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La Tecnología de Microarrays
en Medicina Reproductiva
Dr. José A.Horcajadas- Investigador ARAID- Investigador de la Fundación IVI, Valencia, Spain- Director Científico de iGenomix, Valencia, Spain- Profesor Asociado de la Univ. De Valencia y Pablo de Olavide deSevilla
IMPLANTACIÓN EMBRIONARIA
DIÁLOGO MOLECULAR
-
Un embrión en estadíode blastocisto
Receptividad endometrial
Para conocer las bases moleculares de la infertilidadPara mejorar los ciclos de estimulación ovárica
Seleccionar el mejor embrión
% EMBARAZO
INTRODUCCIÓN AL ENDOMETRIO HUMANO
14 15 16 17 18 19 20 21
Bergh P, Navot D. Fertil Steril 1992; 58: 537-42
VENTANA DE IMPLANTACIÓN CLÍNICA
LH+7
LH+0
Características del endometrio
receptivo
» Marcadores morfológicos
» Marcadores Bioquímicos
» Patrones de expresión génica
ESTUDIOS HISTOLÓGICOS
Psychoyos Ann N Y Acad Sci 86, Murphy et al Cell Biology Int 1994
LOS CRITERIOS DE NOYES, 1950
Noyes y cols., Fertil Steril 1950; Noyes y cols., Am J Obstet Gynecol 1975
- Li TC, Dockery P, Rogers AW, Cooke ID (1989) How precise is histologicdating of Endometrium using the standard dating criteria. F&S 51:759-63.
- Balasch J, Fabregues F et al., (1992) The usefulness of endometrial biopsyfor luteal phase evaluation in infertility Hum Reprod 7:973-7.
- American Society for Reproductive Medicine (2000) A practice committeereport: optimal evaluation of the infertile female ASRM, 2000:1-6.
- Murray MJ, Meyer WR, Zaino RJ, Lessey BA, et al., (2004) A criticalanalysis of the accuracy, reproducibility, and clinical utility of histologyendometrial dating in fertile women. Fertil Steril 81:1333-43.
- Coutifaris C, Myers ER, et al., (2004) Histological dating of timedendometrial biopsy tissue is not related to fertility status. Fertil Steril 82:456-61.
CRÍTICAS A LOS MÉTODOS HISTOLÓGICOS
MARCADORES BIOQUÍMICOS
From Giudice et al. Trends Endocrinol Metab, 1995
DNA –30 K genes
DESDE EL GENOMA HASTA LA FUNCIÓN
mRNA? Proteínas?
Hitos
Estructura DNA 1953
Código Genético 1961
Proyecto Genoma
1985-2003
Nuevas tecnologías
Microarrays 1995
Secuenc. Masiva 2006
ProcesosBiológicosFuncionesBiológicas
Vida/Muerte
EL ENFOQUE TRADICIONAL VERSUS EL ENFOQUE GENÓMICO
• Por primera vez descrita en 1995 (Schena, Science)
• Basada en la complementariedad de los ácidos nucleicos
• Permite analizar cientos de eventos en un solo experiemento
• El impacto en Ciencia. Miles de publicaciones al año
General
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Year
pu
bli
cati
on
s
General
TECNOLOGÍA DE MICROARRAYS
GENE EXPRESSION PROFILING OF HUMAN ENDOMETRIAL
RECEPTIVITY ON DAYS LH+2 VS LH+7 BY MICROARRAYS
EXPERIMENTAL DESIGN
MICROARRAY
AFFIMETRIX
HG-U95A
12,686 genes
RNA
ISOLATION
TWO ENDOMETRIAL
BYOPSIES
LH+2
LH+7
Riesewijk et al. Molec Human Reprod 9, 253-64, 2003
FIVE WOMEN
CaucasianFertile women with normal cycles23–39 yearsbody mass index:19-25 kg/m2
GENES REGULADOS DURANTE LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN
Up at LH+7 Down at LH+7
Strong (>10) 22 5
Medium (5-10) 47 12
Weak (3-5) 84 41
153 58
Results (>3.0 fc in 4 out of 5)
Riesewijk et al. Molec Human Reprod 9, 253-64, 2003
Principal Component AnalysisLH+2 and LH+7 samples
based on 2000 random genes
LH+2
LH+7
PCA 1
-1500
-1000
-500
0
500
1000
1500
2000
-3000 -2000 -1000 0 1000 2000 3000 4000
11756
9064
8669
9068
9286
9068
11756
8669
9064
9286
GENES DE LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN
Horcajadas et al. Molec Human Reprod 2005 Horcajadas et al., JCEM 20062003
Horcajadas et al., JCEM 2007 Horcajadas et al., JCEM 2008
EXPRESIÓN GÉNICA EN CICLOS NATURALES Y ESTIMULADOS EN LA VENTANA DE IMPLANTACIÓN
EXPERIMENTAL DESIGN
FIVE ENDOMETRIAL
BYOPSIES AT EACH TIME POINT
MICROARRAY
AFFIMETRIX
HG-133A
>22,000 genes
50 WOMEN
CaucasianFertile women with normal cycles23–39 yearsbody mass index:19-25 kg/m2
LH Day 1 2 3 4 5 6 7 8 9
hCG Day 1 2 3 4 5 6 7 8 9
GeneSpring 7.0GEPASHISTOLOGICAL CONTROL:
BLIND DATING BY NOYES CRITERIA
Day LH/hCG+1
PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)
Day LH+1/hCG+1
Day LH/hCG+3Day LH+3/hCG+3
PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)
Day LH/hCG+5Day LH+5/hCG+5
PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)
Day LH+7/hCG+7
PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)
Day LH/hCG+9Day LH+9/hCG+9
PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)
Natural/LH vs IVF across the WOI
PRE-RECEPTIVE
RECEPTIVE
PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA)
BIOLOGICAL PROCESSES FROM DAY LH+1 TO LH+9
COMPARED TO COS CYCLES
1
2
3
1
2
3
GENE CLUSTERING IN NATURAL AND COS CYCLES
34.4% WOI GENES
92%
BIOLOGICAL PROCESSES OF THE 203 DELAYED GENES
BIOLOGICAL TERM Count % PValue
taxis 5 2,67% 0,0437137
cell motility 7 3,74% 0,04103273
blood vessel development 4 2,14% 0,03996548
negative regulation of physiological process 12 6,42% 0,09769689
transport 41 21,93% 0,02625948
positive regulation of apoptosis 6 3,21% 0,02985379
locomotory behavior 5 2,67% 0,04919509
phosphate metabolism 16 8,56% 0,07933242
negative regulation of biological process 15 8,02% 0,03312411
locomotion 7 3,74% 0,04103273
cell death 11 5,88% 0,09003195
localization of cell 7 3,74% 0,04103273
localization 48 25,67% 0,00371126
fructose 6-phosphate metabolism 2 1,07% 0,04132375
organic acid metabolism 10 5,35% 0,08394103
carboxylic acid metabolism 10 5,35% 0,08237153
chemotaxis 5 2,67% 0,0437137
behavior 6 3,21% 0,05876496
positive regulation of programmed cell death 6 3,21% 0,03071029
negative regulation of cellular process 13 6,95% 0,07576561
phosphorus metabolism 16 8,56% 0,07933242
negative regulation of cellular physiological 12 6,42% 0,08059537
cellular physiological process 126 67,38% 0,05501213
development 27 14,44% 0,0787654
angiogenesis 4 2,14% 0,03590782
vasculature development 4 2,14% 0,03996548
response to stress 19 10,16% 0,04424593
negative regulation of cell proliferation 5 2,67% 0,080454
death 11 5,88% 0,09312635
response to chemical stimulus 9 4,81% 0,05742527
cell proliferation 13 6,95% 0,01235572
BIOLOGICAL CONECTIONS AMONGTHE 203 DELAYED GENES
Horcajadas et al., 2008 JCEM
Journal of Clinical Endocrinology of Metabolism2008, 93:4500-4510
Cómo usar esta información en la clínica?
Desde la básica a la clínica
APLICACIONES DE LA
TECNOLOGÍA DE MICROARRAYS
- Para la evaluación de la receptividad endometrial
New England Journal of Medicine 2006;354:2463-72.
Integrando toda esta información para elaborar una herramienta molecular para el dataje endometrial
DATOS DE EXPRESIÓNGÉNICA
INSTITUTO NACIONALDE BIOINFORMÁTICA
BIOINFORMÁTICA APLICADAA GENÓMICA FUNCIONAL
EndometrialEvaluation/Dating
Predictor
EEP or EDP
ERA
15k
Grupo de prueba: 206 + 28 + 76: 310 genes – 17 genes =
293 genes / 738 sondas
Número total de spots:15.744 spots
Control Agilent: 536 spots
Spots útiles: 15.208 spots
8 replicates = 738 x 8 = 5.904 spots
Spots Vacíos= 9.304
8x15K
Endometrial Receptivity Array (ERA)
Prophet
Endometrial Receptivity Array (ERA)
Francisco Esteban, Universidad de Jaén
Sondas LH+7 LH+7 LH+2 Día 9
desconocidoSondas
¿Cómo trabaja un Predictor?
Endometrial Receptivity Array (ERA)Hierarchical clustering
R
NR
Endometrial Receptivity Array (ERA)Gene Ontology
Term over-represented GO level % genesNº
genesGene names per class
adjusted
P-value
inmune response (GO 0006955) BP3 14.94 26DPP4 OPRK1 C3 CRISP3 HLA-DOB C4BPA NR4A2 XCL2 LIF CXCL14 GZMA XCL1 CXCL13
KLRC1 IL15 INDO CD7 BCL6 SERPING1 CLU CTSW GBP2 PSMB10 DEFB1 CFD ARHGDIB4,14E-04
response to stress (GO:0006950) BP3 15.52 27
ADRA2A C3 PROS1 AOX1 C4BPA HPSE DUOX1 SOD2 FGB SCYE1 CXCL14 MAP2K6
RAD54B THBD CXCL13 BARD1 IDH1 ANG BCL6 GPX3 GADD45A SERPING1 CLU
PPARGC1A PENK CFD CDC2
9,49E-03
defense response (GO:0006952) BP3 10.34 18C3 AOX1 CRISP3 C4BPA HPSE SCYE1 CXCL14 GNLY CXCL13 IL15 CD7 BCL6 SERPING1
CLU OFD1 DEFB1 PENK CFD9,76E-03
circulation (GO:0008015) BP3 4.60 8 EDNRB FGB XCL2 CYP2J2 S100A1 SERPING1 EDN3 TH 9,76E-03
response to external stimulus (GO:0009605) BP3 10.34 18C4BPA HPSE FGB XCL2 SCYE1 CXCL14 THBD XCL1 CXCL13 BCL6 SERPING1 CLU
PPARGC1A DEFB1 CFD C3 PROS1 AOX19,76E-03
behavior (GO:0007610) BP3 6.32 11 OPRK1 XCL2 SCYE1 CXCL14 XCL1 CXCL13 MAOA TRH TH DEFB1 PENK 3,36E-02
cell cycle (GO:0007049) BP3 12.07 21HRASLS3 RASSF2 MAP2K6 RAD54B CCNB2 GAS1 PBK BARD1 G0S2 HPGD KIF11 PRC1
ASPM GADD45A IGF2 RPRM DLG7 CORO1A BUB1B CDC2 CDC203,59E-02
cell adhesion (GO:0007155) BP3 10.34 18CRISP3 MUC16 HABP2 CTNNA2 CLDN10 EMCN BCL6 CLDN4 VCAM1 COBL COMP
AMIGO2 THBS2 POSTN SPP1 LAMB3 COL16A1 ARHGDIB4,18E-02
anatomical structure development
(GO:0048856)BP3 2.41 39
POSTN ID4 EVC OLFM1 SPP1 EDN3 LAMB3 TH CRABP2 NR4A2 NDRG2 DUOX1 EDNRB
ALPL EFNA1 IGFBP1 CDA TAGLN LIF HAND2 ADAMTS1 PRKCQ CTNNA2 ENPEP CXCL13
DKK1 LRP4 ANG HEY2 IER3 IL15 EMCN BCL6 CSRP2 HEY1 COBL COMP IGF2 MSX1
4,52E-02
humoral immune response (GO:0006959) BP4 6.02 10 C3 C4BPA NR4A2 XCL1 KLRC1 SERPING1 CLU PSMB10 DEFB1 CFD 7,06E-03
cell-cell signaling (GO:0007267) BP4 13.25 22OPRK1 SLC1A1 HSD11B2 NR4A2 GDF15 EFNA1 XCL2 SCYE1 LIF CXCL14 XCL1 ENPEP
CXCL13 NRG2 MAOA TRH IL15 GABARAPL1 DLG7 EDN3 TH PENK7,06E-03
innate immune response (GO:0045087) BP4 4.22 7 SERPING1 CLU DEFB1 CFD C3 CRISP3 C4BPA 7,90E-03
mitotic cell cycle (GO:0000278) BP4 6.63 11 DLG7 CORO1A BUB1B CDC2 CDC20 CCNB2 GAS1 PBK KIF11 PRC1 ASPM 2,99E-02
response to wounding (GO:0009611) BP4 8.43 14 C4BPA HPSE FGB SCYE1 CXCL14 THBD CXCL13 BCL6 SERPING1 CLU CFD C3 PROS1 AOX1 3,17E-02
oxidoreductase activity (GO:0016491) MF3 18.10 21CBR3 SORD SOD2 IDH1 MAOA KMO CYP2J2 ACADSB INDO HSD11B2 LEPREL1 LAMB3 AOX1
TH CYBRD1 GPX3 HPGD DHRS3 CYP3A5 CP DUOX14,49E-02
carbohydrate binding (GO:0030246) MF3 9.48 11 ADAMTS1 EMCN FAM59A THBD GALNT12 SERPINA5 HABP2 KLRC1 THBS2 ANG POSTN 4,62E-02
receptor binding (GO:0005102) MF4 16.91 23FGB EFNA1 XCL2 SCYE1 IGF2 ANG CXCL14 LIF TRH C3 ADAMTS1 EDN3 SPP1 PPARGC1A
XCL1GABARAPL1 GDF15 CXCL13 GREM2 NRG2 PENK GAST DKK11,52E-02
spindle (GO:0005819) CC10 30.43 7 CDC2 CDC20 KIF11 PRC1 KIF4A DLG7 BUB1B 9,47E-05
spindle microtubule (GO:0005876) CC11 30.77 4 CDC2 KIF11 PRC1 KIF4A 7,29E-04
Endometrial Receptivity Array (ERA)Gene clustering
Endometrial Receptivity Array (ERA)Transcriptomic Signature
Endometrial Receptivity Array (ERA)
Comparison with Histology
FARMACOGENÓMICA
FARMACOGENÓMICA EN CICLOS DE
ESTIMULACIÓN OVÁRICA
Ciclos de estimulación ovárica
FARMACOGENÓMICA
Bajas respondedoras Altas respondedorasNormo respondedoras
OBJETIVO
Nuestra propuesta
Una herramienta predictora del tipo de respuesta frente a los ciclos de estimulación ovárica
Detectar marcadores
COMO? Buscar marcadores e incluirlos en una plataforma diagnóstica
MUESTRAS
Extracción de sangre (3ml en EDTA)
Altas-respondedoras
n=12
Normo-
respondedoras n=12
CONTROLES
Bajas-respondedoras
n=12
MARCADORES
Búsqueda de marcadores
1) Detección alteraciones cromosómicas – Array CGH
2) Detección Polimorfismos – Array SNP
3) Detección mutaciones puntuales en receptores – Secuenciación
4) Analizar variantes de genes metabolismo fármacos - Luminex
DISEÑO SONDAS PARA LUMINEX
ProbeName GeneName LogRat
io
Samples
AK130020 chr01:17104345-17104404 -0.50 FCG-11, FCG-13, FCG-16
chr1:191109994-
191110053
chr01:191109994-191110053 0.78 FCG-14, FCG-16
NEK7 chr01:196555302-196555361 0.61 FCG-11
chr2:131034084-
131034143
chr02:131034084-131034143 0.86 FCG-16
SATB2 chr02:200020740-200020799 0.75 FCG-16
STK36 chr02:219251485-219251544 0.95 FCG-15
C3orf21 chr03:196270291-196270350 1.17 FCG-14
KIAA1680 chr04:92154164-92154223 0.72 FCG-11
chr5:97077666-97077725 chr05:97077666-97077725 1.89 FCG-12
XRCC2 chr07:151982740-151982799 0.43 FCG-11
chr7:152087566-
152087619
chr07:152087566-152087619 -0.56 FCG-14
sep-07 chr07:35886791-35886850 0.55 FCG-14
chr9:115462447-
115462506
chr09:115462447-115462506 1.08 FCG-16
RNF38 chr09:36353448-36353507 0.98 FCG-12, FCG-13, FCDG-15, FCG-
16
ENST00000380027 chr11:5762182-5762241 1.22 FCG-12
SLCO1B3 chr12:20859893-20859952 1.93 FCG-16
chr13:97329413-97329468 chr13:97329413-97329468 1.25 FCG-13
chr14:40704122-40704181 chr14:40704122-40704181 1.27 FCG-11, FCG-15
chr16:58439142-58439201 chr16:58439142-58439201 0.65 FCG-14
HCRT chr17:37589590-37589637 -0.64 FCG-14
CLPTM1 chr19:50174693-50174752 0.79 FCG-12
NPAS1 chr19:52220223-52220282 0.99 FCG-13
AK024373 chr19:737550-737609 0.76 FCG-15
OSBPL2 chr20:60247696-60247755 0.51 FCG-16
chr21:22717037-22717096 chr21:22717037-22717096 0.81 FCG-15
AK093119 chr21:28368917-28368976 -0.63 FCG-15, FCG-16
GSTT1 chr22:22712211-22712266 1.58 FCG-11, FCG-13
Genes comunes
Lista de genes con una sonda
alterada en ambas comparaciones
(muestra con Cy-3 y control con Cy-
5 y viceversa). El color de la muestra
significa: verde= cambio en un
sentido; rojo= cambio en el otro
sentido)
SITUACIÓN ACTUAL
Las –ómicas en Medicina Reproductiva
Transcriptome Proteome Metabolite profiling Pathway identificationGenomic
Preimplantational Genetic DiagnosePharmacogenomicPOF, IF, Repeated Miscarriage
GENOMIC
Endometrial EvaluationPreimplantational Genetic DiagnoseEndometrial diseaseGene Expression markers in bloodSperm analysis for IVF or AI
TRANSCRIPTOMIC
Endometrial evaluationEmbryo selection
PROTEOMICMETABOLOMIC
C. Simón A. Pellicer
