Embed Size (px)
Citation preview
MANIPULACION Y ANALISIS
DE LAS MOLECULAS DEL DNA
Gabriela Vidal S.
Definición
Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse
en un conjunto heterogéneo de secuencias.
Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA
específico
Enzimas de restricción
Cada enzima de restricción reconoce una secuencia
específica de nucleótidos y corta en ese punto cada
una de las cadenas de ADN.
Los extremos libres que quedan se llaman
“extremos pegajosos” (pueden unirse a otros
fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la
misma enzima de restricción).
Los fragmentos obtenidos se pueden separar por
tamaños mediante la técnica de electroforesis.
En el proceso de la electroforesis se prepara una
mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en
distintas soluciones.
Los fragmentos se desplazan en relación inversa
con su tamaño, los fragmentos más pequeños se
mueven rápidamente, mientras que los grandes lo
hacen muy lentamente.
HIBRIDIZACION
La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice.
Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U; C≡G; G≡C; T=A ó U=A.
En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo Northern blot, para uniones ADN-ARN
Procedimiento experimental
1.La hélice de doble cadena (ADN) es separada mediante un proceso físico (calor) o químico. Esto rompe los enlaces por puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN.
2.Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.
3.Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples.
4.La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van emparejando por las zonas complementarias y se va formando una nueva molécula hibridada.
Ejemplo
FISH o hibridación fluorescente in situ
Técnica de marcaje de cromosomas mediante la
cual los cromosomas son hibridados con sondas que
emiten fluorescencia y que gracias a ello permiten
la visualización, distinción y estudio de los
cromosomas así como de las anomalías que puedan
presentar.
El primer paso consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice.
A la muestra desnaturalizada se le añade la sonda de interés (fragmento de ADN marcado fluorescentemente).
Primero, las sondas hibridan a regiones específicas.
Después, se tiñen los núcleos con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI).
Las sondas de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (método indirecto).
Translocación t(9;22) : Gen de fusión BCR / ABL
La translocación t(9;22)(q34;q11) que origina el
cromosoma Filadelfia está presente en casi todos los
casos de leucemia mieloide crónica (95%) y en algunos
casos de leucemia linfocítica aguda, siendo de
importancia diagnóstica la detección del gen de fusión
BCR / ABL, mediante Hibridación in situ con
Fluorescencia (FISH). Esta técnica es capaz de detectar
un mosaicismo bajo de alrededor de 2-3%.
Amplificación del gen ErbB2 ó HER2/NEU
El gen HER2/NEU se encuentra localizado en el
cromosoma 17q y su amplificación está presente en
un 25% a 30% de las neoplasias de mama, se
relaciona estrechamente con los estadios
avanzados, metastásicos, que implican mal
pronóstico. El método más importante para detectar
el estado HER2 / NEU es la técnica del FISH.
REACCION EN CADENA DE
POLIMERASA (PCR)
Técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo.
Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN.
Necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores (primers).
La reacción es un proceso cíclico:
1. Desnaturalizacion: La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se separen las dos hebras.
2. Apareamiento: De los primers o iniciadores con cada una de las hebras separadas del ADN molde.
3. Extension: La ADN polimerasa extiende los primers, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde.
El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers.
Termociclador para PCR
http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU
Aplicaciones en medicina de PCR
Identificación de personas en medicina forense (DNA fingerprint).
Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV).
Diagnóstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística.
Reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológicas.
Evaluar el riesgo de padecer diabetes de tipo I y la enfermedad celíaca.
CLONACION
Proceso por el que se consiguen copias idénticas de un organismo ya desarrollado, de forma asexual.
Dos características:
Se parte de un animal ya desarrollado, porque la clonación responde a un interés por obtener copias de un determinado animal que nos interesa, y sólo cuando es adulto conocemos sus características.
Por otro lado, se trata de hacerlo de forma asexual. La reproducción sexual no nos permite obtener copias idénticas, ya que este tipo de reproducción por su misma naturaleza genera diversidad.
Clonación del DNA
Recombinación in vitro de un fragmento de DNA con
un DNA vector con capacidad de replicación
autónoma.
El fragmento de DNA se replicará junto con el DNA
vector en la célula hospedadora y así será posible
obtenerlo en un número elevado de copias.
1. OBTENCIÓN DEL DNA
El DNA podrá obtenerse mediante la extracción a partir de la célula, generalmente con la finalidad de construir una genoteca.
Consiste en una lisis celular y la purificación del DNA. La lisis puede conseguirse mediante métodos físicos y químicos.
La pared bacteriana se degrada mediante un lisozima y se lisa con EDTA y SDS. Posteriormente las proteínas y el RNA se degradan por tratamiento con proteasas (ej: Kinasa K) y con RNAasas. El DNA se podrá separar de los enzimas y los restos ya que precipitará con etanol.
Este DNA purificado, en el que está representado todo el genoma del individuo lo vamos a fragmentar con el objetivo de construir lo que denominamos genotecas.
Una genoteca (library en inglés) es una colección de
clones cada uno de los cuales contiene un vector al
que se le ha insertado un fragmento de ADN
derivado del ADN o el ARN totales de la célula o
tejido.
Entre los usos que se le pueden dar a una genoteca están:
El aislamiento de secuencias y genes: punto de partida
para el estudio molecular.
La conservación del genoma: la excepcionalidad de
una muestra biológica aconseja conservar su material
genético (restos arqueológicos, especies en extinción,
individuos con patologías únicas).
Estudio de la secuencia genómica: conocer la secuencia
completa de un genoma implica su clonación previa.
Endonucleasas de restricción
Las endonucleasas de restricción son enzimas que se encuentran en numerosas especies bacterianas y su función es la de reconocer y cortar el DNA foráneo.
Tipos:
Tipo I, cortan de forma inespecífica en un punto que dista de la secuencia de reconocimiento alrededor de 1000 pares de bases.
Tipo III, cortan en un punto más cercano de la secuencia que las del tipo I (25pb).
Tipo II, son las más utilizadas. No requieren ATP y cortan específicamente en la secuencia de reconocimiento.
Las tipo II cortan justo en los puntos que reconocen,
que son repeticiones invertidas o palíndromes
2. UNIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE DNA AL
VECTOR
Vectores de clonación:
Un vector es una molécula de DNA con un origen de replicación autónomo y
que posee zonas donde pueden introducirse fragmentos de DNA exógeno.
Así, el DNA exógeno se replica como parte del vector en la célula
receptora y hospedadora.
Plásmidos
Moléculas de DNA bihebra circular extracromosómico que se heredan de manera estable. Suelen conferir a la célula que hospedan alguna característica fenotípica como la resistencia a antibióticos.
Están clasificados en dos grupos:
1) estrictos, si su replicación está acoplada a la del DNA de la célula hospedadora
2) relajados, si se replican independientemente.
Para ser utilizados como vectores los plásmidos deben cumplir unas características:
pequeño tamaño (mejor manipulación y aislamiento);
replicación relajada (permite obtener el DNA clonado en grandes cantidades); y
presencia de puntos de corte únicos (permiten seleccionar las células que porten el plásmido recombinante).
Plásmido pBR322
3. INTRODUCCIÓN DEL DNA EN CÉLULA HUÉSPED:
TRANSFORMACIÓN
Cuando el DNA exógeno ha sido ligado en el
vector, debe entonces introducirse en la célula
hospedadora.
La más usada es E. coli pues, o bien la clonación se
realiza directamente en esta bacteria o bien se
utiliza para la amplificación del DNA recombinante.
4. Selección de colonias aisladas que porten moléculas
de DNA recombinante
Queda simplemente seleccionar aquellas colonias
bacterianas que expresen nuestro DNA
recombinante.
Lo podemos hacer detectando el gen o sus
productos (RNA o proteína) o detectarlo por
secuenciación del genoma de cada colonia.
PLANTAS TRANSGÉNICAS
Entre los principales caracteres que se han transferido a vegetales o se han ensayado en su transfección, merecen destacarse:
Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas.
Incremento del rendimiento fotosintético
Mejora en la calidad de los productos agrícolas
Síntesis de productos de interés comercial
Asimilación de nitrógeno atmosférico
ANIMALES TRANSGENICOS
Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar:
La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación.
Manipular de forma específica la expresión génica in vivo.
Estudiar la función de genes específicos.
Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteinas humanas.
La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica.
APLICACIONES DE LA INGENERIA
GENETICA EN HUMANOS
1. OBTENCIÓN DE PROTEINAS DE MAMÍFEROS
Una serie de hormonas como la insulina, la hormona
del crecimiento, factores de coagulación, etc ...
2. OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES
Por ejemplo, hepatitis B
3. DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DE ORIGEN
GENÉTICO
4. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
Terapia Génica
Consiste en la aportación de un gen funcionante a las células que carecen de esta función, con el fin de corregir una alteración genética o enfermedad adquirida.
La terapia génica se divide en dos categorías.
I. Alteración de células germinales (espermatozoides u óvulos), lo que origina un cambio permanente de todo el organismo y generaciones posteriores. Esta terapia no se utiliza en seres humanos por cuestiones éticas.
II. Terapia somática celular. Uno o más tejidos son sometidos a la adición de uno o más genes terapéuticos, mediante tratamiento directo o previa extirpación del tejido. Esta técnica se ha utilizado para el tratamiento de algunas enfermedades como la Distrofia muscular de Duchenne.
PROYECTO GENOMA HUMANO
El Proyecto Genoma Humano comenzó en 1990 en
los Estados Unidos con el objetivo de analizar
molecularmente la herencia genética humana.
Se trata de realizar mapas de cada uno de los
cromosomas humanos.
Implica dividir los cromosomas en pequeños
fragmentos que puedan ser caracterizados y
posteriormente ordenados en el cromosoma.
Los objetivos del Proyecto
•Identificar los aproximadamente 100.000 genes humanos en el ADN.
•Determinar la secuencia de 3 billones de bases químicas que conforman el ADN.
•Acumular la información en bases de datos.
•Desarrollar de modo rápido y eficiente tecnologías de secuenciación.
•Desarrollar herramientas para análisis de datos.
•Dirigir las cuestiones éticas, legales y sociales que se derivan del proyecto
Mapa genético
Mapa físico
GRACIAS
