Mise au point de la technique High Resolutionmelt(HRM) pour le génotypage des polymorphismesgénétiques ponctuels (SNPs) et la détection des mutations

Mise au point de la technique High Resolution melt (HRM) pour

le génotypage des polymorphismes génétiques ponctuels

(SNPs) et la détection des mutations

BEN SALAH Hamza

Laboratoire de Parasitologie Médicale, Biotechnologies

et Biomolecules, Institut Pasteur de Tunis, LR 11-IPT-06

Colloque Jeunes Chercheursde l’Institut Pasteur de Tunis8-9 Décembre 2016

Les polymorphisms génétiques ponctuels (SNPs)

représente la forme de variation la plus abondante dans

l’ADN humain.

Parmi les objectifs de l’analyse des SNPs est l’étude de la

susceptibilité génétique des maladies humaines complexes.

Les polymorphismes génétiques ponctuels (SNPs)


Génotypage des SNPs

Couteûses

Lourdes

Manipulations post-PCR

Séquençage, PCR-

RFLP, Essais TaqMan,

Spectrométrie de

masse, puces à ADN…

Efficacité, cependant,…


La technique High resolution melt (HRM)

Technique rapide: 90-120 minutes

Faible risque de contamination:

’closed tube technique’

Technique non destructive

Excellent Rapport coût/efficacité


Historique

L’analyse HRM est une extension de l’analyse classique des

courbes de fusion.

Une méthode relativement nouvelle mise en place en 2003.

Collaboration entre le laboratoire d’analyse d’ADN de l'Université de

l'Utah (Pr. Carl wittwer) et Idaho Technology, Inc (Salt Lake City, UT).

Appliquée avec succès au Génotypage des SNPs, détection de

variants, identification des espèces, étude de la méthylation de

l’ADN…


High Resolution Melt (Fusion à haute résolution)

… C’est quoi ? … en quoi consiste… ?

La méthode HRM caractérise les échantillons d'acides

nucléiques pour leur comportement à la dissociation

("melting") suite a une montée standard en température.

La discrimination se fait en fonction de la température de

fusion (Tm) et l’allure des courbes de fusion.


Syber green: intercalant non saturant Eva green: intercalant saturant

…Agent intercalant saturant ou non saturant ?

VSRéincorporation de l’intercalant

Pas de changement dans le signal de fluorescence Diminution du signal de fluorescence


Gène Polymorphisme

USP03 rs17765311A/C

APH rs2131109 A/G

USP40 rs12472244 A/G

Les gènes étudiés


L’ Acyl peptide hydrolase (APH)

Le gène APH humain est localisé sur le chromosome

3 (3p21.31).


Le Polymorphisme rs2131109A/G

Substitution type transition d’une adénine par une

guanine A>G.

Localisation du gène APH sur le chromosome 2



La protéase spécifique d’ubiquitine 40 (USP40)

Le gène USP40 humain est localisé sur le

chromosome 2 (2q37.1)

Substitution type transition d’une adénine par une guanine

A>G.

Le Polymorphisme rs12472244A/G

Localisation du gène USP40 sur le chromosome 2



La protéase spécifique d’ubiquitine 3 (USP03)

Le gène USP03 est localisé sur le chromosome 15

(q22.31).

Le polymorphisme rs17765311A/C

Localisation du gène USP03 sur le chromosome 15

Mutation type transversion, substitution d’une adénine

par une guanine A>C.


Objectif

La mise au point de la technique qPCR-HRM pour

le génotypage des polymorphismes

rs17765311A/C, rs12472244A/G, rs2131109A/G

et la détermination de leur distribution génotypique

chez la population générale tunisienne.


Matériel et Méthodes


La population d’étude

• 118 sujets « sains ».

• Services de consultants externes de l’Institut Pasteur de Tunis.

Consentement des participants

et éthique

Un accord a été obtenu suite a une

demande déposée, pour une

évaluation complète d’éthique,

auprès de comité d’éthique

médicale de l’Institut Pasteur à

l’entame de ce projet.

Matériel


Conception d’amorces

Outils de conception

Logiciel Primer 3: présélection de trois

couples d’amorces pour chaque

polymorphisme.

Logiciel Netprimer: choix du couple

d’amorce le plus stable: faible possibilité de

formation de dimères et de structures

secondaires.


Design des couples d’amorces

Gène SNP Taille Tm (°C)

USP03 rs17765311 132 pb 58.8

APEH rs2131109 133 pb 60.0

USP40 rs1247224 112 pb 56.8

Les trois couples conçus répondent au mieux aux exigences de l’analyse HRM: Tm

comprise entre 55°C et 60°C, taille de l’amplicon comprise entre 100 et 150pb,

pourcentage important en GC supérieur a 50%, très faible possibilité

d’autohybridation.


Montée standard en T° 0,2°/s

Dénaturation

Courbe de fusion

High Resolution Melt

Analyse des courbes de

fusion

Courbes d’amplification

Contrôles positifs

Attribution des

génotypes


Résultats


50 pb

100 pb

MT 1 2 3 4 5 6 ND

97 pb97 pb97 pb + 106pb132 pb

Identification du polymorphisme rs17765311A/C (USP03)

Profil de migration des produits digérés

106 pb 106 pb106 pb

A/A A/A A/A

Amplification par

PCR classique

Digestion

enzymatique

(Alu1)

Profil de migration la séquence amplifiée du

gène USP03

132 pb

M 1 2 3 4 T(-)

200 pb

100 pb

C/C C/CA/C

Détection des contrôles positifs


QPCR-HRM

Coubes d’amplification de la séquence cible du gène USP03

Amplification


Courbes de fusion normalisées de la séquence

amplifiée du gène USP03

A/A

A/C C/C

Courbes de différences de la séquence amplifiée

du gène USP03

A/C

A/A

C/C

Analyse HRM


Gène polymorphisme Génotype/ Allèle N % HW

USP03

Génotype

0.51

A/A 48 41.73

A/C 55 47.82

C/C 12 10.43

Allèle

A 151 65.6

C 79 34.4

Distribution allélique et génotypique du polymorphisme rs17765311A/C

chez la population générale tunisienne



100 pb

200 pb

Profil de migration de la séquence cible du gène APH

MT 1 2 3 4 5 T(-)

133 pb

Identification du polymorphisme rs2131109 A/G (APH)

rs2131109

Chromatogramme de la séquence cible d’un échantillon à

génotype A/G

Amplification par

PCR classique

Séquençage des

produits PCR

Détection des contrôles positifs par séquençage



QPCR-HRM

Coubes d’amplification de la séquence cible du gène APH


amplifiée du gène APH

A/A

A/G G/G

Courbes de différences de la séquence

amplifiée du gène APH

G/G

A/A

A/G

Amplification

Analyse HRM


Gène polymorphisme Génotype/Allèle N % HW

APH rs2131109 A/G

Génotype

0.89

A/A 46 40

A/G 54 47

G/G 15 13

Allèle

A 146 63.5

G 84 36.5

Distribution allélique et génotypique du polymorphisme rs17765311A/G

chez la population générale tunisienne



Identification du polymorphisme rs12472244 A/G (USP40)

Chromatogramme de la séquence cible d’un échantillon à

génotype A/A

rs12472244

200 pb

100 pb

MT 1 2 3 4 5 T(-)

Profil de migration de la séquence cible du gène

USP40

112 pb

Amplification par

PCR classique

Séquençage des

produits PCR

Détection des contrôles positifs



Coubes d’amplification de la séquence cible du gène USP03

QPCR-HRM

Analyse HRM



G/G

A/A

A/G

Courbes de différences de la séquence


A/A

G/G

A/G

Amplification


Gène polymorphisme Génotype/Allèle N % HW

USP40 rs1247244A/G

Génotype

0,14

A/A 44 38.26

A/G 48 41.74

G/G 23 20

Allèle

A 136 59

G 94 41

Distribution allélique et génotypique du polymorphisme rs17765311A/C chez

la population générale tunisienne



rs12472244

Chromatogramme révélant une deuxième mutation au niveau de la

séquence amplifiée du gène USP40

Détection d’une mutation supplémentaire

A/T

Lors de l’identification de contrôles positifs du polymorphisme du gène USP40

(rs12472244), un SNP supplémentaire a été détecté dans l’un échantillon.

L’analyse HRM a révélé une courbe différente des trois génotypes qui forme

un cluster séparément.

Cluster isolé

Coubes de différences



Discussion


Ce travail est le premier a avoir identifié ces SNPs par

qPCR-HRM.

Cette approche se distingue des autres techniques de

génotypage par sa simplicité, son efficacité et son

cout réduit.


L’échantillon présentant un SNP secondaire

(détecté par séquençage) a généré une courbe

différente de celle des trois génotypes et a formé un

cluster séparément lors de l’analyse HRM .

Possibilité d’appliquer la technique

pour la recherche des mutations

Technique très sensible


…Limite

Les formes homozygotes (C/C, G/G et A/A, T/T) Difficiles à

distinguer compte tenu de la faible différence de Tm

Niveau d’amplification

SNP de classe III (C/G) et IV (A/T)

Trois échantillons n’ont pu être discriminés par HRM due à leur

faible niveau d’amplification. L’analyse HRM est limitée par un

niveau d’amplification faible.


Conclusions et perspectives


La mise en place d’une technique de génotypage efficace

et rapide: la qPCR-HRM.

Détermination pour la première fois de la distribution

génotypiques et alléliques des trois polymorphismes étudiés

dans la population générale tunisienne.

Intérêt de la technique qPCR-HRM dans la découverte de

nouveaux polymorphismes.


En perspectives,

Etude cas témoins pour analyser l’association des trois

polymorphismes génétiques à la rectocolite

hémorragique en Tunisie.

Mise au point de qPCR-HRM triplexe pour l’amplification

et le génotypage des trois SNPs étudiés simultanément.


• Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un projet

collaboratif interne (PCI06): <<Etude des facteurs

de risques génétiques et microbiologiques

associés à la rectocolite hémorragique en

Tunisie 2014-2016>>.

• PIA Dr. CHELBI Hanen


Health & Medicine

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