INSTITUTO NACIONAL DE CIENCIAS MÉDICAS Y NUTRICIÓN (SALVADOR ZUBIRÁN) “LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA”

Objetivo

Conocer las características que debe reunir un laboratorio, para poder emplear las técnicas y procedimientos básicos para la aprobación de dicho recinto, así como el manejo que se le da en cada área de investigación y las medidas de precaución que se deben de tomar en cada una de ellas.fig1.1

Introducción

Las personas que trabajan en laboratorios preparan muestras y realizan pruebas, reacciones y análisis para investigaciones y para la detección de enfermedades y patógenos. Trabajan con sustancias químicas, enseres de vidrio, llamas y equipos de laboratorio manuales y automáticos. Aunque los trabajadores de laboratorios hacen experimentos con muestras y reactivos, la seguridad en el laboratorio no debe ser una incógnita.

El laboratorio constituye el lugar de trabajo, en enseñanza e investigación, es preciso conocer las características que debe de reunir, no importando si su importancia, sea en investigaciones a escala industrial o en cualquiera de sus especialidades, ya sea química, dimensional, electricidad, biología.

fig 1.1

El Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición pudimos observar que se encuentra ubicado estratégicamente al sur de la Ciudad de México

El laboratorio debe ser un lugar seguro para trabajar. Para ello se deben tener siempre presente los posibles peligros asociados al trabajo con materiales peligrosos, aunque el trabajo en el laboratorio también requiere la observación de una serie de normas de seguridad que eviten posibles accidentes debido al desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia de las personas que estén en un momento dado, trabajando en el Laboratorio. fig 1.2

Así entonces deberán conocerse las características que debe reunir un laboratorio para su buena acreditación como son:

Localización y orientación del laboratorio Instalaciones fig. 1.3

fig 1.2

fig 1.3

Dentro del hospital visitamos el Laboratorio especializado en el área de Microbiología

Aquí vemos los materiales de construcción de la infraestructura del hospital (laboratorios); se percibe que son materiales de resistencia.

Ventilación y calefacción Iluminación Desagüe Conductos en general Materiales para la construcción Inmuebles de trabajo Seguridad y precauciones en el laboratorio

Dependiendo el tipo de laboratorio estas normas pueden estar sujetas a diversos cambios en medidas de seguridad.

Desarrollo

Acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos

Dichos laboratorios deben de cumplir con ciertas reglas para poder ser acreditados, pues estas reglas son las que deben aplicarse a todo tipo de mediciones objetivas, ya sean o no rutinarias, o como parte de actividades de investigación y desarrollo.

Como cumplimiento de ciertas reglas son:

Personal

Los análisis microbiológicos deben ser realizados o supervisados por una persona con experiencia (fig. 1.4) y con titulación superior en microbiología o equivalente, pues el personal debe tener la necesaria experiencia profesional práctica para que se le permita realizar sin supervisión trabajos cubiertos por el alcance de la acreditación o se considere que tiene experiencia suficiente como para supervisar el trabajo acreditado. (fig. 1.5)

Condiciones Ambientales

Locales

Un laboratorio suele tener áreas de ensayo (dónde se realizan análisis microbiológicos específicos y

actividades relacionadas) y áreas auxiliares (recepción, pasillos, oficinas de administración, guardarropas y aseos, almacenes, archivos, etc.). En general, existen requisitos ambientales específicos para las áreas de ensayo.

Dependiendo del tipo de ensayos que se realicen, el acceso al laboratorio microbiológico debe restringirse al personal autorizado.

fig. 1.4

Cuando existan este tipo de restricciones, el personal debe conocer:

(a) el uso restringido de una determinada área; (fig. 1.6)

(b) las restricciones impuestas al trabajo que puede realizarse en dichas áreas; (c) las razones para imponer esas restricciones;

(d) los niveles de contaminación apropiados.

El laboratorio debe tomar las medidas necesarias para reducir al mínimo el riesgo de contaminación cruzada, siempre que dicho riesgo sea importante. Este objetivo puede conseguirse, por ejemplo, mediante la adopción de las siguientes medidas:

(a) construir el laboratorio conforme a un diseño sin camino de regreso’(fig. 1.7)

fig 1.7

En esta imagen observamos un plano de la ubicación de cada parte y vemos que está desarrollado de una manera inteligente con todos los señalamientos y con las medidas de seguridad.

Las entradas a cada laboratorio del hospital; están libres al paso, con indicaciones de lo que está prohibido hacer y con señalamientos de

fig 1.6

(b) realizar los procedimientos de una manera secuencial utilizando medidas apropiadas para asegurar la integridad de los ensayos y las muestras (por ejemplo, utilizando recipientes herméticos).

(c) separar las actividades en el tiempo o en el espacio.

En general debe ser conveniente que existan áreas separadas o claramente designadas para algunas actividades como por ejemplo:

recepción y almacenamiento de muestras preparación de muestras (por ejemplo, debe utilizarse un área separada

para la preparación de productos en polvo que pueden estar muy contaminados)

examen de muestras, incluyendo su incubación mantenimiento de microorganismos de referencia preparación de medios y equipos, incluyendo su esterilización verificación de la esterilidad descontaminación.

El área de lavado puede compartirse con otras partes del laboratorio siempre que se adopten las debidas precauciones para evitar la transferencia de substancias que afectarían negativamente el crecimiento microbiano.

Los equipos del laboratorio no deben moverse habitualmente entre las distintas áreas, para evitar una contaminación cruzada accidental. En el laboratorio de biología molecular debe disponerse de pipetas, puntas, centrifugadoras, tubos, etc. de uso exclusivo para cada área de trabajo, las cuales deberán ser lo suficientemente espaciosas para mantenerse limpias y ordenadas, al igual deberán mantenerse ventiladas y mantenidas a una temperatura adecuada. Esto puede conseguirse con ventilación natural o forzada, o mediante el uso de aire acondicionado. Cuando se utilice aire acondicionado, se emplearán unos filtros adecuados, que tendrán que inspeccionarse, mantenerse y reponerse según el tipo de trabajo realizado.

Otro aspecto importante en cuanto a condiciones ambientales, es la reducción de contaminación del laboratorio, la cual se reduciría adoptando algunas medidas; tales como:

Superficies lisas en paredes, techos, suelos y mesas de trabajo. No se recomienda el empleo de madera como material de revestimiento

Uniones cóncavas entre suelos, paredes y techos Apertura mínima de ventanas y puertas mientras se estén realizando los

ensayos Instalación de persianas externas Fácil acceso para la limpieza de las persianas internas cuando sea

imposible instalarlas en el exterior;

Las tuberías que transportan líquidos no deben pasar por encima de las superficies de trabajo salvo que estén provistas de un revestimiento herméticamente sellado

Filtros para el polvo en las entradas de aire del sistema de ventilación Instalaciones de lavamanos de accionamiento no manual Armarios hasta el techo Evitar las maderas rugosas y sin revestir Superficies de madera de instalaciones y accesorios debidamente

selladas Materiales y equipos colocados de forma que se facilite su limpieza Ausencia de mobiliario, documentos u objetos que no sean los

estrictamente necesarios para la realización de los ensayos.

Condiciones Ambientales

El laboratorio debe establecer un programa adecuado de vigilancia de las condiciones ambientales que incluya, el uso de placas de sedimentación y frotis de superficies. Se asignarán unos recuentos máximos de microorganismos que se consideran aceptables y existirá un procedimiento documentado en el que se describan las medidas a tomar para corregir las situaciones en que se sobrepasen dichos límites.

Higiene

El laboratorio debe establecer un programa de limpieza para las instalaciones, los equipos y las superficies, teniendo en cuenta los resultados de la vigilancia de las condiciones ambientales y la posibilidad de contaminación cruzada, así mismo, evitar la acumulación de polvo, reduciendo al mínimo el trabajo con papeles en el laboratorio y no permitiendo la presencia de plantas y objetos personales innecesarios en el área de trabajo.(fig. 1.8)

fig. 1.8

Equipos

Mantenimiento

El mantenimiento de los equipos esenciales debe realizarse dependiendo de factores tales como la frecuencia de uso, donde el laboratorio debe adoptar medidas para evitar la contaminación causada por dichos equipos, como:

el material desechable debe estar limpio o estéril, en función de su uso; el material de vidrio reutilizable debe estar debidamente limpio o estéril,

en función de su uso.

El mantenimiento de algunos equipos, consiste en la limpieza y revisión, así como la inspección de daños, verificación general y si es necesario esterilización:

equipos de uso general – aparatos de filtración, recipientes de vidrio o plástico (matraces, tubos de ensayo), placas Petri de cristal o plástico, instrumentos de muestreo, asas de siembra de platino, níquel/cromo o material de plástico desechable

baños termostáticos, estufas, cabinas de seguridad microbiológica, autoclaves, homogeneizadores, refrigeradores, congeladores;

material volumétrico, como pipetas, dispensadores automáticos, sembradores en espiral; (fig.1.9)

instrumentos de medida, como

termómetros, cronómetros, balanzas, pH-

metros, contadores de colonias.

Calibración y verificación de equipos

El laboratorio debe establecer un programa de calibración y verificación de los equipos que puedan influir directamente en los resultados de los ensayos. La frecuencia de esas calibraciones y verificaciones se establecerá en función de la experiencia

fig 2.0

fig. 1.9

documentada y dependerá del uso, el tipo y el funcionamiento previo de los equipos.(fig.2.0)

Reactivos y Etiquetado de las substancias

Reactivos

El laboratorio debe asegurarse de que la calidad de los reactivos utilizados sea apropiada para los ensayos realizados. Debe verificar la idoneidad de cada uno de los lotes de reactivos críticos para el ensayo, al inicio y durante su período de validez, utilizando microorganismos de control positivo y negativo.

Etiquetado

El laboratorio debe asegurarse de que todos los reactivos, medios, diluyentes y otras suspensiones estén debidamente etiquetados, indicando, según sea apropiado, identidad, concentración, condiciones de conservación, fecha de preparación, fecha de caducidad validada y/o períodos recomendados de almacenamiento. Asimismo, los registros deben permitir la identificación de la persona responsable de la preparación. (fig 2.1)

fig 2.1

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

Dentro del laboratorio aprendimos las Medidas de Bioseguridad que deben de haber para recrear un ambiente de trabajo óptimo.

o Todo laboratorio debe de estar ventilado e iluminado adecuadamente, y

los servicios de agua deben de funcionar satisfactoriamente

o Las mesas de trabajo deben confeccionarse de material de superficie

continua sin hendiduras e impermeable, resistente a sustancias corrosivas y fáciles a la limpieza.

o Las paredes y pisos deben de ser lisos para facilitar limpieza con

soluciones desinfectantes.

o Debe de haber áreas de tránsito libre sin obstrucciones algunas.(fig. 2.2)

CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR SUS GRUPOS DE RIESGO

fig. 2.2

Aquí percibimos el área de trabajo, podemos ver que está adecuado con luz tanto solar como artificial, así como con aire acondicionado y el paso está al libre tránsito del personal.

Dentro del área de investigación del laboratorio que visitamos encontramos que estudiaban a los “microorganismos” y se clasifican (de acurdo a si riesgo) de la siguiente manera.

Grupo de Riesgo I

Incluye a los agentes que generan un limitado riesgo para el individuo .Este grupo de microorganismos tiene bajas posibilidades de provocar enfermedades en el hombre o en los animales.

Grupo de Riesgo II

Agrupa a los agentes que representan un riesgo individual moderado. Estos patógenos pueden producir enfermedad pero no implican un riego grave para el personal del laboratorio. (Actinobacter, Aeromas, Mycobacterium)

Grupo de Riesgo III

Aquellos agentes que representan un riesgo individual elevado, suelen provocar una enfermedad grave en el hombre aunque no suele propagarse.(Brucella, Taeniasolium, Triponozomacruzi).

Grupo de Riesgo IV

Tienen un alto riesgo para el individuo y para la comunidad, suelen provocar enfermedades graves para la persona y pueden propagarse fácilmente. (VIH, Virus Ebola, Virus de las fiebres hemorrágicas).

TIPOS DE LABORATORIOS CON RELACION AL NIVEL DE SEGURIDAD

LABORATORIO NIVEL 1

Laboratorio básico que permite la manipulación de microorganismos de bajo riesgo en ambientes, son adecuados para centros de salud, laboratorios clínicos y hospitales de nivel local.

LABORATORIO NIVEL 2

Laboratorios que cuentan con cabinas de bioseguridad y dispositivos de protección personal o de contención física adecuados para el trabajo con microorganismos. Tiene áreas de transito limitado; funciona en hospitales regionales y laboratorios de salud pública.

LABORATORIO NIVEL 3

Este tipo de laboratorios está implementado con áreas de acceso restringido y cabinas de bioseguridad. Son laboratorios de investigación biomédica y de diagnóstico especializado.(fig. 2.3)

.

LABORATORIO NIVEL 4

Es un laboratorio de contención máxima que cuenta con recintos separados o aislados, con sistemas de apoyo exclusivo y en cuya infraestructura incluye barreras de contención adecuados para trabajar con agentes de clase IV. El personal que labora estas áreas deberá traer ropa especial.(fig. 2.4)

fig. 2.3

fig. 2.4

En esta fotografía podemos observar la entrada al área de Mico bacterias, el cual es un laboratorio de Nivel 3

En esta imagen encontramos el CUARTO OSCURO que se usa para observar las muestras de tuberculosis.

Actividades que se desarrollan en el laboratorio de Microbiología Clínica

El laboratorio de Microbiología Clínica se divide en diferentes áreas de trabajo para el estudio de diferentes microorganismos las cuales son: Recepción, Bacteriología, Parasitología, Hemocultivos; Hongos; Anaerobios, Mico bacterias y Antibióticos.(fig. 2.5)

Al laboratorio llagan muestras tanto de los pacientes del hospital como de pacientes externos (provenientes de otros hospitales tanto de la Ciudad de México como de hospitales del interior de la República) entre las cuales pueden ser muestras de orina, sangre, líquidos cefalorraquídeos; muestras de catéter, biopsias, heridas, líquidos de ascitis, aspirados endotraquiales,

muestras de VIH, entre otros.

Una vez que se reciben las muestras pasan al área de recepción en dónde se siembran y se distribuyen a las mesas o aparatos correspondientes.

Todas las muestras líquidas (muestras de sangre, líquidos cefalorraquídeos o líquidos de ascitis) se siembran tanto en medios de cultivo como en soluciones correspondientes, las cuales se registran y se introducen en un aparato llamado VITEK 2 (fig.2.6) , el cual es un aparato que tiene separaciones para introducir las botellas de las soluciones y tengan movimiento para homogenizar la muestra y favorezca el desarrollo bacteriano; una vez que llegue a una curva de crecimiento favorable para su estudio “pita” una alarma para poderlo sacar y comenzar a trabajarlo. Las demás muestras una ve sembradas pasan a las diferentes mesas como son Bacteriología I y II, Parasitología, Hemocultivos, Hongos, Anaerobios y Mico bacterias, donde estudian a fondo el microorganismo para conocer sus características, formas y así saber el diagnóstico de los pacientes.(fig. 2.7)

fig. 2.5

fig 2.7

fig 2.9

Una vez estudiado el microorganismo la muestra se pasa a la mesa de antibióticos (generalmente son cepas multirresistentes) para que dependiendo del tipo de microorganismo se le corran una serie de antibióticos para conocer la sensibilidad y resistencia que tengan los microorganismos a los antibióticos y poder darle un tratamiento óptimo al paciente.(fig. 2.9)

Cada mesa tiene sus propios protocolos, aparatos, y metodologías a seguir para la realización de su trabajo. (Fig 3.0)Un punto importante y que cabe resaltar es la exactitud en cuanto a la entrega de resultados ya que una vez ingresada la muestra al laboratorio tiene cierto lapso de tiempo en el que se deben entregar resultados tanto del

microorganismo que tiene la muestra así como el tratamiento a seguir para la pronta recuperación del paciente, por lo que se debe trabajar con responsabilidad, precisión y veracidad en los resultados que cada mesa arroja, pues esta en juego la salud e incluso la vida de una persona.

Metodología de la mesa de antibióticos

Una vez realizado el procedimiento arriba mencionado, se comienza a trabajar con la cepa que se recibe. Lo primero que se debe hacer es resembrar todas y cada una de las muestras que lleguen a la mesa en un agar llamado “Gelosa Sangre de Carnero” para que la curva de crecimiento del microorganismo tenga aproximadamente 24 hrs. Cuando se tiene el microorganismo en este estado se “cosecha” para posteriormente guardarlo en viales que contengan medio de cultivo (medio glicerado) e introducirlo en Ultra congeladores (con temperatura de -80ªC) y formar lo que se conoce como “Cepario”. Esto se realiza para que si se tiene alguna duda o corrección de los resultados se tenga de donde obtener la muestra.(fig. 3.1)

fig 3.0

El método que se utiliza para conocer la sensibilidad o resistencia de los microorganismos se llama “Micro dilución en placa”, al cual le anteceden una serie preparaciones para poder vaciar en las placas la cepa. Una vez teniendo el microorganismo con curva de crecimiento de 24 hrs. Se toma una porción pequeñísima de cepa y se disuelve en solución salina para poder ajustar al 0.5 en la escala de MC Farland con ayuda de un aparato llamado Nefelómetro; posteriormente se tomas 10 micro litros de esa solución salina y se vierten en 20 mL. de una solución llamada “PBS”, la cual tiene 7.3 de pH. Una vez teniendo de esta manera la cepa se comienza a trabajar con la placa (la cual tiene 84 pozos, se distribuyen en columnas del 1 al 12 y en filas de la “A” a la “H”.) se vacía medio de cultivo (Miuller Hinton Caldo) en los pozos correspondientes de la columna 2 a la 12, dejando la columna 1 vacía. Posteriormente se agrega el antibiótico en las columnas 1 y 2 de la fila “A” hasta la fila “H”, y se comienza a diluir a partir del pozo 2 hasta el pozo 11; de manera que una vez preparada la placa; los pozos de la columna 2 a la 11 tienen medio de cultivo y antibiótico, la columna 1 antibiótico y la columna 12 medio de cultivo. Teniendo de esta manera la placa se introduce la cepa de la fila “A” hasta la “G”; la fila “H” lleva la cepa control, para verificar y saber la sensibilidad o la resistencia al antibiótico.

Esta mesa lleva ciertas líneas de investigación como lo son las “Beta Lacta masas” y “Amp C” las cuales son un mecanismo de resistencia a ciertos antimicrobianos como las cefalosporinas presentes en las cepas.(fig. 3.2)

fig 3.1

En esta imagen encontramos los viales y las cajas en donde se guardan para posteriormente introducirlos en los Ultra congeladores.

fig 3.2

Medio de Cultivo Gelosa Sangre de Carnero

CONCLUSIONES

Como conclusiones podríamos agregar que este trabajo nos ayudó a saber más acerca de la estructura de un laboratorio; así como de los materiales que se usan, las medidas de seguridad; también observamos cómo se trabajaba en un laboratorio y a que ramas de investigación está dirigida el área de éste.

Con esta investigación que realizamos ampliamos nuestro conocimiento y ponemos un tanto en práctica lo visto en clase, además que tuvimos la grata experiencia de conocer un laboratorio a un nivel más avanzado como es el caso del Laboratorio de Microbiología Clínica en el Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán.

Observamos la manera de trabajo, la distribución de cada área laboral en el laboratorio, aprendimos cuáles son los materiales e instrumentos más requeridos así como su uso y manera de trabajar con ellos.

También logramos adentrarnos en el mundo de la microbiología y conocer más a fondo la investigación de estos seres microscópicos. Observamos la importancia, pero también lo dañinos que pueden ser los microorganismos.

Nuestros objetivos fueron logrados ya que conocimos todo lo que requerimos saber de un laboratorio: su distribución, las medidas de seguridad que se deben de seguir, los materiales más usados así como su importancia y clasificación, el área de investigación del laboratorio (microbiología), los distintos tipos de laboratorios, los cuidados requeridos para trabajar y todo lo relacionado en cuanto a la infraestructura de un laboratorio.

BIBLIOGRAFIA

*M.C. Martí (1997) Prevención de Riesgos Biológicos en el Laboratorio. Madrid

Tubos con PBS

Placas para la Micro Dilución

*M. Bultó y Cols (1992). Seguridad y Condiciones de Trabajo en el Laboratorio. Madrid