Guia de bioquimica_y_nutricion_2016-ii

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Guía de Prácticas

Bioquímica y Nutrición

Lima - Perú

2016-II

FACULTAD DE MEDICINA GUIA DE BIOQUIMICA Y NUTRICION

Universidad Ricardo Palma Página 2

UNIVERSIDAD RICARDO PALMA FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

Dr. Elio Iván Rodríguez Chávez

Rector

Dr. Manuel Huamán Guerrero

Decano de la Facultad de Medicina Humana

Autores:

Dra. Nancy Jo Vargas

(Coordinadora de Curso)

Q.F. Cecilia Rojas Guerrero

(Coordinadora de Laboratorio)

2016-II



A.- CONTENIDOS DE BIOQUIMICA:

Actividad Página

Interconversión de unidades y manejo de concentraciones de

disoluciones.

08

Buffer:

Capacidad buffer en términos de pKa. 10

Espectrofotometría Uso de la luz visible y UV en Medicina. 13

Actividad enzimática: Efecto de factores en la transformación del

sustrato.

19

Acción de la amilasa en la digestión del almidón. 22

Sobrecarga oral de glucosa y DM (TTG). 25

Determinación e interpretación del HCO3- en la ácidosis

diabética.

27

Aislamiento e identificación de lipoproteínas plasmáticas y su

asociación con el riesgo coronario.

31

Ictericia: Metabolismo de la bilirrubina y pigmentos biliares.

35

Transaminación. Uso de la cromatografía. 38

B.- CONTENIDOS DE NUTRICIÓN HUMANA

Actividad Página

Valoración Nutricional: Balance Nitrogenado 44

Evaluación de la Masa Proteica Visceral y Esquelética: Marasmo-

Kwashiorkor. 48

Medidas Antropométricas y signos clínicos que evidencian

desnutrición. Manejo de la Tabla de composición de alimentos.

52



Reglamento Interno del Laboratorio

1. La asistencia a las prácticas de laboratorio son de carácter obligatorio e

injustificada

2. Las justificaciones por enfermedad se realizarán dentro de las 48 horas y con la

presentación del certificado médico del servicio médico de la URP

3. Se aplicará una tolerancia máxima de 5 minutos para el ingreso del alumno y lo

realizará portando un mandil como vestimenta de protección y la guía de prácticas

respectiva.

4. Los alumnos rendirán una prueba cognoscitiva de entrada conforme a la tabla de

evaluación diseñada, debiendo para ello haber leído la práctica correspondiente

5. En cada práctica, los alumnos presentarán, un informe grupal, absolviendo el

cuestionario de la práctica realizada durante la práctica.

6. A cada alumno se le asignará una mesa de trabajo, los cambios de grupos o

subgrupos no están permitidos.

7. El alumno tomará conocimiento del profesor en cuanto al buen manejo del material

y equipo de laboratorio y será responsable de su integridad y funcionamiento.

8. Si algún alumno rompe material de vidrio, deberá reponerlo, de lo contrario no

podrá rendir el próximo examen.

9. En caso de deterioro de algún equipo de laboratorio toda la mesa será responsable

del daño causado.

10. Si porta celulares y equipos de sonido (MP3, Ipod, Ipad, tablet, etc.) serán

apagados, permaneciendo así durante el transcurso de la práctica.

11. No se permite ingresar con alimentos y/o bebidas al laboratorio y aún menos

ingerirlas

12. La duración de desarrollo de la práctica es de 2 horas y todo permiso para salir del

laboratorio deberá ser solicitado a su profesor de prácticas, otorgándosele permiso

sólo si fuera absolutamente urgente.



El trabajo en el Laboratorio requiere la observación de

una serie de normas de seguridad que eviten posibles

accidentes debido a desconocimiento de lo que se

está haciendo o a una posible negligencia de los

alumnos.

1. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.

2. Es conveniente la utilización de mandil, ya que evita posibles proyecciones de sustancias químicas

o biológicas lleguen a la piel. Por supuesto además, evitarás posibles deterioros en tus prendas de

vestir.

3. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido.

4. Y no haría falta decir esto; pero por supuesto en el laboratorio está terminantemente prohibido

fumar, ingerir bebidas y/o alimentos

1. Antes de utilizar un compuesto, verifique el nombre con el que figura en el rotulo del compuesto

2. No devolver a los envases de origen, los remanentes de los reactivos (no utilizados)

3. El descarte de los reactivos o productos químicos utilizados se viertan en la pila del desagüe para

ser arrastrados con abundante agua.

4. No utilizar la boca para el aspirado de volúmenes de reactivos. Utilice pipeteadores automáticos o

bombillas de aspiración

5. Cuando se haga diluciones de ácidos, tener la precaución de agregar ácido al agua y no agua al

ácido

6. Para evitar contaminación de reactivos, utilice una pipeta seca y limpia para cada sustancia química

7. Utilizar guantes descartables, para manipular material biológico

8. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si

hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama.



9. Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente con mucha agua y

avisa al profesor.

10. Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado convenientemente.

1. Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio.

2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar quemaduras,

dejarlo enfriar antes de tocarlo.

3. Las manos se protegerán con guantes o trapos cuando se introduzca un tapón en un tubo

de vidrio.

4. Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa

cuidadosamente estas dos normas:

Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no apunte a

ningún compañero. Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías

ocasionar un accidente.

Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita suavemente.

5. Utilizar material limpio y seco





Por muchos años los científicos expresaron las mediciones en unidades métricas, relacionadas entre sí

decimalmente, es decir, mediante potencias de 10. Sin embargo, en 1960, la Conferencia General de Pesas

y Medidas, la autoridad internacional en unidades, propuso un sistema métrico revisado y actualizado al cual

se denominó Sistema Internacional de Unidades (Abreviado SI, del francés Systéme Internationale d

Unites). En la tabla Nº 1 se muestran las siete unidades SI fundamentales; las demás unidades de medición

se pueden derivar a partir de estas unidades. Como las unidades métricas, las unidades SI cambian en

forma decimal por medio de una serie de prefijos, como se muestra en la tabla Nº 2.

En Bioquímica se suele usar éste sistema el cual significa un amplio dominio en su manejo toda vez que las

concentraciones de los fluidos intra y extracelulares son generalmente en el orden de los submúltiplos.

Tabla 1 .- Unidades SI básicas

CANTIDAD

FUNDAMENTAL

NOMBRE

DE LA UNIDAD

SÍMBOLO

Longitud Metro m

Masa Kilogramo kg

Tiempo Segundo s

Corriente eléctrica Ampere A

Temperatura Kelvin K

Cantidad de sustancia Mol mol

Intensidad luminosa Candela cd

Tabla 2.- Prefijos utilizados con unidades SI

Prefijo Símbolo Factor Equivalente

MULTIPLOS tera T 1012 1 000 000 000 000

giga G 10 9 1 000 000 000

mega M 106 1 000 000

Kilo K 103 1 000

hecto H 102 100

deca Da 10 10

SUBMULTIPLOS deci d 10-1 0,1

centi c 10-2 0,01

mili m 10-3 0,001

micro u 10-6 0,000 001

nano n 10-9 0,000 000 001

pico p 10-12 0,000 000 000 001

femto f 10-15 0,000 000 000 000 001

atto a 10-18 0,000 000 000 000 000 001



INFORME DE LA PRACTICA N° 1

Nombre del Alumno:------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Grupo: ---------------------------------- Fecha: ---------------------------

1.- Realice las siguientes conversiones:

X dg = X ug Xdg = XHg

X ug = X dg Xpl = Xul

X ml = X pl XnMol = XuMol

X pm = X mm X Hg = X dg

2.- Estructura química y calcule el Peso molecular de los siguientes compuestos:

a) Glucosa

b) Cloruro de sodio

c) Cloruro de potasio

d) Cloruro de calcio

e) Lactato de sodio

f) Gluconato de calcio

g) Urea

h) Manitol

3.- Describa las siguientes expresiones:

a) Molaridad

b) Normalidad

c) Equivalente

d) m-Eq

e) Osmolaridad

4.- Calcule la Molaridad de las siguientes soluciones :

a) 500 ml de Cloruro de sodio al 0.9%

b) 1 L de Suero glucosado al 5%

c) Una ampolla de 20 ml de NaCl al 20%

d) Una ampolla de 20ml de NaHCO3 al 8.4%

5.- Calcule los mEq de las siguientes soluciones:

a) Cuantos mEq de Na y cuantos mEq de Cl hay en una ampolla de 20ml de NaCl al 20%

b) Cuantos mEq de K y cuantos mEq de Cl hay en una ampolla de 20 ml de KCl al 10%

c) Cuantos mEq de HCO3 y cuantos mEq de Na hay en una ampolla de 20ml de HCO3Na al 10%.

------------------------------------------- ------------------------------------------------------- --------------

Firma del Alumno Firma del Profesor Nota



La curva de titulación de un ácido débil como acético representa las variaciones de pH con respecto a diferentes proporciones relativas

entre la sal y el ácido de una solución tampón. Antes de adicionar la base, el pH se debe solamente al ácido. Tan pronto como se

agregue algo de base ésta reacciona con una cantidad equivalente de sal y agua. Pero el ácido débil , mas su sal disuelta constituye

una solución tampón, cuyo pH puede calcularse mediante el uso de la ecuación de Henderson - Hasselbach.

pH = pKa + log

OBJETIVO

a) Obtener la curva de valoración de un ácido débil, HA, CH3COOH O.1N

y una base fuerte NaOH 0.1N

b) Calcular el pH haciendo uso de un potenciómetro y la ecuación de Henderson Hasselbach

POTENCIOMETRIA

El método más confiable para medir el pH es mediante el uso de un medidor de pH comúnmente denominado potenciómetro, que mide

la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una celda formada por un electrodo de referencia, la solución problema y un electrodo de vidrio

sensible a hidrogeniones. El electrodo de referencia puede ser de calomel (mercurio, cloruro mercurioso) sumergido en una solución

concentrada de cloruro de potasio. El electrodo de medida o de vidrio, esta constituido por un tubo de vidrio grueso con un extremo en

forma de bombilla, el cual es selectivo y sensible al paso de iones hidrógeno. Está conectado a un alambre de platino conectado al

electrodo de Ag, Cl2Ag, sumergido en HCl 0.1M. La fuerza electromotriz generada es leída en un galvanómetro es unidades de pH.

ACIDO

SAL



EXPERIMENTO 1

Medir y mezclar los volúmenes de CH3-COOH 0.1N, de NaOH 0.1N y agua indicados en el siguiente cuadro:

Tubo N° CH3-COOH 0.1N NaOH 0.1N H2O DEST. pH

1 10 ml 0.0 ml 10 ml

2 10 1.0 9

3 10 2.0 8

4 10 3.0 7

5 10 4.0 6

6 10 5.0 5

7 10 6.0 4

8 10 7.0 3

9 10 8.0 2

10 10 9.0 1

11 10 10.0 0

a) Medir los valores de pH de cada mezcla, utilizando el potenciómetro

b) Calcular los valores de pH de cada mezcla, aplicando la ecuación de Henderson – Hasselbach. pKa=4.76

EXPERIMENTO 2

Medir y mezclar los volúmenes de HCl 0.1N, de NaOH 1N y agua indicados en el siguiente cuadro:

Tubo N° HCl 0.1N NaOH 0.1N H2O DEST. pH

1 10 ml 0.0 ml 10 ml

2 10 1.0 9

3 10 2.0 8

4 10 3.0 7

5 10 4.0 6

6 10 5.0 5

7 10 6.0 4

8 10 7.0 3

9 10 8.0 2

10 10 9.0 1

11 10 10.0 0


EXPERIMENTO 3

Titulación de la Alanina

Tubo N° Alanina 0.1N NaOH 0.5M H2O DEST. pH

1 10 ml 0.0 ml 10 ml

2 10 1.0 9

3 10 2.0 8

4 10 3.0 7

5 10 4.0 6

6 10 5.0 5

7 10 6.0 4

8 10 7.0 3

9 10 8.0 2

10 10 9.0 1

11 10 10.0 0





Nombre del Alumno(s):------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Grupo: ---------------------------------- Fecha: ---------------------------

CURVA DE TITULACION DE LA ALANINA

ALANINA

1. Deduzca la ecuación de Henderson – Hasselbach y calcula los valores del pH de la neutralización del CH3COOH con NaOH

2. En papel milimetrado:

a. grafique los valores del pH vs ml de NaOH 0.1N utilizados en la titulación del ácido acético y HCl

b. compare ambas curvas e interprete.

3. En papel milimetrado:

a. Grafique la titulación de la Ala

b. Calcule el valor del pK1 y pK2

4. La concentración del H2CO3 en el plasma sanguíneo es aproximadamente 0.00125M

a. Calcule la concentración de HCO3 – en el plasma, cuando el pH es 7.4

b. Halle la razón HCO3 / H2CO3 del buffer

------------------------------------------- ------------------------------------------------------- --------------


VALORACION DE UN ACIDO DEBIL MONOPROTICO

pH

ml de NaOH

0.1N

CH3COOH HCl

pH

ml de NaOH

0.1N

VALORACION DE UN ACIDO FUERTE

pH

ml de NaOH 1N



OBJETIVO:

a) Preparar soluciones de concentración creciente de una solución estándar de Azul de Metileno y leer %T y calcular sus A ó

D.O.

Ley de Lambert:

Cuando un rayo de luz monocromática incide sobre un medio absorvente, su intensidad decrece en forma exponencial al espesor del

medio.

Ley de Beer:

Cuando un rayo de luz monocromática incide sobre un medio absorvente su intensidad decrece en forma exponencial a la

concentración.

Ambas leyes se fusionan así:

Ley Lambert – Beer

I = I0 . 10-abc a = absortividad molecular

b = espesor medio

c = concentración

I = luz emergente

I0= luz incidente

I/I0 = 10-abc

log(I/I0) = -abc

log I0/I = abc

log 100%/%T = 2-log%T

2-log%T = a.b.c

Abs = a.b.c

si b = k

a.k = K

Abs = K.c



La Abs es directamente proporcional a la concentración . Luego establecemos la siguiente proporcionalidad :

Abs x = Abs desconocido

Abs St = Abs standard

Cx = Concentr. Desconocido

CSt = Concentr. Standard

Cx =

Cx =

Concentración = x Abs desconocido

Desconocido

FACTOR CALIBRACION:

Cuando previamente se ha determinado la linaridad de Absst=k.c:

= Factor

Factor x Abs desconocido = Concentración desconocido

Definiciones:

1. Absorbancia:

A = log10T = -log = 2-log10 % T

2. Absortividad ó

Coef. Extin.:

a = Absorbancia/Unidad de concentración y

espesor ó absorbancia específica

a = A / b c Concentración

espesor

3. Energía Radiante:

I0 = Luz incidente

4. Transmitancia:

(emergente)

T =

(incidente)

5. % Transmitancia:

%T = 100T

Cx

CSt

xAbs

St Abs

xCstSt Abs

xAbs

odesconocidxAbs _St Abs

St C

st Abs

st.ón Concetraci

stAbs

st.ón Concetraci

T

1

0I

I.



AM

1

UV Región espectral de 200-380 nm

IR Región espectral de 0.7 - 300um

Luz Visible Región espectral de 380 – 780nm

Absortividad molar cm ó Coeficiente de extinción molar o molecular

Absortividad de una solución 1 Mol/L, en 1 cm espesor cm

La relación matemática entre A y concentración:

A = a.b.c = log 100

por 100 de T

Los espectrofotómetros reportan sus resultados en absorbancia (luz absorbida por las partículas de la solución) y transmitancia ( luz

absorbida)

A 2 1.0 0.5 0.25 0.125 0.06 0

% T 0 10 31 56 75 87 100

La absorbancia o Densidad aplicada se expresa en valores semilogarítmicos y la trasmitancia en valores alfanuméricos.

EXPERIMENTO N° 2

La práctica consiste en preparar soluciones de concentración creciente de una solución standart y leer sus D.O. y %T.

N° tubo St 1 St 2 St 3 St 4 St 5

ml. de sol standart 2 4 6 8 10 -

ml. Agua destilada 8 6 4 2 - 8.5

ml. muestra problema - - - - - 1.5

% Transmitancia

Calcular Absorbancia

Calcular mg %

Mezclar.

Leer el % de Transmitancia a 540, colocando a 0 con agua destilada.

A= 2 – log % T

AM

1

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Electromagnetic_spectrum-es.svg




Nombre del Alumno(s):---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Grupo: ---------------------------------- Fecha: ------------------------------

CURVA DE CALIBRACION

1.-Calcule las concentraciones en mg% de las diluciones de los colorantes utilizados.

2.- Grafique en papel milimetrado A(DO) vs Concentración y en papel semilogarítmico %T vs Concentración e interprete.

%T

3.- Calcular el Factor de Calibración: Concentración

A (DO)

4.- Calcular la concentración de una muestra problema, haciendo uso del F.C. y la curva de calibración.

--------------------------------------------- -------------------------------------- -----------


Concentración Concentración

A



Las enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones bioquímicas, acelerando la velocidad de la reacción hasta su punto de

equilibrio.

ACTIVIDAD ENZIMATICA

Es la capacidad de una enzima de acelerar una reacción química.

Se puede expresar de diversas maneras:

(a) Desaparición de un sustrato (S)

(b) Formación de producto (P)

(c) Modificación de cofactores (C)

E + S E S E + P

c' e''

Diversos factores modifican la actividad enzimática:

1. pH

2. Concentración de la enzima

3. Concentración del sustrato

4. Tiempo de incubación

5. Temperatura

6. Inhibidores y activadores.

Para la práctica buscamos el efecto de la pepsina, enzima proteica, sobre la albúmina. La mayor actividad enzimática se demostrará

por desaparición del sustrato (menor turbidez de la albúmina por su transformación en aminoácidos).

EXPERIENCIA NRO. 1

EFECTO DEL pH

Cada enzima tiene un pH óptimo de trabajo. Para demostrar el pH óptimo de la pepsina, trabajaremos con 6 tubos de acuerdo al

siguiente esquema:

TUBO Nro. 1 2 3 4 5 6 B

PH 1.0 1.5 6.0 9.5 11.5

Albúmina : ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

HCl 1N : ml 2.0 0.5

CO3Na2 10% : ml 0.5 2.0

Agua dest. : ml 1.5 2.0 1.5 5.0

Pepsina 1% : ml 20

Incubar los Tubos del 1 al 6 a 37°C x 5’

K1

K2

K3

K4



Añadir rápidamente del tubo N°6; 3ml de pepsina a los tubos N° 1,2,3,4 y 5. Mezclar, incubar 37° x 5'

Leer D.O en el espectrofotómetro a 420nm de los tubos N°1,2,3,4 y 5 y el tubo Blanco(B). Llevando a cero el instrumento con un

blanco de agua destilada.

Restar la lectura del tubo Blanco (B) menos la lectura de cada uno de los 5 tubos. La diferencia será asumida como actividad

enzimática.

EXPERIENCIA NRO. 2

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA

Demostrar que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a [E]cuando la concentración del S es constante. Preparar el

experimento de acuerdo al siguiente esquema:

TUBO Nro. B 1 2 3 4 5

Albúmina : ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

HCl 1N : ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua dest. : ml 4.5 4.0 3.5 2.5 1.5

Pepsina 1% : ml 10.0

Incubar los Tubos a 37°C x 5'. Añadir la pepsina del tubo 5 a los tubos 1 al 4 según el sgte. esquema:

TUBO Nro.1 B 1 2 3 4

Pepsina incubada 0.0 0.5 1.0 2.0 3.0

Mezclar, incubar a 37°C x 5'.Detener la reacción colocando los tubos en baño de hielo. Leer las D.O en el espectrofotómetro a 420nm.

Llevando a cero el instrumento con un blanco de agua destilada.

La diferencia de las absorbancias entre el tubo Blanco y la lecturas de los otros tubos nos indicará la actividad enzimáticca para cada

tubo.|

EXPERIENCIA NRO. 3

EFECTO DE LA T°

El incremento de la temperatura acelera la velocidad de las reacciones químicas por un aumento en número de colisiones efectivas

entre los elementos reaccionantes, sin embargo todo incremento de temperatura por encima de la velocidad máxima de reacción,

produce una desnaturalización progresiva de la enzima.

Para la experiencia, prepararemos 2 series de 5 tubos cada una.

Serie N°1

TUBO Nro.(1° serie) 1a 2a 3a 4a 5a Blanco

Albúmina : ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

HCl 1N : ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 -

Agua dest. : ml 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 4.0

Serie N°2

TUBO Nro.(2° serie) 1b 2b 3b 4b 5b

Pepsina 1% : ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Incubar por 5´los tubos de acuerdo al siguiente esquema de temperaturas:

TUBO Nro. 1a-1b 2a-2b 3a-3b 4a-4b 5a 5b

T°.C° 0°C T°amb 37° 70° 37° 100°

Agregar el contenido de los tubos 1b,2b,3b,4b y 5b a sus respectivos tubos 1a,2a,3a,4a y 5a .



Luego incubar a las T° correspondientes 0°C, T°amb, 37°C, 70°C y 100°C a cada tubo por 5 minutos.

Colocar los tubos en baño de agua helada para detener la reacción. Leer D.O. en el espectrofotómetro a 420nm. Llevando a cero el

instrumento con un blanco de agua destilada.

La actividad enzimática se encontrará restando la lectura del tubo blanco (B) menos la lectura de los otros 5 tubos.

EXPERIENCIA NRO. 4

EFECTOS DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO

Si aumentamos progresivamente la concentración del sustrato, aumentaremos la velocidad enzimática (velocidad inicial) hasta un

punto en que la velocidad llega a una meseta y no se modificará aunque sigamos aumentando el sustrato (saturación).

Preparar 8 tubos de acuerdo al siguiente esquema:

TUBO Nro. 1 2 3 4 5 6 7 8

Albúmina : ml 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 -

HCl 1N : ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 -

Agua dest. : ml 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 -

Pepsina 1% : ml 5.0

Mezclar. Leer los tubos 1,2,3,4,5,6,7. Considerar las absorbancias como lectura inicial.

Luego incubar los 8 tubos a 37° x 5'.

Añadir 0.5ml de pepsina a cada tubo (del tubo 8 a los tubos 1,2,3,4,5,6 y7) Mezclar.

Incubar 5' a 37°C.

Detener la reacción en un baño de hielo.

Leer D.O en el espectrofotómetro a 420 nm. Considerar las absorbancias como lectura final.

Hacer la diferencia:

Actividad Enzimática = Lectura Inicial – Lectura Final

El resultado de ésta diferencia se considerará como actividad Enzimática.




Nombre del Alumno(s):---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Grupo: --------------------------------- Fecha: ------------------------------------

1. Usando los valores de la actividad enzimática(D.O) obtenidos, Grafique:

EFECTO DEL pH

Act. Enz.

pH

Interpretación:___________________________________

________________________________________________

________________________________________________

__

EFECTO DE LA T°

Act. Enz.

T°

Interpretación:___________________________________

________________________________________________

________________________________________________

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA

Act. Enz.

[E]

Interpretación:___________________________________

________________________________________________

________________________________________________

______________________________________

EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO

Act. Enz.

[S]

Interpretación:___________________________________

________________________________________________

________________________________________________

__

FACULTAD DE MEDICINA GUIA DE BIOQUIMICA Y NUTRICIÓN


2. Determine los valores del Km y Vmax de una inhibición competitiva y no competitiva de una enzima que mostró los siguientes datos

experimentales:

⁅S⁆

(mM)

V1, sin inhibidor

(mmol.min-1)

V2, con inhibidor

(mmol.min-1)

3,0 4,58 3,66

5,0 6,4 5,12

7,0 7,72 6,18

9,0 8,72 6,98

11,0 9,5 7,60

Grafique la curva de

--------------------------------------------- -------------------------------------- -----------




INTRODUCCION

El almidón es un polímero de glucosa y se caracteriza por dar un color azul con una solución de yodo. Está constituido por amilosa (15-

20%) y amilopeptina (80-85%) ambos constituyentes son hidrolizadas por la alfa-amilasa salival y pancreática produciendo maltotriosa, maltosa y

dextrinas. La presencia de azúcares reductores se identifican por la formación de Cu2O en presencia del reactivo de Benedict.

OBJETIVO

a) Determinar la acción de la amilasa sobre el almidón.

b) Determinar sustratos y productos producidos por acción de la amilasa salival.

c) Efecto del pH sobre la amilasa salival.

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON (DIGESTION)

Haciendo uso de cuatro tubos, seguir el siguiente esquema:

TUBO Nº 1 2 3 4

ALMIDON 1%; ml 2.0 2.0 2.0 2.0

BUFFER FOSFATO pH 6.8:ml 1.0 1.0 1.0 -

HCL O,3N : ml - - - 3.4

CL Na 0,9%: ml 3.0 2.4 - -

Agua dest.:ml - - 2.4 -

Baño María 37º x 5´

Amilasa Salival: ml - 0.6 0.6 0.6

Mezclar, Incubar en Baño María 37°C x 20’

A. DETERMINACION EL SUSTRATO

TUBOS Nº 5 6 7 8

DIGERIDO DEL TUBO 1: ml 0.5 - - -

DIGERIDO DEL TUBO 2: ml - 0.5 - -

DIGERIDO DEL TUBO 3: ml - - 0.5 -

DIGERIDO DEL TUBO 4: ml - - - 0.5

H CL 0.05N : ml 5 5 5 5

Sol. de Lugol: ml 0.5 0.5 0.5 0.5

Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolorímetro con filtro rojo (660nm)

B. DETERMINACION DEL PRODUCTO

TUBOS 9 10 11 12 13

DIGERIDO DEL TUBO 1: ml 0.5 - - - -

DIGERIDO DEL TUBO 2: ml - 0.5 - - -

DIGERIDO DEL TUBO 3: ml - - 0.5 - -

DIGERIDO DEL TUBO 4: ml - - - 0.5

SOLUCION DE GLUCOSA 1%: ml - - - - 0.5

SOLUCION BENEDICT : ml 2 2 2 2 2

Mezclar, Incubar en Baño María a 100°C x 5’

Enfriar en agua helada e interpretar.



REACCION DE BENEDICT:

TUBOS 1 2 3 4

ml Reactivo de Benedict 5 5 5 5

Gotas Glucosa 0.1 M 8 - - -

Gotas Fructosa 0.1 M - 8 - -

Gotas Maltosa 0.1 M - - 8 -

Gotas Sacarosa 0.1 M - - - 8

Mezclar, Incubar en Baño María a 100°C x 5’

Enfriar en agua helada e interpretar.




Nombre del Alumno(s):--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Grupo: -------------------------- Fecha: ----------------------------

1.- Determinación del sustrato:

Tubo Nº 1 Color...........................................................................Interprete el resultado……………………………...........

Tubo Nº 2 Color.......................................................................... Interprete el resultado……………………………...........

Tubo Nº 3 Color .......................................................................... Interprete el resultado……………………………...........

Tubo Nº 4 Color......................................................................... Interprete el resultado…………………………….............

Reste las DO de los tubos de aquel que tuvo la DO más alta y grafique:

a) Actividad0.500 b) Interpretación de la curva Enzimática

0.400

0. 300

0.200

0. 100

5 6 7 8 Tubo

2.- Determinación del producto:

a) Tubo Nº 1 Color........................................................................ Interprete el resultado……………………………...........

Tubo Nº 2 Color......................................................................... Interprete el resultado……………………………...........

Tubo Nº 3 Color......................................................................... Interprete el resultado……………………………...........

Tubo Nº 4 Color.......................................................................... Interprete el resultado……………………………...........

b) Identifique cuál es la condición para una mejor hidrólisis enzimática del almidón soluble.

3.- Interprete la reacción de los carbohidratos frente al reactivo de Benedcit

Carbohidrato Glucosa Fructosa Maltosa Sacarosa

Reacción ( + ó - )

----------------------------------- ------------------------------------- ---------------




La prueba de tolerancia a la glucosa (TTG) es empleada para evaluar pacientes en quienes se sospechan anormalidades del metabolismo de los

carbohidratos. Esto es particularmente útil para la diabetes mellitus. La prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral es más funcional , más

confiable y más fácil de llevar a cabo que la prueba de tolerancia a la glucosa por vía intravenosa. La secreción de insulina como respuesta a la

administración de glucosa es mayor debido a la estimulación de la secreción de hormonas entéricas, las cuales a su vez estimulan la secreción

de insulina.

OBJETIVO:

1 Determinar la concentración de glucosa sérica basal ( 0' ) y a los 30', 60', 90' y 120' después de una sobrecarga oral de glucosa ( 75 g ).

2 Determinar el umbral renal de reabsorción de glucosa

3 Presencia de Cuerpos Cetónicos

DETERMINACION DE GLUCOSA SERICA:

La glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la glucosa de acuerdo con la siguiente ecuación:

El peróxido de hidrógeno formado reacciona con 4 amino-antipirina y fenol en presencia de peroxidasa, formando una quinonaimina coloreada, la

cual es directamente proporcional a la concentración de glucosa en sangre.

EXPERIMENTO 1

Determinar la concentración de glucosa sérica siguiendo el siguiente esquema:

N° Tubo 1 2 3 4 5 6 7

ST. Glucosa: 200 mg | dl: (ul) - 10 - - - - -

Suero : 0' (ul) - - 10 - - - -

30' (ul) - - - 10 - - -

60' (ul) - - - - 10 - -

90' (ul) - - - - - 10 -

120' (ul) - - - - - - 10

Reactivo de glucosa: ml 1 1 1 1 1 1 1

1. Mezclar. Incubar 37° C x 10' o 20 minutos a T° ambiente

2. Leer D.O. en el espectrofotómetro a 505 nm, frente al Bl



CALCULO.- Haciendo uso del factor de calibración expresar la glucosa en mg/dl

VN = 70 - 110 mg/dl

EXPERIMENTO 2

Para determinar la presencia de glucosa en orina, seguir el siguiente esquema:

Tubo N° 1

Orina ml 0.5

React. Benedict. ml 2.0

1. Mezclar. Colocar a 100° C x 5'.

2. Enfriar ( hielo). Observar la formación de precipitado.



INFORME PRACTICA N° 6


Grupo: ------------------------------------------------------------------ Fecha: ---------------

1.- Calcule y grafique la concentración de glucosa (mg/100ml) en condiciones basales y 30`, 60`, 90`, 120`del TTG del sujeto normal y con DM.

2.- Compare las curvas obtenidas e interprételas.

CURVA DEL T.T.G.

3.-Explique la formación de Cu2O en la orina del sujeto con DM.

--------------------------------------------------------- ------------------------------------- --------


Glucosa

mg | dl

Tiempo : minutos



El sujeto diabético se caracteriza por presentar alteración del metabolismo de los carbohidratos, proteínas y de los lípidos. La lipólisis produce

una elevación de los ácidos grasos libres y consecuentemente el incremento de cuerpos cetónicos. La cetonemia ocasiona una disminución

del pH sanguíneo lo cual ocasiona una disminución de la concentración del HCO3- sanguíneo. ( Acidosis diabética)

DETERMINACIÓN DEL BICARBONATO

FUNDAMENTO:

El CO3H sérico o plasmático es neutralizado con HCl desprende CO2. El ácido que no reacciona se determina a través de una titulación con

NaOH, obteniéndose por diferencia la concentración de HCO3-

PROCEDIMIENTO

Se usa suero o plasma obtenido en anaerobiosis , empleando aceite mineral en el momento de su obtención.

I. NEUTRALIZACION DEL BICARBONATO

Colocar en un beacker o matraz los siguientes componentes:

a) 5 ml de HCl 0.01N

b) 1 ml de suero ó plasma

c) 1 gota de alcohol caprílico.

d) Agitar suavemente por rotación por 2’

e) Incubar 15’ a 37°C

f) Añadir 20 ml agua destilada hervida y fría.

g) Añadir 3 gotas del colorante fenosulfonthaleina (PSP).

II. TITULACION

Usando una bureta, agregar solución de NaOH 0.01 N hasta que el color del colorante cambie de color amarillo (ph 6.8) al rosado (ph

8.2)

III. EXPRESION

Calcular los m Eq/L del sujeto normal y compararla con un sujeto diabético descompensado

VN= 26-32 m Eq/L

IV. CETONURIA

FUNDAMENTO

La presencia de cuerpos cetónicos se determina por el test de Rothera, frente al reactivo de nitroprusiato de Na forma un anillo

púrpura rojizo.

PROCEDIMIENTO

En un tubo de prueba colocar

a) 1 ml orina

b) 1 gr de SO4(NH4)2

c) 3 gotas de nitroprusiato de Na al 10%

d) Mezclar

e) 1 ml de NH4 (OH) en zona

Observar:

Aparición de un anillo púrpura o morado = (+)





INFORME DE PRACTICA N. 7

Nombre del alumno(s) ......................................................................................

Grupo ..............................................

DETERMINACIÓN DE BICARBONATO

1. Calcule los mEq/L de HCO-3 del sujeto normal

2. Calcule los mEq/L de HCO-3 del sujeto D.M.

3. Compare e interprete los resultados.

DETERMINACION DE CETONURIA

COMENTARIO

1. Explique la disminución del bicarbonato en el sujeto diabético

2. Interprete, la formación del anillo rojo-violáceo (test de rothera) en la orina del sujeto diabético.

--------------------------------------------------------- ------------------------------------- -----------




La enfermedad cardiaca coronaria ( E.C.C.) sigue siendo la principal causa de morbilidad prematura. Un factor de riesgo importante es el

incremento del colesterol plasmático. Sin embrago el colesterol por si mismo no es un elemento de predicción en el paciente individual. Otros

parámetros lipídicos como el HDL y triglicérido también son necesarios para cuantificar el riesgo de ECC con mayor precisión.

Aplicando la formula de Friedewald podemos calcular las otras lipoproteínas séricas VLDL y LDL que completan la información de predicción de

alteración vascular.

OBJETIVO

a) Determinar la concentración de colesterol total, triglicérido, HDL, LDL y VLDL.

b) Determinar el RC a través del perfil lipídico ( según Castelli )

DETERMINACION DE COLESTEROL TOTAL

Fundamento

El colesterol se determina por acción de la enzima colesterol éster hidrolasa y colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los esteres de

colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre produciéndose peróxido de hidrogeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona

con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe 505nm.

Colesterol ester CEH Colesterol + ácidos grasos

Colesterol + O2 CHOD Colest-4-en-3-ona + H2O2

2H2O2 + 4-AAP + p-HBA PAP Comp. Coloreado + 4H2O

Tubo N° Blanco Standard Muestra 1 Muestra 2

St-Colesterol: 200 mg/dl - 30 ul - -

Suero –Pb - - 30 ul 30 ul

Reactivo Color 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml

Mezclar. Incubar 10 minutos a 37°C o 20 minutos a T°ambiente

Leer en espectrofotómetro el St y Pb frente al BL a 505 nm.

Expresión

Haciendo uso del factor de Calibración, expresar el colesterol en mg/dl :

VN = 160 - 200 mg / dl



DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS

Fundamento

Los triglicéridos presentes en la muestra, según las reacciones acopladas descritas a continuación, son un complejo coloreado que se cuantifica

por espectrofotometría.

Triglicéridos + H20 lipasa Glicerol + ácidos grasos

Glicerol + ATP Glicerol-Kinasa Glicerol-3-P + ADP

Glicerol – 3 – fosfato + O2 GPO Dihidroxiacetona fosfato + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol Peroxidasa Quinonaimina

Esquema


St-Triglicérido: 200 mg| dl - 30 ul - -

Suero -Pb - - 30 ul 30 ul

Reactivo Color 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml

Agitar. Incubar 10 minutos a 37°C o 20 minutos a T° ambiente

Leer en espectrofotómetro el St y Pb frente al BL a 520 nm.

Expresión

Haciendo uso del factor de Calibración, expresar los triglicéridos en mg/dl :

VN = 60 - 200 mg / dl

DETERMINACION DE COLESTEROL - HDL

Fundamento del Método

El HDL - Colesterol es obtenido precipitando selectivamente las lipopotreínas LDL y VLDL, quedando el primero en solución.

El HDL - Colesterol en solución se determina por acción de las enzimas Colesterol ester hidrolasa y Colesterol oxidasa. La primera libera el

colesterol de los ésteres de colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre, produciéndose peróxido de hidrógeno, el cual en presencia de la

enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe a 505 nm.

Colesterol ester CEH Colesterol + ácidos grasos

Colesterol +O2 CHOD Colest-4-en-3-ona + H202

2H2O2 + 4-AAP + p-HBA PAP Comp. Coloreado + 4H2O



Técnica

Precipitación: Agregar en un tubo de centrífuga 0.5 ml de reactivo precipitante y 0.2 ml de muestra, mezclar y esperar 15 minutos a temperatura

ambiente. Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. o 3 minutos a 10.000 r.p.m

Colorimetría.-

LLevar el reactivo colesterol CHOD- PAP a la temperatura que se realizara el ensayo.


Sobrenadante (ml) - - 0.30 0.30

Standard (ml) - 0.03 - -

Reactivo (ml) 3.00 3.00 3.00 3.00

Mezclar e incubar 10 minutos a 37° o 20 minutos a temperatura ambiente (20 a 25° C). Leer las absorbancias a 505 nm. llevando a cero el

espectrofotómetro con el blanco del reactivo. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos.

Cálculos.-

HDL-Colesterol : (mg%)=F.D. x D.O. Pb

FD =76.5/D.O standard

Ecuación de Friedewald:

VLDL (mg/dl) = TG

5

Esta fórmula es válida cuando los Tg son menores de 400 mg/dl.

Observaciones

- Después de centrifugar, el sobrenadante debe ser claro.

- Sueros con concentraciones de triglicéridos superior a 1000 (mg/dl) deben diluirse con suero fisiológico antes de precipitar. El

resultado obtenido se multiplica por el factor de dilución.

Interpretación del Perfil Lipídico Mínimo

LIPIDO

(mg/dl)

DESEABLE RIESGO POTENCIAL ALTO RIESGO

CT < 200 200-239 >= 240

LDL < 130 130-159 >= 160

HDL : Hom : > 35 25-35 < 25

Muj : > 45 40-45 < 40

TG < 200 > 200 > 200 (*)

(*) Si se acompaña de HDL < 35 mg/dl o relación CT/HDL >5

LDL-C (mg/dl)=C.Tot.(mg/dl)-HDL(mg/dl)-VLDL. (mg/dl)




Nombre del Alumno(s)--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Grupo: ----------------------------------------------------------------------- Fecha: ---------------

1. Calcular , en el sujeto normal y patológico , la concentración en mg/ dl del :

C T :

T G :

H D L :

L D L :

VLDL :

2. Calcular el R. C.:

CT/HDL :

LDL/HDL :

3. Describa el perfil electroforético de las lipoproteínas plasmáticas:

Origen

( - ) ( + )

--------------------------------------- ---------------------------------------------------------- --------------




Las alteraciones del Metabolismo de la bilirrubina pueden evaluarse haciendo su dosaje en suero o plasma sanguíneo en forma fraccionada.

Dichas alteraciones se deben a:

1. - Aumento de la producción del pigmento (hemólisis: incremento de la destrucción de los hematíes circulantes)

2. - Disminución de la captación hepática de la bilirrubina (medicamentosa, síndrome de Gilbert, déficit de glucoronil transferasa).

3. -Alteración de la conjugación hepática, disminución de la actividad de la glucoronil transferasa – ictericia neonatal (ictericia fisiológica del recién

nacido).

4. - Excreción deficiente (obstrucción intrahepática o extrahepática – cálculos).

Por último permite el estudio de las enfermedades hepatocelulares: hepatitis o cirrosis, enfermedades en las cuales suelen estar interferidas

todos los pasos del metabolismo de la bilirrubina (captación conjugada y excreción).

OBJETIVO:

a) Determinar la concentración de Bilirrubina Total, Directa e Indirecta

b) Determinar Urobilinógeno y Urobilinas

Método de Malloy y Evelyn

Fundamento:

La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo – violáceo (azobilirrubina) que se

mide fotocolorimétricamente a 530 nm.

Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia

de un desarrollador acuoso que posibilite su reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada)

presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción.

VALORES NORMALES:

BT = 0.3 – 1.1 mg/dl

BD (Conjugada) = 0.1 – 0.4 mg/dl

BI = 0.2 – 0.7 mg/dl

PROCEDIMIENTO:

Preparar St. 2mg% .D.O. st =0.09

Blanco Directa Total

Muestra 200 ul 200 ul 200 ul

Agua Destilada 2.4 ml 2.4 ml -

Desarrollador - - 2.4 ml

Reactivo sulfanílico 200 ul - -

Diazorreactivo - 200 ul 200 ul

Mezclar por inversión suave e Incubar por 5 minutos a T° ambiente. Leer las absorbancias a 530nm, llevando a cero el instrumento con un

blanco de agua destilada. La bilirrubina directa debe leerse exactamente a los 2 minutos.

CALCULOS:

FC = Conc. St

Abs St.

BT = FC x (Abs Total – Abs Blanco) = mg/dl

BD = FC x (Abs Directa – Abs Blanco) = mg/dl

BI = BT – BD = mg/dl



Determinación de Urobilinógeno y bilirrubina em orina:

REACCION DE EHRLICH

En un tubo de prueba se colocan 5 ml de orina. Se añade 0.5 ml de reactivo de Ehrlich.

Si hay urobilinógeno en cantidad anormales, a los 3 minutos se presenta un color rojo cereza.

REACCION DE GMELIN

En un tubo de prueba se coloca 2 ml de orina y con una pipeta se hace

llegar al fondo 2 ml de acido nítrico nitroso, procurando que se forme

dos capas.

En la líneas de unión aparecen una serie de colores, comenzando con verde

que luego puede cambiar a azul, violeta, anaranjado, si existe bilirrubina en la orina. En la orina normal solo aparecen bandas

de color anaranjado o bruno, debido a la oxidación del urocromo.




Nombre del Alumno(s): --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Grupo: ----------------------------------------------------------------------- Fecha: ---------------

1. Calcule los mg/dl de Bilirrubina Total, Bilirrubina Directa y Bilirrubina Indirecta en cada sujeto estudiado

2. Explique bioquímicamente, la reacción de conjugación de la bilirrubina directa

3. Indique cuales son los pigmentos biliares

--------------------------------------- ---------------------------------------------------------- --------------




La reacción de transaminación consiste en la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un cetoácido con la consiguiente formación de

nuevos aminoácidos y cetoácidos. El objetivo es entender como el organismo a través de este proceso los carbohidratos se transforman en

aminoácidos o como los aminoácidos se interconvierten.

Las enzimas que catalizan estas reacciones se llaman transaminasas, que tienen como coenzima al fosfato de piridoxal (B6). La glutámico

pirúvico y oxal- acético son de importancia en el diagnóstico de enfermedades hepáticas y cardiacas toda vez que se produce aumento en el

torrente circulatorio tras la muerte celular del órgano.

COOH COOH

| |

CH2 CH2

| |

CH2 CH2

| |

HC-NH2 C=O

| |

Ac. Glutámico COOH COOH Ac. Cetoglutarato

PO4B6

COOH GLUTAMICO

OXALACETICA COOH

| TRANSAMINASA |

CH2 CH2

| |

C=O HC-NH2

| |

Ac. Oxalacético COOH COOH Ac. Aspártico

1) REACCION DE TRANSAMINACION

Para demostrar la reacción de la transaminación, se extraerá la enzima de homogenizado de hígado de pollo y se aplicará a el siguiente

esquema :

Tubo N° 1 1 2

PIRUVATO 0.2 M (ml) 0.3 0.3

GLUTAMATO 0.2 M (ml) 0.3 0.3

ARSENITO 0.2 M (ml) 0.4 0.4

ENZIMA ACTIVA 0.2 M (ml) 0 1

ENZIMA INACTIVA 0.2 M (ml) 1 0

Incubar a 37° x 45min . Agregar 6 ml. alcohol etílico en cada tubo centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografía.

Demostrar si hubo transaminación, utilizando el proceso de cromatografía ascendente.



2) EVIDENCIA DE LA TRANSAMINACION POR CROMATOGRAFIA:

Cromatografía ascendente en placas con Silicagel:

Por cromatografía en capa fina se entiende la técnica capaz de separar los componentes de una muestra entre dos fases, una móvil, que suele

ser líquida y otra estacionaria, que puede ser líquida o sólida, y que está dispuesta como una capa de material poroso de un espesor

determinado, colocada sobre un soporte plano inerte, de vidrio o de aluminio. Dos principios fisico-químicos participan en esta separación:

partición por solvente y adsorción.

Los aminoácidos Alanina, Ac. Aspártico, y Ac. Glutámico, se van a separar en función de sus diferentes solubilidades entre la fase móvil líquida,

constituida por propanol:agua (80/20), y la fase estacionaria, también líquida al estar constituida por el agua adsorbida por el material sólido de la

capa fina, en este caso celulosa.

Por tanto, el fundamento de la separación implica que los aminoácidos cuya cadena lateral (R) tenga un carácter más apolar, tendrán tendencia

a desplazarse con la fase móvil, mientras que los aminoácidos que sean polares, ya sean con carga o sin carga, serán retenidos por la fase

estacionaria. Ello es así, porque la fase móvil está formada por solventes que son más apolares que el agua, que es el solvente de la fase

estacionaria.

2. ¿Cómo realizar una cromatografía en capa fina?

Primera etapa: Aplicación de las muestras a analizar.

La primera precaución que hay que tener en el manejo de la placa

es la de procurar no tocar con los dedos la capa de celulosa. La

placa fina se coge siempre por los bordes de la misma.

Se coloca la placa encima de la mesa, y con un lápiz se traza una

línea muy débil a unos 1,5 cm del borde inferior de la placa,

procurando dañar lo mínimo posible la capa de celulosa.



En la línea se señalan débilmente cuatro puntos, distribuidos equitativamente a lo ancho de la placa.

En cada punto de ellos se aplica cada uno de los muestras: patrón o standares y las muestras problemas con probable transaminación. La

aplicación se realiza mediante capilares.

La segunda precaución a considerar es la de no contaminar las disoluciones de los aminoácidos patrón y la muestra problema. Para ello, se

utiliza un capilar para cada uno de las soluciones a aplicar. El capilar se introduce en el tubo de muestra y por capilaridad va a ascender la

muestra a aplicar.

Se aplica en la placa una gota de la muestra, procurando que se extienda lo menos posible y no dañe la capa. Se seca a continuación con el

secador de aire. Se aplica una segunda gota y se vuelve a secar. Esta operación se repite para cada unas de las tres muestras restantes.

Segunda etapa: Elución de las muestras.

La cromatografía se realiza en la cubeta o cámara de desarrollo. La cubeta contiene un volumen de fase móvil, cuya altura de líquido debe de

estar siempre por debajo de la línea de aplicación de las muestras.

La técnica de elución que se va a utilizar para la realización de la cromatografía es la ascendente, puesto que la fase móvil asciende por

capilaridad por los poros e intersticios de la celulosa.

La placa que contiene las muestras se introduce en la cubeta. Se coloca la tapa de la cubeta y se espera que la fase móvil ascienda por la capa

hasta que alcance una altura de hasta unos 2-3 cm del extremo opuesto a la parte sumergida. Una vez realizada la elución, se abre la tapa de la

cubeta y se saca la placa.



Tercera etapa: Secado y visualización de los aminoácidos.

Inmediatamente que se ha sacado la placa, con el lápiz se marca en un borde el nivel alcanzado por el solvente y que constituye el frente

de solvente (FS). Se introduce en la estufa durante unos 5 min para que se seque. A continuación, con ayuda de un pulverizador y una

solución de ninhidrina al 0.1% en butanol visualizar los aminoácidos estandart y de la muestra problema.

Calculo de los valores del Rf.

Rf = distancia (cm) recorridos por la sustancia

distancia (cm) recorridos por el solvente (FS)




Nombre del Alumno(s): --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Grupo: ----------------------------------------------------------------------- Fecha: ---------------

PROCESO DE TRANSAMINACIÓN:

1.- Indique, la reacción de transaminación producida en la práctica realizada

2.- Medidas de los Rf, identificación de aminoácidos en las cromatoláminas obtenidas e interpretación de los resultados

3.- Qué relación existe entre las transaminasas y las enfermedades hepáticas?

4.- Como se encuentran las transaminasas en el infarto agudo de miocardio?

Discusión y/o comentarios

--------------------------------------- ---------------------------------------------------------- --------------






El objeto de la presente práctica es evaluar el metabolismo proteico empleando el Balance Nitrogenado. Explicaremos los

parámetros mas representativos de la excreta nitrogenada en general.

Se evalúa los egresos de N mediante el nitrógeno ureico urinario en 24 horas y la excreción de nitrógeno proteínico urinario en

24 horas empleando la formula de nitrógeno total estimado (NTE).

FORMULA:

BN = N INGERIDO – ( NTE + 2 )

NTE = g. N. UREICO + g. N.CREATININICO

2 = Excreción fecal (g / 24 hrs.)

N. Ingerido = g. de proteínas

6.25

Nota : Si el paciente presenta Albuminuria,

añadir a la excreta : Proteína urinaria

6.25

PROCEDIMIENTO:

DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA.-

FUNDAMENTO:

La creatinina en presencia del ácido pícrico en medio alcalino forma un complejo de color amarillo anaranjado cuya intensidad

de color es proporcional a la concentración de creatinina.

(R. JAFFE).

N° TUBO BL ST Muestra 1 Muestra 2

ORINA 1/10 ml 0.04 0.04

AGUA ml 0.8 0.2 0.8 0.8

St. 1.5 mg/dl ml 0.2

R. Pícrico ml 1.6 0.8 1.6 1.6

Buffer Alcalino ml 0.4 0.2 0.4 0.4

Incubar a Tº ambiente por 20 min.y leer las Absorbancias a 505 nm.

Urinario 24 hs. Urinario 24 hs.



Calculo:

Cr.Orina (mg/dl)=Abs. Muestra x 150

Abs. standard

Cr.Urinaria 24 hs = Cr.Orina (mg/dl) x Vol 24h(L) x 10

N Creatinínico en 24 hs.= Cr.Urinaria 24hs x 0.37

VN = 0.8 a 1.5 g. en 24hs

DETERMINACION DE UREA URINARIA.-

FUNDAMENTO:

La urea presente en la muestra, es desdoblada a amonio por acción de la enzima ureasa, según la proposición de Faucett y

Scott.

NH2

CO + 2H2O UREASA 2NH3 + CO2 + H2O

NH2

El amonio producido reacciona con salicilato e hipoclorito en medio alcalino, formándose un complejo de color verde; la

intensidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra y su absorvancia se

lee a 600nm (580 - 620).

TÉCNICA:

Preparación Reactivo de trabajo.-

Mezclar 1 ml. de Reactivo Salicilato + 1 gota (50uL) de Suspensión Ureasa. Preparar el volumen de reactivo necesario

manteniendo la proporción (p.e. 30 ml. Reactivo Salicitato + 30 gotas (1.5 ml.) de Suspención Ureasa). Mantener protegido de

la luz.

El Reactivo de trabajo es estable por 30 días entre 2° y 8° C y protegido de la luz. Mantener en frasco color ambar.

Técnica: Nitrógeno Ureico en orina.

N° TUBO Blanco Standard Muestra 1 Muestra 2

Orina:1/100 (ml) 0.02 0.02

St:66mg/dl (ml) 0.02

Reactivo de trabajo (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar incubar 3' a 37°C o 5’ a T° ambiente

Reactivo de Hipoclorito (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar incubar 5' a 37°C o 10’ a T° ambiente

Leer las Absorvancia a 600 n.m.

Expresión: mg urea/24 hs.



Cálculo:

a) Factor = 66

D.O. St

b) Urea Ur/24h= Factor x D.O. Pb x 100x Vol.24 hs(ml)

100

c) Nitrógeno Uréico 24hs.= Urea Ur/24hs x 0.455

RANGO DE REFERENCIA

UREA : 15 a 30g /24hs.

N. URÉICO : 7 a 14g /24hs.

BN = Ingesta Nitrogenada - [N uréico + N creatinínico + 2]

BN = g N / 24hs

VARIACIONES EN ALGUNOS CONSTITUYENTES

NITROGENADOS URINARIOS CON DIFERENTE INGESTA

PROTÉICA

Dieta Proteica normal

(mixta)

Dieta rica en Proteínas Dieta pobre en

Proteínas

g. %N g %N g %N

N. Urinario Total 13.2 100 23.28 100 4.2 100

N. Proteico 82.5 145.5 26.25

Urea (N) 11.36 86.1 20.45 87.9 2.9 69.1

Amoniaco (N) 0.4 3.0 0.82 3.5 0.17 4.0

Creatininico (N) 0.61 4.6 0.64 2.7 0.6 14.3

Urico (N) 0.21 1.6 0.3 1.3 0.11 2.6

N indeterminado 0.62 4.7 1.07 4.6 0.42 10.0





Grupo: ---------------------------------------------------------------------- Fecha: ---------------

Determine el Balance Nitrogenado del sujeto Normal y del paciente empleando la siguiente fórmula:

BN = Ingesta Nitrogenada - [gN uréico + gN creatinínico + 2]

INTERPRETACIÓN Y DIAGNOSTICO NUTRICIONAL:

------------------------------------ -------------------------------------- -----------




INTRODUCCION.-

- Utilizamos el metabolismo proteico (síntesis y degradación) para evaluar el estado nutricional de una

persona.

- Señalamos didácticamente dos compartimientos de distribución de las proteínas en el organismo:

a) Compartimiento Proteico Visceral.

b) Compartimiento Proteico Somático o esquelético.

Las proteínas del compartimiento visceral se evalúan mediante los niveles de Transferrina, Pre-Albúmina, Proteína

Total y Albúmina en suero, que por su relativamente corto tiempo de vida (Albúmina 20 días) rinde una estimación

razonable del compartimiento proteico visceral. En esta práctica utilizaremos la Proteína total y Albúmina sérica.

Las proteínas del compartimiento somático esquelético la evaluaremos mediante la excreción de la creatinina urinaria

24 hrs./Talla, relación que es fiel índice de masa muscular esquelética.

Asi mismo mediremos el Peso y la Talla para evaluar la masa corporal total.

1) DETERMINACION DE LA PROTEINA TOTAL.-

Fundamento:

Las proteínas en presencia del reactivo de Biuret forman un complejo Biuret cuprosódico color azul violeta, que indica

la presencia de enlaces peptídicos, cuya intensidad de color es proporcional a la concentración de proteína en la

muestra.

BL Muestra 1 Muestra 2 St

Agua destil. 20 ul

Suero 20 ul 20 ul

St. Prot. Tot 5.7 g/dl 20 ul

R. Color 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml

Mezclar. Incubar 10 min a 37° C o 20 min a T° ambiente. Leer 540 n.m.

Cálculos : Factor de Calibración y Concentración del Problema.

Valores Normales : 6-8 g/dl

2) DETERMINACION DE ALBUMINA SERICA.-

BL Problema Problema St

Agua destil. 20 ul

Suero 20 ul 20 ul

St. Albúmina 3.3 g/dl 20 ul

R. Color 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml



Mezclar. Incubar 3 min a Temperatura ambiente. Leer 620 nm.

Cálculos : Factor de Calibración y Concentración del Problema.

Valores Normales : 3.5 a 4.7 g/dl

3) DOSAJE DE CREATININA URINARIA..-

Empleáremos el mismo método usado para la creatinina urinaria de la práctica anterior. Dividir la excreción urinaria

24 hs. entre la Talla.

N° TUBO BL ST Muestra 1 Muestra 2

ORINA 1/10 ml 0.04 0.04

AGUA ml 0.8 0.2 0.8 0.8

St. 1.5 mg/dl ml 0.2

R. Picrico ml 1.6 0.8 1.6 1.6

Buffer Alcalino ml 0.4 0.2 0.4 0.4

Incubar a Tº ambiente por 20 min.y leer las Absorvancias a 505 nm.

Calculo:

Cr.Orina (mg/dl)=Abs. Muestra x 150

Abs. standard

Cr.Urinaria 24 hs = Cr.Orina (mg/dl) x Vol 24h(L) x 10

Muestra 1:

Muestra 2:

Peso :

Peso :

Talla :

Talla :

Relación :

Relación :

Vol. Orina/24 h =

Vol. Orina/24 h =



Nomograma de Valoración del Estado Nutricional

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Grupo: ---------------------------------------------------------------------- Fecha: ---------------

En el nomograma de valoración del estado nutricional, marque :

El Indice Cr. Ur. / 24hs / Talla encontrado o interprete el diagnóstico del paciente.

El Indice Peso / Talla encontrado e interprete el resultado.

El Indice Prot. Tot. Sérica y albúmina Sérica encontrado e interprete.

DIAGNOSTICO FINAL.

------------------------------------ -------------------------------------- -----------




Debido a que el estado nutricional del paciente juega un papel importante para determinar su

capacidad de tolerancia a la cirugía y a otros procedimientos terapéuticos, la adecuada evaluación

del estado nutricional es de gran importancia. Las siguientes mediciones son valiosas en la

determinación del estado del paciente:

A. DIAGNOSTICO CLINICO.

Los mejores elementos para un correcto diagnostico nutricional son una buena historia

clínica nutricional y un buen examen físico. Ayuda de manera especial, el consignar en la

anamnesis el estado socio-económico del enfermo y de los antecedentes patológicos,

especialmente la presencia de enfermedades debilitantes crónicas como la tuberculosis

pulmonar, diabetes mellitus, infecciones o parásitos intestinales.

Es importante consignar la historia dietética con una apreciación semicuantitativa de la

ingesta calórico y proteica; el peso habitual en el estado de salud y el peso actual en estado de

enfermedad, la fecha de inicio de la enfermedad, así como la fecha de inicio de síntomas que se

asocian a la desnutrición, a saber; anorexia, nauseas, vómitos o diarreas. Se debe anotar

también la presencia de depresión como factor anorexigeno y la actitud familiar frente a la

enfermedad, desde que la rehabilitación debe ser psicológica y orgánica.

Completa el diagnostico de desnutrición el examen físico. La flacidez es características, con

perdida de grasa y de la masa muscular de la cara, ojos hundidos que aparecen de mayor

tamaño El tórax adelgazado, con atrofia mamaria y desaparición del tejido graso y muscular,

se observan las costillas y dificultad en los movimientos respiratorios. El abdomen mostrara

hepatomegalia, edema, ascitis.

B. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO.

B.1 Métodos Antropométricos.

B.1.1 Peso Corporal.- Los individuos cuyos estados nutricionales sean cuestionables deben

ser pesados (peso actual), debiendo además buscarse en las tablas pertinentes el peso ideal

que corresponde a su talla. El peso ideal varia para una misma tala de acuerdo al sexo.

Mediante la confrontación del peso actual del paciente con su peso ideal se puede

obtener el porcentaje del peso corporal ideal, utilizando la siguiente fórmula:

Peso actual

% Peso Ideal = X 100

Peso ideal



Se comparara este valor con la tabla 1. Esto nos dará el estado nutricional del

paciente. Debe recordarse, sin embargo, que el edema es uno de los efectos de la

malnutrición proteica y puede falsear una apreciación cuantitativa.

La integridad orgánica y funcional del organismo no se compromete durante

perdidas medianas de peso y el equilibrio del organismo se restituye espontáneamente. Las

perdidas extremas de peso, que suceden en enfermedades graves medicas o quirúrgicas se

acompañan de una mortalidad elevada, así por ejemplo: la mortalidad de un paciente que

sufre una pérdida de peso de 20% o más es el 37%, es contraste con el 3.5% en pacientes

con pérdidas de peso al 20%.

Valor Standard Estado Nutricional

> 120 % - Obesidad

110-120 % - Sobrepeso

90-110 % - Normal

80-90 % - Desnutrición leve

70-80 % - Desnutrición moderada

< 69 % - Desnutrición grave

PESO IDEAL SEGÚN TALLA HOMBRES

Talla Peso Talla Peso Talla Peso

(cm) (Kg) (cm) (Kg) (cm) (Kg)

1.45 51.9 1.59 59.9 1.73 68.7

1.46 52.4 1.60 60.5 1.74 69.4

1.47 52.9 1.61 61.1 1.75 70.1

1.48 53.5 1.62 61.7 1.76 70.8

1.49 54.0 1.63 62.3 1.77 71.6

1.50 54.5 1.64 62.5 1.78 72.4

1.51 55.0 1.65 62.9 1.79 73.3

1.52 56.6 1.66 64.0 1.80 74.2

1.53 56.7 1.67 64.6 1.81 75.0

1.54 56.8 1.68 65.2 1.82 75.8

1.55 57.2 1.69 65.9 1.83 76.5

1.56 57.9 1.70 66.5 1.84 77.3

1.57 58.6 1.71 67.3 1.85 78.1

1.58 59.3 1.72 68.0 1.86 78.5

Evaluación de Peso Corporal



PESO IDEAL SEGÚN TALLA MUJERES

Talla Peso Talla Peso Talla Peso

(cm) (Kg) (cm) (Kg) (cm) (Kg)

1.40 44.9 1.50 50.4 1.60 56.2

1.41 45.4 1.51 51.0 1.61 56.9

1.42 45.9 1.52 51.5 1.62 57.6

1.43 46.4 1.53 52.0 1.63 58.3

1.44 47.0 1.54 52.5 1.64 58.9

1.45 47.5 1.55 53.1 1.65 59.5

1.46 48.0 1.56 53.7 1.66 60.1

1.47 48.6 1.57 54.3 1.67 60.7

1.48 49.2 1.58 54.9 1.68 61.4

1.49 49.8 1.59 55.5 1.69 62.1

B.1.2.Indice de Masa Corporal (IMC).- Esta medida es la que predice mejor el porcentaje

de grasa corporal. Anteriormente para el diagnóstico de obesidad se consideraban la edad,

estatura, sexo y peso corporal; ahora se acepta el IMC que se obtiene dividiendo el peso

(Kg) entre la altura al cuadrado (m2):

IMC= P/A2

Un IMC entre 25 y 30 se considera como “sobrepeso”, y por arriba de 30 como

“obesidad”. El sobrepeso indica simple aumento de la masa corporal; en cambio de la

obesidad representa un exceso de grasa corporal por depósito de triglicéridos en los

adipocitos.

IMC Kg/m2 Estado Nutricional

> 40 - Obesidad mórbida

35 – 39.9 - Obesidad severa

30 – 34.9 - Obesidad moderada

>25 – 30 - Sobrepeso

> 19 – 25 - Normal

17 – 19 - Desnutrición leve

16 _ 16,9 - Desnutrición moderada

< 16 - Desnutrición grave



B.1.3. Almacenamiento de Lípidos.- La medición del pliegue cutáneo del tríceps arroja un

estimado del almacenamiento corporal de lípidos. La medición se realiza con calibraciones.

Deben tomarse tres medidas y promediarse los resultados.

PLIEGUE SUBCUTANEO DEL TRICEPS

Acromion

Olecranon



Adulto (mm)

Espesor del pliegue del Triceps (EPT)

Standard

90%

Standard

80%

Standard

70%

Standard

60%

Standard

Hombre

Mujer

12.5

16.5

11.3

14.9

10.0

13.2

8.8

11.6

7.5

9.9

B.1.4. Masa Magra Corporal.- Representa a la masa corporal total exenta de grasa. En

otras palabras la masa músculo-esquelética, la que puede ser determinada mediante dos

métodos:

- circunferencia muscular del brazo (CMB)

- índice de creatinina urinaria (método bioquímico).

Circunferencia Muscular del Brazo.- Se mide toda la circunferencia de la parte superior

del brazo no dominante, tomando el punto medio del mismo. Por la presencia de la capa de

tejido adiposo subyacente se modifica esta medida de acuerdo a la siguiente formula:

CMB = CB – (3.14 x PCT)

CMB: circunferencia muscular del brazo, en cm.

CB: circunferencia del brazo, en cm.

PCT: pliegue cutáneo del tríceps, en cm.

Luego se usa la tabla para calcular el grado de depleción.



CIRCUNFERENCIA DEL BRAZO (cm)

Standard

90%

Standard

80%

Standard

70%

Standard

60%

Standard

Hombre

Mujer

29.3

28.5

26.3

25.7

23.4

22.8

20.5

20.0

17.6

17.0

CIRCUNFERENCIA MUSCULAR DEL BRAZO (cm)

Adulto (cm)

Standard

90%

Standard

80%

Standard

70%

Standard

60%

Standard

Hombre

Mujer

25.3

23.2

22.3

20.9

20.2

19.0

17.7

16.2

15.2

13.9

MANEJO DE TABLA DE COMPOSICION DE ALIMENTOS

1) Sujeto de análisis Edad: Peso: Talla:

2) Gasto calórico diaria:

Actividad Horas Kcalorías

Durmiendo

Muy Ligera

Ligera

Moderada

Pesada

Total:

3) Ingesta Calórica y Proteica:

Encuesta Dietética de 24 Hrs:

Desayuno

Alimento Porción(g) Proteína Lípido Carbohidrato



Almuerzo


Cena


Otros


Total Proteínas X 4 Kcal/g = Kcal obtenidas de proteínas

Total Carbohidratos X 4 Kcal/g = Kcal obtenidas de carbohidratos

Total Lípidos X 9 Kcal/g = Kcal obtenidas de lípidos

Kcal obtenidas de proteínas + Kcal obtenidas de carbohidratos + Kcal obtenidas de lípidos



Descripción de algunas preparaciones culinarias autóctonas

Aceitunas preparadas: Las aceitunas se lavan y se cuecen en poco agua con sal, se

aderezan con cebolla, ají, vinagre y aceite.

Ají panca: El ají fresco se pone a secar al sol varios días.

Cancha: Es el maíz uniformemente tostado en una olla de barro con la abertura al costado.

Ccaya (oca helada): La oca fresca es expuesta a la intemperie, a bajas temperaturas,

(“heladas”) por espacio de varios días.

Carne seca de venado: La carne de venado se corta en porciones pequeñas y delgadas

agregándole sal, y luego se pone a secar colgándola de cordeles.

Chancaca: Es el jugo de caña de azúcar, hervido, y concentrado hasta que tome la

consistencia requerida y luego vaciado en moldes

Chaquepa: Es la cebada tostada y molida, pero no siempre cernida.

Chicharrón: Carne de chancho cortada en trozos, con sal y sancochada hasta que se

consume el agua, luego empiezan a freirse los trozos en su propia grasa hasta que se doren

por todos lados.

Chochoca: Es el maíz en grano, semi-cocido en pequeña cantidad de agua y por poco

tiempo, y luego secado al aire.

Chuño: Es una forma indígena de preparación y preservación de la papa, para lo cual se la

coloca en depresiones del terreno por las que corre agua lentamente, allí permanece dos o

tres semanas y luego es secada al aire. Esta operación se efectúa en la época de frío, con lo

cual se consigue una deshidratación por congelamiento.

Chuño negro: Humedecidas las papas, se extiende en campo abierto uno o dos días. Una

vez que se han congelado, se pisan para extraerle toda el agua y parte de la cáscara. Luego

se secan al sol.

Jamón del país: La carne de cerdo se enrolla, se le agrega condimentos y sal, y se amarra;

luego es hervida por espacio de dos horas.

Jora: El maíz colorado se hace germinar hasta conseguir el rote de los granos; a los diez

días hasta “quemar” los brotes debido al calor intenso que se desarrolla. Luego es

enfriado, al aire primero, y secado al sol después. Es la materia prima para elaborar la

Chicha de Jora.

Llunka: Con este nombre se conoce el producto lavado, remojado durante dos horas y

luego sobado suavemente en el batán hasta eliminar la cáscara; enseguida se deja secar al

aire. Se prepara de cebada o trigo.

Machka: Es el producto tostado, sólido y cernido, que se prepara de cebada o trigo.



Maní sancochado: Es el maní en su vaina cocido en agua con sal.

Mote: Es el producto al que se le ha eliminado la cáscara de un modo más completo que en

el caso de la Llunka; para esto se le cuece en una solución de cenizas (generalmente usan

madera de Molle, “Schinus molle”), y luego es sobado fuertemente con la palma de las

manos, enjuagado y secado al aire. El mote de maíz es preparado con una solución de

cenizas más débil y con menor tiempo de cocción que el trigo. Para el mote de cebada la

solución de cenizas es más fuerte y el tiempo de cocción más largo. Con frecuencia se

adiciona cal.

Plátano seco (“orejón”): Es el plátano maduro, pelado, y cortado en rebanadas,

deshidratado parcialmente.

Papa helada: La papa fresca es expuesta a la intemperie a bajas temperaturas (“heladas”)

por espacio de varios días.

Papa seca: Es la papa sancochada, pelada y secada al aire. Posteriormente puede ser

molida o partida en trozos pequeños.

Tocash: Es una forma de preservar el maíz fresco, usada por los indígenas. Consiste en

enterrrar el maíz fresco en el lecho de un arroyuelo a unos 30 o 40 cm. De profundidad,

durante varias semanas. La muestra analizada se extrajo de uno de estos sitios.

Yuca fermentada (“masato”): Las yucas se pelan y se ponen a cocer, luego se muelen, o se

mastican hasta formar una pasta, diluyéndola en el agua de cocción; si no es masticada se

le agrega azúcar. Esta preparación se deposita en tinajas, varios días, para que fermente.



TABLA DE GASTO ENERGÉTICO POR ACTIVIDAD FISICA

TABLA DE COMPOSICIÓN DE LOS ALIMENTOS PERUANOS

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD 2009

http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Tabla%20de%20Alimentos

.pdf

http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Tabla%20de%20Alimentos.pdf

http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Tabla%20de%20Alimentos.pdf



Health & Medicine

Guia de bioquimica_y_nutricion_2016-ii