Utilidad y limitaciones actuales del Utilidad y limitaciones actuales del diagndiagnóóstico genstico genéético tico preimplantacionalpreimplantacional

Luis González-Viejo GómezDirector de Laboratorios

Unilabs Reproducción HumanaC/ Velázquez 19, 1º Dcha., Madrid

• Definición y marco legal

• Evolución de las técnicas de DGP. (aCGH)

• Indicaciones del DGP. Estado actual.

• Indicaciones del Screening de aneuploidías� Edad materna avanzada� Aborto de repetición� Fallo repetido de implantación� Factor masculino

• Conclusiones.

ÍNDICE:

• DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL

(DGP): Técnica diagnóstica para el estudio de los

ovocitos y embriones a nivel genético antes de ser

transferidos al útero para su implantación.

• DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL

(DGP): Técnica diagnóstica para el estudio de los

ovocitos y embriones a nivel genético antes de ser

transferidos al útero para su implantación.

DEFINICIÓN:

•MARCO LEGAL DE APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DGP:

1. LEY 14/2006, de 26 mayo, sobre técnicas de reproducción humana asistida

a) Detección de enfermedades hereditarias GRAVES, de APARICIÓN

PRECOZ y NO SUSCEPTIBLES DE TRATAMIENTO CURATIVO.

b) Detección de ALTERACIONES que puedan comprometer la VIABILIDAD

DEL PREEMBRIÓN

*Para cualquier otra finalidad requerirá la AUTORIZACIÓN EXPRESA

individualizada de la autoridad sanitaria competente (Informe

favorable de la Comisión Nacional de Reproducción Humana Asistida).

•MARCO LEGAL DE APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DGP:

2. LEY 14/2006, de 26 mayo, sobre técnicas de reproducción humana asistida

Artículo 3.

1. Las técnicas se realizarán solamente cuando haya POSIBILIDADES

RAZONABLES DE ÉXITO, NO SUPONGA RIESGO GRAVE PARA LA

SALUD, física o psíquica de la mujer o la posible descendencia.

Previa aceptación LIBRE y CONSCIENTE por parte de la mujer, que

deberá haber sido informadade sus posibilidades de éxito,

riesgos y condiciones de aplicación de las técncas.

•PROBLEMAS GENÉTICOS SUSCEPTIBLES DE ESTUDIO MEDIANTE DGP:

1. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS NUMÉRICAS: screening de aneuploidías

(PGS).

2. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES: Traslocaciones,

inversiones, delecciones.

3. ENFERMEDADES MONOGÉNICAS: Más de 2000 patologías descritas.

4. ESTUDIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD (HLA): Para futuros trasplantes de

células madre hematopoyéticas o trasplante de médula, de un tercero

afecto de enfermedad congénita o adquirida.

INDICACIONES PARA LA REALIZACIÓN DEL DGP:

Criterios de inclusión del grupo de interés de la SEF:

•“Cuando el diagnóstico genético sea técnicamente posible, su fiabilidad elevada, las posibilidades de éxito sean aceptables y las técnicas de reproducción asistida sean factibles.”

* Son INDICACIONES de DGP las enfermedades monogénicas con diagnóstico fiable, anomalías cromosómicas estructurales o existencia de abortos de repetición.

* PUEDE realizarse DGP en los fallos repetidos de implantación, en pacientes mayores de 35 años, en los factores masculinos severos y pacientes con embarazos previos trisómicos.

1ª publicación de DGP (sexado)Handyside AH.1990

Analisis del 1º CPVerlinsky Y. 1990

Ác. Tyrodes + PCRÁc. Tyrodes + PCR

FISH de aneuploidías en embriones D+3Munné S. 1995

Ác. Tyrodes + FISH CR.16, 18, X e YÁc. Tyrodes + FISH CR.16, 18, X e Y

Introducción del láser para AH.Veiga A. 1997

Láser + FISHLáser + FISH

Introducción de medio sin Calcio ni MagnesioDulmoulin. 1998

Láser + FISH+ Ca/Mgfree

Láser + FISH+ Ca/Mgfree

Diagnóstico de 1ºy 2º CP biopsiadosVerlinsky Y. 1998

Diagnóstico biopsia CPsDiagnóstico biopsia CPs

m-CGH para estudio de aneuploidías en CPsWells D. 2002

Optimización de la vitrificación como técnica complementariaZhu. 2011; Chang 2011

Diagnóstico biopsia BTsDiagnóstico biopsia BTs

Optimización de la biopsia de BlastosMonk M . 1988, Kokkali G. 2005, McArthur SJ. 2005

Utilización de a-CGH en blastómeras, CPs y BTsWells D. 2002; Hellani A 2008, Geraedts J. 2010, Harper. 2010

• EVOLUCIÓN DE LA TÉCNICA DE DGP

ARRAYS DE CGH (COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION)

• Técnica citogenética cuantitativa que permite el estudio de las diferentes regiones de cada uno de los cromosomas.

• Permite la detección de un 42% más de anormalidades

FISH aCGH

Análisis de hasta 12 cr Análisis de todos los cromosomas

Análisis de una sola región del cromosoma Mapeado de todo el cromosoma

Lectura subjetiva por un especialista Lectura objetiva por un software

Material genético de una sola célula Permite amplificación de varias células

Fijación celular Entubado de células

Varias rondas de hibridación Una sola prueba de detección

No requiere amplificación Requiere amplificación (WGA, MDA)

Tasa de error ± 9% Tasa de error ± 1,8%

Detecta alteraciones de la ploidía No detecta alteraciones de la ploidía

Sondas específicas para a. estructurales No detección de balanceadas ni pérdidas de >1MB

Theisen A. 2008

Datos de ESHRE PGD Consortium desde 1997 hasta 2007. Harper JC 2011

* Centros participantes de 16 en 1997 a 57 en 2007

* Distribución de los tipos de DGPs realizados

A. Número de ciclos por indicaciónB. Tanto por ciento por indicación

27.630 ciclos totales: 61% aneuploidías17% Monogénicas16% anomalías cromosómicas estructurales4% Enfermedad ligada al cr. X 2% Sexado (causas sociales)

• Indicaciones para Screening de aneuploidíasdel consorcio de DGP de la ESHRE:

1. Edad Materna Avanzada (AMA)

2. Abortadora de repetición (RM)

3. Fallo de implantación (RIF)

4. Factor masculino severo (SMF)

5. Gestación anómala previa (PAP)

Datos de ESHRE PGD Consortium desde 1997 hasta 2007. Harper JC 2011

Distribución de los ciclos realizados de DGP para enfermedades monogénicas1997-2007.

Distribución de los ciclos realizados para cromosomopatías estructurales 1997-2007.

27.630 ciclos totales: 61% Aneuploidías17% Monogénicas16% Anomalías cromosómicas estructurales4% Enfermedad ligada al cr. X 2% Sexado (causas sociales)

Datos del registro SEF del año 2010 (70% de la actividad en España):

•De 58.268 ciclos de FIV y/o técnicas afines iniciados, 2719 son ciclos iniciados para DGP. 4,7% de los ciclos.

% gestación/ciclo % gestación/transfer

Ciclos ovocitos propios 29,2 38,3

CT ovocitos propios 27,9 31,4

Ciclos ovo. donados 50,9 54,9

CT ovo. donados 35,1 37,5

Ciclos con DGP 20,0 39,6

Registro Sociedad Española de Fertilidad 2010.

INDICACIONES PARA EL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS:“Edad Materna Avanzada”

EDAD MATERNA AVANZADA (EMA)

•Incremento de aneuploidías en mujeres >35 años

•HUSO MEIÓTICO y/o BAJO NÚMERO DE QUIASMAS.

Munné S & Cohen J. 1998

o Aumento en el riesgo de embarazos trisómicos.

o Aumento de posibilidad de aborto temprano.

o Incremento de fallo de implantación en TRA.Spandorfer SD. 2000

METODOLOGÍA EMPLEADA A DEBATE:

1.Realización del análisis citogenético: alguna de las

publicaciones tiene tasas de embriones NO

INFORMATIVOS del 20%.

2.No inclusión de CR 15 y 22 directamente implicados

en abortos tempranos. Mastembroek S. 2007

3.Cuestionada la metodología de la biópsia embrionaria

por la alta tasa de abortos. Hardarson T. 2008

4.Optimización de un buen programa de cultivo largo

de embriones. Beyer CE. 2009

5.Los criterios de inclusión son cuestionados, como

edad ≥35 años. Mastembroek S. 2007 y Schoolcraft WB

. 2009

6.No se evalúa la reducción de aborto temprano y la

detección de síndromes.

� NO BENEFICIO DEL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS

� SI BENEFICIO DEL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS

• 183 pacientes 41-44 años.• 9 CR• PGS vs. Cultivo Largo• % Nacido vivo: 32,3% PGS vs 15,5% CL

• 57 pacientes ≥38 años.• 9 CR• PGS vs. NO PGS• % gestación/ciclo: 43% PGS vs 25% CL

� Respuesta ovárica a la estimulación:

• Beneficio PGS : Pacientes entre 40-45 años y al menos 6 MII.

• Beneficio de criopreservación de ovocitos/embriones en ciclos consecutivos

INDICACIONES PARA EL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS:“Aborto de Repetición”

ABORTO DE REPETICIÓN (AR)

•DEFINICIÓN CLÁSICA:

“Existencia de TRES o más pérdidas gestacionales consecutivas de un embrión o feto de 20 semanas o menos, o con un peso menor a 500 gr. Quedan excluidas Enfermedad trofoblástica y gestación ectópica” ACOG practice Bulletin. 2002

•El 50% de los abortos recurrentes quedan sin diagnóstico tras el protocolo de estudio.

•El 70% de los casos de AR acaban consiguiendo gestación sin tratamiento.

ABORTO DE REPETICIÓN (AR)

•Causas propuestas:

1. Genéticas: Representan sobre el 50-70% de los casos de AR, según la edad de la mujer. Cramer DW. 2000; Stephenson MD. 2002; Christiansen OB. 2005 El 80% en pacientes por encima de 35 años. Marquard K. 2010. Cuando hablamos de parejas infértiles, la tasa de cariotipos de restos abortivos alterados alcanza el 65% analizando sólo 5 cr. Lathi RB. 2008

2. Síndrome Antifosfolípido: Responsable de al rededor del 10-15% de los AR. Rai R.2006;

Kutteh WH. 1996

3. Alteraciones Anatómicas Uterinas: Fundamentalmente abortos del segundo trimestre. ACOG practice Bulletin. 2002

4. Otras trombofilias: Factor V Leiden, mutación G20210A del gen de la protrombinaaumentan entre dos y tres veces las posibilidades de abortos en el primer trimestre. Otras más discutidas son la Resistencia a la Proteina C Activada (APCR) o Déficit de proteína C o S y Antitrombina III. Ozcan T. 2002

5. Causa Endocrina: Diabetes Mellitus, Disfunción Tiroidea, Síndrome de Ovario Poliquístico, Insuficiencia del cuerpo lúteo.

6. Infecciosas: se ha relacionado con AR infeciones con Ureaplasma, Mycoplasma, Chlamydia, Estreptococo.

7. Inmunológica: Autoinmune y aloinmune. Aumento de citoquinas de los linf T colaboradores, NK elevados en cantidad y actividad, compatibilidad paterna (HLA), actividad de la T reguladoras maternas en la tolerancia al feto…

8. Psicosociales: factores como el estrés, o situaciones emocionales de la paciente pueden actuar sobre desequilibrios inmunológicos. (Tender loving care)

• Otras causas más controvertidas:

Protocolo de estudio para el AR:

Jaslow CR. 2010*Un criterio clínico y otro de laboratorio. Dos determinaciones.** Cuando estudio de criterios anteriores Normal.

• Pruebas genéticas • Estudio de restos abortivos, biopsia de corion

• Cariotipos paternos

• FISH de espermatozoides

• Test de fragmentación de ADN en semen

• Pruebas anatómicas • Ecografía vaginal 3D

• Histeroscopia diagnóstica

• Estudio de trombofilias • Antifosfolípidos*: AC anticardiolipina IgG, IgM; AC anti-β2 glicoproteina I IgG, IgM; Anticoagulante lúpico

• Proteina C, S y antitrombina III

• Antimicrosomales, antitiroglobulina

• Mutación G20210A del factor II

• Factor V Leiden

• mutación MTHFR

• Estudio Inmunológico (F. Aloinmunes) • Estudio y valoración por el Inmunólogo especialista**

Aborto Recurrente de causa genética:

•Alteraciones cromosómicas numéricas: 86%1. Trisomías: 52%2. Poliploidías: 21%3. Monosomía X: 13%

•Alteraciones cromosómicas estructurales: 6%

•Otras: 8%

Grupo AR Grupo control ≤37 Grupo control >37

% Emb Aneuploides 70,7 33,3 57,7

Godjin M. Genetic aspects of miscarriage. 2000

• Utilización del Screening de aneuploidías en el AR:

1. Pruebas genéticas alteradas (cariotipo, FISH en espermatozoides…)

2. Aborto recurrente idiopático según la edad

� 34 años y 3 abortos de media la esperanza de nuevo aborto es 38%� 40 años y 3 abortos de media la esperanza de nuevo aborto es 70%

ESHRE Capri Workshop Group. 2008; Marquard K. 2010

PGS como opción??

Cribado genético preimplantacional en AR (IVI valencia, 1997-2009)

Edad ≤37 >37 Total

Nº Ciclos 368 260 628

Edad media (DE) 33,6 (2,5) 40,1 (1,8) 36,5 (3,9)

Tasa implantación 40,2 25,1 35,3

Tasa de aborto 13,7 30,0 17,9

Tasa aborto esperada (ESRHE) 38 70 54

Manual práctico de Esterilidad y Reproducción Humana. 4ª Ed. 2012

• Descenso de las tasas de aborto esperadas en ambos grupos de edad. Media de embriones transferidos 1,6.

Munné S. 2006

INDICACIONES PARA EL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS:“Fallo Repetido de Implantación”

FALLO REPETIDO DE IMPLANTACIÓN (FRI)

•Proceso de baja eficacia en humanos (±30% implantan).

•DEFINICIÓN:

“No consecución de embarazo tras la transferencia de 5-6 embriones de buena calidad repartidos en al menos 3 transferencias, independientemente de que hayan sido en fresco o criopreservados”

•CRITERIOS DE EXCLUSIÓN: 1.Mujeres con baja respuesta.2.Mujeres con patología conocida que comprometa su fertilidad (hidrosalpinx, endometriosis)3.Mujeres con alteraciones de la cavidad uterina (miomas submucosos, pólipos endometriales, malformaciones uterinas…)4.Transferencia de embriones de mala calidad (Tipo C,D)

FALLO REPETIDO DE IMPLANTACIÓN (FRI)•Protocolo de estudio de FRI:

• Pruebas genéticas • Cariotipos paternos

• FISH de espermatozoides*

• Test de fragmentación de ADN en semen*

• Pruebas anatómicas • Histeroscopia diagnóstica o Histerosonografía

• Estudio de trombofilias • Antifosfolípidos**: AC anticardiolipina IgG, IgM;AC anti-β2 glicoproteina I IgG, IgM; Anticoagulante lúpico

• Proteina C, S y antitrombina III

• Antimicrosomales, antitiroglobulina

• Mutación G20210A del factor II

• Factor V Leiden

• mutación MTHFR

• Estudio tiroideo • Perfil tiroideo y Ac antitiroideos

• Estudio Inmunológico (F. Aloinmunes) • Estudio y valoración por el Inmunólogo especialista***

* Se realizará si: Factor masculino severo o No factor masculino pero resto de estudio normal.** Un criterio clínico y otro de laboratorio. Dos determinaciones*** Cuando el estudio de todos los criterios anteriores normales.

FALLO REPETIDO DE IMPLANTACIÓN (FRI)

•Aplicación del Screening de aneuploidías en FRI:

1.Prueba genética alterada. Indicación PGS.

2.Si estudio NORMAL. No está claro la mejora de tasas de embarazo.

3.Se puede considerar como una opción válida cuando la mujer es >35 años.

4.Fundamental explicar a los pacientes las limitaciones de la técnica en FRI estricto.

5.Otras opciones como Cultivo Largo, Assisted Hatching o Aspiración de fragmentos tampoco han demostrado una mejora en las tasas de implantación.

6.Medios de cultivo suplementados con GM-CSF (Macrophage colony-stimulating factor) Salmassi A. 2010; Ziebe. 2012

• No observa diferencias estadísticamente significativas.

• Posiblemente con una n mayor.

• Diferencia significativa en en nº de fallos de implantación previos.

Perspectivas futuras:•Omicas•Time-Lapse•a-CGH en blastocisto

INDICACIONES PARA EL SCREENING DE ANEUPLOIDÍAS:“Factor Masculino Severo”

FACTOR MASCULINO SEVERO

•Mayor incidencia de aneuploidías en espermatozoides y embriones en factor masculino severo. Silber S. 2003; Obasaju I. 1999.

•Es recomendable en oligozoospermias severas la realización de un estudio de FISH en espermatozoides. Egozcue J. 1997; Vidal F. 2001; Blanco J. 2010

•Las alteraciones meioticas en biopsia de testículo y las aneuploidías en espermatozoides de eyaculado tienen el mismo valor pronostico clínico. Y justifica igualmente la realización de screening de aneuploidías. Vidal F. 2008; Velilla E. SEF. 2010

FACTOR MASCULINO SEVERO

2010

Group 1: Varones 46XY, FISH con aumento de disomías de cr sexuales.Group 2: Varones 46XY, FISH con aumento en las diploidíasGroup 3: varones 47XYY, con aumento en diploidías y disomías de cr sexuales

Muestra correlacción de anomalías cromosómicas en espermatozoides y embriones

FACTOR MASCULINO SEVERO

•Microdeleciones del brazo largo del cromosoma Y (Regiones AZF a,b,c) es la causa genética más frecuente de infertilidad masculina severa.

• Azoospermia no obstructiva: prevalencia 10-15% • Oligozoospermia severa: prevalencia 5-10%

•Las microdeleciones del cr Y se relaciona con disrupción en la espermatogénesis, y con un posible aumento en la tasa de aneuploidías en embriones.

• Aumento de tasa de aneuploidías cuando hay microdelecciones del cr Y. 2010.

• Influencia de la edad en el aumento de anomalías cromosómicas

CONCLUSIONES

1. Equipo de profesionales con amplia experiencia en DGP. Ginecologos, Embriólogos y Genetistas.

2. Puesta a punto de un buen programa de cultivo embrionario y de vitrificación de embriones.

3. Laboratorio con equipamiento adecuado para la realización de las técnicas.

4. Estudio de embriones con tecnología de aCGH.

5. Se realizará si FIABILIDAD ELEVADA, es TÉCNICAMENTE POSIBLE y las posibilidades de ÉXITO SON ACEPTABLES

6. Sigue siendo necesarios trabajos prospectivos y randomizados rigurosos y reproducibles.

8. EDAD MATERNA AVANZADA:

• Pacientes de >39 años con al menos 6 ovocitos MII y embriones tipo A, B.

• Vitrificación de ovocitos o embriones de ciclos consecutivos para posterios PGS.

• Disminución de la tasa de aborto temprano y de descendencia portadora de síndromes.

9. ABORTO DE REPETICIÓN:

• Es importante contar con un correcto cariotipado de restos abortivos cuando sea posible o biopsia de corion.

• Hasta un 70% de abortos del primer trimestre son de causa genética.

• Sin causa aparente, valorar edad, si mujer >35 años podemos contemplar el PGS.

• Diferentes estudios avalan el descenso en las tasas de aborto con PGS

10. FALLO REPETIDO DE IMPLANTACIÓN:

•FIR idiopático: PGS no demuestra mayor eficacia. Otras técnicas de selección espermática y embrionaria, incluso AH o cultivo largo pueden ofrecer otras salidas.

•Importancia de la edad de la paciente.

•Nuevas líneas de investigación como las ómicas, inmunología y time-lapsetienen mucho que aportar a estos pacientes.

11. FACTOR MASCULINO SEVERO:

• Posibilidad de estudio mayor.

• Aumento de tasas de alteraciones cromosómicas con:a. Oligozoopermias severasb. FISH y/o estudio de meiosis alteradosc. Delecciones del cr Y en la región AZF.d. Edad del varón?

• Correlación entre aumento de aneuploidías en espermatozoides y embriones.

¡¡MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!

¡¡MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!

Luis González-Viejo GómezDirector de laboratorios

Unilabs Reproducción HumanaC/ Velázquez nº 19, Madrid