χρωματογραφία

Στην κλινικοεργαστηριακή πράξη

Τον θυμάστε;Γι αυτόν κάθε λέξη είχε ελληνική ρίζα

Δεν πάσχουμε από το σύνδρομο του Mr.Portokalos αλλά…

• Χρώμα+γραφία

Όρος ελληνικής προέλευσης.

Τον όρο τον εισήγαγε ο ρωσο-ιταλός Tsvet

• Παίζοντας με φύλλα, κιμωλία και οινόπνευμα.

Το δίδασκα κι εγώ στην Παστερ όταν υπήρχαν ακόμα κιμωλίες στα

βιβλιοχαρτοπωλεία.

Μια πιο ελκυστική εικόνα

Άλλη μια ελκυστική εικόνα από το Ίντερνετ

Κι άλλη μια

Τι ακριβώς είναι η Χ;

• Σύνολο μεθόδων,ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ,απομόνωσης και ταυτοποίησης ουσιών σε μίγματα (βιολογικά υγρά).

• Οι ουσίες διαχωρίζονται καθώς «τρέχουν» σε ένα διαχωριστικό μέσο με διαφορετικές ταχύτητες,αφού ακολουθούν διαφορετικά μονοπάτια, συνδέονται με διαφορετική ένταση στο διαχωριστικό μέσο, είτε προσροφώνται λιγότερο,περισσότερο ή καθόλου στο δ.μ.

• Αποτελει βασικό εργαλείο για απομόνωση-ταυτοποίηση και μελέτη πρωτεϊνών,πεπτιδίων,αμινοξέων,γλυκοπρωτεϊνών,ορμονών και ορμονικών μεταβολιτών.

• Με φασματοφωτομετρικές και άλλες μεθόδους μπορεί να προσδιοριστούν ποσοτικά.

Ταξινόμηση χρωματογραφικών τεχνικών

Χρωματογραφία προσρόφησης

• Ο Διαχωρισμός των ουσιών τελείται με την προσρόφησή τους σε ουσίες κοκκώδους υφής (Αl2O3),oι οποίες τοποθετούνται καθέτως σε γυάλινους σωλήνες (σιφώνια-προχοϊδες ).

Να μια εικόνα από περασμένες καλές εποχές

Βαρύτητα και διαφορετική συζευκτική δύναμη ουσιών με δ.μ.

• Οδηγούν στην προσρόφησή τους σε διάφορα τμήματα της στήλης και στη συνέχεια μελετώνται

Ασκηση πιεσης

Στηλη χρωματογραφιας

Χρωματογραφία Λεπτής Στιβάδας TLC

• To προσροφητικό μέσο (στατική φάση ) επιστρώνεται ως λεπτή στιβάδα σε γυάλινη πλάκα.

• Τοποθετείται το δείγμα στο άκρο της, σημειώνεται η θέση του, η πλάκα εμβαπτίζεται σε διαλύτη αναπτύξεως της χρωματογραφίας και το σύστημα τοποθετείται σε γυάλινο θάλαμο.

• Ο Διαλύτης ανερχόμενος συμπαρασύρει και διαχωρίζει σε κλάσματα ,το μίγμα ουσιών.

• Κατόπιν εμφανίζεται το χρωματογράφημα και υπολογίζεται ο συντελεστής κατακράτησης RF (retention factor).

Μαρκάρεται το σημείο με το δείγμα

Η πλάκα εμβαπτίζεται στο υγρό αναπτύξεως

Το χρωματογράφημα εμφανίζεται

• Μετά από έκθεση σε UV ακτινοβολία,ή σε ατμούς Ιωδίου, σε ψεκασμό με νινυδρίνη κλπ

Επιστρωμένες (στη μία πλευρά) αντικειμενοφόρες πλάκες

• Προσροφητικό μέσο Silica gel 10% σε CH3OH-CHCl3.Βυθίζουμε τις πλάκες (πλάτη με πλάτη,ανά δύο, με συνδετήρα.

Ένας πιο «βιομηχανικός» τρόπος επίστρωσης

Από μια συναδελφο

Το παρασκεύασμα

• Και ο υπολογισμός του RF

με αυτό το όργανο

Ή με απλό χάρακα

Εδώ η ειδική σύριγγα απόθεσης δείγματος

Κι εδώ το βαποριζατέρ για τον ψεκασμό με νινυδρίνη

Ανιούσα χρωματογραφία λεπτής στιβάδας

Ανιούσα και κατιούσα χαρτοχρωματογραφία

Χαρτοχρωματογραφία δύο διαστάσεων

Χαρτοχρωματογραφία αμινοξέων

Δισδιάστατη χαρτοχρωματογραφία αμινοξέων

Η θέση των αμινοξέων σε δισδιάστατο χάρτη

Αλφαριθμητικό ευρετήριο αμινοξέων

Χρωματογράφημα και συγκέντρωση καψαϊκίνης

HPLC

Συσκευή χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ VMA με HPLC

VMA

VMA

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΗBA1C

HPLC για ΗbA1C

HPLC για Ηb S

• Δρεπανοκυτταρα (ερυθρά με αλλοιωμένο σχήμα και λειτουργία εξ αιτίας της παθολογικής αιμοσφαιρίνης s (πολυμερισμός αιμοσφαιρινης Α ) οφειλόμενη σε μιά μετάλλαξη (Val αντι Glu)

Μια Val αντικαθιστά ένα Glu στη θεση 6 της β-αλύσσου της Ηb

Δρεπανοκυτταρική νόσος SS

Διαγραμμα ετεροζυγώτη S

Διαγραμμα ομοζυγωτη S

δρεπανοκυτταρα

Άλλες κατηγορίες χρωματογραφίας

ENAΛΛΑΚΤΙΚΑ ΜΕ ΣΤΗΛΗ AFFINITY

Μοριακό κόσκινο (δεξτράνες,πολυακρυλαμίδια)

Και η ηλεκτροφόρηση εντάσσεται στο πεδίο της χρωματογραφίας

• Αφού διαχωρίζουμε πρωτεΐνες,βάφουμε με χρωστικές,υπολογίζουμε συγκεντρώσεις (έστω έμμεσα με φωτόμετρο και ντενσιτόμετρο)

Ηλεκτροφόρηση Ηb

Τύποι Αιμοσφαιρίνης που συνήθως απουσιάζουν από τον οργανισμό

• Τύποι Αιμοσφαιρίνης που συνήθως απουσιάζουν από τον οργανισμό• Αιμοσφαιρίνη C: Αυτή η αιμοσφαιρίνη προκαλεί τα ερυθρά αιμοσφαίρια• να λύονται ευκολότερα από το κανονικό. • Αυτά τα ερυθρά αιμοσφαίρια έχουν μειωμένη διάρκεια ζωής.• Αιμοσφαιρίνες D/E: Όταν υπάρχουν αυτοί οι τύποι αιμοσφαιρινών σε έναν ασθενή με δρεπανοκυτταρική αναιμία

ή θαλασσαιμία, η ασθένεια τείνει να είναι πιο σοβαρή. • Αιμοσφαιρίνη Η: Αυτός ο τύπος αιμοσφαιρίνης διαταράσσει την κανονική μεταφορά οξυγόνου στους ιστούς του

σώματος. Η Αιμοσφαιρίνη Η δεσμεύει το οξυγόνο με τέτοιο τρόπο που το εμποδίζει από το να είναι διαθέσιμο στους ιστούς.

• Αιμοσφαιρίνη S: Αυτός ο τύπος αιμοσφαιρίνης αναγκάζει τα ερυθρά αιμοσφαίρια να πάρουν σχήμα δρεπανιού (δρεπανοκύτταρα), ως απόκριση στα μειωμένα επίπεδα οξυγόνου. Η παρουσία της αποτελεί τη βάση για τη διάγνωση του στίγματος της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας.

• Τιμές Αναφοράς• Ενήλικες• o Αιμοσφαιρίνη Α1: > 95.0%• o Αιμοσφαιρίνη Α2: 1.5 - 3.3%• o Αιμοσφαιρίνη F: < 1.8%• o Αιμοσφαιρίνη C: Απουσία• o Αιμοσφαιρίνη D: Απουσία• o Αιμοσφαιρίνη E: Απουσία• o Αιμοσφαιρίνη H: Απουσία• o Αιμοσφαιρίνη S: Απουσία

Hb A2

• Β-Θαλασσαιμία

• Προκαλείται από μεταλλάξεις στο γονίδιο HBB στο χρωμόσωμα 11. Η σοβαρότητα της νόσου εξαρτάται από τη φύση της μετάλλαξης. Οι μεταλλάξεις αυτές έχουν ως συνέπεια τη μειωμένη παραγωγή (ή την αναστολή σύνθεσης) β-αλυσίδων, με αποτέλεσμα η περίσσεια των α-αλυσίδων να σχηματίζει τετραμερή με σφαιρίνες δ ή γ, σχηματίζοντας αντίστοιχα τις αιμοσφαιρίνες Α2( σπουδαία διαγνωστική αξία) και F.

Β-Μεσογειακή Αναιμία• Στην ομόζυγη μορφή οι πάσχοντες • κληρονομούν και από τους δύο γονείς τα • υπεύθυνα για την διαταραχή γονίδια και • υπάρχει διαταραχή της σύνθεσης των• β • αλυσίδων με αποτέλεσμα την ελάττωση του • συνολικού ποσού της αιμοσφαιρίνης που • περιέχεται στο ερυθροκύτταρο και επομένως • την δημιουργία βαριάς υποχρωμίας. Εξαιτίας • της μειωμένης παραγωγής των β αλυσίδων • επέρχεται, κατά κανόνα σχεδόν, αύξηση της • παραγωγής• των γ ή δ αλυσίδων, με • αποτέλεσμα την αύξηση των ποσοτήτων • των F και Α αιμοσφαιρινών που περιέχονται • στα ερυθροκύτταρα.

Δομη αιμοσφαιρινης

.

Α2β2 αλυσίδες της σφαιρινης

Αιμη vs Xλωροφύλλη

Αεριο-υγρο χρωματογραφία GLC

Η παρουσίαση αυτή έγινε στα πλαίσια των μαθημάτων

• Των ειδικευόμενων Βιοπαθολόγων,Βιοχημικών,Τεχνολόγων Ιατρικών Εργαστηρίων&Παρασκευαστών,τον Μάρτιο του 2012, στο Νοσοκομείο Παναγία-Άγιος Παύλος στη Θεσσαλονίκη.και αποτελεί βάση για περεταίρω προσέγγιση θεμάτων που ενδιαφέρουν το προσωπικό του Εργαστηρίου. Κ.Φλωρίδης Βιολόγος ,μέλος του Επιστημονικού Συμβουλίου.

Επειδή η δουλειά μας δεν είναι να βάζουμε τα αίματα στη σειρά

Ούτε να παίζουμε με τα γυάλινα σκεύη

Ούτε να κάνουμε μόνο άχαρες στατιστικές που μας κοιμίζουν

Αποφασίζουμε να κάνουμε το εργαστήριο από έτσι

Λίγο διαφορετικό

Αλλά προλάβανε και μας κλείσανε

Παρά τις προσπάθειες κ τους αγώνες

Κι έτσι μετά τη διαδρομή Παναγία-Ιπποκράτειο –Αγ.Παύλος, κατέληξα

εδώ

Τιμή μου και χαρά μου, ελπίζω και δική σας

Σας ευχαριστώ