Upload
dama-kamelijama
View
148
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
Kreatin kinaza - analitika
Predavanja iz Kliničke enzimologije
Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska biohemija
Školska 2013/2014. godina
2
Analitika CK
• Određivanje aktivnosti ukupne CK
• Određivanje izoenzima CK-MB
• Separacija izoenzima CK
– hromatografske metode
– elektroforetsko razdvajanje
– imunohemijske metode
• Rutinske metode određivanja CK-MB
– imunoinhibicija – određivanje aktivnosti CK MB
– Imunohemijske metode određivanje masene koncentracije CK-MB
• Separacija izoformi CK
3
Metode određivanja aktivnosti CK
• Metode: fotometrijske, fluorimetrijske i kuplovane
• Komercijalni testovi koriste kreatin-fosfat kao supstrat
• Oliver, Rozalki:
– cAMP za inhibiciju AK; cistein
• Szasz-ova metoda
• Referentna metoda po IFCC na 37o C
339 nm
4
Određivanje aktivnosti ukupne CK
• Optimizirana metoda određivanja aktivnosti ukupne
CK po IFCC
• Szazsova metoda CK-NAC
– Supstrat: kreatin fosfat
– Povratna reakcija
– pH 6,7
• Uloga Mg jona
• Zaštita SH grupa
• Dodatak NAC N-acetilcisteina
5
Preanalitičke varijacije CK
• Uzorak
– Serum ili heparinizirana plazma
– Drugi antikoagulansi se ne mogu koristiti jer inhibiraju CK
• Stabilnost
– CK u serumu je nestabilna
– 8 sati na ts, 48 sati na 40o C i 1 mesec na -20o C
– Za duže čuvanje na -80o C
– Dodatak NAC i EDTA u reagens-rastvoru reaktivira enzim
• Interferencije
• Uticaj hemolize
– Jak uticaj i slabe hemolize
– Umerena i jaka hemoliza interferira zbog prisustva ATP, G-6-P i
AK u eritrocitima
– Utiču na produženje lag faze i na neželjene reakcije
6
Interferencije u metodi određivanja aktivnosti
ukupne CK
1.Uticaj hemolize
• interferencija adenilat kinaze iz eritrocita
• 2ADP AMP + ATP
• Uklanjanje interferencije
– dodatak inhibitora AK adenozin pentafosfat A5P
2. Interferencija makro formi
• Uklanjanje interferencije
– zagrevanjem jer su one termolabilne
– elektroforetsko razdvajanje
7
Preanalitičke varijacije i referentne
vrednosti za CK
• Uticaj pola, godina, rase, telesna težina, genetika i
fizičke aktivnosti
• Crnci više vrednosti
• Muškarci više vrednosti
– raspodela vrednosti ka višim
RV za IFCC metodu (37o C)
m: 46-171 U/L
Ž: 34-145 U/L
• Bebe imaju više vrednosti pri rođenju zbog traume
skeletnih mišića
• Smanjenje u roku od 6-10 nedelja
8
Referentne vrednosti za CK
• CK aktivnost u serumu normalno odražava
– Uglavnom CK-MM
– Vrlo malo CK-MB
• Uticaj vežbanja i traume mišića
– Povećana aktivnost CK kod fizičke aktivnosti
– Maratonci i CK
– Dobro utrenirani dugoprugaši imaju viši CK-MB
9
Metode separacije i kvantifikacije izoenzima kreatin kinaze
Metode separacije izoenzima
• Hromatografske
• Elektroforetske
• Imunohemijske
Elektroforetske tehnike
• Potporni medijumi: agar, agaroza, celuloza acetat
• Detekcija izoenzima:
• NADPH fluorescentna metoda 360 nm
• NADPH bojena reakcija sa tetrazolijum solima pri čemu nastaje obojeni
formazan
• Denzitometrija fluorimetrije traka izenzima na elferogramu
• Detekcioni limit 2 do 5 U/L
• Detecija abnormalnih traka
10
Elektroforetsko razdvajanje izoenzima i izoformi CK
11
Elektroforetsko razdvajanje izoenzima CK
Denzitometriranje
normalni uzorak 24 sati posle AIM
Dinamika promena izoformi CK-MM kod akutnog
infarkta miokarda
12
Broj sati posle AIM
Odnos izoformi MM3, MM2 i MM1
Porast MM2 posle 6 sati, a MM3 posle 9 sati
Vraćanje na normalu posle 15 sati
13
Određivanje CK-MB imunoinhibicijom
2 faze
I faza
• imunoinhibicija sa antitelima na M subjedinicu
II faza
• Određivanje aktivnosti B subjedinice sa optimiziranom metodom za određivanje aktivnosti ukupne CK po IFCC
Izračunavanje :
• Aktivnost CK-MB = aktivnost B subjedinice x 2
Referentne vrednosti CK-MB:
• < 5 % od ukupne aktivnosti CK
• Interferencija makroformi CK, CK Mt
14
Određivanje masene koncentracije CK-MB
• Nasuprot imunoinhibiciji gde se meri katalitička aktivnost CK-MB,
imunoesej ovde meri masenu koncentraciju CK-MB.
• Metoda koristi sendvič tehniku
– dva antitela
– jedno antitelo je za B subjedinicu
– drugo za M-subjedinicu
• Prvo antitelo je imobilizirano za matriks, a sekundarno je
konjugovano sa enzimom kao markerom
• Metoda je takva da se meri samo CK-MB, a ne ni MM ni BB
• Metode koje mere masu su osetljivije od onih koje mere aktivnost
• Detekcioni limit je 1 μg/L
• Gornja granica RV je 5 μg/L
15
Određivanje masene koncentracije CK-MB
Elisa tehnika
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
anti-CK-B coated tube
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Tagged anti-CK-M
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
POSITIVE
Y Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Substrate