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Uso de áptameros en biosensores
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APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Uso de aptámeros en biosensores
8 -Marzo-2.011
Aptámeros
Juan C. Vidal
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
I. Aptámeros y Biosensores : II. Transducción de masa : III. Aptasensores ópticos : IV. Aptasensores electroquímicos :
ÍNDICE
● QCM ● AFM
● SPR ● Fluorescencia
● Aptabeacons ● Microarrays
SELEX, Transd.+Rec., vs Ab, Spielgelmers, Plegamientos
● Voltametría ● EIS
Índice
Uso de aptámeros en biosensores
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
BIOSENSOR
I. Aptámeros y Biosensores
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Características ideales de un biosensor
I. Aptámeros y Biosensores
• Alta sensibilidad (ppb / ng mL-1) • Alta selectividad
• Alta fiabilidad • Tiempo vida largo
• Bajo coste • Tiempo corto análisis
• Pretratamiento muestra innecesario • Manejo sencillo
• Tiempo real • Portátil
• Automatizable • Miniaturizable
• Pequeño requerimiento operativo • Capacidad de multi-análisis
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Biosensores analíticos
BIOSENSORES • Ópticos
• Electroquímicos
• T. Masa (QCM) • Catalíticos (enzimas) • De afinidad (aptámeros, anticuerpos, DNA, Receptores, tejidos, MIPs…)
Biosensor: Transductor + Elemento de bio-reconocimiento selectivo I. Aptámeros y Biosensores
Bioreactivo inmovilizado
Transductor
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Selección de aptámeros: SELEX
Aptámeros
(DNA o RNA)
Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
o SELEX convencional (1990)
o SELEX mejorado (ej. CE-SELEX)
o SELEX automatizado (1998)
I. Aptámeros y Biosensores
(Librería combinatoria inicial 1013-1015 OLN;
In-vitro transcription; modific. quím.;
Selecc. negativa;Post-SELEX)
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptámeros vs. Anticuerpos
I. Aptámeros y Biosensores
Tamaño 6X: accesibilidad L, difusionabilidad,
cinética (superf. sólidas), nº L inmovilizados,
FP / EIS / SPR, Arrays
Aptámeros Anticuerpos
Afinidad μM - pM μM - pM
Especificidad Alta Alta
Síntesis In-vitro In-vivo (inmunización)
Dianas Moléc. tamaño grande-peq. Moléc. con inmunorespuesta
Réplicas Misma molécula (síntesis) Variaciones (pAb)
Modif. química Sencilla / Afinidad Limitada
Desnaturalización Reversible Irreversible
Tiempo de vida Largo Limitado
Nucleasas, pleomorfismo, simplicidad 5-25 kDa
vs
150 kDa
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Spiegelmers / Aptámeros modificados
• “Mirror-image aptamers” (1996<)
• Síntesis de L-nucleósidos
(en lugar de D-enantiómeros)
• Mínima toxicidad e inmunogenicidad
Nucleósidos modificados (1994<) (no reconocidos por nucleasas). Post(Pre)-SELEX.
I. Aptámeros y Biosensores
Noxxon Pharma AG
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Plegamiento de los Aptámeros
Estabilización: puentes de H, hidrofobicidad, atracciones iónicas, interacciones dipolares (Van der Waals)
• Especificidad • Espaciadores • Disoluc. reguladoras • Iones • Regeneración
(Estructuras terciarias; Señal: Fluoróf. / MTC)
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Transducción
II. III y IV. Transducción
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Transducción de masa (I)
II. Transducción de masa
QCM
S ~ 0,5 nM (3 ng cm-2),
IgG, Regenerac. (2002)
• Efecto piezoeléctrico
• NO ETIQUETADO (t. real)
• f0 ~ 5 MHz, 10 MHz
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Transducción de masa (II)
Flexible micro-cantilevers (2004)
Interferometría (“surface-stress” Apts >> Abs)
3-32 nm differential bending (Gold)
2x (referencia – ads. inespecífica)
Ej.: hepatitis HVC virus helicase (100 pg mL-1)
AFM II. Transducción de masa S ~ 1-100 nM Thbr
50 x 150 μm
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Resonancia de Plasmón Superficial (SPR)
III. Aptasensores ópticos
SPR ~ 10 pg/mm2
QCM ~ 1 ng/mm2
Afinidad (y cinética) aptámero-diana en tiempo real, sin etiquetado (2001)
Sistemas de flujo (Biacore)
Kd (afinidad)
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptasensores de fluorescencia (FP)
III. Aptasensores ópticos
Fibra óptica-avidina+bi-RNA-Apt, L-adenosina (μM) (1998)
• Anisotropía fluorescente: F. luz Polarizada • Tamaños Ab-Apt => cambio difusión rotacional, onda evanescente • Etiquetado fluorescente del aptámero • Gran sensibilidad (LOD 0,7 amol ThBr, 3 órdenes magnitud; 10 min.) • También cinética y Ka´s (en disolución, no immovilizados)
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptamer microarrays
III. Aptasensores ópticos
• Spotting” • Multianalito (1998, FP) • Somalogic (LOD 10 fM) • FP (fibras ópticas) • Bi-Apt + av-agarosa
Lisozima + HIV + Ricina (glass-slides) (LODs 320 ng mL-1) (Ellington, 2004)
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Aptamer molecular beacons - FP
Aptabeacon: F*-Apt-F*(Q*) (hairpin) (1996)
• Versatilidad frente Ab’s • Composición disoluciones • En disolución (no inmovilizac. Apt) • No regeneración
F*-Q*
F*-F*
FRET Mayor sensibilidad
(ej. thrombin pM) (TBA, 2002)
Cocaine (dye displac.) III. Aptasensores ópticos
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptasensores electroquímicos
IV. Aptasensores electroquímicos
•DPV, CRA, SWV, LSV, … •EIS
ELAA (<1 nM) (2005)
TBA (CNTs)
(*): enz., MB, NPs
•S~20-200 mM (LOD ≤ 1 nM)
Desplazamiento
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptasensores: sandwich / competitividad
IV. Aptasensores electroquímicos
Sandwich: => necesidad de 2º Apt*/Ab* y epitopo
• Conjugaciones previas
• No influye el cambio conformacional (3D)
• Ensayo directo o indirecto (o sobre MBs)
Competitividad o desplazamiento: => Necesidad de Ag*
LODs ~ 0,5 pM
ELONAs (~ ELISAs)
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Espectroscopía de Impedancia e-
EIS (2005)
IV. Aptasensores electroquímicos
• No etiquetado (difus. externa) • Sensibilidad (Ab’s) • Modulac. carga Apt.(-) • IgG (Ferric.), hairpin, (2-100 nM, LOD 0,1 nM) • Medida rápida (10-90 min.)
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Electrochemical aptabeacons
IV. Aptasensores electroquímicos
•Etiqueta electroquímica (mediador) •Regeneración (immovilizac.) •“Reagentless” (as SPR, QCM) •No “contaminación óptica” •Cuádruple / helix-junction •Grandes cambios conformac. (Prot.)
Ejemplos:
TBA, 15 mesh, MB, DPV, nM-μM, G-quad. (2002)
Cocaína, MB, 3-stem, DPV, LOD 10 μM (2006)
Señal ON / Señal OFF
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptasensor electroquímico de OTA (ejemplo)
IV. Aptasensores electroquímicos
Determination of OTA in wheat flour
DPV
LODs: 0,10 ng mL-1 OTA UE < 3-5 ppb´s
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Aptasensores: ejemplos
IV. Aptasensores electroquímicos
• Factor Xa (p-Thbr=>Thbr) • 2 Apt* (FM - híbrido) • LOD 50 pM
Aplicaciones Aptasensores: Drogas, proteínas, peq. molec., Thrombina, fact. coagulac., Vit. B12, Aminoácds., Citoquinas, fact. crecim., IgG, toxinas, HIV, Bi/Av, Dip-stick assays (ej. embarazo, micotoxinas)
Cocaína (500 μM)
(3-way-juntion)
Platelet PDGF
NPs (CNTs, QDs)
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Gracias por su atención !!
Prof. Juan R. Castillo (GEAS – Chairman) Prof. Juan C. Vidal (GEAS) Lcda. Alba Ezquerra (GEAS) Dra. Laura Bonel (Capher IDI SL) Lcda. Susana Hernández (Capher IDI SL)
Aptasensores (inmunosensores) electroquímicos: