第二章 基因工程的酶学基础

第二章 基因工程的酶学基础

第一节 限制性内切酶第二节 DNA 连接酶第三节 DNA 聚合酶和反转录酶第四节 DNA 修饰酶第五节 外切核酸酶第六节 单链内切核酸酶第七节 RNA 酶

第二节 DNA 连接酶

剪刀—限制性内切酶

针线、胶水—连接酶

第二节 DNA 连接酶

DNA 连接酶

第二节 DNA 连接酶

一、概念与机理 　　　 DNA 连接酶是 1967 年在三个实验室同时发现的。它是

一种能够将 DNA 链上彼此相邻的 3’- 羟基（ OH ）和 5’-磷酸基团（ -P ），在 NAD+ 或 ATP 供能的作用下，形成磷酸二酯键。大肠杆菌和其他细菌的 DNA 连接酶以 NAD+ 作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以 ATP 作为能量来源。 　　

第二节 DNA 连接酶

一、概念与机理

　　　 DNA 连接酶只能连接缺口（ nick ），不能连接裂口（ gap ）。而且被连接的 DNA 链必须是双螺旋 DNA 分子的一部分。 注意：缺口（或称切口）和裂口的区别！！！！！

注：关于“ Gap” 与“ Nick” 的概念。

1.Gap 裂口：即 DNA 裂口，是指双链 DNA 分子上的某一条链失去一个或数个核苷酸时所出现的 DNA 单链断裂。 Gap in DNA is the absence of one or more nucleotides in one strand of duplex. 2.Nick 缺口：即双链 DNA 分子的单链断裂，即在相邻的2 个核苷酸分子之间，失去了 ( 移走了 ) 一个磷酸二酯链。 Nick in duplex DNA is the absence of a phosphodiester bond between two adjacent nucleotides on one strand.

第二节 DNA 连接酶

DNA 连接酶对不同 DNA 分子的连接作用

第二节 DNA 连接酶

二、 DNA 连接酶的种类 （一） T4 噬菌体 DNA 连接酶

　特点：

只连接 ds -DNA 分子，要求 3’- 羟基和 5’-

磷酸基

　用途：

1) 粘性末端的连接

2) 平头末端的相连

抑制剂 :

PO43->5mM , NaCl>25mM, Ca2+>0.1mM

第二节 DNA 连接酶

二、 DNA 连接酶的种类 ( 二）大肠杆菌 DNA 连接酶

　　连接具粘性末端 DNA 分子，以 NAD 作辅助因子

( 三）热稳定 DNA 连接酶

　　以 NAD 为辅助因子，优先作用于缺口

连接酶使用注意事项

　　 1)DNA 连接酶不能催化两单链 DNA 分子连接；

　　 2) 只能连接双链 DNA 分子的单链切口 (nick) ；

　　 3) 不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的缺口（ gap ）。

DNA 连接酶的部分性质

连接酶底物

辅助 因子

巯基 试剂粘性末端 平末端 DNA-RNA

杂合体 RNA-RNA 杂合体

大肠杆菌 DNA 连接酶

可行 可行 不行 不行 NAD+

Mg2+ 不需要

T4DNA 连接酶

可行 可行 可行 可行 ATP Mg2+

需DTT

噬热菌 DNA 连接酶

可行 不行 不行 不行 NAD+

Mg2+ 需要

第二节 DNA 连接酶DNA 连接酶应用图解 （一）分子间的连接

（二）分子内的连接

第二节 DNA 连接酶

三、 DNA 连接酶的反应体系

四、影响连接反应的因素

　　 1. 插入片段与载体的浓度比例： 2-10:1

　　　 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象

　　 2. 反应温度：一般 4~16 ℃

　　 3. ATP 浓度

10×T4 DNA Ligase Buffer 1μl

pMD18-T （ 30ng/μl ） 1μl

已纯化的 PCR 产物 Xμl*

T4 DNA Ligase 2~3Weiss Units

ddH2O 至 10μl

第二节 DNA 连接酶

平末端 DNA 片段的连接 ( 补充 )

1. 同聚物加尾法

第二节 DNA 连接酶

平末端 DNA 片段的连接 ( 补充 )

2. 衔接物连接法

第二节 DNA 连接酶

平末端 DNA 片段的连接 ( 补充 )

3.DNA 接头（ adaptor ）连接法 问：衔接物和DNA 接头有什么区别？？？

衔接物（ linker ）是一种人工合成的双链 DNA 短片段，其上具有一个或数个在将与其连接的载体 DNA 上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规方法连接的方法，提高平齐末端间的连接作用效率。也可利用接头进行 DNA平齐末端门的连接。 接头（ adaptor ）是一种具有粘性末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与载体相连。

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

DNA 聚合酶 3’5’ 外切酶活性

5’3’ 外切酶活性

聚合速率 持续能力

大肠杆菌 DNA 聚合酶 低 有 中 低

Klenow fragment 低 无 中 低

T4 DNA 聚合酶 高 无 中 低

T7 DNA 聚合酶 高 无 快 高

化学修饰 T7DNA 聚合酶 低 无 快 高

遗传修饰 T7DNA 聚合酶 无 无 快 高

逆转录酶 无 无 低 中

Taq DNA 聚合酶 无 有 快 高

　　 DNA 聚合酶（ DNA polymerase) 是指能在引物和模板的存在下，将脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链 DNA 分子引物链的 3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。分为：依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶和依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶。

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

一、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I

　　 1957 年，美国的生物学家 A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种 DNA 聚合酶，即现在所说的DNA 聚合酶Ｉ。

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

CCG

GGCTATCGG

E.coli DNApolI

Mg 2+ ， 4dNTP

CCGATAGCC

GGCTATCGG

1. 5’→3’ 聚合酶活性

GATAGCC

AGCTATCGG

TCGATAGCC

AGCTATCGG E.coli DNApolI

Mg 2+

+ pC ， pT5′

TCGATAGCC

AGCTAT E.coli DNApolIMg 2+ TCGATA

AGCTAT+ pC ， pG ， pC

5′

2. 5’→3’ 外切酶活性

3. 3’→5’ 外切酶活性

DNA 聚合酶的三种活性

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

一、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 用途： 1 ） 除去 3’- 端突起的单链 DNA （在无 dNTP 时） 2 ） 补齐 5’-突起端 3 ） 合成第二条 cDNA 4 ） 切口移位制备探针 其中用途 2) 和 3) 常用大片段

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

二、 Klenow 片段

　（一）基本性质

　　　大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N 端三分之二的大肽段，即 Klenow 片段。

　　　 Klenow 片段仍拥有 5`→3` 的 DNA 聚合酶活性和3`→5` 的核酸外切酶活性，但失去了 5`→ 3` 的核酸外切酶活性。

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

二、 Klenow 片段

　（二）用途

1. 3’ 端补平：补平限制性内切酶切后形成的 3’隐蔽端。

2. DNA 3’ 末端标记 : 在 3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP 。

5’

klenow

klenow

5’

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

二、 Klenow 片段

　（二）用途

3. cDNA第二链的合成

•

mRNA

cDNA第一链逆转录

cDNA第二链

klenow

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

引物

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

三、 T4 噬菌体 DNA 聚合酶 （一） T4 DNA 酶的基本特性 　　　有 3`→5` 的核酸外切酶活性和 5`→3 的 DNA 聚合酶活

性（降解单链更快） 。 　　　在无 dNTP 时，可以从任何 3`-OH 端外切 　　　在四种 dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶三、 T4 噬菌体 DNA 聚合酶 （二）用途

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

四、 T7 噬菌体 DNA 聚合酶与测序酶

　（一） T7 噬菌体 DNA 聚合酶

　　　从 T7 噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成，已知 DNA 聚合酶中持续结合能力最强的一个。

　（二） T7 噬菌体 DNA测序酶

　　　通过对 T7DNA 聚合酶进行化学修饰，去除 3’5’ 外切酶活性，使 DNA 聚合能力和聚合速率提高了 3倍。

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

五、 Taq DNA 聚合酶 来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种 。 结构：单亚基 MW=94000d 。 特点：热稳定性， 70 ℃ 反应 2 h残留活性为原来的

90% ； 93 ℃ 反应 2 h残留活性为原来的 60% ； 94 ℃反应 2 h残留活性为原来的 40% 。 活性：聚合最适温度为 75-80℃，不具 3’ →5 ’ 外切酶活性，具 5’→3’外切活性 。

　用途： 1. PCR 反应。 2. 测序，高温下进行 DNA 合成可减少模板二级结构。

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

五、逆转录酶（ reverse transcriptase ）

　　　依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（ RNA 指导的 DNA 聚合酶）。

　来源商品反转录酶有两种： 来自禽类成髓细胞瘤病毒 (AMV)(42℃) 。 来自能表达Moloney鼠白血病毒 (M-MLV) 反转录酶基因的 E.coli(37 ℃) 。

　结构和活性：酶类别 肽链 5’-3’ 聚合活性 RNAseH

AMV α62 ， 000

β94 ， 000

+ +++

M-MLV 84 ， 000 + +

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶

五、逆转录酶（ reverse transcriptase ）

　用途：

　　　 (1) 5’ → 3’ 聚合酶活性 , 能以 RNA 或 DNA模板合成 DNA 分子；

　　　 (2) RNA 酶 H 活性：对 RNA:DNA 杂交体中的 RNA 特异性地降解，免除了在反转录完成后再用 NaOH降解 RNA模板的步骤。

　　　 (3) 用于３’凹陷末端的标记，杂交探针的制备和 DNA序列测定。

第三节 DNA 聚合酶和反转录酶五、逆转录酶（ reverse transcriptase ）

RNaseH 活性

第四节　 DNA 修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶

来源及特点：　 　　　简称末端转移酶（ terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) ，

能催化 5’脱氧核苷三磷酸进行 5’→3’ 方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性 DNA 分子的 3’-OH 末端。

　它不需要模板，可以用含有的 3’-OH DNA 片段为引物，在3’-OH 端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有 3’-OH 末端的单链 DNA ，也可以是具有 3’-OH突出末端的双链 DNA 。

用　途： 　　　 1. 催化 [α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记 DNA 片断的 3’ 末端。 　　　 2. 催化非放射性的标记物掺入到 DNA 片断的 3’- 末端： 生物

素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。 　　　 3. 用于在平头 DNA 上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末

端。

第四节　 DNA 修饰酶

末端转移酶功能图解

第四节　 DNA 修饰酶

3‘突出末端

二、 T4 噬菌体多核苷酸激酶

来源

从 T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。

功能

催化磷酸从 ATP 转给双链或单链 DNA 或 RNA 的 5’-OH 端。

　　　　　　不论 5’-OH 端突出与否。 用途： DNA 5’-OH 端磷酸化、标记 DNA 的 5’ 端。

5’ 3’ HO- -OH5’

3’ HO- -OH

3’ P- -OH5’

3’ HO- -P 5’

ATP T4 多核苷酸激酶

第四节　 DNA 修饰酶

三、碱性磷酸酶 1 ）碱性磷酸酶种类 　　　 细菌性碱性磷酸酶（ Bacterial alkaline phosphatase ， BAP ），从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。

　　　小牛肠碱性磷酸酶（ Calf intestinal alkaline phosphatase ， CIAP ），从小牛肠中纯化出来。加热 68 ℃ 可完全失活。

2 ）碱性磷酸酶的特性 　　　 催化脱掉 DNA （或 RNA ） 5’ 端的磷酸根。

3’ HO- -P 5’

3’ HO-

-OH 5’ 3’

HO- -OH

碱性磷酸酶

5’ P- -OH 3’

5’

第四节　 DNA 修饰酶

第四节　 DNA 修饰酶

3)碱性磷酸酶的功能 防止线性化的载体份子自我连接

其中每条链上都有一个 nick ，但转入细菌后会被修复。

第四节　 DNA 修饰酶

第五节 外切酶核酸（自学）

　　　核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。

一、作用于单链的核酸外切酶

　　　如：大肠杆菌核酸外切酶 I （ exo I ）；大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（ exo Ⅶ ）

二、作用于双链的核酸外切酶

　　　如：大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（ exo Ⅲ ）；噬菌体核酸外切酶（ exo ）； T7 噬菌体基因 6 核酸外切酶

三、既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶

　　　如： Bal 31 核酸酶

DNA 外切酶 切割方式 识别位点

单链 大肠杆菌核酸外切酶 I （ exo I ） 5’3’ 5’-OH

大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（ exo Ⅶ ）

5’3’

3’5’

5’-P

3’-OH

双链 核酸外切酶Ⅲ（ exo Ⅲ ） 3’5’ 3’-OH

噬菌体核酸外切酶（ exo ） 5’3’ 5’-P

T7 噬菌体基因 6 核酸外切酶 5’3’ 5’-P

5’-OH

单、双链 Bal 31 核酸酶 5’3’

3’5’

3’-OH

不同核酸外切酶的特性比较

第五节 外切酶核酸

第五节 外切酶核酸

第六节 单链内切核酸酶

　一、 S1 核酸酶 　　来源：来源于稻谷曲霉（ Aspergillus oryzae ） 　　功能：是一种高度单链特异的核酸内切酶。 　注意： 　对双链 DNA 、双链 RNA 和 DNA-RNA 杂交体相对不敏感。 酶量大可完全消化双链， 中量，可在切口或小缺口处切割双链 　　用途： 　　　 (1)测定核酸分子的杂交程度；　　　 (2) 去除 DNA 片段中突出的单链尾巴； 　　　 (3)打开 cDNA 合成时形成的发夹环结构。

一、 S1 核酸酶

第六节 单链内切核酸酶

一、 S1 核酸酶

第六节 单链内切核酸酶

一、 S1 核酸酶

第六节 单链内切核酸酶

第六节 单链内切核酸酶一、 S1 核酸酶 S

1

的用途：合成C

DN

A

时切除单

链环

二、脱氧核糖核酸酶 I （ DNase I ）

　　来源于牛胰脏，分子质量为 31ku ，是一种糖蛋白。

用途：

　　 1. 与大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 一起参加切口平移

　　 2. 制作 DNA文库 　　 3. 使用 DNaseI足迹法测定 DNA结合蛋白在 DNA 上的精确结合位点

　　 4. 去除转录产物中的模板 DNA

第六节 单链内切核酸酶

第七节 RNA 酶

一、核糖核酸酶 A （ RNase A ）

　　　来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶。可特异地攻击 RNA 上嘧啶残基的 3‘ 端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。反应终产物是嘧啶 3’ 磷酸及末端带嘧啶 3‘ 磷酸的寡核苷酸。

用途：

　（ 1 ）从 DNA-RNA 或 RNA-RNA 杂合体中去除未杂合的 RNA 区

　（ 2 ）确定 DNA 或 RNA 中单碱基突变的位置　（ 3 ） RNA检测 　（ 4 ）降解 DNA 制备物中的 RNA 分子

　二、核糖核酸酶 H （ RNase H ）

　　　核糖核酸酶 H(RNaseH) 催化 DNA-RNA 杂合体的RNA 部分的核内降解，产生不同链长带 3‘ 羟基和 5’ 磷酸末端的寡核糖核酸。

第七节 RNA 酶

用途：

　在 cDNA克隆，合成第二链之前去除RNA 。

小　结

酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N

习 题

1.       片段大小 2450 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N2.       两单酶切成三个片段 ,说明各有两个切点 ------p------- p--------- 750 500 12003 .Pst1, 1200, 750不见 , 说明 :(1) 另外两个酶的切点在其中 ---x-----p------p---x------ Xbo1 500 (2) 两个 Pst1酶的切点相距 500 500 ---1200---4. 1200---300+900( 被 Xbo1) ---x-----p------p--- x----- 300 900 Pst1 距 Xbo1 为 300 --750----5. 750—150+600 ----x------p-----p---x----- 150 600 Pst1 距 Xbo1 为 600 -------1400-------6. 1400—600+500+300 ---x------p------p---x----- 600 500 300  -------------2450-------------7. 2450-150+600+500+300+900 ---x------ p------ p----x----- 150 600 500 300 900

酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N