico. Se tomaron 1.500 ml de licor mezcla con un recipiente de plástico, a partir de estas

muestras se tomaron alícuotas para su fijación que se realizó antes de las 24 horas.


26

El transporte y conservación de las muestras en los botes fue en condiciones aerobias, dejando

en los mismos una cámara de aire sobre el licor mezcla.

En el caso que la planta presentaba problemas de espumas se tomaron muestras tanto del

licor mezcla como de las espumas de forma independiente. Sólo se encontraron problemas de

espumas en el periodo muestreado en la EDAR del Carraixet (CX).

Todas las EDAR estudiadas tratan aguas de origen doméstico, aunque las plantas de

tratamiento de Quart Benàger y Carraixet reciben además aguas industriales.

En la Tabla 6 se muestra el número de líneas de tratamiento independientes de cada EDAR y el

número de muestreos realizados en cada punto. El cómputo total de muestras fue de 148.

Tabla 6. Número de muestras por depuradora

EDAR Número de muestras

Abreviatura Nº líneas Reactor Espumas

QB 1 24 -

DE 1 24 -

CX 2 (A+B y C+D) 46 8

CS 2 (R1 y R2) 46 -

A continuación se muestra por cada depuradora sus respectivas fechas de muestreos (Tabla 7):


27

Tabla 7. Relación de muestras estudiadas

QB DE CS CX

04/12/08 R 10/12/08 R 03/12/08 R.1 03/06/09 R.2 10/12/08 R.(A+B) 22/07/09 R.(A+B)

17/12/08 R 22/12/08 R 03/12/08 R.2 17/06/09 R.1 10/12/08 R.(C+D) 22/07/09 R.(C+D)

14/01/09 R 08/01/09 R 17/12/08 R.1 17/06/09 R.2 23/12/08 R.(A+B) 16/09/09 R.(A+B)

28/01/09 R 21/01/09 R 17/12/08 R.2 01/07/09 R.1 23/12/08 R.(C+D) 16/09/09 R.(C+D)

11/02/09 R 04/02/09 R 15/01/09 R.1 01/07/09 R.2 07/01/09 R.(A+B) 30/09/09 R.(A+B)

25/02/09 R 18/02/09 R 15/01/09 R.2 15/07/09 R.1 07/01/09 R.(C+D) 30/09/09 R.(C+D)

11/03/09 R 04/03/09 R 28/01/09 R.1 15/07/09 R.2 21/01/09 R.(A+B) 14/10/09 R.(A+B)

25/03/09 R 16/03/09 R 28/01/09 R.2 09/09/09 R.1 21/01/09 R.(C+D) 14/10/09 R.(C+D)

07/04/09 R 01/04/09 R 11/02/09 R.1 09/09/09 R.2 04/02/09 R.(A+B) 14/10/09 Esp(A+B)

22/04/09 R 29/04/09 R 11/02/09 R.2 23/09/09 R.1 04/02/09 R.(C+D) 14/10/09 Esp(C+D)

06/05/09 R 13/05/09 R 25/02/09 R.1 23/09/09 R.2 18/02/09 R.(A+B) 27/10/09 R.(A+B)

20/05/09 R 27/05/09 R 25/02/09 R.2 07/10/09 R.1 18/02/09 R.(C+D) 27/10/09 R.(C+D)

03/06/09 R 10/06/09 R 11/03/09 R.1 07/10/09 R.2 04/03/09 R.(A+B) 27/10/09 Esp(A+B)

17/06/09 R 24/06/09 R 11/03/09 R.2 21/10/09 R.1 04/03/09 R.(C+D) 27/10/09 Esp(C+D)

01/07/09 R 08/07/09 R 25/03/09 R.1 21/10/09 R.2 01/04/09 R.(A+B) 11/11/09 R.(A+B)

15/07/09 R 22/07/09 R 25/03/09 R.2 04/11/09 R.1 01/04/09 R.(C+D) 11/11/09 R.(C+D)

09/09/09 R 16/09/09 R 22/04/09 R.1 04/11/09 R.2 29/04/09 R.(A+B) 11/11/09 Esp(C+D)

23/09/09 R 30/09/09 R 22/04/09 R.2 18/11/09 R.1 29/04/09 R.(C+D) 25/11/09 R.(A+B)

07/10/09 R 14/10/09 R 06/05/09 R.1 18/11/09 R.2 13/05/09 R.(A+B) 25/11/09 R.(C+D)

21/10/09 R 11/11/09 R 06/05/09 R.2 16/12/09 R.1 13/05/09 R.(C+D) 25/11/09 Esp(A+B)

04/11/09 R 11/11/09 Esp. 20/05/09 R.1 16/12/09 R.2 27/05/09 R.(A+B) 09/12/09 R.(A+B)

18/11/09 R 25/11/09 R 20/05/09 R.2 29/12/09 R.1 27/05/09 R.(C+D) 09/12/09 R.(C+D)

16/12/09 R 15/12/09 R 03/06/09 R.1 29/12/09 R.2 10/06/09 R.(A+B) 09/12/09 Esp.(A+B)

29/12/09 R 21/12/09 R 10/06/09 R.(C+D) 21/12/09 R.(A+B)

24/06/09 R.(A+B) 21/12/09 R.(C+D)

24/06/09 R.(C+D) 21/12/09 Esp(A+B)

08/07/09 R.(A+B)

08/07/09 R.(C+D)

R: reactor Esp: Espumas A, B, C, D, R.1, R.2: diferentes líneas

3.3. Parámetros físico-químicos y variables operacionales 3.3.1 Parámetros físico-químicos Los parámetros físico-químicos se determinaron siguiendo los procedimientos normalizados

(APHA, 2005). La fracción filtrada se ha obtenido a través de un filtro de lana de vidrio

(Whatman GF/C), con un tamaño nominal de poro de 1.2 μm, y la fracción soluble se obtuvo a

través de un filtro de 0.45 μm (Grady, 1989).

Las tablas 8 y 9 muestran los parámetros medidos en el licor mezcla y en el afluente al reactor

de las distintas EDAR. El índice Volumétrico de Fango (IVF) se calculó según el procedimiento

descrito por Jenkins et al. (2004), el cual se define como el volumen en ml ocupado por 1 g de

fango seco después de decantar media hora.


28

Tabla 8. Parámetros físico-químicos determinados en el licor mezcla Parámetro Abreviatura Unidades

pH Phlm Ud

Sólidos suspendidos en el licor mezcla SSLM mg/l

Sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla SSVLM mg/l

Índice Volumétrico del fango IVF ml/g

Nitrógeno total del licor mezcla NTSSVLM mg/g SSVLM

Fósforo total del licor mezcla PTSSVLM mg/g SSVLM

Temperatura T ºC

Tabla 9. Parámetros físico-químicos determinados en el afluente al reactor Parámetro Abreviatura Unidades

Nitrógeno Total NT mg/l

Nitrógeno Amoniacal N-NH4 mg/l

Fósforo Total PT mg/l

Fósforo del ortofosfato PO4 mg/l

DBO5/NKT DBO5NKT ud

DBO5/PT DBOPT ud

Carga de carbohidratos CCARBO Kg/d

Proteínas Prote mg/l

Ácidos grasos volátiles AGV mg/l

3.3.2 Parámetros operacionales

Las variables operacionales determinadas durante la campaña de muestreo se muestran en la

Tabla 10.

Los valores de carga másica (CM) y tiempo de retención hidráulico en el reactor (TRHr) se

determinaron calculando el promedio de los tres días anteriores al muestreo del licor mezcla.

Los valores de oxígeno disuelto (OD) en el reactor fueron distribuidos en tres intervalos: <0,8,

0,8-2 y <2 ppm, expresados en porcentaje de tiempo (%), y por tanto representando

indirectamente la variabilidad de oxígeno a lo largo del periodo de muestreo.

La edad del fango (EF) determinada para cada depuradora fue aquella en la que el proceso se

encontraba más estable.

Tabla 10. Variables operacionales Parámetro Abreviatura Unidades

Tiempo de retención hidráulico en reactor TRH3 Horas (h)

Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo expresada en DBO5

CMdbo3 kgDBO5/kgSSVLM.d

Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo expresada en DQOs

CMdqo3 kgDQOs/kgSSVLM.d

Edad de fango EF 7 Días

Oxígeno disuelto en reactor Obajo, Omed, Oalt %


29

3.4. Fijación y permeabilización de las muestras El primer paso para realizar la técnica FISH es la fijación de las bacterias, para que su estructura

celular se mantenga rígida y estática y se conserve su morfología, favoreciendo la penetración

de las sondas. Para la permeabilización de las células se utilizan detergentes como el SDS

(sodio dodecil sulfato). Los reactivos utilizados para la fijación de las muestras son diferentes

según la pared celular de la bacteria (Gram positiva y Gram negativa). En el presente estudio,

puesto que las bacterias analizadas fueron Gram negativas la fijación se realizó con

paraformaldehido (PFA). Una vez fijadas las muestras, se conservan a -20ºC.

Los pasos y reactivos para la fijación y permeabilización se describen en detalle a continuación:

- Para bacterias Gram negativas:

Lavar 1ml de flóculo con 500μl de tampón salino fosfato (PBS) 1X (7000

r.p.m durante 3 minutos).

Añadir 3 vols de PFA (750 μl) a 1 vol (250 μl) de muestra y mantener a 4ºC

durante 1-3h (mínimo 1h-máximo 18h).

Concentrar las células por centrifugación (7000 r.p.m durante 3 minutos) y

eliminar fijador.

Lavar las células con PBS 1X (500 μl).

Resuspender las células en PBS 1X (500 μl) y añadir etanol absoluto frío

(4ºC) (500 μl) .

Guardar a -20ºC.

La Figura 13 describe los pasos a realizar para las bacterias Gram -.


30

Gram -

1 ml de muestra

Centrifugar 3 min 7000 rpm

Lavar 1000 µl PBS 1X


Resuspender 250 µl PBS 1X + 750 µl PFA durante 3h a 4ºC


Resuspender 500 µl PBS 1X


Resuspender 500 µl PBS 1X + 500 µl EtOH abs

Figura 13. Fijación de las muestras

3.5. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluorófors (FISH) 3.5.1. Preparación de reactivos para FISH En primer lugar se describe el protocolo de preparación de los reactivos necesarios en los

procesos de fijación, lavado e hibridación.

Paraformaldehido (Fijación)

Los pasos a seguir para preparara este reactivo son los siguientes, debiéndose realizar en

campana de extracción de humos:

Calentar 65 ml de agua bidestilada hasta 60ºC.

Añadir 4 g de paraformaldehido (PFA).

Añadir 1 gota de una solución de NaOH 2M y agitar rápidamente hasta que la solución

se haya clarificado.

Quitar de la fuente de calor y añadir 33 ml de PBS 3X.

Ajustar el pH a 7,2 con HCl.

Eliminar cualquier resto de cristales por filtración a través de 0,2 µm.

Enfriar rápidamente a 4ºC y conservar a esta temperatura.


31

Tampón fosfato salino (para fijación)

Concentración PBS 1X

- NaCl.............…..…..7,60 g

- NaH2PO4∙H2O....... 1,38 g

- NaH2PO4∙H2O....... 1,78 g

- Agua destilada.......1000 mL

- pH 7,2

Concentración PBS 3X

- NaCl.................... 22,8 g

- NaH2PO4∙H2O.... 4,1 g

- Na2HPO4∙H2O..... 5,3 g

- Agua destilada.... 1000 ml

- pH 7,2

- Preparación: Primero disolver los fosfatos y luego el cloruro sódico.

- Esterilizar por filtración 0,45 µm ó 0,2 µm y conservar a 4ºC.

Solución de gelatina (preparación de portaobjetos)

- Gelatina.................................... 0,1%

- Sulfato potasico cromato ........ 0,01% (Sigma ref. C-5926, 12H20)

- Calentar previamente el agua destilada hasta 60ºC en un baño.

- Fundir la gelatina (100 mg 0,1% + 10 mg sal de cromato 0,01%) en 100 ml de agua

destilada en un vaso de precipitados, homogenizando la muestra agitando con una

varilla.

- Enfriar a 50ºC para sumergir los portas.

Solución de limpieza de portaobjetos (preparación de portaobjetos)

Etanol con 10% KOH (reactivo de limpieza).

Etanol (para deshidratación)

- 50%

- 80%

- 100%


32

Cloruro sódico 5M (tampón de hibridación y tampón de lavado)

- Cloruro sódico.......... 292.2 g

- Agua destilada.......... 1000 ml

- Disolver el NaCl en 800 ml de agua destilada y ajustar el volumen hasta 1 litro.

- Distribuir en alícuota.

- Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y por filtración.

EDTA 0,5M (cuando la concentración de formamida es mayor o igual a 20%)

- EDTA 2H2O.....................186,1 g

- Agua destilada................ hasta 1000 mL

- Preparación: pesar el EDTA y añadir a 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8,0 con

NaOH (el reactivo no se disuelve hasta ajustar el pH a 8,0). Completar hasta 1000 mL

con agua destilada.

- Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y por filtración.

Tris-HCl pH 8.0 (tampón de hibridación y tampón de lavado)

- Tris Base ........................ 121,1 g

- H-Cl.................................. 42 ml de HCl concentrado

- Agua destilada................ hasta 1000 ml

- Preparación: pesar el Tris y añadir a 800 ml de agua destilada. Añadir 42 ml de HCl

concentrado y completar hasta 1000 ml con agua destilada.

- Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y filtración.

SDS 10% (para tampón de hibridación y tampón de lavado)

- SDS ........................ 10 g

- Agua destilada....... Hasta 100 ml

- Esterilizar por filtración.

Agua Milli-Q

Reactivo de montaje para evitar la pérdida de fluorescencia

Vectashield® (Vector Laboratories, USA).


33

3.5.2. Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón

Todos los portaobjetos utilizados en la técnica FISH se han de lavar y desengrasar. Previamente

a su empleo se les debe dar un baño en una solución de gelatina y de sulfato de potasio y

cromo para favorecer la adhesión de la muestra.

A continuación se detallan los pasos a seguir para el tratamiento de los portaobjetos:

Lavar con solución de limpieza.

Enjuagar con agua destilada dos veces

Secar al aire (dejar escurrir todo 1 día, protegiendo del polvo ambiental cubriendo los

portas con papel aluminio).

Cubrir con gelatina por inmersión en la solución de gelatina 0,1% con cromato sulfato

potásico 0,01% (preparada en el momento, temperatura 60ºC).

Secar al aire.

3.5.3. Aplicación de las muestras a los portaobjetos

La aplicación de las muestras a los portaobjetos se realiza de la siguiente forma:

Poner un volumen entre 3 y 5 μl de muestra fijada al portaobjetos FISH. En este caso se

ha puesto un volumen de 4 μl en cada pocillo del portaobjetos.

Secar al aire.

Deshidratar en etanol 50% durante 3 minutos por inmersión.



Secar al aire.

3.5.4. Sondas utilizadas

Las diferentes sondas utilizadas en las hibridaciones se muestran en la Tabla 11. Asimismo, se

especifica la secuencia de nucleótidos del extremo 5´al 3´ de las sondas y el porcentaje de

formamida óptimo a utilizar (%F).


34

Tabla 11. Sondas empleadas en la identificación de bacterias filamentosas

Sonda Secuencia (5´-3´) Especificidad %F Comentarios Referencia

HHY GCCTACCTCAACCTGATT Haliscomenobacter hydrossis

20-25 Wagner et al. (1994)

SAP-309 TCTCAGTACCCGTGTGGG Mayoría de miembros de Saprospiraceae

25 Tanto filamentos como células simples

Schauer and Hahnn (2005)

EUB 338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT Bacteria 0-50 Amann (1990)

EUB 338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT Planctomycetes 0-50 Daims et al (1999)

EUB 338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT Verrumicrobiales 0-50 Daims et al (1999)

Las sondas HHY y SAP-309 fueron marcadas con el fluoróforo TAMRA (rodamina, cuya longitud

de onda de absorción es de 565nm y de emisión de 580nm, rojo).

3.5.5. Hibridación “in situ”

Los pasos a seguir y reactivos utilizados del proceso de hibridación se describen en detalle a

continuación:

Preparar la solución de hibridación con formamida en un microtubo de 2 ml. La

cantidad de reactivos dependerá del porcentaje óptimo de formamida que a su vez

dependerá de la sonda utilizada (Tabla 12).

Tabla 12. Tampón de hibridación según porcentaje de formamida

Reactivo % DE FORMAMIDA

10% 20% 25% 30% 35% 40% 45%

NaCl 5M 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl

HCl-Tris 1M 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl

Formamida 200 µl 400 µl 500 µl 600 µl 700 µl 800 µl 900 µl

H2O MiliQ 1398 µl 1198 µl 1098 µl 998 µl 898 µl 798 µl 698 µl

SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl

Volumen Final 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl

Poner 9 µl de la solución de hibridación + 1µl de sonda en cada pocillo y repartir

homogéneamente por todo el campo para HHY. En caso de que junto con la sonda

se tengan que añadir sondas competidoras y/o facilitadoras se deberá hacer una

combinación de todos ellos con la sonda hasta alcanzar la cantidad de 1 µl. A partir

de la puesta en contacto con la sonda hay que evitar el contacto con la luz para

evitar la pérdida de fluorescencia del fluoróforo.

Poner un trozo de papel de celulosa dentro de un tubo Falcon de 50 ml y echar

sobre el papel la solución de hibridación sin sonda que sobra, para crear una

atmósfera húmeda.

Introducir el portaobjetos dentro del tubo Falcon de 50 ml en posición horizontal.

Incubar a 46ºC durante al menos 1h 30 min.


35

Preparar 50 ml de solución de lavado (precalentar a 48ºC) para eliminar el exceso

de sonda que no ha hibridado y la formamida de los portaobjetos (Tabla 13).

Tabla 13. Solución de lavado según porcentaje de formamida

Reactivo % DE FORMAMIDA

10% 20% 25% 30% 35% 40% 45%

NaCl 5M 4500µl 2150 µl 1490 µl 1020 µl 700 µl 460 µl 300 µl

EDTA 0,5M - 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl

HCl-Tris 1M 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl

H2O MiliQ 44,45ml 46,3ml 47,94ml 47,43 µl 47,75ml 47,06 µl 48,15ml

SDS 10% 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl

Volumen Final 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml

Sacar de la estufa y rápidamente lavar los portaobjetos e introducirlos dentro del tubo

con la solución de lavado. Para proteger los tubos de la luz, se forran con papel de

aluminio.

Incubar en un baño a 48ºC durante 15-20 minutos.

Lavar con agua MilliQ.

Secar al aire en la oscuridad.

Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a -20ºC.

3.6. Observación al microscopio de epifluorescencia

Una vez realizada la hibridación in situ con las sondas específicas se procede a la observación

con el microscopio y a la toma de imágenes.

Para observar las muestras con el microscopio de epifluorescencia se precisa utilizar un líquido

de montaje (Vectashield) que evita el deterioro y la pérdida de fluorescencia. Se vierten unas

gotas de este líquido en la zona central del portaobjetos y se coloca encima un cubreobjetos,

con ayuda de una punta se ejerce una pequeña presión sobre éste para que el líquido de

montaje se extienda de forma uniforme por toda la muestra. A continuación se observa el

pocillo a 600X con aceite de inmersión.

El microscopio utilizado para la observación de las muestras ha sido un Olimpus BX 50

equipado con condensador de campo claro, contraste de fases e interferencial de Nomarsky y

sistema de iluminación por epifluorescencia. Las fotografías en color se realizaron con una

cámara digital Olimpus DP 12 acoplada al microscopio con los filtros U-MWIB (Fluoresceína,

FAM) y U-MWIG (Rodamina, TAMRA).


36

3.7. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos

La cuantificación de la población de filamentos se realizará de dos formas: siguiendo el criterio

subjetivo de Eikelboom y por medio del análisis de imagen con el programa Matlab 7.1.

3.7.1. Criterio subjetivo de Eikelboom (2000,2006)

Para la cuantificación de los microorganismos se realizó un barrido de todos los pocillos del

portaobjetos con el microscopio de epifluorescencia, una vez realizado el proceso de

hibridación in situ.

La densidad de organismos fue estimada según el criterio subjetivo propuesto por Eikelboom

(2000, 2006), que establece el índice de filamentos (IF) dentro de una escala ordinal del 0-5

(Tabla 14).

Tabla 14. Escala de valoración de organismos filamentosos

IF Abundancia Descripción

0 “Ninguno” Ningún filamento presente

1 “Pocos” Pocos filamentos y de forma ocasional en el flóculo

2 “Algunos” Filamentos en aproximadamente la mitad de los flóculos

3 “Comunes” Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1-5/flóculo)

4 “Muy comunes” Filamentos en todos los flóculos con densidad media (5-20/ flóculo)

5 “Abundantes” Filamentos en todos los flóculos con alta densidad (>20/flóculo)

En la Figura 14 se muestra la escala utilizada para valorar la abundancia de bacterias

filamentosas.

Figura 14. Criterio de valoración de abundancia de filamentos

Este índice se utilizó para cuantificar la abundancia de Haliscomenobacter Hydrossis utilizando

la sonda HHY en las 148 muestras correspondientes a las 4 depuradoras estudiadas.


37

3.7.2. Análisis de imagen con el programa Matlab 7.1

Para la cuantificación de los microorganismos de las muestras hibridadas de las 4 depuradoras

objeto de estudio con las sondas HHY y SAP-309, se observaron las muestras con microscopio

de fluorescencia, se capturaron las imágenes correspondientes y posteriormente fueron

procesadas por el software desarrolado por Borrás (2008).

Se realizaron fotos a unos 20 - 25 campos de cada pocillo; por cada campo se adquirieron dos

fotos: una correspondiente a las bacterias objeto de estudio (sonda específica) y otra de toda

la comunidad bacteriana (sonda EUBmix), y en ocasiones una tercera con el filtro de doble

banda que ayuda a diferenciar las falsas señales de la sonda de hibridación.

En total se realizaron 11.120 fotos aproximadamente, correspondientes a los 296 pocillos de

todas las muestras (148 pocillos por cada una de las dos sondas que dieron resultados

positivos). La toma de fotos de cada pocillo duró aproximadamente 20 minutos lo que dio un

total de 5.920 minutos, equivalentes a 99 horas empleadas en la toma de fotos.

Tras la captura de imágenes, éstas fueron tratadas con el programa Photoshop CS2 9.0, para la

eliminación de falsas señales de la sonda de hibridación, con el objeto de que la cuantificación

posterior fuera lo más precisa posible.

El análisis de imagen se realizó haciendo uso del software de cuantificación desarrollado por

Borrás (2008). Este software desarrollado para Matlab 7.1 descompone las imágenes digitales

tomadas en RBG a escala binaria para realizar el conteo de píxeles a partir del cual se

calcularán los porcentajes de la población de bacterias.

El algoritmo del programa permite con un simple ajuste eliminar las partes de la imagen que

no son de interés o que son falsos positivos mediante los parámetros Low_in y Gamma_in.

Con el primero se consigue eliminar la parte de la imagen que representa imagen de fondo

(background) y establece un valor de 0 a 1, por debajo del cual es un falso positivo (Borrás,

2008).

El parámetro Gamma_in representa la forma de la curva que describe la relación entre los

valores de intensidad de la imagen original y la nueva imagen. Cuando Gamma_in es menor a

1 la nueva imagen tendrá una intensidad más alta, es decir que será más brillante, si por el

contrario este parámetro es superior a 1 la nueva imagen será más oscura (Borrás, 2008).


38

Todas las imágenes capturadas de cada pocillo se introducen en el software de cuantificación

desarrollado por Borras, 2008, generando un archivo en Excel con los porcentajes de las áreas

ocupadas por las bacterias estudiadas, su desviación estándar, así como su error estándar de la

medida. Este error (incertidumbre) es calculado dividiendo la desviación estándar por la raíz

cuadrada de “n”, donde n es el número de campos examinados (Borrás, 2008).

En la Figura 15 se muestra el flujo de procesos para la cuantificación en el software

utilizado.

Figura 15. Flujo de procesos para la cuantificación de bacterias

3.8. Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de las todas las variables medidas se utilizó el paquete informático

SPSS versión 19.0.


39

Primeramente se estudió si existían diferencias significativas entre las depuradoras estudiadas

en la cantidad de cada morfotipo filamentoso, por medio del análisis de la varianza de un

factor (ANOVA) (para la cuantificación de HHY y SAP-309 por medio del análisis de imagen) y

por la prueba del Chi cuadrado a partir de las tablas de contingencia creadas para la

cuantificación de HHY por medio de Índice de Eikelboom.

En segundo lugar se realizó un resumen estadístico donde se tabularon todos los valores

mínimos, máximos, la media y desviación estándar de cada una de las variables físico-químicas

y operacionales del afluente y licor mezcla presente en los fangos.

Se integraron todos los datos de las cuatro depuradoras para obtener una matriz general con

un número elevado de muestras (140) y realizar primero un análisis preliminar bivariante. Este

análisis sirve para establecer la asociación existente entre la abundancia de los morfotipos

filamentosos estudiados con las variables físico-químicas y operacionales. Este análisis

consistió en el cálculo de los coeficientes de Pearson y de Spearman.

Las variables operacionales y físico-químicas fueron previamente transformadas

logarítmicamente “LN (variable+1)” para conseguir una distribución normal (Esteban et al.,

1991).

Posteriormente se empleó un análisis multivariante mediante la realización de un análisis de

componentes principales para permitir la síntesis de información contenida en una base de

datos de gran dimensión en un nuevo subespacio de menor dimensión (Aguado, 2004).

3.8.1. Análisis de variables categóricas: Tablas de contingencia y Prueba de Chi

cuadrado

El índice de Eikelboom es una variable categórica y cuando se trabaja con estas variables, los

datos suelen organizarse en tablas de doble entrada en las que cada entrada representa un

criterio de clasificación (una variable categórica). Como resultado de esta clasificación, las

frecuencias (el número o porcentaje de casos) aparecen organizadas en casillas que contienen

información sobre la relación existente entre ambos criterios. A estas tablas de frecuencias se

les llama tablas de contingencia.

El grado de relación existente entre dos variables categóricas no puede ser establecido

simplemente observando las frecuencias de una tabla de contingencia. Para determinar si dos

variables se encuentran relacionadas debemos utilizar alguna medida de asociación,

preferiblemente acompañada de su correspondiente prueba de significación.


40

La opción Chi cuadrado proporciona un estadístico (también conocido como χ2 o ji-cuadrado)

propuesto por Pearson (1911) que permite contrastar la hipótesis de que los dos criterios de

clasificación utilizados (las dos variables categóricas) son independientes. Para ello, compara

las frecuencias observadas (las frecuencias de hecho obtenidas) con las frecuencias esperadas

(las frecuencias que teóricamente deberíamos haber encontrado en cada casilla si los dos

criterios de clasificación fueran independientes).

Obtenidas las frecuencias esperadas para cada casilla, el estadístico 2 o chi-cuadrado de

Pearson se obtiene de la siguiente manera:

Donde:

nij: frecuencias observadas

mij: frecuencias esperadas

De la ecuación se desprende que el estadístico χ2 valdrá cero cuando las variables sean

completamente independientes y que el valor del estadístico χ2 será tanto mayor cuanto

mayor sea la discrepancia entre las frecuencias observadas y las esperadas.

El estadístico χ2 sigue el modelo de distribución de probabilidad χ2. Por tanto, podemos utilizar

la distribución χ2 para establecer el grado de compatibilidad existente entre el valor del

estadístico χ2 y la hipótesis de independencia. Un valor de probabilidad asociada mayor de

0,05 del estadístico χ2 indica que los datos son compatibles con la hipótesis de independencia.

Sin embargo, si esa probabilidad es muy pequeña (menor que 0,05), consideraremos que los

datos son incompatibles con la hipótesis de independencia y concluiremos que las variables

estudiadas están relacionadas (Pardo y Ruiz, 2002).

3.8.2. Análisis de la varianza (ANOVA)

El análisis de la varianza sirve para comparar si los valores de un conjunto de datos numéricos

son significativamente distintos a los valores de otro o más conjuntos de datos. El

procedimiento está basado en la varianza global observada en los grupos de datos numéricos a

comparar. Este método se utiliza para asociar una probabilidad a la conclusión de que la media

de un grupo de puntuaciones es distinta de la media de otro grupo de puntaciones.

En este trabajo se realiza un análisis de la varianza para estudiar las sondas HHY y SAP-309 en

cada una de las depuradoras estudiadas. Se trata de un análisis de varianza de un único factor

o unifactorial. Se pretende comprobar que, cómo la variabilidad total existente entre los datos


41

es debida al efecto del valor investigado (variabilidad debida entre tratamientos) y al efecto de

los valores no controlados (variabilidad residual).

Supuestas k poblaciones independientes, las hipótesis del contraste son siguientes:

1. H0: μ1=μ2=…=μk Las medias poblacionales son iguales

2. H1: Al menos dos medias poblacionales son distintas

Para realizar el contraste ANOVA, se requieren k muestras independientes de la variable de

interés. Una variable de agrupación denominada Factor y clasifica las observaciones de la

variable en las distintas muestras.

Suponiendo que la hipótesis nula es cierta, el estadístico utilizado en el análisis de varianza

sigue una distribución F de Fisher-Snedecor con k-1 y n-k grados de libertad, siendo k el

número de muestras y n el número total de observaciones que participan en el estudio. Cabe

destacar que el estadístico F del ANOVA de un factor se basa en el cumplimiento de 2

supuestos fundamentales: normalidad y homocedasticidad o igualdad de varianzas.

Con el programa estadístico SPSS, se obtiene la siguiente información, al realizar un ANOVA:

La tabla que contiene el estadístico de Levene, la cual nos permite contrastar la hipótesis de

igualdad de varianzas poblacionales. Si el nivel crítico (sig.) es menor o igual que 0,05,

debemos rechazar la hipótesis de igualdad de varianzas. Si es mayor, aceptamos la hipótesis de

igualdad de varianzas.

Por otra parte la tabla de ANOVA, que nos ofrece el estadístico F con su nivel de significación.

Si el nivel de significación (sig.) intraclase es menor o igual que 0,05, rechazamos la hipótesis

de igualdad de medias, si es mayor aceptamos la igualdad de medias, es decir, no existen

diferencias significativas entre los grupos.

El programa SPSS también permite realizar los contrastes llamados comparaciones múltiples

post-hoc o a posteriori para saber qué media difiere de qué otra. Esas comparaciones

permiten controlar la tasa de error al efectuar varios contrastes utilizando las mismas medias.

El cuadro de post hoc muestra las distintas pruebas post hoc para hacer comparaciones

múltiples por parejas o pruebas de rango. Si la conclusión del contraste es rechazar la igualdad

de medias se puede plantear qué grupos dos a dos son los que tienen medias

significativamente distintas. Una forma de hacerlo sería plantear contrastes de igualdad de

medias para dos muestras independientes con la prueba T de Student. Otra forma es utilizar

una de las pruebas Post hoc que ofrece el análisis de la varianza. En particular, la prueba de

Scheffé realiza todos los contrastes de igualdad de medias dos a dos y constituye dos distintos

grupos homogéneos a partir de los resultados de los contrastes por parejas. Algunos autores


42

destacan la prueba de Scheffé como más conservadora, así como la más utilizada, a pesar de

que en muchas áreas se está imponiendo la de Bonferroni (Lizasoain y Joaristi; 2003).

Desde la tabla de comparaciones post-hoc vemos posibles combinaciones dos a dos entre los

niveles de la variable factor, las diferencias entre las categorías de la variable 1 en cada grupo,

el error típico de diferencias y nivel crítico asociado a cada diferencia (significación). Los grupos

cuyas medias difieren de forma significativa (a nivel de 0,05) son los que presentan diferencias

estadísticamente significativas entre sí.

3.8.3. Análisis bivariante

El coeficiente de correlación de Pearson se realiza para variables cuantitativas y es un índice

de la precisión de la dependencia lineal entre variables linealmente relacionadas x e y (Viedma,

1972).

Este coeficiente se calcula con la siguiente fórmula:

El coeficiente de correlación de Pearson está comprendido entre -1 y +1, donde los valores

próximos a +1 indican una fuerte dependencia lineal creciente y los valores de r próximos a -1

indican una dependencia lineal decreciente.

Los valores del coeficiente r pequeños indican una pequeña dependencia lineal. En estos casos

se debe cambiar el modelo lineal por otro tipo de curva a fin de tener una mejor aproximación.

El coeficiente de correlación de Spearman o por rangos, también llamado rs es una medida no

paramétrica de asociación que requiere que ambas variables sean aleatorias continuas, de

forma que los objetos o individuos puedan colocarse en series ordenadas (Siegel, 1983).

El coeficiente de Spearman utiliza los números de orden (rangos) de cada grupo de variables y

compara dichos rangos (Conover, 1998). Este coeficiente es recomendable utilizarlo cuando los

datos presentan valores externos que afectan al coeficiente de Pearson o ante distribuciones

no normales.

La fórmula para calcular el Coeficiente de Spearman es la siguiente:

Donde:

di es la diferencia entre los rangos de X e Y, es decir di = rXi-rYi.

N es el número de valores de la muestra


43

Los valores de los rangos se colocan según el orden numérico de los datos de la variable

estudiada.

Su interpretación es semejante al coeficiente de correlación de Pearson. Para índices cercanos

a +1 la asociación es positiva, para valores cercanos a -1 la asociación es negativa y 0 significa

que no hay correlación entre las variables (Siegel, 1983).

La prueba de significación asociada a ambos coeficientes únicamente prueba la hipótesis nula

de que el coeficiente puede ser igual a 0, es decir, que no exista ninguna relación lineal entre

variables. El nivel de significación “p” representa la probabilidad de error que se comete al

aceptar el resultado observado como válido. Cuanto mayor sea este nivel de significación

mayor error se comete al aceptar que las correlaciones observadas entre variables de la

muestra son indicadoras de la relación entre las respectivas variables de la población.

Se genera como salida de este estudio, con el programa estadístico SPSS, los valores de las

correlaciones y los p-valores de cada uno. Estos últimos indican la bondad estadística del

modelo ajustado. P-valores iguales o menores a 0,05 indican una relación estadísticamente

significativa al 95%.

3.8.4. Análisis multivariante

El análisis multivariante es la parte de la estadística y del análisis de datos que estudia, analiza,

representa e interpreta los datos que resultan de observar más de una variable estadística

sobre una muestra de individuos. Las variables observables son homogéneas y

correlacionadas, sin que alguna predomine sobre las demás.

Análisis de componentes principales

El Análisis de Componentes Principales (ACP) es una técnica de reducción de la información

disponible sobre un grupo de muestras, de los cuales se han tomado diversas variables sobre

diversas características. Por ejemplo si se tienen datos de N muestras referentes a p

características diferentes de éstos, es decir, X=(X1,….,Xp), el objetivo del ACP consiste en

reducir las dimensiones de la variable X creando una nueva variable U=(U1,…..,Ur), donde r<p,

cuyas componentes Ui sean combinación lineal de las Xi y que también expliquen una

proporción suficientemente grande de la dispersión total presente en los datos originales

(Pérez, 1996).

El proceso de cálculo del ACP es el siguiente:


44

El primer componente se construye buscando un vector b= (b1,…,bp) que, entre todos los que

tengan modulo unitario, atribuya a U1 la mayor varianza posible, de forma tal que este nuevo

componente constituya la mejor explicación unidimensional de la varianza total en los datos

(Pérez, 1996).

Procediendo con las variables sucesivas se construyen las componentes principales. Este

método logra sintetizar al máximo la información con el criterio de pérdida mínima de

capacidad explicativa con respecto a la varianza de las series (Pérez, 1996).

Cuando se realiza un ACP sobre una matriz de datos X, se está realizando la siguiente

modelación (Aguado, 2004):

Donde, pa son los vectores de pesos que definen las direcciones principales de máxima

varianza en el espacio X. Estas direcciones determinan un subespacio de menor dimensión (A)

que el espacio original.

La dimensión (A) se escoge de manera que no exista información importante de X en E que es

la matriz de residuos, y que, por tanto, representa el ruido. Xˆ es la estimación de X a partir de

modelo con A componentes.

En la Figura 16 se muestran de forma gráfica las matrices del modelo ACP.

Figura 16. Representación esquemática de las matrices del modelo ACP.

Para una componente dada, los pesos son definidos como la dirección sobre la que se están

proyectando las observaciones y están poniendo de manifiesto la contribución de las variables

originales en la formación de dicha componente (Aguado, 2004).

Para realizar el análisis de componentes principales (ACP) se utilizó el programa IBM SPSS

Statistics 19 donde se introdujo la matriz de datos y se especificaron las variables para realizar

el ACP.


45

La primera de las salidas del programa es la tabla que presenta la medida de adecuación

muestral de Kaiser-Meyer-Olkin y la prueba de elasticidad de Barlett.

La medida de adecuación muestral de Kaiser-Meyer-Olkin contrasta si las correlaciones

parciales entre las variables son pequeñas, tomando valores entre 0 y 1, e indica que el análisis

factorial es tanto más adecuado cuanto mayor sea su valor. Mientras que la prueba de

esfericidad de Barlett contrasta si la matriz de correlaciones es una matriz identidad, lo cual

indicaría que el modelo factorial es inadecuado. Este estadístico se obtiene a partir de una

transformación del determinante de la matriz de correlaciones y canto mayor sea, y por tanto

menor el nivel de significación, más improbable es que sea la matriz identidad y más adecuado

resulta el análisis factorial.

Otra de las salidas del programa es la matriz anti-imagen, la diagonal de esta matriz representa

la medida de la adecuación muestral para cada una de las variables introducidas en el análisis.

En el presente estudio se han descartado todas las variables cuya medida de la adecuación

muestral está por debajo de 0,5, de manera que la medida de adecuación muestral de Kaiser-

Meyer-Olkin y la prueba de elasticidad de Barlett dieran valores correspondientes que

establecieran la adecuación del análisis.

Otra de las tablas que ayudan a establecer la adecuación del análisis es la varianza total

explicada, donde el porcentaje acumulado de la suma de las saturaciones al cuadrado de la

rotación indica el porcentaje de variabilidad de los datos que es explicada por los factores

extraídos. En este estudio se han considerado adecuados los ACP con una carga factorial de

0,4, en vez de 0,5, debido a que el tamaño muestral para la significación fue alrededor de 200

muestras (Hair et al. 1999).

Con estas tablas el programa genera los siguientes gráficos:

Gráfico de Saturaciones en componentes: este gráfico representa las relaciones entre

las variables, es decir, qué variables son responsables de los patrones que presentan

las muestras. En este gráfico cuando dos variables se encuentran muy cercanas

presentan correlaciones positivas entre sí, por el contrario si se encuentran

linealmente opuestas presentan correlaciones negativas.

Gráfico de componentes: utiliza la rotación varimax para mostrar las cargas factoriales

de las distintas variables que forman cada componente.

Gráfico de Sedimentación: se utiliza para determinar cuántos factores deben

retenerse, tomándose en cuenta la cantidad de varianza (en porcentaje) explicada por

dichos factores. Típicamente el gráfico muestra una fuerte ruptura entre la


46

pronunciada pendiente de los factores más significativos y el descenso gradual de los

restantes, denominados sedimentos.

En el ACP realizado se utilizó una nomenclatura específica para cada una de las variables físico-

químicas, operacionales y concentración de bacterias de cada sonda utilizada en el presente

estudio. En las Tablas 15, 16 y 17 que se encuentran a continuación se muestran todas las

variables con sus unidades y sus respectivas nomenclaturas para este análisis estadístico.

Tabla 15. Nomenclatura utilizada en el ACP para las variables físico-químicas

Variable Unidades Nomenclatura

AFL

UEN

TE

N total mg/l NTaf

N-NH4 mg/l NH4af

P total mg/l PTaf

P-PO4 (fosfato) mg/l PO4af

DBO5/NKT Ud DBO5NKT

DBO5/PT mg/l DBOPT

Tens. Aniónicos mg/l Tensaf

Carga carbohidratos Kg/d CCARBO

Proteínas mg/l Prote

Ácidos grasos

volátiles mg/l AGV

LIC

OR

MEZ

CLA

pH Ud Phlm

Sólidos suspendidos mg/l SSLM

Sólidos suspendidos

volátiles mg/l SSVLM

Índice volumétrico

del fango ml/g IVF

Nitrógeno total del

licor mezcla mg/g SSVLM NTSSVLM

Fosforo total del licor

mezcla mg/g SSVLM PTSSVLM

Temperatura ºC T


47

Tabla 16. Nomenclatura utilizada en el ACP para los parámetros operacionales

Parámetro Unidades Nomenclatura

Carga másica kgDBO5/kgSSVLM.d CMdbo3

Carga másica kgDQOs/kgSSVLM.d CMdqos3

Tiempo de retención celular Horas (h) TRHr3

Edad del fango Días EF7

Oxígeno disuelto (<0,8ppm) % Obajo

Oxígeno disuelto (0,8-2ppm) % Omed

Oxígeno disuelto (>2 ppm) % Oalt

Tabla 17. Nomenclatura utilizada en el ACP para las variables biológicas Parámetro Unidades Nomenclatura

Sonda HHY Índice Eikelboom IE

Sonda SAP-309 + EUBmix I, II, II Promedio del área % SAP

Sonda SAP-309 + EUBmix I, II, II mgSSVLM/l SAPsol

Sonda HHY + EUBmix I, II, II Promedio del área % HHY

Sonda HHY + EUBmix I, II, II mgSSVLM/l HHYsol

4. RESULTADOS


48

4. RESULTADOS

Los resultados que se obtuvieron durante la realización del proyecto corresponden, tal como

se explicó en el capitulo anterior, a la realización de las hibridaciones mediante la técnica FISH

de muestras tomadas quincenalmente en el fango activo de las EDAR de Quart Benáger,

Carraixet, Denia-Ondara-Pedreguer y Castellón, durante un período de un año.

Las hibridaciones se realizaron con el fin de determinar y cuantificar la cantidad de bacterias

Haliscomenobacter hydrossis presentes en el licor mezcla del reactor biológico. Para ello, se

emplearon dos sondas HHY y SAP-309. La sonda HHY cubre algunos de los morfotipos del

género Haliscomenobacter y la sonda SAP-309 abarca todo el género (Figura 4).

Seguidamente se realizó un análisis de variables categóricas mediante tablas de contingencia,

para evaluar si existen relación entre la cantidad de H. hydrossis según el Índice de Eikelboom y

el tipo de EDAR y un análisis de la varianza (ANOVA) para determinar si hay diferencias

significativas en la cantidad de bacterias cuantificadas mediante la técnica FISH y el análisis de

imagen.

Y por último se realizó un análisis estadístico bivariante de Pearson y Spearman y un análisis de

componentes principales (ACP) con los parámetros físico-químicos, operacionales y las

bacterias estudiadas presentes en el fango activo.

A continuación se presentan detalladamente los resultados obtenidos en el proyecto de

investigación.

4.1 Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos


Para la cuantificación de la abundancia de Haliscomenobacter Hydrossis con el índice de

Eikelboom se hibridaron 148 muestras correspondientes a las 4 EDAR estudiadas con la sonda

HHY (Figura 17).

En la Figura 17 se pueden observar ejemplos de muestras de fango activo de las diferentes

depuradoras objeto de estudio hibridadas con la sonda HHY mediante la técnica FISH y

cuantificada su abundancia con el índice de Eikelboom (IE). Para el IE 5, que supone que se

contabilicen más de 20 filamentos por flóculo hibridados, se observa diversidad de filamentos

hibridados, unos 22 en la foto (a) y mucho más de 30 en la foto (b). Lo mismo, ocurre con las

muestras que presentaban un IE 4; en la fotografía (c) aparecen unos 7 filamentos hibridados,

mientras que en la (d) 19 filamentos con señal positiva.


49

Figura 17. Ejemplos de muestras de fango activo hibridadas con la sonda HHY mediante FISH

(600x). IE 5: (a) Castellón C+D 03/12/08 (b) Denia 14/01/09; IE 4: (c) Quart 18/11/09 (d) Castellón A+B

17/12/08; IE 3: (e) Carraixet A+B 27/10/09

A continuación se muestra en la Figura 18, 19, 20 y 21 los resultados obtenidos

quincenalmente en cada una de las depuradoras estudiadas.

a) b)

c) d)

e)


50

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

IE

Días

Quart

IEHHY

Figura 18. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para la EDAR Quart según FISH para la sonda HHY.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

IE

Denia- Ondara- Pedreguer

IEHHY

Figura 19. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para la EDAR Denia-Ondara- Pedreguer según FISH para la

sonda HHY.


51

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

%; I

E

Castellón

IEHHY CS C+D IEHHY CS A+B

Figura 20. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para las dos líneas de tratamiento de la EDAR Castellón

según FISH para la sonda HHY.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

%; I

E

Carraixet

IEHHY CX A+B IEHHY CX C+D

Figura 21. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para llas dos líneas de tratamiento de la EDAR Carraixet

según FISH para la sonda HHY.

El morfotipo filamentoso H. hydrossis se observó en todas las EDAR estudiadas con

abundancias elevadas (Índice Eikelboom 5 y 4), excepto valores medios de índice 3 en el


52

muestreo 15/07/2009 de Quart, 11/02/2009 de la línea de tratamiento C+D de Castellón y el

muestro realizado en el día 27/10/2009 para la línea A+B de la EDAR de Carraixet.

En cada una de las depuradoras estudiadas, se presentaron 6 muestreos dónde no se

proporcionó muestra por parte del IIAMA: uno en la EDAR de Quart, uno en la EDAR de Denia,

uno en la línea C+D de la EDAR de Castellón y tres en la EDAR de Carraixet (dos en la línea A+B

y uno en la línea C+D).

Por otra parte en una muestra de Quart (01/07/09) y una muestra de Denia (16/09/09) no

hibridó la muestra con la sonda HHY. Éstas se consideraron datos anómalos y se eliminaron del

tratamiento estadístico, puesto que no tenía sentido que no hubiesen bacterias ese día

concreto, cuando la evolución de la población de H. hydrossis en la EDAR a lo largo del año

indicaba que había mucha abundancia de estas bacterias.

Para evaluar si la cantidad de H. hydrossis cuantificada mediante IE depende del tipo de EDAR

estudiada se realizó un análisis de variables categóricas mediante tablas de contingencia

(Anexo 1).

Mediante la tabla de contingenica del Anexo 1, se observa que el valor de IE 5 fue el que con

mayor frecuencia se presentaba en cada depuradora, entre un 60-82%, seguida del IE 4 (14-

36%) y el IE 3, siendo este último el menor observado dentro de cada depuradora (0-5%).

Debido a que el valor de probabilidad asociada del estadístico X2 fue mayor de 0,05

consideraremos que los datos son compatibles con la hipótesis de independencia y por tanto

la cantidad de H. hydrossis y el tipo de depuradora no están relacionadas.

4.2. Toma de imágenes y cuantificación de la señal de hibridación mediante el análisis de

imagen.

Una vez realizadas las 296 hibridaciones correspondientes a las dos sondas utilizadas en el

presente trabajo, se procedió a la toma de fotos de 20-25 campos por cada pocillo de cada una

de las sondas que dieron señal positiva en las hibridaciones (SAP-309 y HHY). Lo que quiere

decir: 20-25 fotos del campo verde (bacterias generales) y 20-25 fotos del campo rojo

(bacterias específicas).

A continuación se presentan algunas fotos tomadas para cada una de estas sondas (Figura 22 y

Figura 23).


53

Figura 22. Campo de la muestra 07/01/09 de la depuradora Carraixet línea A+B hibridada con

la sonda HHY mediante la técnica FISH (en rojo) y otra correspondiente a toda la comunidad

bacteriana (sonda EUBmix) (en verde). Las fotos superiores son sin tratar y las inferiores

tratadas con Adobe Photoshop CS (600x).

Figura 23. Campo de la muestra 11/02/09 de la depuradora Quart hibridada con la sonda SAP-

309 mediante la técnica FISH (en rojo) y otra correspondiente a toda la comunidad bacteriana

(sonda EUBmix) (en verde). Las fotos superiores son sin tratar y las inferiores tratadas con

Adobe Photoshop CS (600x).


54

Es importante destacar que se realizaron aproximadamente 5.560 fotos por cada sonda

estudiada, correspondientes a 2.780 pares de fotos similares a las Figuras 22 y 23 para cada

una de las dos sondas objeto de estudio.

Para la cuantificación de las bacterias estudiadas presentes en cada muestra se utilizó el

programa desarrollado por Borras (2008) tal como se indicó en el apartado de Materiales y

Métodos. Este programa genera una hoja de cálculo en Excel, tal como se muestra en la Figura

24.

Este informe contiene los resultados de la cuantificación con las áreas ocupadas por las

bacterias presentes para cada campo y para todo el pocillo.

En la hoja de cálculo generada también se presenta un gráfico de barras de porcentaje en área

de las bacterias que desean identificarse en la muestra, junto con su media. En esta hoja las

barras representan el porcentaje de bacterias específicas obtenido para cada campo y la línea

azul es la media acumulada, la cual tiende a estabilizarse.

La Figura 24 corresponde al análisis de la muestra del día 13/05/2009 de la EDAR Denia-

Ondara- Pedreguer para (sonda HHY).

Figura 24. Hoja de cálculo generada por el programa de cuantificación de señal

En el presente trabajo se generaron 196 hojas de cálculo (98 hojas en Excel para cada una de

las sondas utilizadas: SAP-309 y HHY) semejantes a la Figura 24. De esta forma se obtuvieron

los porcentajes en áreas de las bacterias presentes que hibridaban con cada sonda para cada

muestra por fecha de muestreo en tablas. La media de las bacterias se presenta tanto en

porcentaje (%) como en miligramos de sólidos suspendidos volátiles en el licor mezcla por litro

(mg SSVLM/l), para así obtener una variable continua acorde a la cantidad real de bacterias

existentes en el sistema.

En el Anexo 2 se presentan los resultados correspondientes a las bacterias identificadas con las

sondas SAP-309 y HHY para cada depuradora estudiada.


55

Por otra parte, a continuación se muestra en las Figuras 25, 26, 27 y 28 la representación de

los resultados obtenidos quincenalmente en cada una de las EDAR estudiadas del porcentaje

en áreas de las bacterias que hibridaban tanto con la sonda SAP-309, como HHY.


mediante la técnica FISH en la EDAR Quart Benáger. Barras de error representan valores de

incertidumbre.

En la EDAR Quart- Benáger el porcentaje de HHY hibridadas se mantiene más o menos

constante a lo largo del año (4-9%) , sin embargo, el porcentaje de bacterias hibridadas con la

sonda SAP-309 va aumentando progresivamente de diciembre (8 %) hasta principios de junio

(31%), para posteriormente volver a disminuir hasta finales de diciembre (10%).

0

5

10

15

20

25

30

35

%

Días

Quart

SAP HHY


56

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

%

Denia

SAP HHY


mediante la técnica FISH para la EDAR de Denia. Barras de error representan valores de

incertidumbre.

En la depuradora de Denia se observa una población variable de 2,5 % a un 12 % de bacterias

hibridadas con la sonda HHY, y de un 5% a un 16% de bacterias hibridadas con la sonda SAP-

309, sin existir una clara tendencia de los datos.

En la Figura 27, relativa a las dos líneas de tratamiento de Castellón, existe una similitud de

resultados entre ambas líneas en cuanto a la población bacteriana que hibrida con las sondas

SAP-309 y HHY. Las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 presentaron una población

variable de 4 % a 39 % (línea A+B) y de 7 % a 32 % (línea C+D). El rango de bacterias hibridadas

con la sonda HHY está entre 3-19 % para la línea A+B y entre 3-17 % para la línea C+D

Las mayores poblaciones se dieron en los meses de febrero, junio, octubre y mediados de

diciembre. Sin embargo, respecto al porcentaje de H. hydrossis la línea A+B presenta dos picos

(octubre y mediados diciembre) y la línea C+D otros dos picos en meses diferentes (marzo y

octubre).


57

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

%

Castellón A+B

SAP HHY

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

%

Castellón C+D

SAP HHY


mediante la técnica FISH para las dos líneas de tratamiento A+B y C+D de la EDAR de Castellón.

Barras de error representan valores de incertidumbre.


58

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

%

Carraixet A+B

SAP HHY

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

%

Carraixet C+D

SAP HHY


mediante la técnica FISH para las dos líneas de tratamiento A+B y C+D de la EDAR de Carraixet.

Barras de error representan valores de incertidumbre.

La evolución del porcentaje de bacterias hibridadas con las sondas objeto de estudio del

presente trabajo fue diferente en cuanto a las dos líneas de tratamiento de la EDAR de la

cuenca del Carraixet (Figura 28). Se observó una mayor variabilidad temporal de resultados en


59

la línea A+B que en la línea C+D. En la línea de tratamiento A+B se observaron valores mayores

del 15% de sonda hibridada con SAP-309 a mitad de febrero, finales de junio, finales de

octubre hasta mitad de septiembre y a finales de diciembre. Sin embargo sólo se observaron

dos picos de H. hydrossis (15 % de promedio de área) a finales de junio y de octubre.

En la línea C+D, los mayores porcentajes hibridados se obtuvieron para SAP-309 se obtuvieron

a finales de abril (17 %), octubre (21 %) y noviembre (22 %), y la población hibridada con la

sonda HHY, se mantuvo más estable en el tiempo en torno a un 5%.

Como resultado general de las figuras anteriores se observa como en todas las EDAR el

porcentaje de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 siempre es mayor que las hibridadas

con HHY. El rango de porcentaje del área hibridada en las diferentes EDAR para HHY está ente

5-15% aproximadamente, predominando un 10%; sin embargo para la población de bacterias

hibridadas con SAP-309, el rango es mucho más amplio, situándose aproximadamente entre 5-

35% del área hibridada de bacterias.

4.2.1 Comparación entre EDAR de la cuantificación de bacterias hibridadas

A simple vista no se aprecia una tendencia clara en la evolución del porcentaje de bacterias

hibridadas en las diferentes EDAR objeto de estudio. Por ello, para poder determinar si existen

diferencias significativas entre las EDAR estudiadas en la cantidad de cada morfotipo

filamentoso, se realizó un análisis de la varianza de un factor (ANOVA) para la cuantificación

del % de área hibridada de HHY y SAP-309 por medio de FISH y análisis de imagen (Anexo 3).

Tras el análisis realizado, debido a que el estadístico de Levene (Anexo 3.2 y 3.6) es mayor que

0,05 aceptamos la hipótesis de igualdad de varianzas tanto para los resultados obtenidos con

la sonda SAP-309, como para la HHY. Por otra parte la tabla de ANOVA (Anexo 3.3 y 3.7), nos

ofrece el estadístico F con su nivel de significación, el cual, al ser menor o igual que 0,05,

rechazamos la hipótesis de igualdad de medias y por tanto existen diferencias significativas

entre los grupos de EDAR en la cantidad de bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY.

A continuación se muestra en la Figura 29 la representación gráfica de diagramas de caja y

bigotes del promedio del área % (SAP) ó concentración (mg SSVLM/L) (SAPCONC) de las

bacterias hibridadas con la sonda SAP-309.


60


(SAP) ó concentración (mg SSVLM/L) (SAPCONC) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-

309 para cada EDAR estudiada (1. Quart; 2. Denia; 3. Castellón A+B; 4. Castellón C+D; Carraixet

A+B y Carraixet C+D). Los asteriscos son casos extremos, los círculos valores atípicos y los

números el nº de muestra del análisis.

En cada Figura aparecen juntos los diagramas de caja correspondientes a los grupos definidos

por la variable factor (EDAR). Las medianas nos informan de la cantidad media de bacterias

hibridadas para la sonda SAP-309 (% del área o en mg SSVLM/l) de cada grupo. Las cajas (cuya

altura representa la amplitud intercuartílica) muestran el grado de dispersión del 50 % de los


61

casos centrales: en ambas figuras, las cajas correspondientes a la EDAR de Castellón (líneas

A+B y C+D) reflejan una amplitud mayor que las cajas del resto de EDAR. Así mismo, en las

líneas de tratamiento de la EDAR de Castellón, ha sido donde mayores concentraciones de

bacterias que hibridaron con la sonda SAP 309 se han encontrado. Tal y como se muestra en

Anexo 3.1, la concentración media más elevada de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309

fue de 485,36 mg SSVLM/l para la línea de tratamiento C+D de Castellón.

En la Figura 29, los bigotes y los casos atípicos y extremos indican hacia dónde se desplazan los

valores más alejados del centro. En todos los casos se observan valores extremos (valores

alejados más de 3 longitudes de caja del percentil 75 o 25) y atípicos (valores alejados más de

1,5 longitudes de caja del percentil 75 o 25) por la parte alta de las distribuciones.

El Anexo 3.4 presenta una tabla con comparaciones múltiples del promedio del área % ó

concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada

depuradora estudiada, utilizando el método de Bonferroni. Se observan diferentes resultados

en función de si se utiliza el promedio del área en % o en mg SSVLM/l.

Empleando el promedio del área en % existen diferencias significativas (menor de 0,05) entre

la EDAR de Denia y la línea C+D de Castellón, entre la línea C+D de Castellón y las líneas A+B

de Carraixet y la línea C+D de Castellón y la línea C+D de la EDAR de Carraixet. Sin embargo,

empleando la concentración de bacterias en mg SSVLM/l se observan las anteriores diferencias

significativas entre EDAR y además entre Quart y Castellón A+B, Quart y Castellón C+D, Denia y

Castellón A+B y Denia y Castellón C+D, Castellón A+B y Carraixet A+B, Castellón A+B y Carraixet

C+D.

En las siguiente Figuras 30 se muestra la representación gráfica de diagramas de caja del

promedio del área % (HHY) y de la concentración (mg SSVLM/L) (HHYCONC) de las bacterias

hibridadas con la sonda HHY.


62


(HHY) ó concentración (mg SSVLM/L) (HHYCONC) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY

para cada EDAR estudiada (1. Quart; 2. Denia; 3. Castellón A+B; 4. Castellón C+D; Carraixet A+B

y Carraixet C+D). Los asteriscos son casos extremos, los círculos valores atípicos y los números

el nº de muestra del análisis.

Tal y como ocurría con los valores obtenidos con la sonda SAP-309, las cajas correspondientes

a la EDAR de Castellón (líneas A+B y C+D) reflejan una amplitud mayor que las cajas del resto

de EDAR para los valores obtenidos con la sonda HHY, tal y como se observa en la Figura 30.


63

En este caso, también la línea C+D de la EDAR de Castellón, ha sido donde se han hallado los

valores más elevados de concentración de bacterias que hibridaron con la sonda HHY, con una

valor medio de 281, 78 mg SSVLM/l (Anexo 3.5).

De nuevo, tal y como ocurría con la sonda SAP-309, de los resultados obtenidos por las

comparaciones múltiples de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada EDAR

estudiada, se observan diferentes resultados en función de si se utiliza el promedio del área en

% o en mg SSVLM/l (Anexo 3.8).

Empleando el promedio del área en % existen diferencias significativas (menor de 0,05) entre

la EDAR de Quart y Castellón A+B y entre Quart y Castellón C+D. Sin embargo, empleando la

concentración de bacterias en mg SSVLM/l se observan las anteriores diferencias significativas

entre EDAR y además entre la EDAR de Denia y Castellón A+B, entre Denia y Castellón C+D,

entre Castellón A+B y Carraixet A+B, entre Castellón A+B y Carraixet C+D, entre Castellón C+D

y Carraixet A+B y entre Castellón C+D y Carraixet C+D.

4.3 Análisis Estadístico entre las señales obtenidas para las bacterias hibridadas con las

sondas SAP-309 y HHY y los parámetros operacionales de la EDAR

El Análisis Estadístico realizado para relacionar la población de bacterias estudiadas con los

parámetros físico-químicos y operacionales se dividió en dos partes: primero un análisis

bivariante donde se determinaron los coeficientes de Pearson y Spearman y segundo un

análisis multivariante, correspondiente a un ACP.

Antes de hacer dichos análisis se realizó un resumen estadístico de todos los parámetros

determinados durante el período de diciembre 2008 a diciembre 2009 en las cuatro EDAR

objeto de estudio. En estos resúmenes se presenta el mínimo, el máximo y la desviación

estándar de cada una de las variables físico-químicas y operacionales (Tabla 18 y 19).

Se han tenido en cuenta aquellos parámetros que pueden afectar la síntesis celular y el

crecimiento bacteriano del género Haliscomenobacter, tales como nutrientes del agua residual

del afluente (principalmente las diversas formas de nitrógeno y fosforo), así como la

concentración de materia orgánica expresada en las fracción proteica, de carbohidratos y

ácidos grasos volátiles, debido al tipo de metabolismo especializado en la degradación de

polisacáridos que presentan. Por otra parte, se ha considerado el pH, Tª, nutrientes (fósforo y

nitrógeno) y sólidos del licor mezcla ya que intervienen en el metabolismo de estas bacterias.


64

Para caracterizar la sedimentabilidad del fango se ha utilizado el Índice Volumétrico del Fango

(IVF). Si el valor es menor de 100 implica una buena decantación, sin embargo si el valor es

superior, se han desarrollado organismos filamentosos con mala sedimentación, lo cual puede

llevar a una descompensación en el funcionamiento del sistema.

Asimismo, se han estudiado los parámetros operacionales más significativos: la carga másica,

la edad de fango, el oxígeno disuelto considerados por diversos autores (Eikelboom, 2000;

Eikelboom y van Buisen, 1983; Jenkins et al. 2004 y Richard, 1989) para el control de

Haliscomenobacter y el Tiempo de Retención Hidráulico dado su importancia en el diseño y

mantenimiento de las EDAR.

Tabla 18. Valor medio, mínimo, máximo y desviación típica de los parámetros físico-químicos Parámetro Unidades Nomenclatura Media Mínimo Máximo D. típica

AFL

UEN

TE

N total mg/l NTaf 53,3 20,0 103,0 16,5

N-NH4 mg/l NH4af 35,0 5,3 66,0 13,1

P total mg/l PTaf 7,5 0,8 31,0 4,3

P-PO4 (fosfato) mg/l PO4af 5,2 0,2 17,0 3,2

DBO5/NKT Ud DBO5NKT 3,3 1,1 7,9 1,2

DBO5/PT Ud DBOPT 26,6 5,0 97,9 14,6

Carga carbohidratos Kg/d CCARBO 11,1 1,9 59,7 8,5

Proteínas mg/l Prote 47,1 4,0 111,0 19,6

Ácidos grasos volátiles mg/l AGV 15,5 0,0 169,0 26,4

LIC

OR

MEZ

CLA

pH ud Phlm 7,4 6,7 8,0 0,2

Sólidos suspendidos mg/L SSLM 2.931,6 1.080,0 6.800,0 1.173,6

Sólidos suspendidos volátiles mg/L SSVLM 2.197,7 900,0 4.920,0 800,7

Índice volumétrico del fango ml/g IVF 121,1 0,0 286,0 40,4

Nitrógeno total del licor mezcla mg/g SSVLM NTSSVLM 71,3 29,6 140,3 26,2

Fósforo total del licor mezcla mg/g SSVLM PTSSVLM 38,8 18,6 89,9 16,7

Temperatura ºC T 20,8 10,8 29,1 4,0


65

Tabla 19. Valor medio, mínimo, máximo y desviación típica de los parámetros operacionales Parámetro Unidades Nomenclatura Media Mínimo Máximo D. típica

Carga másica kgDBO5/kgSSVLM.d CMdbo3 0,2 0,0 0,6 0,1

Carga másica kgDQOs/kgSSVLM.d CMdqos3 0,2 0,0 0,5 0,1

Tiempo de retención

hidráulico Horas (h) TRHr3 9,3 4,7 21,9 4,9

Edad del fango Días EF7 9,3 2,9 30,5 5,9

Oxígeno disuelto

(<0,8ppm) % Obajo 21,4 0,0 69,4 21,8

Oxígeno disuelto

(0,8-2ppm) % Omed 29,9 0,0 95,1 23,5

Oxígeno disuelto

(>2 ppm) % Oalt 48,9 0,0 100,0 38,2

4.3.1 Coeficientes de Pearson y Spearman. Análisis Bivariante.

El Análisis bivariante se realizó con el programa estadístico IBM SPSS Statistics 19

introduciendo las variables físico-químicas, operacionales y de las bacterias hibridadas con las

sondas objeto de estudio presentes en el licor mezcla.

A continuación se presenta las Tablas 20, 21, 22 y 23 se observan los coeficientes de Pearson y

Spearman para las variables físico-químicas, operacionales y biológicas del proceso con

respecto a las bacterias hibridadas con la sonda SAP- 309 y HHY. En todas las tablas

correspondientes al análisis de Pearson y Spearman se presentan algunos valores en negrita,

esto indica una significancia estadística de un nivel igual o superior al 95% (*) o igual o superior

al 99% (**).

En la Tabla 20, se observa que tanto la concentración de bacterias que hibridaron con la sonda

SAP-309, como con la sonda HHY presentan correlaciones positivas significativas con los

parámetros referentes al Nitrógeno (N), al fósforo (P) y ácidos grasos volátiles (AGV)en el

afluente y correlación negativa significativa con la DBOPT del afluente. Así como, correlación

positiva significativa entre las proteínas y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda

SAP-309.

Otro resultado interesante es la correlación negativa significativa entre el caudal de

carbohidratos en el afluente con el porcentaje de las bacterias Haliscomenobacter hydrossis

cuantificadas con análisis de imagen y si se tiene en cuenta la correlación de Spearman, la


66

correlación negativa entre la carga de carbohidratos y las concentraciones de bacterias

hibridadas con la sonda SAP-309 y HHY.

Sin embargo, no aparece ninguna correlación bivartiante entre las bacterias de H. hydrossis

cuantificadas mediante el índice de Eikelboom y los parámetros físico-químicos del afluente.

De la Tabla 21 se pueden extraer correlaciones significativas positivas entre los sólidos

suspendidos del licor mezcla (SSLM), los sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla (SSVLM)

y el fósforo total (PTSSVLM) y una correlación significativa negativa para NTSSVLM y la

concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 y HHY cuantificadas con análisis

de imagen.

Por otra parte se obtuvo una correlación significativa de Spearman negativa entre el pH y la

concentración de bacterias H. hydrossis cuantificadas por tratamiento de imagen.

Otro de los resultados obtenidos, fue la correlación significativa positiva entre la temperatura y

el porcentaje promedio de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309.

En este caso, sí que aparece alguna correlación bivariante entre los filamentos de H. hydrossis

cuantificados mediante el índice de Eikelboom y los parámetros físico-químicos del licor

mezcla, existiendo una correlación significativa negativa entre el SSLM y SSVLM con estas

bacterias.

Ninguna variable biológica fue correlacionada con el índice volumétrico del fango (IVF).


67

Tabla 20. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY con las variables físico-químicas del afluente

Muestra Variable

Correlación de Pearson Rho de Spearman

SAPCONC HHYCONC SAP HHY IEHHY SAPCONC HHYCONC SAP HHY IEHHY A

FLU

ENTE

NTaf Coef 0,205* 0,240** -0,021 0,038 0,041 0,137 0,189* -0,067 0,026 0,032

SIg.(bilateral) 0,016 0,005 0,815 0,668 0,639 0,111 0,027 0,444 0,769 0,719

NH4af Coef 0,405**

0,344**

0,220* 0,121 0,094 0,414

** 0,342

** 0,211

* 0,089 0,076

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,011 0,168 0,282 0,000 0,000 0,015 0,309 0,388

PTaf Coef 0,349**

0,392**

0,037 0,119 -0,068 0,238**

0,300**

0,007 0,122 -0,099

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,672 0,173 0,437 0,005 0,000 0,935 0,165 0,258

PO4af Coef 0,294** 0,380** 0,040 0,188* -0,080 0,239** 0,342** 0,047 0,195* -0,140

SIg.(bilateral) 0,001 0,000 0,660 0,035 0,370 0,006 0,000 0,601 0,028 0,118

DBO5NKT Coef 0,016 -0,167 0,019 -0,212* 0,105 -0,018 -0,236** 0,048 -0,247** 0,113

SIg.(bilateral) 0,853 0,056 0,828 0,016 0,240 0,839 0,006 0,590 0,005 0,203

DBOPT Coef -0,295** -0,410** -0,128 -0,298** 0,081 -0,250** -0,397** -0,036 -0,255** 0,141

SIg.(bilateral) 0,001 0,000 0,151 0,001 0,365 0,004 0,000 0,685 0,004 0,113

CCARBO Coef -0,168 -0,199* -0,121 -0,041 0,054 -0.313** -0,333** -0,193** -0,069 -0,064

SIg.(bilateral) 0,050 0,021 0,167 0,643 0,537 0,000 0,000 0,028 0,431 0,337

Prote Coef 0,269**

0,157 0,157 0,015 0,057 0,284**

0,102 0,156 -0,066 0,011

SIg.(bilateral) 0,002 0,070 0,072 0,861 0,517 0,001 0,240 0,075 0,455 0,904

AGV Coef 0,254** 0,253** 0,172* 0,156 -0,024 0,269** 0,163 0,158 0,049 -0,001

SIg.(bilateral) 0,003 0,003 0,050 0,076 0,784 0,002 0,059 0,072 0,576 0,987

*La correlación es significante al nivel 0,05 (bilateral)** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral)


68

Tabla 21. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY con las variables físico-químicas del licor mezcla

Muestra Variable


SAPCONC HHYCONC SAP HHY IEHHY SAPCONC HHYCONC SAP HHY IEHHY LI

CO

R M

EZC

LA

Phlm Coef -0,065 -0,150 -0,022 -0,128 0,004 -0,038 -0,171* -0,007 -0,165 0,021

SIg.(bilateral) 0,452 0,081 0,803 0,142 0,965 0,660 0,046 0,937 0,059 0,811

SSLM Coef 0,592**

0,631**

0,212* 0,129 -0,219

* 0,647

** 0,686

** 0,249

** 0,158 -0,207

*

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,015 0,140 0,012 0,000 0,000 0,004 0,070 0,017

SSVLM Coef 0,622**

0,628**

0,225**

0,102 -0,239**

0,668**

0,643**

0,258**

0,098 -0,204*

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,009 0,243 0,006 0,000 0,000 0,003 0,266 0,019

IVF Coef 0,021 -0,011 0,051 -0,061 0,132 -0,046 -0,080 0,003 -0,014 0,157

SIg.(bilateral) 0,808 0,895 0,558 0,485 0,131 0,592 0,353 0,974 0,875 0,073

NTSSVLM Coef -0,333** -0,454** -0,155 -0,205* 0,014 -0,465** -0,532** -0,260** -0,211* 0,033

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,076 0,019 0,873 0,000 0,000 0,003 0,015 0,705

PTSSVLM Coef 0,398** 0,524** 0,144 0,266** -0,054 0,403** 0,536** 0,134 0,243** -0,073

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,099 0,002 0,537 0,000 0,000 0,127 0,005 0,405

T Coef 0,164 0,090 0,204* 0,092 0,068 0,233** 0,076 0,262** 0,077 0,094

SIg.(bilateral) 0,056 0,297 0,019 0,295 0,441 0,006 0,377 0,002 0,379 0,286



69

De la Tabla 22 se pueden extraer correlaciones importantes entre Haliscomenobacter con los

parámetros operacionales. Se presentan correlaciones positivas entre la concentración de

bacterias hibridadas con SAP-309 y HHY y la concentración de oxígeno en rangos bajo y medio.

Por otro lado, se observaron correlaciones negativas significativas entre la concentración de

estas bacterias objeto de estudio y el tiempo de retención hidráulico.

De nuevo, ningún parámetro operacional fue correlacionado con la cantidad de H. hydrossis

evaluada mediante el Índice de Eikelboom.

Por último la Tabla 23, corresponde a las correlaciones de Pearson y Spearman de las

bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY estudiadas entre ellas mismas.

Se puede observar una correlación positiva entra las bacterias hibridadas con las sondas SAP-

309 y HHY, lo que quiere decir una clara dependencia entre estas poblaciones; ya que la

población de H. hydrossis representan un amplio porcentaje del total de las bacterias que

hibridan con la sonda SAP-309 (ver Figura 4).

Por otra parte cabe destacar la correlación significativa positiva entre la concentración de H.

hydrossis cuantificada mediante FISH y análisis de imagen y la cuantificada por FISH y el Índice

de Eikelboom.


70

Tabla 22. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY con las variables operacionales del proceso

Variable


SAPCONC HHYCONC SAP HHY IEHHY SAPCONC HHYCONC SAP HHY IEHHY

CMdbo3 Coef -0,057 0,007 -0,029 0,114 0,152 -0,161 -0,154 -0,079 0,071 0,148

SIg.(bilateral) 0,507 0,933 0,739 0,194 0,082 0,059 0,073 0,367 0,418 0,089

CMdqos3 Coef 0,176* 0,147 0,104 0,110 0,147 0,113 0,071 0,072 0,101 0,145

SIg.(bilateral) 0,039 0,087 0,236 0,208 0,092 0,190 0,415 0,409 0,251 0,097

TRHr3 Coef -0,228**

-0,287**

-0,123 -0,261**

0,090 -0,270**

-0,355**

-0,100 -0,253**

0,099

SIg.(bilateral) 0,007 0,001 0,159 0,003 0,303 0,001 0,000 0,256 0,003 0,260

EF7 Coef -0,007 -0,019 0,038 -0,066 -0,007 0,123 0,119 0,115 -0,027 -0,013

SIg.(bilateral) 0,935 0,828 0,667 0,454 0,939 0,152 0,167 0,189 0,757 0,886

Obajo Coef 0,291** 0,249** 0,115 -0,054 -0,053 0,273** 0,252** 0,125 -0,054 -0,044

SIg.(bilateral) 0,001 0,003 0,188 0,542 0,545 0,001 0,003 0,152 0,537 0,618

Omed Coef 0,321** 0,310** 0,135 0,030 0,040 0,376** 0,265** 0,177* -0,060 -0,020

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,123 0,734 0,651 0,000 0,002 0,042 0,496 0,816

Oalt Coef -0,057 0,052 -0,012 0,214* -0,011 -0,268** -0,149 -0,151 0,139 0,011

SIg.(bilateral) 0,510 0,548 0,889 0,014 0,904 0,002 0,084 0,084 0,112 0,902



71

Tabla 23. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY con las variables biológicas del proceso

Variable Correlación de Pearson Rho de Spearman

SAPCONC HHYCONC SAP HHY IEHHY SAPCONC HHYCONC SAP HHY IEHHY

SAPCONC Coef 1 0,702** 0,839** 0,425** -0,089 1,000 0,668** 0,854** 0,350** -0,117

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,000 0,310 . 0,000 0,000 0,000 0,181

HHYCONC Coef 0,702** 1 0,470** 0,773** 0,035 0,668** 1,000 0,466** 0,784** 0,030

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,000 0,694 0,000 . 0,000 0,000 0,729

SAP Coef 0,839** 0,470** 1 0,511** 0,006 0,854** 0,466** 1,000 0,438** 0,030

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,000 0,945 0,000 0,000 . 0,000 0,734

HHY Coef 0,425** 0,773** 0,511** 1 0,206* 0,350** 0,784** 0,438** 1,000 0,253**

SIg.(bilateral) 0,000 0,000 0,000 0,018 0,000 0,000 0,000 . 0,003

IEHHY Coef -0,089 0,035 0,006 0,206* 1 -0,117 0,030 0,030 0,253** 1,000

SIg.(bilateral) 0,310 0,694 0,945 0,018 0,181 0,729 0,734 0,003 .



72

4.3.2 Análisis de Componentes Principales (ACP)

En el presente estudio se realizaron tres ACP entre la concentración de bacterias hibridadas

con la sonda SAP-309 y la sonda HHY: uno para las variables físico-químicas del afluente, otro

para las del licor mezcla y un último para las operacionales.

Los resultados mostrados en este apartado corresponden a los gráficos de las saturaciones

factoriales (estructura rotada) para dichas variables y la concentración en mg SSVLM/l de la

población de bacterias hibridadas con las sondas objeto de estudio y las variables

anteriormente citadas; ya que se presentaron mayores correlaciones significativas que

teniendo en cuenta el porcentaje promedio de superficie hibridada.

Así mismo, se realizaron los cuatro ACP comentados con la cantidad de H. hydrossis

cuantificada mediante FISH y el IE.

Por medio de este análisis factorial, el cual, es una técnica de reducción de datos, se obtienen

grupos homogéneos de variables a partir de un conjunto numeroso de variables. Estos grupos

homogéneos se forman con las variables que correlacionan mucho entre sí y procurando,

inicialmente, que unos grupos sean independientes de otros. Es, por tanto, una técnica de

reducción de la dimensionalidad de los datos. Su propósito último consiste en buscar el

número mínimo de dimensiones capaces de explicar el máximo de información contenida en

los datos.

Es importante la comprensión de estos gráficos para su correcta interpretación, para ello se

debe saber que los mismos están divididos en dos ejes (Componente 1 y Componente 2) que

representan las dos dimensiones (o componentes) que explican la mayor varianza acumulada.

Estos gráficos tienen cuatro cuadrantes, en ellos se reparten distintos grupos de variables

representadas por puntos. Estas variables, mientras más cercanas se encuentran entre sí, se

verán fuertemente relacionadas. Por el contrario, si hay un grupo de variables que aparecen

en el cuadrante opuesto (respecto al origen de coordenadas), es decir que siguiendo una

misma línea se encuentran en los extremos de la misma pasando por el centro del gráfico,

entonces estos grupos de variables presentarán una relación inversa.

A continuación se presentan los resultados de los tres ACP realizados:

4.3.2.1. ACP para las variables físico-químicas del afluente y las variables biológicas

estudiadas


73

En la Figura 31 y Anexo 4.1-4.9 se presentan los gráficos de las saturaciones factoriales

(estructura rotada) de las variables físico-químicas del efluente y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda SAP-309 (a), HHY (b) y H. hydrossis cuantificadas con el IE (c); así como

las tablas de los resultados de las pruebas de Kaiser-Meyer-Olkin y Barlett, varianza total

explicada y la matriz de componentes rotados.

La medida de adecuación muestral de Kaiser-Meyer-Olkin constata en las tres gráficas que el

análisis factorial es adecuado (0,77 (a), 0,77 (b) y 0,72 (c)).

En el caso de Figura 31.a explica un 52,89 % de la varianza acumulada el componente 1 y para

el componente 2 un 15,51%, explicando un porcentaje acumulado de la varianza del 68,41%.

Comparando las saturaciones relativas de cada variable en cada uno de los dos factores o

componentes (anexo 4.3.) podemos apreciar que el primer factor está constituido por las

variables SAPCONC, Nitrógeno total afluente, Nitrógeno amoniacal del afluente, fósforo total y

fosfato del afluente, proteínas del afluente y ácidos grasos del afluente. Todas estas variables

saturan en un único factor, salvo SAPCONC, porque constituyen un grupo diferenciado de

variables dentro de la matriz de correlaciones. Este factor parece reflejar la dimensión de

elementos nutritivos y población bacteriana, siendo todos positivos, por tanto cuanto mayor

es la cantidad de nitrógeno, fósforo, ácidos grasos y proteínas, mayor es la cantidad de

bacterias que hibridan con la sonda SAP-309. El segundo factor recoge el grupo de las variables

carga de carbohidratos en positivo y SAPCONC en negativo, por lo que al aumentar la carga de

carbohidratos se disminuye la cantidad de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309.

La Figura 31.b explica un 52,85 % de la varianza acumulada el componente 1 y para el

componente 2 un 13,38%, explicando un porcentaje acumulado de la varianza del 68,23%

(Anexo 4.5). Se han obtenido los mismos resultados que para el caso anterior, de tal modo que

al aumentar el caudal de carbohidratos se disminuye la población bacteriana de H. hydrossis.

Por último, el ACP realizado para relacionar variables físico-químicas del afluente y la

concentración de H. hydrossis cuantificadas con el IE (Figura 31.c), muestra como al aumentar

la cantidad de carbohidratos disminuye la cantidad de bacterias hibridadas con la sonda HHY

(Componente 2 que explica el 68,08 % de la varianza acumulada (Anexo 4.8)). Por otra parte,

el componente 1 que explica el 49,92 % de la varianza, está compuesto por las siguientes

variables, todas ellas de signo positivo: NT, NH4, PO43- y proteínas del afluente.


74

c)

a)

Figura 31. Gráficos de las saturaciones

factoriales (estructura rotada) de las

variables físico-químicas del afluente y la

concentración de bacterias hibridadas

con la sonda SAP-309 (a), HHY (b) y H.

hydrossis cuantificadas con el IE (c).Los

círculos rojos muestran las variables que

saturan en el mismo factor o

componente.

b)


75

4.3.2.2. ACP para las variables físico-químicas del licor mezcla y las variables biológicas

estudiadas

En la Figura 32 y Anexo 4.10-4.18 se presentan los resultados del ACP para las variables físico-

químicas del licor mezcla y las poblaciones de bacterias estudiadas.

El análisis factorial es adecuado, puesto que la medida de adecuación muestral de Kaiser-

Meyer-Olkin es mayor de 0,63 en los tres análisis, del mismo modo que el porcentaje de

varianza acumulada explicada por los componentes ha sido mayor del 65%.

La Figura 32.a muestra como el primer factor está constituido por las variables SAPCONC,

SSLM, SSVLM, fósforo total del licor mezcla (todos con signo positivo) y Nitrógeno total del

licor mezcla en signo negativo. Por tanto cuanto mayor es la cantidad de sólidos suspendidos,

sólidos suspendidos volátiles, fósforo total y menor la cantidad de nitrógeno, mayor es la

cantidad de bacterias que hibridan con la sonda SAP-309. El segundo factor recoge el grupo de

variables físicas: temperatura y el pH.

Teniendo en cuenta la información de la Figura 32.b y el Anexo 4.15, se observan

prácticamente los mismos resultados para la concentración de H. hydrossis que en la Figura

32.b. Las variables HHYCONC, SSLM, SSVLM, fósforo total del licor mezcla con signo positivo y

Nitrógeno total del licor mezcla en signo negativo, saturan en el primer factor, mientras que el

pH con signo negativo y la Temperatura con signo positivo en el segundo factor.

Para el caso de la Figura 32.c relativa al gráfico de las saturaciones factoriales (estructura

rotada) de las variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de H. hydrossis

cuantificada por el índice de Eikelboom, se obtienen la siguiente información: las variables

SSLM, SSVLM, PTSSVLM y NTSSVLM saturan en un único factor; sin embargo la temperatura y

la cantidad de H. hydrossis en el factor 2 (Anexo 4.18). Se observa que al aumentar la

temperatura crece la población cuantificada por el IE de H. hydrossis.


76

b) a)

c) Figura 32. Gráficos de las saturaciones

factoriales (estructura rotada) de las

variables físico-químicas del licor mezcla y

la concentración de bacterias hibridadas

con la sonda SAP-309 (a), HHY (b) y H.

hydrossis cuantificadas con el IE (c). Los


saturan en el mismo factor o componente.


77

4.3.2.3. ACP para las variables operacionales y las variables biológicas estudiadas

Los resultados del ACP para las variables operacionales y las poblaciones de bacterias

estudiadas se presentan en la Figura 33 y Anexo 4.19-4.27. El análisis factorial realizado es

bueno, puesto que la medida de adecuación muestral de Kaiser-Meyer-Olkin es mayor de 0,5.

Por otra parte, el porcentaje de varianza acumulada explicada por los componentes ha sido

mayor del 68% representando un buen ajuste.

Comparando las saturaciones relativas de cada variable en cada uno de los dos factores o

componentes (anexo 4.19 y Figura 35.a) podemos apreciar que el primer factor está

constituido por las variables de carga másica, edad del fango, tiempo de retención hidráulico y

rango de oxígeno bajo. Todas estas variables saturan en un único factor, salvo oxígeno bajo

porque constituyen un grupo diferenciado de variables dentro de la matriz de correlaciones.

Todas estas variables presentan una correlación positiva, salvo las variables de carga másica

que presentan una relación negativa con el resto de variables. Por otra parte, el segundo

factor recoge el grupo de las variables oxígeno medio, oxigeno bajo y SAPCONC relacionadas

positivamente, por lo que al aumentar el oxígeno en rango bajo a medio se aumenta la

cantidad de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309.

En la Figura 33.b se observa como la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY

aumenta al aumentar el oxígeno en rango bajo a medio, ya que las tres variables saturan en el

componente 2. Del mismo modo, que en la Figura 33.a la carga másica, la edad de fango y el

tiempo de retención hidráulico saturan en el otro componente, estando correlacionadas de

forma positiva la edad de fango y TRH, y negativamente la carga másica.

Para el caso de la Figura 33.c relativa al gráfico de las saturaciones factoriales (estructura

rotada) de las variables operacionales y la cantidad de H. hydrossis cuantificada por el índice

de Eikelboom, se obtienen la siguiente información: las variables tiempo de retención

hidráulico, oxígeno bajo y CMdbo3 saturan en el componente 1. Las dos primeras variables

presentan correlación positiva y la carga másica en Kg DBO5/kg SSVLM·d tienen una relación

negativa con el TRH y el oxígeno bajo. Por otra parte, la carga másica mediada tanto en Kg

DBO5/kg SSVLM·dcomo en Kg DQO/kg SSVLM·d y la cantidad de H. hydrossis saturan en el

componente 2 (Anexo 4.27). Se observa que la carga másica se correlaciona positivamente con

la población cuantificada por el IE de H.hydrossis.


78

Figura 33. Gráficos de las saturaciones

factoriales (estructura rotada) de las variables

operacionales y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda SAP-309 (a), HHY (b)

y H.hydrossis cuantificadas con el IE (c). Los


saturan en el mismo factor o componente.

a)

B

c)

5. DISCUSIÓN


79

5. DISCUSIÓN

5.1 Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos


El morfotipo filamentoso H. hydrossis hibridado con la sonda HHY se observó en todas las

EDAR estudiadas con abundancias elevadas (Índice Eikelboom 5 y 4), excepto valores medios

de índice 3 en un muestreo de la EDAR de Quart, uno de la línea de tratamiento C+D de

Castellón y otro de la línea A+B de la EDAR de Carraixet.

Otros estudios han apuntado que pequeñas poblaciones de H. hydrossis y filamentos similares

a H. hydrossis fueron observados en la mayoría de depuradoras , tanto de origen municipal

como industrial, sin embargo sólo en un 13% de las depuradoras estudiadas tenían grandes

poblaciones de Bacteroidetes potencialmente responsables de “bulking” (Kragelund et al.

2008).

En el presente estudio se observa que el valor de IE 5 fue el que con mayor frecuencia se

presentaba en cada EDAR, entre un 60-82%, seguida del IE 4 (14-36%) y el IE 3, siendo este

último el menor observado dentro de cada EDAR (0-5%).

Kragelund et al. (2008) observó que la gran variedad de industrias en las que aparece esta

bacteria demuestra que no es posible relacionar las diferentes cepas de "H. hydrossis" con un

agua residual específica. Dicha conclusión, también se obtuvo en este estudio donde se

constató que la cantidad de H. hydrossis y el tipo de EDAR no están relacionadas.

5.1.2 Cuantificación de la señal de hibridación mediante el análisis de imagen

Los filamentos de H. hydrossis cuantificados en el presente estudio se caracterizan

morfológicamente por tener filamentos cortos y rectos (con apariencia de agujas) y

mayoritariamente largos y un poco torcidos. Eikelboom (2006) y Jenkins (2003) establecen

que normalmente se presentan saliendo de los flóculos, sin embargo en las muestras de las

EDAR estudiadas se ha observado su presencia de forma mayoritaria en situación intraflocular.

Por otra parte, las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309, se presentaron en forma de

filamentos intra e interflocular de diferente longitud y células aisladas dentro del fóculo o

libres en suspensión, del mismo modo que en otros estudios (Schauer y Hahn, 2005).

Hasta el momento, no se ha realizado ningún estudio dónde se cuantifique la abundancia de H.

hydrossis por medio de la técnica FISH y el análisis de imagen, por lo tanto las conclusiones

obtenidas en este estudio no son comparables y sirven como información preliminar para

posteriores estudios.


80

La combinación de las sondas HHY, HHY-654 (no estudiada en el presente trabajo) y SAP-309

permite la detección de la mayoría o prácticamente todas las bacterias parecidas a H. hydrossis

(Nielsen et al. 2009; Kragelund et al. 2008).

En todas las muestras de las EDAR estudiadas se obtuvo hibridación positiva con las sondas

SAP-309 y HHY. Otros estudios realizados en 126 EDAR industriales diferentes mostraron que

53 depuradoras hibridaban con la sonda SAP-309 y 40 con la sonda HHY (Kragelund et al.

2008).

Como resultado general, se observa como en todas las EDAR el porcentaje de bacterias

hibridadas con la sonda SAP-309 siempre es mayor que las hibridadas con HHY. Esto es debido

a que la sonda SAP-309 cubre la mayoría de las secuencias de la familia Saprospiraceae y el

género Haliscomenobacter (Nielsen et al. 2009; Kragelund et al. 2008), tal y como se puede

observar en la Figura 4.

El rango de porcentaje del área hibridada en las diferentes EDAR para HHY está ente 5-15%

aproximadamente, predominando un 10%; sin embargo para la población de bacterias

hibridadas con SAP-309, el rango es mucho más amplio, situándose aproximadamente entre 5-

35% del área hibridada de bacterias.

A priori no se obtuvo ningún patrón generalizado de la evolución de H. hydrossis en las EDAR

estudiadas a lo largo del año, ya que los distintos picos de abundancia de dicha población se

presentaron en diferentes meses en cada EDAR estudiada.

Se observó que en la EDAR Quart- Benáger el porcentaje de HHY hibridadas se mantiene más o

menos constante a lo largo del año (4-9 %), sin embargo, el porcentaje de bacterias hibridadas

con la sonda SAP-309 va aumentando progresivamente de diciembre (8 %) hasta principios de

junio (31%), para posteriormente volver a disminuir hasta finales de diciembre (10%), quizás

sea debido a que presenta correlación positiva con la temperatura, tal y como se observó en la

Tabla 21, por ello en los meses más fríos hay menos población y en los más cálidos y calurosos

aumenta su población. En la depuradora de Denia se observa que la población bacteriana que

hibrida con cada una de las sondas estudiadas no presenta una clara tendencia en la evolución

(5-16% para SAP-309 y 2,5- 12 % para HHY). Por otra parte, existe una similitud de resultados

entre ambas líneas de la EDAR de Castellón en cuanto a la población bacteriana que hibrida

con las sondas SAP-309 (4-39 % línea A+B y 7-32 % línea C+D) y HHY (3-19 % línea A+B y 3-17 %

línea C+D). Por último, en la línea A+B del Carraixet Se observó una mayor variabilidad

temporal de resultados en la línea A+B que en la línea C+D. En las líneas de tratamiento A+B y

C+D se observaron valores mayores del 15% de sonda hibridada con SAP-309 en diferentes

meses. Sin embargo, la población hibridada con la sonda HHY en la línea C+D se mantuvo más


81

estable en el tiempo en torno a un 5%, aunque en la línea A+B se observaron dos picos de H.

hydrossis (15 % de promedio de área).

Comparación entre EDAR de la cuantificación de bacterias hibridadas

Para poder determinar si existen diferencias significativas entre las EDAR estudiadas en la

cantidad de cada morfotipo filamentoso, se realizó un análisis de la varianza de un factor

(ANOVA) para la cuantificación del % de área hibridada de HHY y SAP-309 por medio de FISH y

análisis de imagen.

Tras el análisis realizado se observó que existen diferencias significativas bivariadas entre los

grupos de EDAR en la cantidad de bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY, aunque

dependiendo de cómo se expresen los resultados (promedio del área en % o en mg SSVLM/l)

se obtuvieron resultados diferentes. De hecho, se obtuvieron más diferencias significativas

cuando se expresaba los resultados como concentración. En el caso de la población de

bacterias hibridadas con la sonda SAP-309, se obtuvieron los mayores valores en la EDAR de

Castellón y en segundo lugar la de Quart y las menores poblaciones las EDAR de Denia y

Carraixet. Por otra parte, respecto a la población de bacterias hibridadas con la sonda HHY, los

mayores valores se presentaron de nuevo en ambas líneas de la EDAR de Castellón,

obteniéndose poblaciones medias similares en el resto de EDAR.

Por último, cabe destacar que nunca se observaron diferencias significativas entre ambas

líneas de una misma depuradora.

5.1.3 Comparación entre IE y la técnica FISH con análisis de imagen

En los resultados del presente trabajo ha quedado demostrado que las cuantificaciones del

morfotipo filamentoso H. hydrossis mediante el índice subjetivo de Eikelboom y la técnica FISH

no coinciden. Dichas diferencias pueden ser por estar los filamentos mayoritariamente dentro

de los flóculos y ser muy finos. Tales diferencias entre las dos técnicas en la cuantificación e

identificación no han sido demostradas por otros autores para esta bacteria. La cuantificación

por el índice de Eikelboom presenta una serie de inconvenientes que le impide ser una

herramienta ideal para la identificación y valoración de la abundancia de los distintos

filamentos bacterianos presentes en el flóculo de los fangos activo.

Por una parte al englobar el IE un rango, no te indica la concentración o el porcentaje de

abundancia de la población bacteriana que se esté estudiando, y por lo tanto no se pueden

realizar análisis estadísticos cuantitativos cuando casi todos los valores son muy parecidos, en


82

este caso de FI=5. Por otra parte, cuando existe mucha población bacteriana, como es nuestro

caso de estudio, no tiene en cuenta las diferencias que existe entre una muestra con IE= 5 de

20 filamentos o un IE = 5 de 70 filamentos hibridados. Sin embargo, con el tratamiento de

imagen junto con la técnica FISH dichos problemas se solventan, obteniéndose variabilidad en

la evolución de las poblaciones bacterianas estudiadas. Es por ello, por lo que los futuros

estudios que se realicen para esta especie deberían ir encaminados en este sentido.

El tratamiento de imagen es una técnica que permite una rápida cuantificación de

microorganismos (Hug et al. 2005) y una profunda caracterización de los agregados

microbianos (Liu et al. 2010). Sin embargo, también supone un trabajo tedioso y de muchas

horas si las imágenes obtenidas con el microscopio, han de ser tratadas previamente a la

cuantificación con algún programa como Adobe Photoshop CS u otro similar.

En nuestro caso se debieron tratar cada una de las 11.120 fotos realizadas, debido a que las

muestras estaban muy concentradas y había mucho ruido de fondo. Este problema, quizás se

pueda solucionar teniendo en cuenta el estudio de Motta et al. (2002), el cual evidenciaba que

las muestras que no se diluían, aparecían los agregados y filamentos de las bacterias

superpuestos en las imágenes, y por tanto se podía producir una mala cuantificación. El

óptimo valor de dilución, está determinado por la dilución más baja que permite un máximo

porcentaje de objetos identificados (Costa et al. 2013). El porcentaje de área identificada es el

ratio entre el área de objetos que están completamente dentro de la imagen y el área total de

objetos en la imagen, incluyendo aquellos que están cortados en los bordes de la misma

muestra (Amaral, 2003). Según Costa et al. (2007, 2009 a, b) el factor óptimo de dilución está

entre 1:5 y 1:10 para muestras de fango anaerobias y una concentración de sólidos volátiles en

torno a 30 g/l. Sin embargo, para fangos activados aerobios, el máximo factor de dilución es

1:5 en un rango total de sólidos suspendidos de 2,3 4,7 mg/l (Mesquita et al. 2010).

5.2 Ecofisiología de los morfotipos filamentosos

5.2.1. Parámetros físico-químicos del afluente respecto a Haliscomenobacter

A partir de los resultados obtenidos (Tabla 20 y Figura 31), se observó una correlación positiva

entre la concentración de bacterias hibridadas con las sondas SAP-309, HHY y el Nitrógeno

total afluente, el Nitrógeno amoniacal del afluente, el fósforo total y fosfato del afluente, los

ácidos grasos volátiles y las proteínas del afluente. Dichos resultados parecen estar en

concordancia con otros estudios (Kämpfer et al. (1995b). Estos autores observaron una estricta


83

dependencia ante la presencia de calcio, magnesio y fosfato para H. hydrossis, de hecho,

prefiere un estricto rango de concentración de fósforo (0,05-0,2 g/l). Sin embargo, observó

que altas concentraciones de amonio (>2 g/l) inhiben el crecimiento de Haliscomenobacter en

cultivo puro, lo cual está en concordancia con los resultados obtenidos, debido a ese valor de

amonio no se daba en las EDAR objeto de estudio, habiendo un rango de 5,3 a 66 mg/l de

amonio en el afluente.

No obstante, el hecho de que no disminuyan las formas nitrogenadas, fosfatadas y parte de la

materia orgánica (proteínas y ácidos grasos volátiles) puede ser debido a su elevada resistencia

al estrés por falta de nutrientes propuesta por Chiesa e Irvine (1985), y su capacidad de utilizar

N-acetilglucosamina y compuestos similares que comparten con sólo unas pocas bacterias

como las Chloroflexi (Kindachi et al. 2004).

De hecho, cabe destacar, que al aumentar la carga de carbohidratos se disminuye la población

bacteriana de H.hydrossis, así como la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-

309.Se ha confirmado en estudios de cultivo puro en H. hydrossis una especialización en la

degradación aerobia de polisacáridos (Kämpfer, 1995; Krul, 1977; Mulder y Deinema, 1992;

van Veen et al. 1973, 1982), debido a su capacidad de tomar glucosa y N-acetilglucosamina, en

general, todos los filamentos de Haliscomenobacter hydrossis y filamentos similares a H.

hydrossis (Kragelund et al. 2008; Kindachi et al. 2004). Unidades de N-acetilglucosamina se

encuentran en lipopolisacáridos y peptoglicanos, los cuales son componentes liberados por las

células en descomposición (Barker y Stuckey, 1999). Cuando se produce la degradación

continua de las células en EDAR, se liberan unidades de N-acetilglucosamina, las cuales,

pueden proporcionar el crecimiento de las bacterias filamentosas del phyllum Bacteroidetes y

por tanto explicar su presencia en las diferentes EDAR.

Kragelund et al. (2008) identificaron actividad exoenzimática de diferentes exo-enzimas

excretados por filamentos similares a H. hydrossis, como glucuronidasas y chitinasas, los

cuales, pueden ayudar en la rotura de polisacáridos. A medida que las bacterias objeto de

estudio van degradando los carbohidratos, y por tanto disminuyendo su cantidad, los

productos obtenidos pueden contribuir como continuo aporte de substrato para las bacterias,

aumentando por tanto su población. El aporte de carbohidratos del afluente no contribuiría

positivamente a esta actividad excepto en ausencia de células muertas intrafloculares y sus

componentes derivados de su lisis.


84

No se encontró ninguna correlación bivariante entre las bacterias de H.hydrossis cuantificadas

mediante el índice de Eikelboom y los parámetros físico-químicos del afluente (Tabla 20),

aunque se obtienen resultados equivalentes a los anteriormente comentados cuando se

realiza el Análisis de Componentes Principales (Figura 31.c). Por lo tanto, en este estudio el IE

no aporta nueva información contrastada.

5.2.2. Parámetros físico-químicos del licor mezcla respecto a Haliscomenobacter

A partir del análisis bivariante y el ACP para las variables físico-químicas del licor mezcla con las

variables biológicas estudiadas (Tabla 21 y Figura 32), se obtuvieron importantes correlaciones

positivas entre los sólidos suspendidos del licor mezcla (SSLM), los sólidos suspendidos

volátiles del licor mezcla (SSVLM) y el fósforo total (PTSSVLM) y correlación significativa

negativa para el Nitrógeno total del licor mezcla (mg/g SSVLM)y la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda SAP-309 y HHY cuantificadas con análisis de imagen.

Un incremento de la biomasa en el flóculo (mayor parte heterótrofa) se asocia de una forma

aproximada con el incremento del % SSVLM (Zornoza et al. 2012). Se observa que cuando hay

valores elevados de SSV en el licor mezcla hay una alta concentración de bacterias. Por otra

parte, parece lógico que cuando hay elevadas cantidades de nitrógeno total en el licor mezcla,

el cual es necesario para el crecimiento de H. hydrossis (Mulder y Deinema, 2006; van Veen et

al. 1973), se aumenta su población y la cantidad de SSVLM, y por tanto disminuye la variable

NTSSVLM.

Una alteración estructural del flóculo (bulking y/o foaming) y una elevada concentración

de SSLM originan con mucha frecuencia una sedimentación lenta y en bloque del licor

mezcla, y por tanto, valores elevados de V30 (aproximadamente por encima de 400 ml/L).

Jenkins et al. (2004) indican la importancia del cálculo del IVF para el control y seguimiento

del bulking filamentoso. En este caso, ninguna variable biológica fue correlacionada con el

índice volumétrico del fango (IVF), lo cual está en concordancia con Kraegelund et al (2008) y

Seviour y Nielsen (2010), que indican que filamentos de Bacteroidetes están presentes en

muchas EDAR, tanto municipales como industriales, pero raramente están involucrados en

originar episodios de bulking y foaming .

A partir del análisis realizado se obtuvo una correlación significativa de Spearman negativa

entre el pH y la concentración de bacterias H.hydrossis cuantificadas por tratamiento de

imagen. Sin embargo, se observó que el rango de pH de todas las EDAR estudiadas estaba


85

entre 6,65 y 8, estando prácticamente en el rango óptimo de crecimiento de esta bacteria que

según van Veen et al. (1973) es de 7-8 pH, lo cual indica que no es significativo este factor en el

presente estudio.

Por otro lado, se presentó una correlación positiva significativa de Spearman entre la

temperatura y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309. Asimismo, en el

gráfico de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables físico-químicas del

licor mezcla y la cantidad de H. hydrossis cuantificada por el índice de Eikelboom (Figura 32. c),

se observa que al aumentar la temperatura crece la población cuantificada por el IE de H.

hydrossis. El rango de temperatura de todas las EDAR estudiadas estaba entre 10,8 ºC y 29,1

ºC, coincidiendo con el rango de crecimiento de esta bacteria que según van Veen et al. (1973)

es de 8-30 ºC, con un óptimo de 26ºC. Estudios realizados con la sonda SAP-309 (familia

Saprospiracea) se han realizado mayoritariamente en lagos y ríos (Schauer et al. 2005; Schauer

y Hann, 2005) y también en una EDAR de aguas industriales (Kragelund et al. 2008)). Dicha

familia perteneciente al phylum Bacteroidetes, está compuesta por diferentes grupos de

bacterias tanto filamentosas como unicelulares. En dichos estudios se muestra como pueden

vivir en diferentes hábitats de agua dulce con un amplio rango de pH y Tª. Sin embargo, dichas

variables no se han estudiado en el campo de las aguas residuales para esta familia.

En este caso, sí que aparece alguna correlación bivariante entre las células de H .hydrossis

cuantificadas mediante el índice de Eikelboom y los parámetros físico-químicos del licor

mezcla, existiendo una correlación significativa negativa entre el SSLM y SSVLM con estas

bacterias. Sin embargo, los resultados son contradictorios con los obtenidos anteriormente, lo

cual, parece ratificar que el empleo del Índice de Eikelboom para cuantificar y correlacionarlo

con variables físico-químicas no es adecuado.

5.2.3. Parámetros operacionales respecto a Haliscomenobacter

A partir del estudio estadístico realizado se pueden extraer correlaciones importantes entre

Haliscomenobacter con los parámetros operacionales, a pesar de que están presentes en muy

distintos medios, con diferente configuración de procesos (nitrificación/desnitrificación y

eliminación biológica del fósforo) (Kragelund et al. 2008).

El estudio estadístico realizado en el presente estudio reveló que se presentaron correlaciones

positivas entre la concentración de bacterias hibridadas con SAP-309 y HHY y la concentración

de oxígeno en los rangos bajo (<0,8 ppm) y rango medio (0,8 a 2 ppm), que se corresponde


86

con su metabolismo aerobio. Eikelboom y van Buisen, (1983) y Jenkins et al. (2004) sugirieron

como condiciones operacionales de planta que favorecen el crecimiento de H. hydrossis bajos

niveles de oxígeno disuelto, aunque valores exactos de estos niveles no son conocidos. Por

tanto, con el presente estudio se estrecha y define este rango a <0,8 a 2 ppm de oxígeno

disuelto.

En el presente estudio, se observaron correlaciones negativas significativas entre la

concentración de las bacterias objeto de estudio (que hibridan con las sondas SAP-309 y HHY)

y el tiempo de retención hidráulico. Estando asociado indirectamente con altas CM. El rango

de TRH de las EDAR objeto de estudio fue de 4,7 a 21,9 días y el rango de CM de 0,03 a 0,57 Kg

DBO5/kg SSVLM d. Por lo tanto, se observaba mayor concentración de las bacterias objeto de

estudio cuanto menor era el valor de TRH hasta 4,7 días y mayor el valor de CM hasta 0,57 Kg

DBO5/kg SSVLM d. Sin embargo Eikelboom y van Buijsen (1983) y Jenkins et al. (2004)

sugirieron como condiciones operacionales de planta que favorecen el crecimiento de H.

hydrossis baja carga másica, al igual que Zornoza (2012) encontró una asociación de

Haliscomenobacter hydrossis con alto TRHr (asociados con baja CM). No obstante, otros

autores (Lemmer y Lind, 2000) relacionan la presencia de H. hydrossis con valores de CM

mayores a 0,15 Kg DBO5 /Kg MLSS d, así como en un rango bastante amplio de carga másica de

0,1 a 0,75 Kg DBO5 /Kg MLSS d (Richard, 1989 y Eikelboom, 2000). Dichos valores de carga

másica se incluyen dentro de los valores encontrados en el presente estudio.

Ningún parámetro operacional fue correlacionado con la cantidad de H. hydrossis evaluada

mediante el Índice de Eikelboom. Sin embargo, a partir de la ACP para las células de H.

hydrossis cuantificadas mediante el índice de Eikelboom y los parámetros operacionales, se

observó que la carga másica (mediada tanto en Kg DBO5/kg SSVLM·d como en Kg DQO/kg

SSVLM·d) se correlaciona positivamente con la población cuantificada por el IE de H. hydrossis

(Figura 33. c). Dichos resultados están en concordancia con los comentados anteriormente en

torno a la correlación negativa entre TRH y la concentración de bacterias hibridadas con HHY,

ya que parecen estar indirectamente relacionados.

5.2.4. Correlaciones entre las variables biológicas estudiadas

Según los resultados obtenidos, se pudo observar una correlación positiva significativa entra

las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY, lo que significa una clara dependencia

entre estas poblaciones; ya que la población de H. hydrossis representan un amplio porcentaje

del total de las bacterias que hibridan con la sonda SAP-309 (Figura 4).


87

Por otro lado cabe destacar la correlación significativa positiva entre la concentración de H.

hydrossis cuantificada mediante FISH y análisis de imagen y la cuantificada por FISH y el Índice

de Eikelboom. Es por ello, por lo que la cantidad de H. hydrossis se puede cuantificar con

ambos métodos; aunque tal y como hemos observado en este estudio, el IE aporta menos

información al correlacionarlo con los parámetros operacionales y fisíco-químicos.

6. CONCLUSIONES


88

6. CONCLUSIONES

Las principales conclusiones que se pueden extraer de este trabajo son las siguientes:

Se observa que el valor de IE 5 fue el que con mayor frecuencia se presentaba en cada

EDAR, entre un 60-82%, seguida del IE 4 (14-36%) y del IE 3 (0-5%).

Las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309, se presentaron en forma de filamentos

intra e interflocular de diferente longitud y células aisladas dentro del fóculo o libres

en suspensión.

Los filamentos de H. hydrossis cuantificados en el presente estudio se caracterizan

morfológicamente por tener filamentos cortos y rectos (con apariencia de agujas) y

mayoritariamente largos y un poco torcidos, siendo su presencia de forma mayoritaria

en situación intraflocular.

En todas las muestras de las EDAR estudiadas se obtuvo hibridación positiva con las

sondas SAP-309 y HHY, siendo siempre el porcentaje de bacterias hibridadas con la

sonda SAP-309 mayor que las hibridadas con HHY

El rango de porcentaje del área hibridada en las diferentes EDAR para HHY se presentó

ente 2-17%. Para la población de bacterias hibridadas con SAP-309, el rango fue

mucho más amplio, situándose aproximadamente entre 4-35% del área hibridada de

bacterias.

No se obtuvo ningún patrón generalizado de la evolución de H. hydrossis en las EDAR

estudiadas a lo largo del año, ya que los distintos picos de abundancia de dicha

población se presentaron en diferentes meses en cada EDAR estudiada.

Se observaron diferencias significativas bivariadas entre los grupos de EDAR en la

cantidad de bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY, aunque dependiendo

de cómo se expresen los resultados (promedio del área en % o en mg SSVLM/l) se

obtuvieron resultados diferentes. Pero nunca se observaron diferencias significativas

entre ambas líneas de una misma depuradora.

Las cuantificaciones del morfotipo filamentoso H.hydrossis mediante el IE y la técnica

FISH con análisis de imagen no coinciden. El IE no permitió análisis estadísticos

cuantitativos ya que casi todos los valores eran muy parecidos (FI mayoritariamente

igual a 5). La cuantificación por el índice de Eikelboom presenta una serie de

inconvenientes que le impide ser una herramienta ideal para la identificación y

valoración de la abundancia de los distintos filamentos bacterianos presentes en el

flóculo de los fangos activo. Sin embargo, con el tratamiento de imagen junto con la


89

técnica FISH se obtuvo variabilidad en la evolución de las poblaciones bacterianas

estudiadas y poder relacionares con los parámetros físico-químicos y operacionales de

las EDAR Quart, Castellón (línea A+B y C+D), Denia y Carraixet (línea A+B y C+D). Por lo

tanto, se aconseja que para futuros estudios de este tipo se use la técnica FISH con

análisis de imagen.

Altas concentraciones de Nitrógeno total afluente, el Nitrógeno amoniacal del

afluente, el fósforo total y fosfato del afluente, los ácidos grasos volátiles y las

proteínas del afluente se asociaron positivamente con la concentración de bacterias

hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY.

La población bacteriana de H.hydrossis, así como la concentración de bacterias

hibridadas con la sonda SAP-309 aumenta al disminuir la carga de carbohidratos. Esta

situación pudo observarse al realizar el análisis estadístico bivariante (correlaciones

significativas negativas de Pearson y Spearman) y en el análisis de componentes

principales.

El índice volumétrico del fango (IVF) no estuvo correlacionado con ninguna variable

biológica, por lo que estos filamentos no contribuyeron en originar episodios de

bulking y foaming.

Se observó la presencia de Haliscomenobacter en el rango de temperatura entre

10,8ºC y 29,1 ºC. Elevadas temperaturas se asociaron positivamente con la población

de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309.

Altas concentraciones de oxígeno en los rangos bajo (<0,8 ppm) y rango medio (0,8 a 2

ppm) se asociaron positivamente con la concentración de bacterias hibridadas con

SAP-309 y HHY. Se observó la presencia de Haliscomnobacter en el rango de <0,8 a 2

ppm de oxígeno disuelto.

No existe un protocolo de control específico de H. hydrossis y filamentos similares a H.

hydrossis, por su especialización en la degradación de azúcares procedentes de la

descomposición celular de la pared bacteria, que hace imposible eliminar el contenido de

estos sustratos para reducir su abundancia en las aguas de las EDAR (Kragelound et al.

2008), pero a partir de los resultados obtenidos en el presente estudio en el Anexo 5 se

recoge sus parámetros de crecimiento y operacionales de control.

7. BIBLIOGRAFÍA


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8. ANEXOS


98

ANEXO 1

Anexo 1.1 Tabla de contingencia para El tipo de EDAR estudiada y el índice de Eikelboom de H. hydrossis

EDAR Parámetro IE

3 4 5 Total

Qu

art

Recuento 1 3 18 22

Frecuencia esperada 0,5 6,0 15,5 22,0

% dentro de DEPU 4,5% 13,6% 81,8% 100,0%

% dentro de IEHHY 33,3% 8,3% 19,4% 16,7%

% del total 0,8% 2,3% 13,6% 16,7%

De

nia

Recuento 0 7 15 22


% dentro de DEPU 0% 31,8% 68,2% 100,0%

% dentro de IEHHY 0% 19,4% 16,1% 16,7%

% del total 0% 5,3% 11,4% 16,7%

Cas

telló

n A

+B Recuento 0 6 17 23


% dentro de DEPU 0% 26,1% 73,9% 100,0%

% dentro de IEHHY 0% 16,7% 18,3% 17,4%

% del total 0% 4,5% 12,9% 17,4%

Cas

telló

n C

+D Recuento 1 8 13 22


% dentro de DEPU 4,5% 36,4% 59,1% 100,0%

% dentro de IEHHY 33,3% 22,2% 14,0% 16,7%

% del total 0,8% 6,1% 9,8% 16,7%

Car

raix

et A

+B Recuento 1 8 12 21


% dentro de DEPU 4,8% 38,1% 57,1% 100,0%

% dentro de IEHHY 33,3% 22,2% 12,9% 15,9%

% del total 0,8% 6,1% 9,1% 15,9%

Car

raix

et C

+D Recuento 0 4 18 22


% dentro de DEPU 0% 18,2% 81,8% 100,0%

% dentro de IEHHY 0% 11,1% 19,4% 16,7%

% del total 0% 3,0% 13,6% 16,7%

Tota

l

Recuento 3 36 93 132


% dentro de DEPU 2,3% 27,3% 70,5% 100,0%

% dentro de IEHHY 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%

% del total 2,3% 27,3% 70,5% 100,0%


99

Anexo 1.2 Prueba Chi-cuadrado para IE y Tipo EDAR

Valor gl Sig. asintótica (bilateral)

Chi-cuadrado de Pearson 8,802 10 0,551


100

ANEXO 2.

Anexo 2.1. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Quart Benáger

Fecha

muestreo

SAP-309 HHY

Media (promedio del área %)

Media (mg SSVLM/l)

SD Media (promedio del área %)

Media (mg SSVLM/l)

SD

04/12/2008 8 157,6 2,3 9 177,3 4,3

17/12/2008 11 185,9 5,8 7 118,3 6,4

14/01/2009 7 141,1 3 5 100,8 1,8

28/01/2009 7 119,4 2,2 5 85,3 5,4

11/02/2009 9 143,1 2,9 7 111,3 3,6

25/02/2009 13 190,5 4,3 5 73,3 2,7

11/03/2009 8 116,4 2,7 8 116,4 6,4

25/03/2009 4 75,2 2,5 4 75,2 2,1

07/04/2009 13 273,0 6,9 5 105,0 2,6

22/04/2009 13 262,6 4,4 5 101,0 1,2

06/05/2009 16 250,4 5,4 5 78,3 2,2

20/05/2009 18 437,4 6,8 5 121,5 3

03/06/2009 31 685,1 5,1 6 132,6 3,4

17/06/2009 24 597,6 5 5 124,5 3,6

01/07/2009 11 211,2 4,4 - - -

15/07/2009 16 367,2 6,6 2 45,9 1,5

09/09/2009 20 338,0 7,5 4 67,6 3,5

23/09/2009 14 266,0 8 4 76,0 2,5

07/10/2009 17 326,4 8 5 96,0 1,8

21/10/2009 11 227,7 3,8 4 82,8 1,7

04/11/2009 13 236,6 5,9 8 145,6 4,8

18/11/2009 10 205,0 4,1 5 102,5 4,1

16/12/2009 - - - - -

29/12/2009 10 227,0 3,9 8 181,6 4,7


101

Anexo 2.2. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Denia- Ondara

Fecha

muestreo

SAP-309 HHY


Media (mg SSVLM/l)


Media (mg SSVLM/l)

SD

10/12/2008 11 218,9 3 11 218,9 9,2

22/12/2008 10 242,0 4,7 9 217,8 4,9

08/01/2009 8 185,6 3,2 8 185,6 5,3

21/01/2009 10 206,0 5,7 9 185,4 6,2

04/02/2009 15 348,0 9,7 7 162,4 5,2

18/02/2009 7 154,0 1,8 4 88,0 2,7

04/03/2009 7 161,7 2,7 7 161,7 3,4

16/03/2009 - - - 7 147,7 2,3

01/04/2009 7 186,9 2,8 6 160,2 2,9

29/04/2009 5 89,5 2,9 2 35,8 1,2

13/05/2009 11 249,3 4,8 6 136,0 1,8

27/05/2009 9 212,4 5 9 212,4 3,8

10/06/2009 12 292,8 7,2 6 146,4 2,3

24/06/2009 8 208,8 2,6 8 208,8 4,4

08/07/2009 10 211,0 2,7 3 63,3 2,4

22/07/2008 11 300,3 4 9 245,7 5,1

16/09/2009 7 149,8 1,2 7 149,8 3,4

30/09/2009 - - - 6 123,0 3,1

14/10/2009 11 231,0 4,5 11 231,0 6,3

11/11/2009 16 353,6 8 7 154,7 3,9

25/11/2009 9 201,6 5,1 7 156,8 2,5

15/12/2009 - - - - - -

21/12/2009 - - - 5 100,5 2,4

11/11/09ESP 7 154,7 3,8 7 154,7 4

ESP: espumas


102

Anexo 2.3. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Castellón Línea A+B

Fecha

muestreo

SAP-309 HHY


Media (mg SSVLM/l)


Media (mg SSVLM/l)

SD

03/12/2008 8 234 2,9 5 146,25 3

17/12/2008 7 301 2,9 4 172 2,2

15/01/2009 4 136,8 1,3 5 171 3,8

28/01/2009 23 828 9,2 6 216 3,7

11/02/2009 9 298,8 5,8 3 99,6 1,6

25/02/2009 24 1092 6,7 9 409,5 3,7

11/03/2009 9 271,8 5,7 3 90,6 1,7

25/03/2009 16 428,8 5,9 6 160,8 2,4

22/04/2009 9 385,2 2,3 5 214 2,3

06/05/2009 9 259,2 1,9 9 259,2 3,7

20/05/2009 10 357 1,9 10 357 6,8

03/06/2009 17 486,2 8 6 171,6 2,8

17/06/2009 10 352 6 10 352 3,3

01/07/2009 11 237,6 6 5 108 4,1

15/07/2009 14 373,8 5,2 10 267 3,6

09/09/2009 12 260,4 3,4 9 195,3 7

23/09/2009 24 609,6 6,1 19 482,6 3,5

07/10/2009 39 858 4,7 12 264 5,6

21/10/2009 27 604,8 8,6 17 380,8 8,1

04/11/2009 8 147,2 3 6 110,4 5,9

18/11/2009 15 300 3,9 10 200 5,9

16/12/2009 26 577,2 5,3 17 377,4 7,3

29/12/2009 14 306,6 6,6 12 262,8 5,1


103

Anexo 2.4. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Castellón Línea C+D

Fecha

muestreo

SAP-309 HHY


Media (mg SSVLM/l)


Media (mg SSVLM/l)

SD

03/12/2008 18 477 5,9 10 265 6,3

17/12/2008 8 208,8 3,1 6 156,6 3,3

15/01/2009 19 625,1 4,1 9 296,1 3,4

28/01/2009 8 303,2 2,7 7 265,3 3,9

11/02/2009 24 844,8 11 3 105,6 1,9

25/02/2009 24 789,6 5,2 17 559,3 7,3

11/03/2009 18 885,6 4,6 14 688,8 5,2

25/03/2009 9 351 2,2 6 234 1,7

22/04/2009 8 162,4 1,8 5 101,5 2,5

06/05/2009 11 438,9 4,2 8 319,2 4,6

20/05/2009 12 434,4 1,9 12 434,4 6,2

03/06/2009 23 809,6 9 8 281,6 5,2

17/06/2009 17 763,3 3 9 404,1 3,9

01/07/2009 14 390,6 5,5 9 251,1 3,7

15/07/2009 8 119,2 2,9 13 193,7 3,9

09/09/2009 10 232 3,2 6 139,2 1,5

23/09/2009 21 386,4 7,9 13 239,2 4,1

07/10/2009 32 649,6 3,6 13 263,9 4

21/10/2009 27 726,3 5,8 15 403,5 7,7

04/11/2009 7 134,4 2 7 134,4 3,1

18/11/2009 - - - - - -

16/12/2009 28 677,6 12 10 242 3

29/12/2009 12 376,8 4,6 8 251,2 2,5


104

Anexo 2.5. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Carraixet Línea A+B

Fecha

muestreo

SAP-309 HHY


Media (mg SSVLM/l)


Media (mg SSVLM/l)

SD

10/12/08 8 118 4,7 - - -

23/12/08 5 87,5 1,4 5 87,5 1,7

7/01/09 6 102,6 2,9 6 102,6 0,4

21/01/09 5 103 1,4 5 103 2

4/02/09 4 61,6 2,1 4 61,6 2,7

18/02/09 17 236,3 6,4 11 152,9 4,8

4/03/09 6 75,6 1,7 4 50,4 1,8

1/04/09 8 88 2,8 8 88 2,7

29/4/09 12 108,6 4,8 7 63,35 3,9

13/05/09 12 189 4,1 4 63 2,3

27/05/09 9 119,7 4 9 119,7 3,4

10/06/09 11 159,5 1,9 10 145 3,8

24/06/09 19 247 5,9 15 195 6,8

08/07/09 6 57 4,4 4 38 1,9

22/07/09 7 64,75 3,6 5 46,25 3,2

16/09/09 7 140,7 3,1 7 140,7 3,1

30/09/09 8 168 3,4 6 126 2,1

14/10/09 11 196,9 3,3 6 107,4 1,5

27/10/09 23 391 5,7 15 255 4,4

11/11/09 18 433,8 5,9 7 168,7 2,7

25/11/09 9 212,4 5,6 5 118 1,4

21/12/09 20 416 6,2 5 104 1,6

9/12/09 - - - - - -

14/10/09ESP 10 179 5,1 5 89,5 3,1

27/10/09ESP 18 306 3,6 6 102 2,1

25/11/09ESP 15 361,5 3,8 6 144,6 2,2

09/12/09ESP - - - - - -

21/12/09ESP 19 448,4 5,6 6 141,6 3,9

ESP: espumas


105

Anexo 2.6. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Carraixet Línea C+D

Fecha muestreo

SAP-309 HHY


Media (mg SSVLM/l)

SD Media (promedio

del área %)

Media (mg SSVLM/l)

SD

10/12/08 8 120,8 3,1 6 90,6 3,5

23/12/08 5 97,5 2,2 5 97,5 3,2

7/01/09 6 109,2 2,3 6 109,2 2,4

21/01/09 4 84 1,9 2 42 1,1

4/02/09 10 130 3,9 9 117 4,4

18/02/09 9 129,6 2,4 9 129,6 4,1

4/03/09 9 100,8 5,3 8 89,6 3,8

1/04/09 6 55,8 2,2 5 46,5 1,7

29/04/09 17 239,7 6,4 7 98,7 2,4

13/05/09 9 96,3 3,4 7 74,9 3,1

27/05/09 13 176,15 3,6 8 108,4 4,1

10/06/09 8 107,2 3,4 8 107,2 3,4

24/06/09 9 161,1 3,5 5 89,5 1,2

08/07/09 5 57,25 1,3 6 68,7 2,4

22/07/09 8 72 2,9 5 45 1,9

16/09/09 7 113,4 2 7 113,4 3,4

30/09/09 8 138,4 3,3 8 138,4 2,9

14/10/09 12 235,2 2,7 7 137,2 3,6

27/10/09 21 329,7 11 13 204,1 5,4

11/11/09 7 160,3 2,8 3 68,7 1,1

25/11/09 22 331,1 6,1 7 105,35 1,8

21/12/09 - - - - - -

9/12/09 23 366,85 5,4 7 111,65 3,7

14/10/09ESP 16 313,6 3,8 4 78,4 4,4

27/10/09ESP 10 157 4,2 5 78,5 4,4

11/11/09ESP 15 343,5 7,1 5 114,5 4,7

ESP: espumas


106

ANEXO 3

Anexo 3.2. Prueba de homogeneidad de varianzas para SAP-309 Media

(promedio del área %)

Media

(mgSSVLM/L)

Estadístico de Levene

4,409 8,903

gl1 5 5

gl2 126 131

Sig. 0,001 0,000

Anexo 3.1. Media, desviación típica, error típico e intervalo de confianza para el promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada EDAR estudiada

EDAR Media

(promedio del

área %)

Desviación

típica Error típico

Intervalo de confianza para

la media al 95% Media

(mgSSVLM/L)

Desviación



la media al 95%

Límite

inferior

Límite

superior

Límite

inferior

Límite

superior

Quart 13,22 6,04 1,26 13,22 6,04 262,62 147,64 30,78 198,77 326,46

Denia 9,60 2,72 0,61 9,60 2,72 206,01 90,27 18,82 166,97 245,04

Castellón A+B 15,00 8,46 1,76 15,00 8,46 422,00 240,54 50,16 317,98 526,02

Castellón C+D 16,27 7,63 1,63 16,27 7,63 485,36 243,69 50,81 379,98 590,74

Carraixet A+B 10,50 5,49 1,17 10,50 5,49 168,45 111,68 23,29 120,16 216,75

Carraixet C+D 10,27 5,56 1,19 10,27 5,56 155,11 90,07 19,20 115,17 195,04

Anexo 3.3. Análisis de la varianza (ANOVA) para el promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada depuradora estudiada

Suma de

cuadrados gl

Media

cuadrática F Sig.

SAP

(promedio del

área %)

Inter-grupos 833,79 5 166,76 4,181 0,002

Intra-grupos 5024,94 126 39,88

Total 5.858,73 131

SAP

(mgSSVLM/L)

Inter-grupos 2.193.594,87 5 438.718,97 15,605 0,000

Intra-grupos 3.682.991,50 131 28.114,44

Total 5.876.586,37 136


107

Anexo 3.4. Comparaciones múltiples (Bonferroni) del promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada EDAR estudiada

SAP-309 (promedio del área %) SAP-309 (mgSSVLM/L)

EDAR Diferencia medias

(I-J)

Error

típico Sig.

Intervalo de confianza para la

media al 95% Diferencia medias

(I-J)

Error

típico Sig.


media al 95%

Límite inferior Límite superior Límite inferior Límite superior

Quart Denia 3,62 1,93 0,95 -2,16 9,39 56,61 49,44 0,86 -86,40 199,62

Cs A+B -1,78 1,86 1,00 -7,35 3,79 -159,38* 49,44 0,02 -302,39 -16,37

Cs C+D -3,05 1,88 1,00 -8,69 2,58 -222,75* 49,44 0,00 -365,76 -79,73

Cx A+B 2,72 1,88 1,00 -2,92 8,35 94,16 49,44 0,40 -48,84 237,17

Cx C+D 2,94 1,88 1,00 -2,69 8,58 107,51 50,00 0,27 -37,11 252,14

Denia Quart -3,62 1,93 0,95 -9,39 2,16 -56,61 49,44 0,86 -199,62 86,40

Cs A+B -5,40 1,93 0,09 -11,18 0,38 -215,99* 49,44 0,00 -359,00 -72,98

Cs C+D -6,67* 1,95 0,01 -12,51 -0,83 -279,36* 49,44 0,00 -422,37 -136,35

Cx A+B -0,90 1,95 1,00 -6,74 4,94 37,55 49,44 0,97 -105,46 180,56

Cx C+D -0,67 1,95 1,00 -6,51 5,17 50,90 50,00 0,91 -93,73 195,53

Cs A+B

Quart 1,78 1,86 1,00 -3,79 7,35 159,38* 49,44 0,02 16,37 302,39

Denia 5,40 1,93 0,09 -0,38 11,18 215,99* 49,44 0,00 72,98 359,00

Cs C+D -1,27 1,88 1,00 -6,91 4,36 -63,36 49,44 0,79 -206,37 79,64

Cx A+B 4,50 1,88 0,27 -1,14 10,14 253,55* 49,44 0,00 110,53 396,56

Cx C+D 4,73 1,88 0,20 -0,91 10,36 266,89* 50,00 0,00 122,27 411,52 Cs

C+D Quart 3,05 1,88 1,00 -2,58 8,69 222,75* 49,44 0,00 79,73 365,76

Denia 6,67* 1,95 0,01 0,83 12,51 279,36* 49,44 0,00 136,35 422,37

Cs A+B 1,27 1,88 1,00 -4,36 6,91 63,36 49,44 0,79 -79,64 206,37

Cx A+B 5,77* 1,90 0,04 0,08 11,47 316,91* 49,44 0,00 173,91 459,92

Cx C+D 6,00* 1,90 0,03 0,30 11,70 330,26* 50,00 0,00 185,63 474,88

Cx A+B

Quart -2,72 1,88 1,00 -8,35 2,92 -94,16 49,44 0,40 -237,17 48,84

Denia 0,90 1,95 1,00 -4,94 6,74 -37,55 49,44 0,97 -180,56 105,46

Cs A+B -4,50 1,88 0,27 -10,14 1,14 -253,55* 49,44 0,00 -396,56 -110,53

Cs C+D -5,77* 1,90 0,04 -11,47 -0,08 -316,91

* 49,44 0,00 -459,92 -173,90

Cx C+D 0,23 1,90 1,00 -5,47 5,92 13,35 50,00 1,00 -131,28 157,97

Cx C+D

Quart -2,94 1,88 1,00 -8,58 2,69 -107,51 50,00 0,27 -252,14 37,11

Denia 0,67 1,95 1,00 -5,17 6,51 -50,90 50,00 0,91 -195,53 93,73

Cs A+B -4,73 1,88 0,20 -10,36 0,91 -266,89* 50,00 0,00 -411,52 -122,27

Cs C+D -6,00* 1,90 0,03 -11,70 -0,30 -330,26

* 50,00 0,00 -474,88 -185,63

Cx A+B -0,23 1,90 1,00 -5,92 5,47 -13,35 50,00 1,00 -157,98 131,28

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.


108

Anexo 3.5. Media, desviación típica, error típico e intervalo de confianza para el promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada EDAR estudiada

EDAR Media

(promedio del

área %)

Desviación



la media al 95% Media

(mgSSVLM/L)

Desviación



la media al 95%

Límite

inferior

Límite

superior

Límite

inferior

Límite

superior

Quart 5,50 1,68 0,356 4,75 6,25 105,39 33,70 7,18 90,45 120,33

Denia 7,00 2,27 0,48 5,99 8,01 161,29 51,48 10,73 139,02 183,55

Castellón A+B 8,61 4,49 0,94 6,67 10,55 237,73 109,71 22,88 190,29 285,18

Castellón C+D 9,45 3,58 0,76 7,87 11,04 281,78 140,73 29,34 220,92 342,64

Carraixet A+B 7,05 3,29 0,72 5,55 8,55 110,27 50,90 10,61 88,26 132,28

Carraixet C+D 6,73 2,25 0,48 5,73 7,73 99,69 36,23 7,72 83,63 115,75

Anexo 3.6. Prueba de homogeneidad de varianzas para HHY Media

(promedio del área %)

Media

(mgSSVLM/L)

Estadístico de Levene

4,753 8,789

gl1 5 5

gl2 126 130

Sig. 0,001 0,000

Anexo 3.7. Análisis de la varianza (ANOVA) para el promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHYpara cada EDAR estudiada

Suma de

cuadrados gl

Media

cuadrática F Sig.

HHY

(promedio del

área %)

Inter-grupos 221,97 5 44,39 4,647 0,001

Intra-grupos 1203,75 126 9,55

Total 1425,72 131

HHY

(mgSSVLM/L)

Inter-grupos 676.022,96 5 135.204,59 20,266 0,000

Intra-grupos 867.283,02 130 6.671,41

Total 1.543.305,97 135


109

Anexo 3.8. Comparaciones múltiples (Bonferroni) del promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada EDAR estudiada

HHY (promedio del área %) HHY (mgSSVLM/L)

EDAR Diferencia medias

(I-J)

Error

típico Sig.


media al 95% Diferencia medias

(I-J)

Error

típico Sig.


media al 95%

Límite inferior Límite superior Límite inferior Límite superior

Quart Denia -1,50 0,93 1,00 -4,29 1,29 -55,90 24,36 0,35 -128,74 16,94

Cs A+B -3,11* 0,92 0,01 -5,87 -0,35 -132,34* 24,36 0,00 -205,18 -59,50

Cs C+D -3,95* 0,93 0,00 -6,74 -1,17 -176,39* 24,36 0,00 -249,23 -103,55

Cx A+B -1,55 0,94 1,00 -4,37 1,27 -4,88 24,36 1,00 -77,72 67,96

Cx C+D -1,23 0,93 1,00 -4,02 1,56 5,70 24,63 1,00 -67,94 79,34

Denia Quart 1,500 0,93 1,00 -1,29 4,29 55,90 24,36 0,35 -16,94 128,74

Cs A+B -1,61 0,92 1,00 -4,37 1,15 -76,44* 24,09 0,03 -148,47 -4,42

Cs C+D -2,45 0,93 0,14 -5,24 0,33 -120,49* 24,09 0,00 -192,52 -48,46

Cx A+B -,048 0,94 1,00 -2,87 2,77 51,02 24,09 0,54 -21,01 123,04

Cx C+D 0,27 0,93 1,00 -2,52 3,06 61,60 24,36 0,19 -11,24 134,44

Cs A+B

Quart 3,11* 0,92 0,01 0,35 5,87 132,34* 24,36 0,00 59,50 205,18

Denia 1,61 0,92 1,00 -1,15 4,37 76,44* 24,09 0,03 4,42 148,47

Cs C+D -0,85 0,92 1,00 -3,60 1,91 -44,046 24,09 1,00 -116,07 27,98

Cx A+B 1,56 0,93 1,00 -1,23 4,35 127,46* 24,09 0,00 55,44 199,49

Cx C+D 1,88 0,92 0,65 -0,88 4,64 138,04* 24,36 0,00 65,20 210,88 Cs

C+D Quart 3,95

* 0,93 0,00 1,17 6,74 176,39

* 24,36 0,00 103,55 249,23

Denia 2,45 0,93 0,14 -0,33 5,24 120,49* 24,09 0,00 48,46 192,52

Cs A+B 0,85 0,92 1,00 -1,91 3,60 44,04 24,09 1,00 -27,98 116,07

Cx A+B 2,41 0,94 0,18 -0,41 5,23 171,51* 24,09 0,00 99,48 243,53

Cx C+D 2,73 0,93 0,06 -0,06 5,52 182,09* 24,36 0,00 109,25 254,93

Cx A+B

Quart 1,55 0,94 1,00 -1,27 4,37 4,88 24,36 1,00 -67,96 77,72

Denia 0,05 0,94 1,00 -2,77 2,87 -51,018 24,09 0,54 -123,04 21,01

Cs A+B -1,56 0,93 1,00 -4,35 1,23 -127,46* 24,09 0,00 -199,49 -55,44

Cs C+D -2,41 0,94 0,18 -5,23 0,41 -171,51* 24,09 0,00 -243,53 -99,48

Cx C+D 0,32 0,94 1,00 -2,50 3,14 10,58 24,36 1,00 -62,26 83,42

Cx C+D

Quart 1,23 0,93 1,00 -1,56 4,02 -5,70 24,63 1,00 -79,34 67,94

Denia -0,27 0,93 1,00 -3,06 2,52 -61,60 24,36 0,19 -134,44 11,24

Cs A+B -1,88 0,92 0,65 -4,64 0,88 -138,04* 24,36 0,00 -210,88 -65,20

Cs C+D -2,73 0,93 0,06 -5,52 0,06 -182,09* 24,36 0,00 -254,93 -109,25

Cx A+B -0,32 0,94 1,00 -3,14 2,50 -10,58 24,36 1,00 -83,42 62,26

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.


110

ANEXO IV. Análisis de componentes principales (ACP)

ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309

Anexo.4.1 KMO y prueba de Bartlett

Medida de adecuación muestral de Kaiser-Meyer-Olkin. 0,773

Prueba de esfericidad de Bartlett

Chi-cuadrado aproximado 673,152

gl 28

Sig. 0,000

Anexo 4.2 .Varianza total explicada

Componente

Autovalores iniciales Sumas de las saturaciones al cuadrado de la extracción Suma de las saturaciones al cuadrado de la rotación

Total % de la varianza % acumulado Total % de la varianza % acumulado Total % de la varianza % acumulado

1 4,232 52,902 52,902 4,232 52,902 52,902 4,231 52,893 52,893

2 1,240 15,505 68,407 1,240 15,505 68,407 1,241 15,513 68,407

3 0,871 10,884 79,291

4 0,662 8,279 87,570

5 0,498 6,225 93,795

6 0,286 3,579 97,374

7 0,119 1,484 98,858

8 0,091 1,142 100,000

Método de extracción: Análisis de Componentes principales.

Anexo 4.3. Matriz de componentes rotadosa

Componente

1 2

NTaf 0,835

NH4af 0,899

PTaf 0,887

PO4af 0,825

CCARBO 0,807

Prote 0,817

AGV 0,559

SAPCONC 0,422 -0,680

Método de extracción: Análisis de componentes principales.

Método de rotación: Normalización Varimax con Kaiser.

a. La rotación ha convergido en 3 iteraciones.


111

ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con

la sonda HHY

Anexo 4.4. KMO y prueba de Bartlett


Prueba de esfericidad de Bartlett Chi-cuadrado aproximado 669,308

gl 28

Sig. 0,000

Anexo 4.5. Varianza total explicada

Componente



1 4,229 52,864 52,864 4,229 52,864 52,864 4,228 52,853 52,853

2 1,229 15,368 68,232 1,229 15,368 68,232 1,230 15,379 68,232

3 0,930 11,629 79,861

4 0,685 8,567 88,428

5 0,414 5,181 93,609

6 0,296 3,700 97,309

7 0,122 1,527 98,836

8 0,093 1,164 100,000


Anexo 4.6.Matriz de componentes rotadosa

Componente

1 2

NTaf 0,837

NH4af 0,893

PTaf 0,891

PO4af 0,831

CCARBO 0,829

Prote 0,805

AGV 0,556

HHYCONC 0,438 -0,696




112

ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias H.hydrossis

cuantificados con IE




gl 15

Sig. 0,000


Componente



1 3,041 50,688 50,688 3,041 50,688 50,688 2,995 49,925 49,925

2 1,044 17,394 68,082 1,044 17,394 68,082 1,089 18,157 68,082

3 0,973 16,216 84,298

4 0,497 8,278 92,576

5 0,312 5,204 97,780

6 0,133 2,220 100,000



Componente

1 2

NTaf 0,862

NH4af 0,929

PO4af 0,733

CCARBO 0,451

IEHHY -0,853

Prote 0,862





113

ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con

la sonda SAP-309




gl 21

Sig. 0,000


Componente



1 3,507 50,104 50,104 3,507 50,104 50,104 3,407 48,668 48,668

2 1,076 15,371 65,476 1,076 15,371 65,476 1,177 16,807 65,476

3 0,962 13,745 79,221

4 0,707 10,103 89,323

5 0,390 5,566 94,889

6 0,343 4,898 99,787

7 0,015 0,213 100,000



Componente

1 2

Phlm 0,664

SSLM 0,966

SSVLM 0,938

NTSSVLM -0,710

PTSSVLM 0,765

T -0,740

SAPCONC 0,704





114

ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la

sonda HHY




gl 21

Sig. 0,000


Componente



1 3,609 51,552 51,552 3,609 51,552 51,552 3,513 50,185 50,185

2 1,068 15,255 66,807 1,068 15,255 66,807 1,164 16,622 66,807

3 0,940 13,427 80,234

4 0,567 8,101 88,335

5 0,446 6,375 94,710

6 0,355 5,078 99,788

7 0,015 0,212 100,000



Componente

1 2

Phlm -0,604

SSLM 0,959

SSVLM 0,922

NTSSVLM -0,732

PTSSVLM 0,787

T 0,798

HHYCONC 0,759





115

ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias H.hydrossis

cuantificados con IE




gl 10

Sig. 0,000


Componente



1 3,096 51,605 51,605 3,096 51,605 51,605 3,093 51,547 51,547

2 1,159 19,319 70,924 1,159 19,319 70,924 1,163 19,377 70,924

3 0,889 14,824 85,748

4 0,472 7,874 93,621

5 0,368 6,134 99,755

6 0,015 0,245 100,000



Componente

1 2

SSLM 0,950

SSVLM 0,901

NTSSVLM -0,805

PTSSVLM 0,812

T 0,719

IEHHY 0,700





116

ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309

Anexo 4.19 KMO y prueba de Bartlett



gl 21

Sig. 0,000


Componente



1 3,102 44,313 44,313 3,102 44,313 44,313 2,908 41,537 41,537

2 1,905 27,215 71,528 1,905 27,215 71,528 2,099 29,991 71,528

3 0,981 14,017 85,545

4 0,354 5,054 90,599

5 0,313 4,472 95,071

6 0,225 3,217 98,288

7 0,120 1,712 100,000



Componente

1 2

CMdqos3 -0,815

TRHr3 0,742

EF7 0,854

Obajo 0,416 0,847

Omed 0,923

SAPCONC 0,574

CMdbo3 -0,859





117

ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY

Anexo 4.22 KMO y prueba de Bartlett



gl 15

Sig. 0,000


Componente



1 2,535 42,247 42,247 2,535 42,247 42,247 2,223 37,049 37,049

2 1,794 29,900 72,147 1,794 29,900 72,147 2,106 35,098 72,147

3 0,936 15,603 87,750

4 0,350 5,835 93,585

5 0,256 4,273 97,858

6 0,129 2,142 100,000



Componente

1 2

CMdqos3 -0,778

TRHr3 0,813

EF7 0,822

Obajo 0,871

Omed 0,935

HHYCONC 0,537





118


Componente



1 2,285 45,697 45,697 2,285 45,697 45,697 1,825 36,500 36,500

2 1,144 22,870 68,568 1,144 22,870 68,568 1,603 32,067 68,568

3 0,925 18,494 87,061

4 0,415 8,300 95,362

5 0,232 4,638 100,000


ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE




gl 10

Sig. 0,000


Componente

1 2

CMdqos3 0,798

TRHr3 0,855

Obajo 0,778

CMdbo3 -0,531 0,709

IEHHY 0,654





119

ANEXO 5

Anexo 5.1. Parámetros de crecimiento y operacionales de Haliscomenobacter hydrossis

Parámetro Descripción Fuente

Categoría nutricional Quimiorganotrofo Mulder y Deinema (2006);

van Veen et al. (1973)

Desnitrificación Nitrato reducido a nitrito

Mulder y Deinema (2006);


Medio de cultivo

Glucosa y sacarosa

Fuentes inorgánicas y orgánicas de N (glutamato, aspartato y casaminoácidos)

Tiamina

Vitamina B12.



pH 7,0-8,0



6,65 y 8 (licor mezcla) Ferrer- Roglán (2014)

Tª

8-30 ºC (óptimo 26)



10,8 - 29,1 ºC (licor mezcla) Ferrer- Roglán (2014); van Veen et al. (1973)

N total afluente Alta carga hasta 103 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

N-NH4 afluente Alta carga hasta 66 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

P total afluente Alta carga hasta 31 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

P-PO4 afluente Alta carga hasta 17 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

Proteínas afluente Alta carga hasta 111 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

Ácidos grasos volátiles afluente Alta carga hasta 169 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

Carga carbohidratos afluente Baja carga de 59,7 a 1,9 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

Sólidos suspendidos Alta carga hasta 6.800 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

Sólidos suspendidos volátiles Alta carga hasta 4.920 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

Nitrógeno total del licor mezcla Baja carga hasta 140,3 a 29,6 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

Fósforo total del licor mezcla Alta carga hasta 89,9 mg/l Ferrer- Roglán (2014)

Requerimientos Oxígeno Disuelto (OD)

Aerobio



Bajos niveles OD, aunque valores exactos de estos niveles no son conocidos

Eikelboom y van Buisen

(1983); Jenkins et al. (2004)

<0,8 a 2 ppm Ferrer- Roglán (2014)

Bajo TRH hasta 4,7 días Ferrer- Roglán (2014)

Carga Másica (CM)

Baja CM. Valores de CM mayores a 0,15 Kg DBO5 /Kg MLSS d

Lemmer y Lind (2000)

CM de 0,1 a 0,75 Kg DBO5 /Kg MLSS d Richard (1989) y Eikelboom (2000)

Alta CM hasta 0,57 Kg DBO5/kg SSVLM d Ferrer- Roglán (2014)


120