1

Lipaza

Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska

biohemija školska 2014/2015. godina

2

Lipaza

Ciljevi predavanja: • Uloga lipaze • Distribucija • Izoenzimi • Klinički značaj • Analitika

3

Lipaza

• EC 3.1.1.3; triacilglicerol acilhidrolaza; skraćenica LPS

• Lipaza je glikoprotein sa jednim lancem i Mm od 48000 i izoelektričnom tačkom 5,8.

• Gen za LPS je na hromozomu 10

• Koncentracija LPS u pankreasu je

• 5000x veća od koncentracije u drugim tkivima

• Koncentracioni gradijent između

pankreasa i seruma je 20 000x

4

Lipaza

• Za punu katalitičku aktivnost i veliku specifičnost neophodno je prisustvo žučnih soli i kofaktora koji se naziva kolipaza

• Kolipaza mali peptid (10 000) se sekretuje iz pankreasa prema potrebama

• Humana LPS se može u potpunosti aktivirati in vitro pomoću kolipaze i iz drugih vrsta (na primer kolipaza svinje)

• Važno je kod određivanja ovog enzima

• Reagens rastvor: kolipazu i deoksiholat

5

Mehanizam dejstva lipaze • Lipaza je hidrolaza koja katalizuje reakciju hidrolize estara glicerola i to

masnih kiselina dugih lanaca • Samo estarske veze na položaju 1 i 3 (alfa-pozicija) su podložne hidrolizi i

produkt reakcije su 2 mola masne kiseline i 1 mol 2-acilglicerola (beta-monoglicerid) po molu supstrata

• Monoglicerid je rezistentan na hidrolizu • Uzrok sterne smetnje • Spontana izomerizacija u alfa formu (3-acilglicerol) • Hidroliza treće masne kiseline spora hidtroliza

6

Lipaza

• Lipaza deluje samo ukoliko je supstrat emulgovan na međupovršini između vode i supstrata

• Brzina dejstva lipaze zavisi od veličine te površine dispergovanog supstrata

• Žučne soli omogućavaju da ta površina bude slobodna od drugih proteina, uključujući i lipolitičke enzime, oblaganjem površine nesolubilnog supstrata i vodenog medijuma

• LPS prihvata višak supstrat na sledeći način:

• kolipaza se vezuje za micele žučnih soli

• stvara se kompleks kolipaza-žučna so

• rekonfiguracija strukture kolipaze sa ekspozicijom strane sa velikim afinitetom i visokom specifičnošću za LPS

• privlači LPS i vezuje je za površinu supstratu, omogućavajući na taj način delovanje enzima

7

Mehanizam aktivacije triacilglicerol lipaze sa kolipazom

8

Mehanizam aktivacije triacilglicerol lipaze sa kolipazom

9

Lipaza

• Poreklo lipaze u serumu

– najveći deo aktivnosti potiče iz pankreasa

– manji deo iz pljuvačnih žlezda i mukoze želuca, pluća i intestinuma

• LPS je mala molekula koja se filtrira u glomerulima, ali se potpuno reapsorbuje u tubulima i normalno se ne detektuje u urinu.

• Pankreasna lipaza pokazuje dve izoforme

• Postoji i potpuni nedostatak lipaze, kongenitalno oboljenje koje je praćeno malapsorpcijom i teškom steatorejom.

10

Klinički značaj lipaze

• Određivanje lipaze u serumu se koristi u dijagnozi akutnog pankreatitisa.

• Klinička senzitivnost: 80-100 % zavisno od izabrane cutoff vrednosti. • Klinička specifičnost: 80-100 % zavisno od grupe pacijenata koja se

ispituje. • Nakon napada akutnog pankreatitisa:

– aktivnost serumske lipaze se povećava u toku 4 do 8 sati – pik posle 24 sata – smanjuje se posle 8 do 14 dana – koncentracija ostaje povišena duže od amilaze – povećanje od 2 do 50x URL – povećanje u LPS aktivnosti nije proporcionalno težini napada

11

Klinički značaj lipaze • Dijagnoza akutnog pankreatitisa je nekada teška, zato što se mora izvršiti

diferencijalna dijagnoza od drugih akutnih intraabdominalnih bolesti sa sličnim kliničkim nalazima, kao što je perforacija ulcera na želucu ili dvanaestopalačnom crevu, opstrukcija intestinalna ili vaskularna-mezenterična.

• U diferencijalnoj dijagnozi pankreatitisa • Povećanje LPS u serumu veće od 3x URL

– Ukoliko je isključeno oštećenje bubrega

• Poređenje lipaze i amilaze – Veča dijagnostička specifičnost lipaze u odnosu na povećanje aktivnosti amilaze

u serumu

– Koncentracija LPS ostaje duže povišena nego AMY

– Preporuka je da LPS zameni amilazu kao inicijalni dijagnostički test za akutni pankreatitis u urgentnim odeljenjima

12

Klinički značaj lipaze

Dinamika promena lipaze i amilaze nakon akutnog pankreatitisa 1. Veće vrednosti lipaze 3x URL 2. Duže ostaju povišene vrednosti u serumu

13

• Opstrukcija pakreasnog duktusa sa kalkulusom ili karcinomom povećava aktivnost LPS

• Povećanje zavisi od mesta opstrukcije i od mase preostalog funcionalnog tkiva pankreasa

• Kod pacijenata sa smanjenom glomerularnom filtracijom, aktivnost serumske lipaze je povećana

• Posebnu pažnju treba obratiti u interpretaciji rezultata vrednosti serumske LPS kod renalnih bolesnika.

• Istraživanje bilijarnih puteva endoskopijom, pankreatografija ili tretman opijatima (koji dovode do kontrakcije Odijevog sfinktera) mogu povećati aktivnost serumske LPS

• Makrolipaza

Klinički značaj lipaze

14

Određivanje aktivnosti lipaze

• Postoji veći broj metoda određivanja aktivnosti lipaze koje koriste kao

supstrat: trigliceride i ne-trigliceride (sintetičke supstrate)

Principi ovih metoda:

• Titrimetrijske, turbidimetrijske, spektrofotometrijske, fluorimetrijske i

imunološke tehnike

• Generalno metode koje koriste trigliceride sa masnim kiselinama dugih

lanaca pokazuju bolju korelacije sa kliničkim stanjima u odnosu na druge

metode

15

Određivanje aktivnosti lipaze

Titrimetrijske metode

Cherry-Crandall-ova metoda

• LPS katalizuje hidrolizu masnih kisaelina iz emulzije maslinovog

ulja ili oleinske kiseline

• Titracija oslobođenih masnih kiselina sa razblaženim alkalijama

• Kinetičke verzije koriste automatski potenciometrijski titrator

(instrument koji se naziva pH-stat)

• Količina upotrebljene alkalije se beleži u funkciji vremena i služi

za merenje stvorene količine masnih kiselina u toku reakcije

• Referentna metoda

16

Određivanje aktivnosti lipaze

Turbidimetrijske metode

• U ovoj metodi LPS hidrolizuje masne kiseline iz emulzije oleinske kiseline sa simultanim sniženjem turbiteta reakcione smese.

• Apsorbancija se meri na 340 nm

• ∆A/min mera enzimske aktivnosti LPS

• Kalibrator

• Ponekad apsorbancija umesto da opada raste tj turbiditet se povećava

– U slučaju prisustva reumatoidnog faktora

• Linearnost metode je ograničena 3x URL

– Primeniti razblaživanje seruma

• Gornja granica RV na 300C je 150 U/L

17

Određivanje aktivnosti lipaze

Spektrofotometrijske metode

• Veći broj supstrata i kompleksi pomoćnih i indikatorskih enzima se koriste u spektrofotometrijskim metodama

• Orto dijagnostika slide method

• Sintetički supstrat 1-oleoil-2,3-diacetilglicerol i emulgator je dodecilbenzen sulfonat

• LPS aktivnost se meri sa kompleksom pomoćnih i indikatorskih enzima i produkuje obojeni proizvod koji se meri na 540 nm

• Substrat je više specifičan za intestinalnu nego pankreasnu lipazu

• Interferencije postheparinske lipaze i pankreasne karboksilesteraze

• Gornja referentna vrednost je 200 U/L na 300 C.

18

Određivanje aktivnosti lipaze

TOOS - sodium N-etil-N-(2-hidroksil-3-sulfopropil)-m-toluidin oksidacija → intenzivno obojeno jedinjenje (550 nm) Gornja RV je 45 U/L na 37o C.

19

Novi sintetički supstrat (1,2-0-dilauril-rac-glicero-3-glutarna kiselina-(4-metil-rezorufin) estar, sadrži dve glicerol etarske i jednu estarsku vezu. LPS hidrolizuje estarsku vezu u alkalnoj sredini u nestabilni estar dikarbonske kiseline i spontano hidrolizuje pri čemu nastaje glutarna kiselina i metilrezorufin.

Određivanje aktivnosti lipaze

Količina stvorenog metilrezorufina je direktno proporcionalna aktivnosti LPS u uzorku Gornja granica referentnih vrednosti je 38 U/L na 37o C bez razlika u odnosu na pol i god U poređenju sa drugim LPS spektrofotometrijskim metodama, princip ovog eseja se zasniva na direktnoj reakciji i ima povećanu specifičnost za LPS

20

Stabilnost enzima:

• aktivnost LPS u serumu je stabilna na sobnoj temperaturi

nedelju dana

• serum se može čuvati 3 nedelje u frižideru

• nekoliko godina zamrznut

Imunohemijske metode

• određivanje koncentracije lipaze

• ELISA test

Određivanje aktivnosti lipaze