Enzim kinetiği ve regülasyonu

ENZİM KİNETİĞİ ENZİM KİNETİĞİ ve ve

REGÜLASYONUREGÜLASYONU

Uzm.Dr. Gülsen YILMAZŞUBAT 2007

ENZİMLER■ Enzimler protein yapıda biyolojik

katalizörlerdir.

■ In vitro koşullarda bağ kırılma reaksiyonları yüksek enerjiye ihtiyaç duyar. (aşırı pH, yüksek ısı ve diğer ölümcül koşullara)

■ İşte enzimler bu reaksiyonların vücut koşullarında oluşumuna izin verir.

ENZİMLER■ Enzimler ilk keşfedildiklerinde enzimlerin

canlı hücrelerin yapılarından ayırt edilemeyeceği savunuluyordu.

■ 1897’de Eduarde Buchner’in canlı maya hücrelerinden şekeri alkole fermentasyonunu katalize eden bir seri enzimleri aktif solüsyon halinde elde etmesi biyokimya tarihinde dönüm noktasıbiyokimya tarihinde dönüm noktası oldu.

NEDEN ENZİM KİNETİĞİ?■ Bugün enzimler saflaştırılabilmektedir. Ancak

enzim katalizli reaksiyonların mekanizmalarını çalışılmasındaki genel yaklaşım hala reaksiyonun hızını belirlemek ve belirlenen hızın deneysel parametrelerdeki değişimlere nasıl cevap verdiğini göstermek üzerine kuruludur

Reaksiyon mekanizmalarının bilinmesinin faydaları :

■ Bir reaksiyonun mekanizmalarının çözülmesi benzer diğer reaksiyonların mekanizmalarını çözmede yardımcı olur.

■ Reaksiyonu denetleme olasılığının olması ve reaksiyon şartlarını değiştirmek veya başka bir madde katarak reaksiyon oluşumunu hızlandırmak veya yavaşlatmaktır.

ENZİM KİNETİĞİ

ENZİM KİNETİĞİ

■ Enzim kinetiği, enzimle katalizlenen bir reaksiyonun hızını ve mekanizmasını inceleme anlamına gelmektedir.

■ Bir kinetik analizin esas amacı kimyasal reaksiyonun nasıl ve ne gibi bir hızla oluştuğunu anlamaktır.

■ Yani SUBSTRATLARIN ÜRÜNE DÖNÜŞÜNDE İZLENEN YOLUN VE HIZIN BİLİNMESİDİR.

SUBSTRATIN ÜRÜNE DÖNÜŞÜMÜ

SUBSTRATIN ÜRÜNE SUBSTRATIN ÜRÜNE DÖNÜŞÜMÜDÖNÜŞÜMÜ

(vo)E + S ES E + P

k-1

k1 k2

Kimyasal reaksiyonların hızı, reaksiyona katılan maddelerin konsantrasyonlarıyla orantılıdır ve hız eşitliği diye adlandırılan bir eşitlikle ifade edilir.

Reaksiyon Hızı

A

B

Hız eşitliğindeki n üsleri, bir tepkimenin derecesini de ifade eder.

nHIZ

SUBSTRATIN ÜRÜNE SUBSTRATIN ÜRÜNE DÖNÜŞÜMÜDÖNÜŞÜMÜ

(vo)E + S ES E + P

k-1

k1 k2

21 3 4 5 6 7 80

0 2 4 6 8

Substrat ( mole)

Ürün

80

60

40

20

0

S+E

↓

P(sabitlenmiş zam

an periyodu)

ENZİMİN SUBSTRAT

TARAFINDAN DOYURULMASI

(SATURASYONU)

Düşük [S]

Enzimin Substrat ile Saturasyonu

A. Düşük [S]

Yüksek [S]


A. Düşük [S] B. 50% [S]


A. Düşük [S] B. 50% [S] C.Yüksek, sature [S]

V0

Vmax

Enzim Kinetiğinin Anlamı

[S] = Düşük → Yüksek [S] = Sabit konsantrasyon

0º kinetik

1º kinetik

E3

E2E1

Enzim konsantrasyonuyla

orantılı

Michaelis-Menten Denklemi

vo =V

m ax [S]

Km +

[S]

■ Vo = ilk hız■ Vmax= maksimum hız■ [S] = substrat konsantrasyonu■ Km= hız sabiti

PROBLEM!

1.0

0.5

0

Vo

0 1 2[S]

Hiperbol hiçbir zaman tam olarak yatay hale geçmez

~Vmax

M-M denklemine alternatif denklemler

■ Lineweaver-Burk denklemi■ Eadie-Hofstee denklemi■ Hanes-Woolf denklemi■ Eisenthal-Cornish-Bowden denklemi

Lineweaver-Burk (çift ters grafik)

■ M-M eşitliğinin her iki tarafı 1/ şeklinde yazılırsa:

1/vo =1 / V

m ax [S]

Km +

[S]

■Bu ilişki, y = mx + b şeklindedir. ■Bu şekilde grafik haline aktarılırsa düz bir eğri elde edilir.

1[s]

1V0

1Vmax

1Km

LINEVEAWER-BURK GRAFİĞİ

Enzim Kinetiği için bir örnek

Vmax

Km S

vo

1/S

1vo

Çift resiprokal (ters)

1)1) Önceden bilinen miktarda Enzim → E 2)2) Farklı konsantrasyonlarda substrat ekle → S (x 軸 )

3)3) Sabit zamanda oluşan Ürünü ölç(P/t) → vo (y 軸 )

4)4) (x, y) eksenindeki hiperbolik eğriden, hesapla→Vmax

5)5) y = 1/2 Vmax olduğunda x ([S]) → Km

1Vmax

- 1 Km

1/2

Enzim Kinetiği için Gerçek Bir ÖrnekV

eri

no

1

2

3

4

0.250.501.02.0

0.420.720.800.92

Absorbance v (( mole/min)[S]

0.210.360.400.46

(1) Ürün oluşumu 600 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülmüştür(2) Reaksiyon zamanı 10 dakikadır

HızSubstrat Ürün Çift Resiprokal

1/S 1/v

421

0.5

2.081.561.351.16

→ → →→

1.0

0.5

0

v

Dir

ek

Çift

Res

ipro

kal

2.0

1.0

0

1/v

-4 -2 0 2 41/[S]

0 1 2[S]

1.0

-3.8

Juan

g R

H (

200

4) B

Cba

sics

Enzim Kinetiğindeki Önemli Kavramlar

■ Km

■ Turnover sayısı (kcat)■ Kcat /Km oranı■ Enzim aktivite ünitesi■ Enzim İnhibisyonu

Km = [S]

Km +

[S] = 2 [S]

Vm ax

2=

Vm ax

[S]

Km +

[S]

Km: Substrat Afinitesi

Eğer vo=V

m ax

2

S2S1 S3

S1 S2 S3

Vmax

1/2

Farklı substratların kullanımı

Afinite değişimiKm

vo =V

m ax [S]

Km +

[S]

Km: Hexokinaz Örneği

Glukoz + ATP → Glc-6-P + ADP

1

2

3

4

5

6

Substratsayı

Km = 8 8,000 5 M

CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

Glukoz Alloz Mannoz

Km: Substrat Afinitesi

Km nedir?■ Km enzimin bir karekteristiğidir. Bir sıvının

kaynama noktası gibi. Ancak birden fazla enzim aynı Km' e sahip olabilir.

■ Km bize substrat için enzim afiinitesi hakkında fikir verir. Bir enzim düşük Km' e sahip ise substrat için yüksek afiniteye sahiptir. Çünkü düşük substrat konsantrasyonunda maksimim hıza ulaşılmış yani doymuştur.

Km nedir?■ Metabolizmada düşük Km' e sahip (yüksek

affinitedeki) enzimler büyük önem taşır. Düşük Km değerleri (1/1.000.000) 10-6 M olarak verilir. Veya hatta daha da küçük 10-7,10-8 M olabilir.

■ Düşük affinitedeki yüksek Km e sahip enzimler ise metabolizma için az önemlidir. Bu Km değerleri 1/100 M-> 10-2 veya 10-1 M olarak verilir.

■ Enzim üzerine bir inhibitör etki ediyorsa Km etki tarzı hakkında bilgi verir.

Turn Over Sayısı, kcat ve kcat / Km oranı

(vo)E + S ES E + P

k-1

k1 k2

kcat: Bir saniyede bir enzim molekülünün substrattan oluşturduğu ürün sayısı. Enzim substrata bağlandıktan sonraki dönemde enzim aktivitesini gösterir. [S]>>Km koşullarında kullanılır.

kcat / Km oranı: Enzim molekülünün total aktivitesini gösterir. Enzimin substrata bağlanmadan önceki dönemide içerir. [S]<<Km koşullarında kullanılır.

Enzimlerin Turn Over Sayıları

Katalaz H2O2

Karbonik anhidraz HCO3-

Asetilkolinesteraz Asetilkolin

40,000,000

400,000

140,000

1-Laktamaz Benzilpenisilin 2,000

Fumaraz Fumarat 800

RecA protein (ATPaz) ATP 0.4

Enzim Substrat kcat (s-1)

Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

Kimotripsin farklı substratlara karşı farklı kcat / Km oranına sahiptir

O R O

H3C–C–N–C–C–O–CH3

H H

= – =––

–HGlisin

kcat / Km

1.3 ╳ 10-1

–CH2–CH2–CH3Norvalin 3.6 ╳ 102

–CH2–CH2–CH2–CH3Norlösin 3.0 ╳ 103

–CH2–Fenilalanin 1.0 ╳ 105

(M-1 s-1)

R =

Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

Enzim Aktivite Ünitesi

Reaksiyon zamanı (dak)Ü

rün

[P]0 10 20 30 40

Slopetan

S → P mol

vo = [P] / dak

Ünite =

Aktivite Unitesi

Protein (mg)

t

mol /dak

yx

yx = tan

Spesifik Aktivite =

Enzim Aktivitesi İnhibisyonu

Enzimlerin katalitik etkileri, bazı kimyasal bileşiklerle değişikliğe uğrar veya tamamiyle yok edilebilir.

Enzim Aktivitesi İnhibisyonu enzimlerin katalitik etkilerinin bazı kimyasal bileşiklerle durdurulması veya sınırlandırılması demektir.

Enzim Aktivitesi İnhibisyonunun Önemi:

■ Aktiviteleri düzenlenerek kontrol sisteminde etkili olurlar.

■ Enzim fonksiyonlarını inhibe eden ilaç ve zehirli bileşiklerin fonksiyon mekanizmalarının anlaşılması.

■ Substrat analogları kullanarak önemli araştırma olanakları sağlanması.

■ İNHİBİSYON TİPLERİ:İNHİBİSYON TİPLERİ:

◆ Yarışmalı inhibisyon (Kompetetif)◆ Yarışmasız inhibisyon (Nonkompetetif)◆ Bağımlı inhibisyon (Unkompetetif)

Enzim İnhibisyonu (Mekanizma)

I

I

S

S

S I

I

I II

S

Kompetetif Non-kompetetif Unkompetetif

EE

Farklı bağlanma bölgesiAktif bölge için

yarışırlarinhibitör

Substrat

[II] sadece serbest [E]’ebağlanır ve [S] ile yarışır;[S]’ı arttırmak [II] etkisiniengeller.

[II] serbest [E] ya da [ES] Kompleksine bağlanabilir; [S]’ı arttırmak etkiyi kaldırmaz.

[II] sadece [ES] kompleksine Bağlanır, [S]’ı arttırmak [II] etkisini arttırır.

E + S → ES → E + P + II↓EII

←

↑

E + S → ES → E + P + + II II↓ ↓EII + S →EIIS

←

↑ ↑

E + S → ES → E + P + II ↓ EIIS

←

↑

EI

S X

Juang RH (2004) BCbasics

Km

Enzim İnhibisyonu

I II Kompetetif Non-kompetetif Unkompetetif

Dire

kÇ

ift r

esi

prok

al

Vmax Vmax

Km Km’ [S], mM

vo

[S], mM

vo

II II

Km [S], mM

Vmax

II

Km’

Vmax’Vmax’

Vmax değişmezKm artar

Vmax azalırKm değişmez Vmax & Km azalır

II

1/[S]1/Km

1/vo

1/ Vmax

II

Paralel çizgi

II

Kesişim x ekseni

1/vo

1/ Vmax

1/[S]1/Km 1/[S]1/Km

1/ Vmax

1/vo

kesişim y ekseni

= Km’

Kompetitif İnhibisyon

Süksinat Glutarat Malonat Oxalat

Süksinat Dehidrogenaz

Substrat Kompetitif İnhibitorÜrün

Kleinsmith & Kish (1995) Principles of Cell and Molecular Biology (2e) p.49

C-OO-

C-H C-H C-OO-

C-OO-

H-C-H H-C-H C-OO-

C-OO-

H-C-H H-C-H H-C-H C-OO-

C-OO-

C-OO-

C-OO-

H-C-H C-OO-

Sulfanilamid Kompetitif İnhibitördür

-COOHH2N-

-SONH2H2N-

PrekürsörFolikasit

Tetrahidro-folik asit

Sulfanilamid

Para-aminobenzoik acid (PABA)

Bakteriler folik asit sentezi içinPABA’ya ihtiyaç duyarlar

Sulfanilamid PABA ile benzerYapıya sahiptirler veBakteriyal büyümeyiİnhibe ederler.

Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197

Enzim Kinetiğinin Özeti

vo=Vmax [S]Km + [S]

Km Vmax &

E1E2E3

1. derece

O. derece

Competitive

Non-competitive

Uncompetitive

Direk

Çift Resiprokal

Bi-substrat reaksiyonlardaM-M denklemine uyarAncak bir substratla çalışırkendiğeri satüre edilmelidir.

Substrat Afinitesi

Maksimum Hız İnh

ibisyo

n

Aktivite

Farklı [S] koşullarında,vo değişikliklerini izle veVmax and Km elde etmek içinişaretle

k2 [Et]

kcat

Turn oversayısı

kcat / Km

Aktivite Unitesi

1 1moldak

Spesifik Aktivite

unitmg

Önem

Enzimlerin Laboratuvarda kullanımı

■ Enzimler laboratuvarda; 1. Reaktif olarak (enzimatik madde analizi) Hexokinazla glukoz tayini vb. 2. Biyokimyasal marker (enzim analizi) ALT, AST, LDH vb.

olarak kullanılmaktadır.

■ Enzimler yardımıyla madde ölçümü (enzimatik madde analizi) yöntemleri ile enzim aktivitesini gösterme (enzim analizi) ve ölçme yöntemlerini karıştırmamak gerekir.

■ Bu iki grupta yer alan yöntemler aslında aynı deney sistemini ve koşullarını içermekle birlikte, enzim ve substrat derişimleri ve deneylerin tasarımı açısından oldukça farklıdırlar.

■ Her iki ölçümde uygun koşullara karar vermek için enzimatik tepkimenin M-M grafiğini incelemek yararlı olur.

21 3 4 5 6 7 80

0 2 4 6 8

Substrat ( mol)

Ürün

80

60

40

20

0

[S]<<Km

[S]=Km

[S]>>Km

vo =V

m ax [S]

Km +

[S]

(vo)E + S ES E + P

k-1

k1 k2

Substrat düşük iken

=k2 [E][S]

Km +

[S]

=Km

k2[E][S]

[substrat] ihmal edilir Sabit

Fazla miktarda

vo = [S][S]< < Km

SUBSTRAT TAYİNLERİ İÇİNSUBSTRAT TAYİNLERİ İÇİNKULLANILAN ARALIKKULLANILAN ARALIK

[S]<<Km

vo =V

m ax [S]

Km +

[S]

(vo)E + S ES E + P

k-1

k1 k2

Substrat yüksek iken

=Vmax [S]

Km +

[S]

[Km] ihmal edilir

vo = [E]

=Km

k2[E]

Sabit

[S]> > Km

ENZİM TAYİNLERİ İÇİNENZİM TAYİNLERİ İÇİNKULLANILAN ARALIKKULLANILAN ARALIK

[S]>>Km

Enzimlerin lab.’da kullanımları yüksek spesifiteleri, kısa reaksiyon zamanı

gibi nedenlerle kullanımı giderek artmaktadır. Bu durum enzim

kinetiğinin anlaşılması gereğini de artırmaktadır.

Enzim Regülasyononuveya

Enzim Aktivitesi Kontrolü

Niçin regüle edilir?

Niçin regüle edilir?

Bu reaksiyonu daha yakından incelersek

Glikolizin ilk basamağı

■ Hücredeki enzim miktarını düzenlenmesi

■ Var olan enzimin aktivitesinin düzenlenmesi

Yeni enzim moleküllerinin sentezi

Enzim molekülü sayısında azalma

Non-kovalent modifikasyon

Kovalent modifikasyon

Fructose-6-P + ATP -----> Fructose-1,6-bisphosphateFructose-1,6-bisphosphate + ADPADPPFK-1PFK-1

Mekanizmalar■ Enzim miktarının düzenlenmesi

■ Enzim aktivitesinin düzenlenmesi

Yeni enzim moleküllerinin senteziEnzim molekülü sayısında azalma

Non-kovalent modifikasyonKovalent modifikasyon

Yeni enzim molekülü sentezi(Indüksiyon)

RNA

Transkripsiyon

Protein

Translasyon

DNA

DNA

Replikasyon

Gen Expresyonu

(Bizim enzimimiz)



Yeni enzim moleküllerinin senteziEnzim molekül sayısında azalma


ENZİM MOLEKÜL SAYISINDA AZALMA

■ Transkripsiyon inhibisyonu (represyon)

■ Protein (enzim) metabolizma hızını artırmak





Non-kovalent Modifikasyon

■ Feed-forward aktivasyon

■ Feed-back inhibisyon

■ Allosterik regülasyon


■ Feed-back inhibisyon

Feed-back inhibisyon


■ Feed-forward aktivasyon

piruvat kinaz’ın Fructose 1,6-bifosfat tarafından aktivasyonu

Non-kovalent Modifikasyon Allosterik regülasyon

v

[S]

Michaelis - Menten Enzim

allosterik enzim

Vmax

Allosterik regülasyon

v

[S]





Kovalent Modifikasyon

■ Reversibl fosforilasyon

■ Polipeptid zincirlerin parçalanması

Polipeptid zincirlerin parçalanması■ Proenzimler (zimojenler) Bir enzimin etkin olmayan öncüsüne denir.

Zimojenler diğer bir enzim, asid veya diğer etkenlerle etkin şekillerine dönüşür.

Pankreatik Zimojenler


■ Reversibl fosforilasyon

■ Polipeptid zincirlerin parçalanması


■ Fosforilasyon

Reversibl fosforilasyon

Hormonal Hormonal kkontrolontrol

Diğer mekanizmalar

■ Kompartmentasyon

■ Izoenzimler

Kompartmentasyon

Enzim ve substratların ayırımıdır. Örn: enzimler substratlarından bazı membranlarla ayrılır, organel membranı gibi. (mitokondri)

Kompartmentasyon

*enzyme activity enhanced by dephosphorylation (high insulin)**enzyme synthesis induced (high insulin)

glucose

pyruvate

glycolysis

citrate OAA

malate

ATP ADP + Pi

CoASH acetyl CoA

fatty acidsynthesis

NADH

NAD+

NADPH NADP+CO2

citrate lyase**

malatedehydrogenase

malic enzyme**

pyruvate

OAA acetyl CoA

citrate

mitochondrion

cytosol

PDH*PC

İzoenzimler

İzoenzimler aynı kimyasal reaksiyonu katalizleyen farklı kimyasal kompozisyona sahip enzimlerdir

İzoenzimlere örnek:

laktat dehidrogenaz (LDH),

hexokinaz/glukokinaz,

kreatin fosfokinaz (CPK).

Saatler-günler içinde

Enzim miktarında değişiklik

Hormonal kontrol

Hemen-dakikalar içinde

Vmax ve/veya Km’de değişiklik

Kovalent modifikasyon

HemenVmax ve/veya Km’de değişiklik

Allosterik kontrol

HemenVmax ve/veya Km’de değişiklik

Ürün inhibisyonu

HemenHızda değişiklikSubstrat miktarı

ZAMANZAMANSONUÇSONUÇREGÜLASYONREGÜLASYON

MEKANİZMASIMEKANİZMASI

Health & Medicine

Enzim kinetiği ve regülasyonu