ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Ngọc Hùng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HẠT NANO BẠC VÀ KHẢ NĂNG SÁT KHUẨN CỦA NÓ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY

Ngành: Vật lý kỹ thuật

HÀ NỘI - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Ngọc Hùng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HẠT NANO BẠC VÀ KHẢ NĂNG SÁT KHUẨN CỦA NÓ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY

Ngành: Vật lý kỹ thuật

Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Đức Quang

HÀ NỘI - 2011

Lời cảm ơn

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Đức Quang (Khoa VLKT – ĐHCN – ĐHQGHN) và TS. Lê Anh Tuấn (Viện tiên tiến Khoa học và công nghệ - ĐH Bách Khoa Hà Nội) đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua.

Em xin gửi lời cám ơn tới các anh chị trong Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội đã chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thí nghiệm.

Em cũng xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và các anh chị khoa Vật lý kỹ thuật, đặc biệt là GS. Lê Trần Bình, TS. Trần Đăng Khoa và TS. Hà Thị Quyến vì đã dạy bảo và giúp đỡ em những lúc khó khăn.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người luôn ủng hộ và động viên em trong suốt thời gian vừa qua.

Hà Nội, Ngày 19/5/2011

Nguyễn Ngọc Hùng

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình do tôi tự làm và nghiên cứu, các trích dẫn tôi đều đã ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Nếu có bất kỳ vấn đề gì xảy ra, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Người viết luận văn:

Nguyễn Ngọc Hùng

MỤC LỤC

Nguyễn Ngọc Hùng ................................................................................ 5

HÀ NỘI - 200<số cuối của năm bảo vệ KLTN> ....................................................... 5

Nguyễn Ngọc Hùng ................................................................................ 6

HÀ NỘI - 2011 ......................................................................................................... 6

HÀ NỘI - 2008 ......................................................................................................... 6

Tóm tắt nội dung khóa luận ................................................................. 1

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG SINH HỌC ..................................................... 2

1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano...........................................................2

Lĩnh vực................................................................................................................3

Tính chất..............................................................................................................3

Độ dài tới hạn (nm)..............................................................................................3

Tính chất điện......................................................................................................3

Bước sóng điện tử.................................................................................................3

10-100..................................................................................................................3

Quãng đường tự do trung bình không đàn hồi......................................................3

1-100....................................................................................................................3

Hiệu ứng đường ngầm..........................................................................................3

1-10......................................................................................................................3

Tính chất từ..........................................................................................................3

Độ dày vách đômen.............................................................................................3

10-100..................................................................................................................3

Quãng đường tán xạ spin.....................................................................................3

1-100....................................................................................................................3

Tính chất quang...................................................................................................3

Hố lượng tử...........................................................................................................3

1-100....................................................................................................................3

Độ dài suy giảm...................................................................................................3

10-100..................................................................................................................3

Độ sâu bề mặt kim loại.........................................................................................3

10-100..................................................................................................................3

Tính siêu dẫn........................................................................................................3

Độ dài liên kết cặp Cooper...................................................................................3

0,1-100.................................................................................................................3

Độ thẩm thấu Meisner..........................................................................................3

1-100....................................................................................................................3

Tính chất cơ..........................................................................................................3

Tương tác bất định xứ..........................................................................................3

1-1000..................................................................................................................3

Biên hạt................................................................................................................3

1-10......................................................................................................................3

Bán kính khởi động đứt vỡ....................................................................................3

1-100....................................................................................................................3

Sai hỏng mầm......................................................................................................3

0,1-10...................................................................................................................3

Độ nhăn bề mặt....................................................................................................3

1-10......................................................................................................................3

Xúc tác.................................................................................................................3

Hình học topo bề mặt...........................................................................................3

1-10......................................................................................................................3

Siêu phân tử.........................................................................................................3

Độ dài Kuhn..........................................................................................................3

1-100....................................................................................................................3

Cấu trúc nhị cấp...................................................................................................3

1-10......................................................................................................................3

Cấu trúc tam cấp..................................................................................................3

10-1000................................................................................................................3

Miễn dịch..............................................................................................................3

Nhận biết phân tử.................................................................................................3

1-10......................................................................................................................3

1.1.3 Ứng dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học.............................4

.............................................................................................................................4

1.2 Hạt nano bạc .................................................................................................... 5

1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại...........................................................................5

1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc.....................................................................6

1.2.4 Các phương pháp chế tạo hạt nano kim loại..............................................7

1.2.5 Giới thiệu về hạt nano bạc.........................................................................8

1.2.5.1 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc...............................................9

1.2.5.2 Ứng dụng của nano bạc........................................................................11

1.3 Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ...................................................... 15

1.3.1 Đường cong sinh trưởng...........................................................................15

1.3.1.1 Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase)..........................................................15

1.3.1.2 Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase).......16

1.3.1.3 Giai đoạn tử vong (Death Phase)...........................................................16

1.3.2 Xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn.......................................................17

1.3.2.1 Xác định số lượng tế bào......................................................................17

1.3.2.2 Xác định khối lượng tế bào...................................................................18

Chương 2: NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM ................................... 20

2.1 Phương pháp chế tạo hạt nano bạc ................................................................ 20

2.1.1 Quy trình công nghệ chế tạo dung dịch nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hóa học với bức xạ UV kích thích. ......................................................................20

2.1.1.1 Hóa chất thí nghiệm sử dụng:...............................................................20

2.1.1.2 Thiết bị sử dụng.....................................................................................20

2.1.1.3 Quy trình tổng hợp................................................................................20

2.1.2 Cơ chế hình thành hạt nano bạc...............................................................22

2.2 Ảnh hưởng của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn ................................ 23

2.2.1 Phương pháp đo OD.................................................................................23

2.2.2 Các trang thiết bị......................................................................................23

2.2.3 Các bước tiến hành thí nghiệm.................................................................24

2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường..............................................................................24

2.2.3.2 Cấy vi khuẩn.........................................................................................24

KẾT QUẢ ĐO OD.................................................................................................29

0(μg/ml).............................................................................................................29

5(μg/ml).............................................................................................................29

10(μg/ml)...........................................................................................................29

15(μg/ml)...........................................................................................................29

25(μg/ml)...........................................................................................................29

M1......................................................................................................................29

M2......................................................................................................................29

M1......................................................................................................................29

M2......................................................................................................................29

M1......................................................................................................................29

M2......................................................................................................................29

M1......................................................................................................................29

M2......................................................................................................................29

M1......................................................................................................................29

M2......................................................................................................................29

0.5......................................................................................................................29

0.154..................................................................................................................29

0.173..................................................................................................................29

0.129..................................................................................................................29

0.121..................................................................................................................29

0.130..................................................................................................................29

0.118..................................................................................................................29

0.145..................................................................................................................29

0.133..................................................................................................................29

0.151..................................................................................................................29

0.148..................................................................................................................29

1.0......................................................................................................................29

0.181..................................................................................................................29

0.209..................................................................................................................29

0.123..................................................................................................................29

0.124..................................................................................................................29

0.129..................................................................................................................29

0.133..................................................................................................................29

0.139..................................................................................................................29

0.138..................................................................................................................29

0.148..................................................................................................................29

0.149..................................................................................................................29

1.5......................................................................................................................29

0.252..................................................................................................................29

0.301..................................................................................................................29

0.125..................................................................................................................29

0.120..................................................................................................................29

0.127..................................................................................................................29

0.119..................................................................................................................29

0.142..................................................................................................................29

0.136..................................................................................................................29

0.151..................................................................................................................29

0.152..................................................................................................................29

2.0......................................................................................................................29

0.421..................................................................................................................29

0.444..................................................................................................................29

0.131..................................................................................................................29

0.124..................................................................................................................29

0.126..................................................................................................................29

0.131..................................................................................................................29

0.141..................................................................................................................29

0.145..................................................................................................................29

0.150..................................................................................................................29

0.162..................................................................................................................29

2.5......................................................................................................................29

0.610..................................................................................................................29

0.673..................................................................................................................29

0.117..................................................................................................................29

0.129..................................................................................................................29

0.128..................................................................................................................29

0.121..................................................................................................................29

0.143..................................................................................................................29

0.128..................................................................................................................29

0.151..................................................................................................................29

0.154..................................................................................................................29

3.0......................................................................................................................29

0.749..................................................................................................................29

0.877..................................................................................................................29

0.126..................................................................................................................29

0.122..................................................................................................................29

0.125..................................................................................................................29

0.119..................................................................................................................29

0.144..................................................................................................................29

0.140..................................................................................................................29

0.151..................................................................................................................29

0.155..................................................................................................................29

3.5......................................................................................................................29

1.262..................................................................................................................29

1.170..................................................................................................................29

0.409..................................................................................................................29

0.127..................................................................................................................29

0.128..................................................................................................................29

0.122..................................................................................................................29

0.146..................................................................................................................29

0.140..................................................................................................................29

0.155..................................................................................................................29

0.154..................................................................................................................29

4.0......................................................................................................................29

1.372..................................................................................................................29

1.389..................................................................................................................29

0.144..................................................................................................................29

0.135..................................................................................................................29

0.128..................................................................................................................29

0.123..................................................................................................................29

0.145..................................................................................................................29

0.141..................................................................................................................29

0.156..................................................................................................................29

0.155..................................................................................................................29

4.5......................................................................................................................29

1.490..................................................................................................................29

1.521..................................................................................................................29

0.142..................................................................................................................29

0.135..................................................................................................................29

0.137..................................................................................................................29

0.121..................................................................................................................29

0.153..................................................................................................................29

0.149..................................................................................................................29

0.156..................................................................................................................29

0.157..................................................................................................................29

5.0......................................................................................................................29

1.612..................................................................................................................29

1.645..................................................................................................................29

0.143..................................................................................................................29

0.139..................................................................................................................29

0.133..................................................................................................................29

0.121..................................................................................................................29

0.148..................................................................................................................29

0.151..................................................................................................................29

0.155..................................................................................................................29

0.157..................................................................................................................29

5.5......................................................................................................................29

1.675..................................................................................................................29

1.713..................................................................................................................29

0.107..................................................................................................................29

0.107..................................................................................................................29

0.081..................................................................................................................29

0.077..................................................................................................................29

0.104..................................................................................................................29

0.010..................................................................................................................29

0.111..................................................................................................................29

0.108..................................................................................................................29

3.3 So sánh với phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn .................................. 34

Chương 4: KẾT LUẬN ....................................................................... 35

Tóm tắt nội dung khóa luận

Từ xa xưa, con người đã sử dụng bạc làm các dụng cụ chứa đồ ăn, nước uống để trị bệnh. Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc để điều trị nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời. Ngày nay, cùng với sự ra đời và phát triển của công nghệ nano, con người đã chế tạo được bạc ở kích thước nano. Điều này làm tăng đáng kể số ứng dụng của bạc. Ở kích thước nano, bạc thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh mà không gây ảnh hưởng tới con người và môi trường. Chính vì vậy, giới khoa học đang đầu tư nghiên cứu bạc để phục vụ cho các ứng dụng trong y học, nhất là khi hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến như ngày nay.

Chính vì vậy, trong khóa luận này, chúng tôi tập trung vào các nhiệm vụ sau:

1. Nghiên cứu quy trình công nghệ và tham gia thử nghiệm chế tạo hạt nano bạc

2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano bạc lên sự phát triển (khả năng ức chế sự phát triển) của vi khuẩn gây bệnh đường ruột E. coli

3. Đánh giá hiệu quả ức chế của nano bạc với E. coli

1

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG SINH HỌC

1.1 Giới thiệu về công nghệ nano

1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của công nghệ nano

Công nghệ nano là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nanômét (nm, 1 nm = 10-9 m) [3]. Ở kích thước nano, vật liệu sẽ có những tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền thống không có được đó là do sự thu nhỏ kích thước và việc tăng diện tích mặt ngoài.

Ý tưởng cơ bản về công nghệ nano được đưa ra bởi nhà vật lý học người Mỹ Richard Feynman vào năm 1959, ông cho rằng khoa học đã đi vào chiều sâu của cấu trúc vật chất đến từng phân tử, nguyên tử vào sâu hơn nữa. Nhưng thuật ngữ “công nghệ nano” mới bắt đầu được sử dụng vào năm 1974 do Nario Taniguchi một nhà nghiên cứu tại trường đại học Tokyo sử dụng để đề cập khả năng chế tạo cấu trúc vi hình của mạch vi điện tử[4].

1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano

Công nghệ nano dựa trên những cơ sở khoa học chủ yếu sau:

- Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử: Đối với vật liệu vĩ mô gồm rất nhiều nguyên tử, các hiệu ứng lượng tử được trung bình hóa với rất nhiều nguyên tử (1 µm3 có khoảng 1012 nguyên tử) và có thể bỏ qua các thăng giáng ngẫu nhiên. Nhưng các cấu trúc nano có ít nguyên tử hơn thì các tính chất lượng tử thể hiện rõ ràng hơn.

- Hiệu ứng bề mặt: Khi vật liệu có kích thước nm, các số nguyên tử nằm trên bề mặt sẽ chiếm tỉ lệ đáng kể so với tổng số nguyên tử. Chính vì vậy các hiệu ứng có liên quan đến bề mặt, gọi tắt là hiệu ứng bề mặt sẽ trở nên quan trọng làm cho tính chất của vật liệu có kích thước nanomet khác biệt so với vật liệu ở dạng khối.

2

- Kích thước tới hạn: Các tính chất vật lý, hóa học của các vật liệu đều có một giới hạn về kích thước. Nếu vật liệu mà nhỏ hơn kích thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi. Người ta gọi đó là kích thước tới hạn. Vật liệu nano có tính chất đặc biệt là do kích thước của nó có thể so sánh được với kích thước tới hạn của các tính chất của vật liệu[3].

Bảng 1: Độ dài tới hạn của một số tính chất của vật liệu[3].

Lĩnh vực Tính chất Độ dài tới hạn (nm)

Tính chất điện

Bước sóng điện tử 10-100Quãng đường tự do trung bình không đàn hồi

1-100

Hiệu ứng đường ngầm 1-10Tính chất từ Độ dày vách đômen 10-100

Quãng đường tán xạ spin 1-100Tính chất quang

Hố lượng tử 1-100Độ dài suy giảm 10-100Độ sâu bề mặt kim loại 10-100

Tính siêu dẫn

Độ dài liên kết cặp Cooper 0,1-100Độ thẩm thấu Meisner 1-100

Tính chất cơ Tương tác bất định xứ 1-1000Biên hạt 1-10Bán kính khởi động đứt vỡ 1-100Sai hỏng mầm 0,1-10Độ nhăn bề mặt 1-10

Xúc tác Hình học topo bề mặt 1-10Siêu phân tử Độ dài Kuhn 1-100

Cấu trúc nhị cấp 1-10Cấu trúc tam cấp 10-1000

Miễn dịch Nhận biết phân tử 1-10

3

1.1.3 Ứng dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học

Do có nhiều tính năng độc đáo và kích thước tương đương với các phân tử sinh học nên hiện nay, công nghệ nano đang được đầu tư nghiên cứu đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh. Các ứng dụng tiêu biểu của công nghệ nano trong lĩnh vực này là:

- Chẩn đoán: Sử dụng các hạt nano (hạt nano vàng, nano từ, chấm lượng tử…) để đánh dấu các phân tử sinh học, vi sinh vật, phát hiện các chuỗi gen nhờ vào cơ chế bắt cặp bổ xung của DNA hoặc cơ chế bắt cặp kháng nguyên – kháng thể.

- Vận chuyển thuốc: Cung cấp thuốc cho từng tế bào cụ thể bằng cách sử dụng các hạt nano nhằm tiết kiệm thuốc và tránh các tác dụng phụ.

- Mô kỹ thuật: Công nghệ nano có thể giúp cơ thể tái sản xuất hoặc sửa chữa các mô bị hư hỏng bằng cách sử dụng “giàn” dựa trên vật liệu nano và các yếu tố tăng trưởng[7].

Hình 1: Hạt nano vàng sử dụng trong truyền dẫn thuốc.

4

1.2 Hạt nano bạc

1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại

Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1

Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm

Bán kính ion bạc: 0,23 nm

Bảng 2: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích[14].

Kích thước của hạtnano Ag (nm)

Số nguyên tử chứatrong đó

1 31

5 3900

20 250000

Bạc nano là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc đáo sau[14]:

- Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi xa, chống tĩnh.

- Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, không có phụ gia hóa chất.

- Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như benzene, toluene).

- Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường.

- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp.

- Ổn định ở nhiệt độ cao.

1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc

5

Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm . Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể hiện tính độc với con người.

Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh. Người cổ đại sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước, rượu dấm. Trong thế kỷ 20, người ta thường đặt một đồng bạc trong chai sữa để kéo dài độ tươi của sữa. Bạc và các hợp chất của bạc được sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều trị các vết bỏng và khử trùng[10].

Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao người ta không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano.

1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc

Hình 2: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn.

Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoặt động

6

của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có thành tế bào,vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này.

Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả như sau: Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sunfuahydrin – SH của phân tử enzym chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn[14].

Hình 3: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn

Ngoài ra các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hòa điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA[15].

Hình 4: Ion bạc liên kết với các base của DNA

1.2.4 Các phương pháp chế tạo hạt nano kim loại

- Phương pháp ăn mòn laze: Phương pháp này sử dụng chùm tia laze với bướ sóng ngắn bắn lên vật liệu khối đặt trong dung dịch có chứa chất hoạt hóa bề mặt. Các hạt

7

nano được tạo thành với kích thước khoảng 10 nm và được bao phủ bởi chất hoạt hóa bề mặt.

- Phương pháp khử hóa học: Phương pháp này sử dụng các tác nhân hóa học để khử ion kim loại thành kim loại. Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc bằng chất hoạt hóa bề mặt. Các hạt nano tạo thành bằng phương pháp này có kích thước từ 10 nm đến 100 nm.

- Phương pháp khử vật lý: Phương khử vật lí dùng các tác nhân vật lí như điện tử, sóng điện từ năng lượng cao như tia gamm, tia tử ngoại, tia laser khử ion kim loại thành kim loại. Dưới tác dụng của các tác nhân vật lí, có nhiều quá trình biến đổi của dung môi và các phụ gia trong dung môi để sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion thành kim loại.

- Phương pháp khử hóa lý: Đây là phương pháp trung gian giữa hóa học và vật lí. Nguyên lí là dùng phương pháp điện phân kết hợp với siêu âm để tạo hạt nano. Phương pháp điện phân thông thường chỉ có thể tạo được màng mỏng kim loại. Trước khi xảy ra sự hình thành màng, các nguyên tử kim loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các hạt nano bàm lên điện cực âm. Lúc này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân thì hạt nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung dịch.

- Phương pháp khử sinh học: Dùng vi khuẩn là tác nhân khử ion kim loại. Người ta cấy vi khuẩn MKY3 vào trong dung dịch có chứa ion bạc để thu được hạt nano bạc. Phương pháp này đơn giản, thân thiện với môi trường và có thể tạo hạt với số lượng lớn[6].

1.2.5 Giới thiệu về hạt nano bạc

Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn.

8

Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano.

1.2.5.1 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc

a) Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua

Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hoạt động trên nguyên tắc giống thấu kính quang học, chỉ khác là sử dụng sóng điện tử thay cho bước sóng ánh sáng nên có bước sóng rất ngắn) và sử dụng các thấu kính điện từ - magnetic lens thay cho thấu kính quang học[5].

Hình 5: Mô hình nguyên lý của TEM so với kính hiển vi quang học

Ảnh của kính hiển vi điện tử truyền qua cho phép ta quan sát được hình dạng và xác định được kích thước của các hạt nano.

9

Hình 6: Ảnh TEM của các hạt nano bạc kích thước 10 nm[11].

b) Phân tích phổ UV-VIS

UV-VIS (Ultraviolet–visible spectroscopy) là phương pháp phân tích sử dụng phổ hấp thụ hoặc phản xạ trong phạm vi vùng cực tím cho tới vùng ánh sáng nhìn thấy được.

Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các thuộc tính trên.

10

Hình 7: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc[10].

Do hạt nao bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt plasmon duy nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta xử dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc[12].

1.2.5.2 Ứng dụng của nano bạc

Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano bạc như:

- Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt nano bạc có tác dụng khử trùng. Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt 99.9% vi khuẩn.

11

Hình 8: Bình sữa làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc

- Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử mùi.

Hình 9: Tất làm bằng sợi nilon có pha nano bạc

12

- Các thiết bị điện tử: Điều hòa, tủ lạnh, máy giặt

Hình 10: Điều hòa sử dụng bộ lọc nano bạc

- Y tế:+ Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu

tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt khuẩn, diệt virus, lọc không khí rất tốt. Lớp vải tẩm nano bạc có chức năng diệt vi khuẩn, virus, nấm bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng khử mùi.

Hình11: Khẩu trang nano bạc do viện môi trường sản xuất

13

+ Sản xuất thuốc chữa bệnh

Hình 12: Các dược phẩm sử dụng nano bạc

+ Màng hô hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước qua nhưngkhông thể cho chất lỏng đi qua, có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại trong tấm film. Các hạtnano bạc gần đây đã được kết hợp với film polyolefin với đặc tính kháng khuẩn rất tốt.

Hình 13: Ảnh SEM của các hạt nano bạc kết hợp với film polyolefin

- Các sản phẩm khác:

Hình 14: các sản phầm có chứa nano bạc

14

1.3 Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

1.3.1 Đường cong sinh trưởng

Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được nghiên cứu bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng trong một môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín. Có nghĩa là vi sinh vật được nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trường và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng tăng lên. Nếu lấy thời gian nuôi cấy là trục hoành và lấy số logarit của số lượng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của các vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi. Đường cong này có 4 giai đoạn (phases) khác nhau[8].

Hình 15: Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín

1.3.1.1 Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase)

Khi cấy vi sinh vật vào một môi trường mới số lượng thường không tăng lên ngay, đó là giai đoạn Tiềm phát hay pha Lag. Trong giai đoạn này tế bào chưa phân cắt nhưng thể tích và khối lượng tăng lên rõ rệt do có sự tăng các thành phần mới của tế bào.

Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi trường. Nếu tính chất hóa học của môi trường mới sai khác nhiều với

15

môi trường cũ thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài. Ngược lại, nếu cấy từ giai đoạn logarit vào một môi trường có thành phần tương tự thì giai đoạn tiềm phát sẽ rút ngắn lại. Nếu cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài[8].

1.3.1.2 Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase)

Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phân cắt với tốc độ tối đa nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn. Do các tế bào sinh ra chỉ khác nhau rất ít cho nên đường cong sinh trưởng là một đường trơn nhẵn chứ không gấp khúc Hình dáng của đường cong hầu như phản ánh tốc độ hấp thu chất dinh dưỡng nhờ sự chuyển vận protein của vi sinh vật[8].

Hình 16: Nồng độ chất dinh dưỡng sinh trưởng

(a ) Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng đối với sản lượng chung của vi sinh vật. Lúc nồng độ đủ cao thì sản lượng chung sẽ đạt tới ổn định.

(b)- Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng tới tốc độ sinh trưởng

1.3.1.3 Giai đoạn tử vong (Death Phase)

16

Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn thất đến môi trường sống của vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong.

Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của quần thể vi sinh vật cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Tổng số tế bào sống và tế bào chết không thay đổi vì các tế bào chết chưa bị phân hủy. Muốn xác định số lượng tế bào sống phải pha loãng ra rồi cấy lên thạch đĩa và đưa vào điều kiện thích hợp để xác định số khuẩn lạc xuất hiện.

Mặc dầu phần lớn vi sinh vật tử vong theo phương thức logarit nhưng sau khi số lượng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết của tế bào chậm lại. Đó là do một số cá thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh. Vì điều này và những nguyên nhân khác làm cho đường cong của giai đoạn tử vong có thể khá phức tạp[8].

1.3.2 Xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn

1.3.2.1 Xác định số lượng tế bào

Phương pháp đơn giản nhất để xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới kính hiển vi. Dùng các phòng đếm để đếm vừa nhanh chóng, dễ dàng, lại rẻ tiền nhất, lại có thể quan sát thấy kích cỡ và hình dáng tế bào.

Với tế bào vi khuẩn cần nhuộm màu hoặc là dùng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang (phase-constrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát hơn. Phòng đếm có cấu trúc để có một độ sâu nhất định lại có chia ra thành các ô nhỏ. Khi đếm số lượng ta đưa dịch pha loãng vào phòng đếm, đậy lá kính (lamelle/ cover glass) lên trên, sau đó tiến hành đếm số lượng dưới kính hiển vi.

Khuyết điểm của phương pháp này là không xác định được với các mẫu có số lượng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác cũng không cao vì không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết[8].

17

Hình 17: Phòng đếm Petroff-Hauser:

(a)- Mặt nhìn nghiêng của phòng đếm

(b)- Giữa phiến kính có phòng đếm với các ô nhỏ

(c) Ở độ phóng đại khoảng x 400-500 tiến hành đếm số lượng vi khuẩn trong các ô nhỏ.

1.3.2.2 Xác định khối lượng tế bào

Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tế bào mà còn ở cả sự tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào. Phương pháp trực tiếp nhất là xác định trọng lượng khô của tế bào. Trước hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào. Sau đó rửa tế bào rồi làm khô trong lò sấy rồi cân trọng lượng khô. Phương pháp này thích hợp để xác định sự sinh trưởng của nấm. Phương pháp này tốn thời gian và không thật mẫn cảm. Đối với vi khuẩn vì trọng lượng từng cá thể là rất nhỏ, thậm chí phải ly tâm tới vài trăm ml mới đủ số lượng để xác định trọng lượng sinh khối khô.

Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm hơn là dùng phương pháp đo mật độ quang (OD). Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Lúc nồng độ vi khuẩn đạt đến 107 tế bào/ml thì dịch nuôi cấy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục cũng tăng theo và làm cản trở ánh sáng đi qua dịch nuôi. Có thể đo độ tán xạ ánh sáng bằng quang phổ kế (spectrophotometer). Ở một mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, giữa nồng độ tế bào và giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính. Chỉ cần nồng độ vi sinh vật đạt tới nồng độ có thể đo được là đều có thể dùng phương pháp đo OD trên quang phổ kế để xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật. Nếu hàm lượng một số vật chất trong mỗi tế bào là giống

18

nhau thì tổng lượng chất đó trong tế bào có tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi sinh vật[8].

Hình18: Phương pháp đo OD

19

Chương 2: NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp chế tạo hạt nano bạc

Trong nghiên cứu này, dung dịch nano bạc được cung cấp bởi Viện tiên tiến Khoa học và công nghệ (AIST) của Đại Học Bách Khoa Hà Nội. Dung dịch nano bạc được chế tạo bằng kỹ thuật khử hóa học sử dụng bức xạ UV kích thích với chất hoạt động bề mặt là axit oleic.

2.1.1 Quy trình công nghệ chế tạo dung dịch nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hóa học với bức xạ UV kích thích.

2.1.1.1 Hóa chất thí nghiệm sử dụng:

- AgNO3 (bạc nitrat): Độ sạch 99%, Trung Quốc.

- NaOH (natri hydroxyt): Hóa chất thí nghiệm, Trung Quốc.

- NH4OH (amoni hydroxyt): Hóa chất thí nghiệm, Trung Quốc.

- C6H12O6 (đường glucozo): Hóa chất thí nghiệm.

- C17H33COOH (axit oleic): Hóa chất thí nghiệm và hóa chất công nghiệp

Axit oleic có công thức cấu tạo: CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH là chất không màu, không mùi, không vị, nóng chảy ở 140C. Khi thủy phân chất béo người ta thu được cả axit oleic cùng với các loại axit no và không no khác.

2.1.1.2 Thiết bị sử dụng

- Nước cất sạch.

- Các bình đựng hóa chất, ống đong, pipet.

- Phim và giấy lọc.

- Máy khuấy từ và rung siêu âm để phân tán và làm đồng đều.

- Đèn pin bức xạ UV, công suất 35W.

2.1.1.3 Quy trình tổng hợp

20

Hình 19: Sơ đồ quy trình điều chế hạt nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hoác học với bức

xạ UV kích thích[1]

- Lấy 1.7 g bạc nitrat AgNO3 (dạng muối kết tinh màu trắng) hòa tan trong 100ml nước cất.

- Thêm vào dung dịch 0.62 g natri hydroxyt, NaOH, để tạo kết tủa Ag2O có màu đen.

- Hòa tan kết tủa bằng một lượng vừa đủ amoni hydroxyt, NH4OH, để tạo ra dung dịch phức bạc Ag(NH3)2OH trong suốt.

- Cho thêm một lượng chất hoạt động bề mặt axit oleic và khuấy đều trên máy khuấy từ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để tạo ra dung dịch đồng nhất và có độ nhớt cao.

- Sau đó thêm 2.0g đường glucozo và khuấy đều trên máy khuấy từ để thực hiện phản ứng khử. Trong quá trình khử sử dụng đèn bức xạ UV để kích thích phản ứng khử và điều khiển phân bố kích thước hạt nano bạc.

21

- Phản ứng khử được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 8 giờ.

2.1.2 Cơ chế hình thành hạt nano bạc

Quá trình hình thành hạt nano bạc được giải thích như sau:

- Đầu tiên, bức xạ UV kích thích các ion [Ag(NH3)2]+ hoạt động. Khi đó các phân tử đường glucose nhường điện tử cho Ag+ và tạo ra hạt nhân nguyên tử bạc Ag0

[Ag(NH3)2]+ + RCHOH hν Ag0 + 2NH3 + H+ + RCOH

nAg0 (Agn)0

- Tiếp theo, các ion Ag+ ở trong dung dịch hấp phụ lên trên bề mặt nguyên tử bạc và tạo ra một lớp điện tích dương. Các điện tích dương Ag+ sẽ hút các ion RCOO- mang điện tích âm trái dấu và tạo ra lớp bảo vệ thứ nhất. Do nhóm carboxyl của ion oleate hướng về phía bề mặt của bạc nên đầu kị nước được hướng ra phía ngoài. Khi đó các ion oleate ở trong dung dịch tiếp tục gắn kết với lớp bảo vệ đầu và hình thành lớp bảo vệ thứ hai với đầu ưa nước hướng ra ngoài. Chính cấu trúc này khiến các hạt nano bạc phân tán đều trong nước và không bị kết đám[1].

Hình 20: Sự hình thành của 2 lớp ion oleate trên bề mặt hạt nano bạc

22

2.2 Ảnh hưởng của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn

2.2.1 Phương pháp đo OD

OD (Optical Density) – là phương pháp dùng để đo nồng độ tế bào có trong dung dịch huyền phù. Phương pháp này có ưu điểm lớn là có thể thực hiện trong thời gian ngắn và không gây phá hủy tế bào.

Nguyên lý của phương pháp này dựa trên hiện tượng tán xạ ánh sáng: Khi truyền qua dung dịch huyền phù, ánh sáng sẽ bị tán xạ. Sự tán xạ phụ thuộc vào nồng độ tế bào trong dung dịch huyền phù. Nồng độ tế bào càng cao thì sự tán xạ càng lớn.

Thông thường, để xác định nồng độ tế bào, ta cần phải xác định mật độ quang (OD). Mật độ quang được xác định dựa vào tỷ số giữa cường độ ánh sáng trước khi qua mẫu và sau khi qua mẫu:

Trong đó:

- Aλ là mật độ quang tại bước sóng λ.

- I0 là cường độ sáng trước khi qua mẫu.

- I là cường độ sáng sau khi qua mẫu.

Người ta sử dụng bước sóng λ = 600 nm để xác định nồng độ tế bào theo công thức sau:

[Số tế bào/ml] = A600x(Hệ số chuyển đổi)x(Hệ số pha loãng)

Hệ số chuyển đổi được mặc định là 5x108.

Không giống như phương pháp đo

2.2.2 Các trang thiết bị

23

- Máy quang phổ kế Beckman Coulter DU 730 (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)

Hình 21: Máy quang phổ kế Beckman Coulter DU 730

- Tủ nuôi cấy vi sinh vật (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)

- Bình tam giác, pipetman…

2.2.3 Các bước tiến hành thí nghiệm

2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường

- Lấy 12,5g bột LB (Luria-Bertani) pha với 0.5 ml nước cất, đun nóng cho bột tan hết.

- Rót dung dịch LB vào 10 bình tam giác, mỗi bình 30 ml. Các bình được chia thành 2 nhóm M1 và M2.

- Đem khử trùng các bình ở nhiệt độ 1800C.

2.2.3.2 Cấy vi khuẩn

24

- Đưa vào mỗi bình 1 ml dung dịch E. coli (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)

- Cho lần lượt vào mỗi bình 0 ml, 1.5 ml, 3.0 ml 4.5 ml, 6.0 ml và 7.5 ml dung

dịch chưa hạt nano bạc 100 ppm (ppm = 1/1 000 000 = 10-4%) để được các dung dịch với nồng độ hạt nano bạc 0 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 25 µg/ml.

Hình 22: Các bình nuôi cấy

2.2.3.3 Đo OD

- Ủ các bình trong tủ lắc ở nhiệt độ 300C trong vòng 30 phút.

- Lấy 100 ml dung dịch ở mỗi bình đem đo OD ở bước sóng λ = 600 nm.

- Lặp lại các bước trên 10 lần

25

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân tích dung dịch nano bạc

26

Hình 23: Dung dịch chứa hạt nano bạc ở các nồng độ khác nhau

Phân tích phổ UV-VIS của mẫu dung dịch có nồng độ 100ppm cho thấy sự xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 422nm. Điều này cho thấy sự có mặt của các hạt nano bạc trong dung dịch.

Hình24: Phổ UV-VIS của dung dịch nano bạc nồng độ 100 ppm

Kết quả phân tích từ ảnh TEM cho thấy các hạt nano trong dung dịch có hình cầu với kích thước trung bình khoảng 9-10 nm. Các hạt nano bạc phân tán đều, không bị kết đám cho thấy hiệu quả của việc sử dụng axit oleic làm chất hoạt động bề mặt.

27

Hình 25: Ảnh TEM của mẫu dung dịch nano bạc

3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn khi có mặt của dung dịch nano bạc

Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli bằng phương pháp đo OD, ta có bảng kết quả sau:

Bảng 3: Kết quả đo OD28

KẾT QUẢ ĐO OD0(μg/ml) 5(μg/ml) 10(μg/ml) 15(μg/ml) 25(μg/ml)

M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M20.5 0.154 0.173 0.129 0.121 0.130 0.118 0.145 0.133 0.151 0.1481.0 0.181 0.209 0.123 0.124 0.129 0.133 0.139 0.138 0.148 0.1491.5 0.252 0.301 0.125 0.120 0.127 0.119 0.142 0.136 0.151 0.1522.0 0.421 0.444 0.131 0.124 0.126 0.131 0.141 0.145 0.150 0.1622.5 0.610 0.673 0.117 0.129 0.128 0.121 0.143 0.128 0.151 0.1543.0 0.749 0.877 0.126 0.122 0.125 0.119 0.144 0.140 0.151 0.1553.5 1.262 1.170 0.409 0.127 0.128 0.122 0.146 0.140 0.155 0.1544.0 1.372 1.389 0.144 0.135 0.128 0.123 0.145 0.141 0.156 0.1554.5 1.490 1.521 0.142 0.135 0.137 0.121 0.153 0.149 0.156 0.1575.0 1.612 1.645 0.143 0.139 0.133 0.121 0.148 0.151 0.155 0.1575.5 1.675 1.713 0.107 0.107 0.081 0.077 0.104 0.010 0.111 0.108

Ở hình 26, ta thấy đường cong sinh trưởng của mẫu có nồng độ hạt nano là 0(μg/ml) (không có mặt của các hạt nano bạc) có dạng tương tự như giai đoạn logarit trong lý thuyết. Ở giai đoạn này vi khuẩn phát triển rất nhanh do gặp môi trường nuôi thuận lợi, các tế bào phân chia đều đặn. Sau 11 giờ, mật độ vi khuẩn trong mẫu xấp xỉ là:

1.7x5x108 = 8.5x108 (tế bào/ml)

Hình 26: Đường cong sinh trưởng của E. coli khi không có mặt của nano bạc

29

t (giờ)

OD

Hình 27: Đường cong sinh trưởng của E. coli khi có sự xuất hiện của nao bạc

a) Nồng độ 5(μg/ml)

b) Nồng độ 10(μg/ml)

30

a)

b

t (giờ)

t (giờ)

OD

OD

c) Nồng độ 15(μg/ml)

d) Nồng độ 25(μg/ml)

31

c)

d

t (giờ)

t (giờ)

OD

OD

Hình 28: Đường cong sinh trưởng của E. coli trong tất cả các mẫu

Từ hình 27, tất cả các mẫu có nano bạc, pha lag kéo dài hơn bình thường, pha chỉ số hầu như không xuất hiện chứng tỏ vi khuẩn không thể phát triển được mặc dù được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng và đc ủ ở nhiệt độ thích hợp. Sau 10 giờ, quần thể vi khuẩn trong tất cả các mẫu này đều đạt tới giai doạn tử vong ngay cả khi quần thể vi khuẩn trong mẫu đối chứng chưa đạt tới pha cân bằng. Điều này chứng tỏ hiệu quả kháng khuẩn của nano bạc.

Nguyên nhân của các hiện tượng trên là do các hạt nano bạc liên kết với peptidoglican ở thành tế bào của vi khuẩn gây ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Và sau khi tác động lên màng tế bào vi khuẩn, các hạt nano bạc sẽ thâm nhập vào bên trong tế bào, tương tác với các enzym tham gia vào quá trình hô hấp dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của vi khuẩn.

Điều đáng chú ý là nồng độ tế bào trong tất cả các mẫu có chứa hạt nano bạc đều xấp xỉ nhau ở tất cả các mốc thời gian (mặc dù trong mẫu có nồng độ nano bạc cao hơn, nồng độ vi khuẩn sẽ thấp hơn). Sau 11 giờ, nồng độ vi khuẩn trong tất cả các mẫu có chứa hạt nano bạc đều xấp xỉ là:

0.1x5x108 = 0.5x108 (tế bào/ml)

Chứng tỏ nồng độ tế bào trong các mẫu có nano bạc nhỏ hơn 17 lần nồng độ tế bào trong mẫu không có nano bạc.

32

t (giờ)

OD

Từ kết quả trên ta thấy rằng với mọi nồng độ nano bạc từ 5 μg/ml đến 25 μg/ml đều thể hiện tính kháng khuẩn mạnh với E. coli.

Hình 29: Các bình nuôi sau 8 giờ: Ta thấy bình không có chứa hạt nano (ngoài cùng bên phải) bị vẩn đục chứng tỏ vi khuẩn phát triển mạnh. Các bình còn lại có chứa các hạt nano bạc

bình gần như không đổi mầu.

Trong 10 giờ đầu, mật độ vi khuẩn hầu như không đổi. Trong giai đoạn này vi khuẩn bị ức chế do tác dụng của các ion bạc được giải phóng từ hạt nano bạc. Tuy nhiên cấu trúc tế bào của vi khuẩn vẫn chưa bị phá hủy.

Sau 10 giờ, nồng độ vi khuẩn giảm mạnh cho thấy các tế bào đã bắt đầu bị phá hủy. Tuy nhiên trong bình nuôi cấy cũng có thể có các cá thể có khả năng kháng lại nano bạc tồn tại.

33

3.3 So sánh với phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn

Trong phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn, ta tẩm dung dịch nano bạc vào một đĩa giấy ở nồng độ nhất định, rồi đặt đĩa có tẩm đó lên mặt môi trường thạch có cấy vi khuẩn thử nghiệm trước đó. Dung dịch nano bạc sẽ nhanh chóng khuếch tán trên môi trường thạch ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ[11]. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp ta biết được mức độ kháng khuẩn cuối cùng của dung dịch nano bạc (thể hiện qua bán kính vòng vô khuẩn)[11].

Phương pháp đo OD tuy có phức tạp hơn nhưng lại giúp ta biết được động thái phát triển của quần thể vi khuẩn dưới tác dụng của dung dịch nano bạc. Cụ thể hơn, ta có thể biết được ảnh hưởng của hạt nano bạc lên từng pha sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó xác định xem ở giai đoạn nào quần thể vi khuẩn dễ bị ảnh hưởng bởi hạt nano bạc nhất[2,9].

34

Chương 4: KẾT LUẬN

Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi đã:

1. Thử nghiệm chế tạo hạt nano bạc dạng dung dịch theo các nồng độ từ 5 µg/ml đến 25 µg/ml.

2. Nghiên cứu tác động của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn bằng kĩ thuật OD (trong 11 giờ).

3. Chứng minh được rằng các mẫu nano bạc dạng dung dịch đều thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh với vi khuẩn E. coli.

Định hướng, đề xuất cho các nghiên cứu tiếp theo:

1. Thử nghiệm tính kháng khuẩn của nano bạc với các chủng vi khuẩn gây bệnh khác.

2. Xác định nồng độ tối thiểu của hạt nano bạc để dung dịch có tác dụng kháng khuẩn

3. Nghiên cứu cơ chế tác động của hạt nano bạc lên vi khuẩn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

35

Tiếng việt

[3] Công nghệ nano. Vi.wikipedia.org

http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%B4ng_ngh%E1%BB%87_nano

[4] Công nghệ nano và những ứng dụng trong thực tiễn, Trang 1

www.prt.vn/upload/Nghiencuu/ Congnghenano vaungdung.doc

[5] Giới thiệu về Kính hiển vi. Svtunhien.net, Trang 1

http://svtunhien.net/mybb/printthread.php?tid=693

[6] Nguyễn Hoàng Hải, Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Các hạt nano kim loại. Tạp chí http://vatlyvietnam.org, 2007. Trang 9.

[8] Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Maxreading.com

http://maxreading.com/sach-hay/vi-sinh-vat/sinh-truong-va-phat-trien-cua-vi-sinhvat-37171.html

[13] Nguyễn Minh Trí, Một phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của Chitozan, Trang 1

[14] Nguyễn Ngọc Tú. Nghiên cứu gel nước thông minh nhạy pH lai nano bạc. Khóa luận tốt nghiệp đại học chính quy 2009. Trang 8-9.

Tiếng Anh

36

[1] Anh-Tuan Le*, P.T. Huy, Phuong Dinh Tam, Tran Quang Huy, Phung Dac Cam, A.A. Kudrinskiy, Yu A. Krutyakov, “Green synthesis of finely-dispersed highly bactericidal silver nanoparticles via modified Tollens technique”, Current Applied Physics, Vol. 10, pp. 910-916.

[2] Alesˇ Pana´ cˇek, Milan Kola´ rˇ, Renata Vecˇerˇova´, Robert Prucek, Jana Soukupova´, Vladimı´r Krysˇtof , Petr Hamal, Radek Zborˇil, Libor Kvı´tek, Antifungal activity of silver nanoparticles against Candida spp, Biomaterials 30 (2009), pp. 6333–6340.

[7] List of nanotechnology applications. en.wikipedia.org

http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_nanotechnology_applications

[9] Siddhartha Shrivastava, Tanmay Bera, Arnab Roy, Gajendra Singh, P Ramachandrarao and Debabrata Dash, Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles, Nanotechnology 18 (2007) 225103, pp 9.

[10] Silver. En.wikipedia.org

http://en.wikipedia.org/wiki/Silver

[11] Silver Nanoparticles: A Case Study in Cutting Edge Research. Cnx.org

http://cnx.org/content/m19597/latest/

[12] Preparation of Silver Nanoparticles and Their Characterization. Azonano.com

http://www.azonano.com/article.aspx?ArticleID=2318

[15] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3807907

37