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第二章 基因工程的酶学基础第二章 基因工程的酶学基础Enzymes

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本章节内容本章节内容

第一节 限制性核酸内切酶第二节 DNA 连接酶第三节 DNA 聚合酶第四节 DNA 修饰酶第五节 核酸外切酶第六节 单链核酸内切酶

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本章学习内容本章学习内容

重点讨论限制性核酸内切酶和重点讨论限制性核酸内切酶和 DNADNA 连接酶连接酶在在 DNADNA 切割和连接中的应用，并简要介绍切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。 其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。

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一、限制性核酸内切酶

第一节 限制性核酸内切酶

是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割 DNA 双链的核酸内切酶。

（ Restriction endonuclease ）

55

2. 性质 内切酶

主要来源于原核生物

即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成 5’-P 和 3’-OH 末端

自我保护作用3. 功能

细菌的限制和修饰系统（ R/M 体系）

1. 来源

66

77

限制性内切酶将侵入细菌体内的外源 DNA 进行分解，切成小片断。

（ 1 ）限制（ Restriction ）

88

细菌自身的 DNA 碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。

（ 2 ）修饰（ Modification ）

① Dam 甲基化酶 (DNA Adenine Methylase)GATC 腺嘌呤 N6 位置引入甲基

② Dcm 甲基化酶 (DNA cytosine Methylase)

CCAGG 或 CCTGG 序列在第二个 C 上 C5 位置上引入甲基

99

1010

（ 3 ）限制与修饰系统相关的三个基因

① hsd R: 编码限制性内切酶

② hsd M: 编码限制性甲基化酶

③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达

这类酶能识别 DNA 分子上的特定位点，并将双链 DNA 切断

这类酶使 DNA 分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNA 的作用。

作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。

1111

1973 年 H.O Smith 和 D. Nathans 提议的命名系统，命名原则如下：

二、限制性内切酶的命名

1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。

大肠杆菌（ Escherichia coli ）用 Eco 表示；流感嗜血菌（ Haemophilus influenzae ）用 Hin 表示

1212

2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。

如 Hind Ⅱ ： d 菌株

EcoR I ：抗药性 R 质粒

1313

3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。 如 Hind Ⅱ ： d 菌株中发现的第二个酶4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为 R ，甲基化酶为M 。

如 R.Hind ⅢⅢ表示限制性内切酶表示限制性内切酶

MM..HinHind Ⅲ d Ⅲ 表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶

实际应用中，实际应用中， RR常被省略。常被省略。

1414

Ⅰ 型限制性内切酶

目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。主要的三种：

三、限制性内切酶的类型

Ⅱ 型限制性内切酶

Ⅲ 型限制性内切酶

1515

首先由 M.Meselson 和 R.Yuan 在 1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。

（ 1 ）识别位点序列

EcoB ： TGA(N)8TGCT

EcoK ： AAC(N)6GTGC

1. Ⅰ型限制性内切酶的基本特性

如 EcoB和 EcoK。

未甲基化修饰的特异序列。

1616

需 ATP 、 Mg2+ 和 SAM （ S- 腺苷甲硫氨酸）

（ 3 ）辅助因子

在距离特异性识别位点约 1000—1500 bp 处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大

Recognize site cut

1-1.5kb

（ 2 ）切割位点

1717

首先由 H.O. Smith 和 K.W. Wilcox在 1970年从流感嗜血菌中分离出来。

（ 1 ）识别位点序列

未甲基化修饰的双链 DNA 上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。

与 DNA 的来源无关，即没有种的特异性。

2. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性

分离的第一个酶是 Hind Ⅱ基因工程用途最大

1818

稀有切割限制酶（ rare cutter ）

可以识别 6 个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。

如 Not II （ GCGGCCGC ）

某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。

如 Hind Ⅱ可识别 4 种核苷酸序列：

Y: C 或 T R: A 或 GGTYRAC -3’5’

-

1919

EcoEcoR I 5’-R I 5’-GGAATTCAATTC--3’ 3’ 3’-3’-CTTAACTTAAGG-5’-5’

PstPst I 5’-CTGCA I 5’-CTGCAGG--3’ 3’ 3’-G3’-GACGTCACGTC-5’-5’ 产生粘性末端产生粘性末端

EcoEcoR V 5’-R V 5’-GATGATATCATC--3’3’ 3’-3’-CTACTATAGTAG-5’-5’ 产生平齐末端产生平齐末端

（ 2 ）切割位点

切开双链 DNA ，形成粘性末端（ sticky end ）或平齐末端（ blunt end ）。如：

识别位点处

2020

含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：

GAATTC

CTTAA GG AATTC

CTTAAG5’- -3’3’- -5’

5’- -3’3’- -5’

[1] 粘性末端（ sticky ends ， cohensive ends ）

ⅰ） 5’ 端凸出（如 EcoR I 切点）

2121

CTGCAG

GACGTC

5’- -3’

3’- -5’

5’- -3’3’- -5’

CTGCA G G ACGTC

ⅱ） 3’ 端凸出（如 Pst I 切点）

2222

i ）不同的 DNA 双链：

只要粘性末端碱基互补就可以连接。

ii ）同一个 DNA 分子内连接：

通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

这比连接两个平齐末端容易得多。

[2] 粘性末端的意义

① 连接便利

2323

2424

B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如 dA 和 dT ），即同聚物加尾造成人工

粘性末端。

A 末端可用 DNA多核苷酸激酶进行 32P标记。

粘性末端可以用 DNA 聚合酶补平成平齐末端。

② 末端标记

③ 补平成平齐末端

2525

[3] 平齐末端（ blunt end ）

在识别序列的对称轴上同时切割

5’- GATATC -3’

3’- -5’CTATAG

如 EcoR V

2626

[4] 平齐末端的特点

连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的 1%，这种连接常出现多联体连接。

粘性末端与平齐末端连接的处理方法

ⅰ）添补法：

利用 DNA 聚合酶Ⅰ (klenow fragment ）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。

2727

ⅱ）削除 (平 )法

利用 S1 和 Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端

2828

不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。

识别位点和切点完全相同

如 Hind Ⅲ 和 Hsu IHinHind 5’-AⅢd 5’-AⅢ AGCTT-3’ AGCTT-3’ 3’-TTCGA3’-TTCGAA-5’A-5’

HsuHsu I 5’-A I 5’-AAGCTT-3’ AGCTT-3’ 3’-TTCGA3’-TTCGAA-5’A-5’

[5] 同裂酶（ Isoschizomer)

① 完全同裂酶：

2929

XmaXma I 5’-C I 5’-CCCGGG -3’ CCGGG -3’ 3’-GGGCC3’-GGGCCC-5’C-5’

SmaSma I 5’-CCC I 5’-CCCGGG-3’ GGG-3’ 3’-GGG3’-GGGCCC-5’CCC-5’

识别位点相同，但切点不同。

如 Xma I 和 Sma I 。

② 不完全同裂酶：

3030

识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I 、 Bgl Ⅱ 、 Bcl I 、 Xho Ⅱ等

5’-G5’-GGATCGATCC-3’ C-3’ 3’-3’-CCTAGCCTAGG-5’G-5’

BamBamH IH I

BclBcl I I 5’-T5’-TGATCGATCA-3’ A-3’ 3’-3’-ACTAGACTAGT-5’T-5’

5’-5’-AAGATCGATCT-3’ T-3’ 3’-3’-TCTAGTCTAGA-5’A-5’Bgl Bgl ⅡⅡ

5’-5’-UUGATCGATCY-3’ Y-3’ 3’-Y3’-YCTAGCTAGU-5’ U-5’ XhoXho Ⅱ Ⅱ

UU代表嘌呤；代表嘌呤； YY代表嘧啶。代表嘧啶。

[6] 同尾酶 (Isocaudamers ）

3131

5’-5’-GATCGATC----3’ ----3’ 3’----3’----CTAGCTAG-5’-5’

Sau 3A

同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。

5’-G5’-G3’-C3’-CCTAGCTAG

GATCGATCTT-3’ -3’ AA-5’-5’BamH IBamH I Bgl ⅡBgl Ⅱ

5’-G5’-GGATCGATCTT-3’ -3’ 3’-C3’-CCTAGCTAGAA-5’-5’BamH IBamH I Bgl ⅡBgl Ⅱ

Sau 3A

3232

限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、 pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。

如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（ *）活性。

所以一般使用专一的反应缓冲液。

[7] 限制酶的酶活性

① 星号（ *）活性

3333

EcoR I 和 BamH I等都有 * 活性。

在低盐、高 pH （ >8）时可识别和切割

GAATTA 、 AAATTC 、 GAGTTC等

GAATTCEcoR I ：

使用的时候要特别注意！

7

3434

② 诱发星号（ *）活性的原因

ⅰ）高甘油含量ⅱ）内切酶用量过大ⅲ）低离子强度ⅳ）高 pHⅴ）含有机溶剂，如乙醇ⅵ） Mn2+ 、 Mg2+ 、 Cu2+ 、 Zn2+等二价阳离子的存在

酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件

3535

在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割 DNA 双链。

移动切割（ shifted cleavage):

GACGCNNNNNGACGCNNNNN

Hga Hga II

CTGCGNNNNNNNNNNCTGCGNNNNNNNNNN5’3’

[8]Ⅱs型限制性内切酶

3636

（ 3 ）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能

Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。

它们识别相同的 DNA 序列，但功能不同。

如 EcoR I 限制性内切酶和 EcoR I 甲基化酶

前者： 5’-’-GGAATTCAATTC-3’ -3’ 3’-3’-CTTAACTTAAGG-5’-5’后者：后者： 5’-5’-GGAAAA**TTCTTC-3’ -3’ 3’-3’-CTTCTT**AAAAGG-5-5

作用的位点也不相同作用的位点也不相同

3737

（ 4 ） II型限制性内切酶对单链 DNA 的切割

定义为切割双链 DNA ，但有一些还可以特异识别并切割单链 DNA 的相应位点，只是切割效率比较低

如：如： HHhahaⅠ切割单链 DNA比

切割双链 DNA效率低 50％

3838

3. Ⅲ类限制性内切酶

在完全肯定的位点切割 DNA ，但反应需要ATP 、 Mg2+ 和 SAM （ S- 腺苷蛋氨酸）。

在基因工程操作中用途不大。

EcoEcoP1: AGACCP1: AGACC

EcoEcoP15: CAGCAGP15: CAGCAG

3939

核酸限制性内切酶的类型及主要特性核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性特性 ⅠⅠ类内切酶类内切酶 Ⅱ类内切酶 ⅢⅢ类内切酶类内切酶

限制和修限制和修饰活性饰活性

单一多功能的酶单一多功能的酶 内切酶和甲基化酶分开

共同亚基的双功共同亚基的双功能酶能酶

内切酶的内切酶的蛋白结构蛋白结构

33 种不同的亚基种不同的亚基 单一成分 22 种不同的亚基种不同的亚基

限制作用限制作用所需要的所需要的辅助因子辅助因子

ATPATP 、 、 MgMg2+2+ 和和SAMSAM

Mg2+ ATPATP 、 、 MgMg2+2+ 和和 SAMSAM

寄主特异寄主特异性位点识性位点识别序列别序列

EcoEcoBB：： TGA(N)TGA(N)88TGTGCT CT EcoEcoKK：： AAC(N)AAC(N)66GTGCGTGC

回文序列（Ⅱ s型除外）

EcoEcoP1:AGACP1:AGACCC

EcoP15:CAGEcoP15:CAGCAGCAG

4040

切割位点

在距离识别位点至少 1000bp 处随机切开一条单链

位于寄主特异性位点或其附近

距寄主特异性位点 3’端 24－ 26bp 处

酶催转换 不能 能 能DNA易位作用 能 不能 不能甲基化作用的位点 寄主特异性位点 寄主特异性

位点寄主特异性位点

识别未甲基化的序列进行切割 能 能 能

序列特异的切割 不是 是 是基因工程中的用途 无用 十分有用 用处不大

4141

四、限制性内切酶酶解反应条件

1. 标准酶解体系的建立

一个单位（ U）的限制性内切酶定义：

在合适的温度和缓冲液中，在 20μl 的反应体系中，1h完全酶解 1μgDNA 所需要的酶量。

推荐：稍过量的酶（ 2-5倍）和较长的反应时间

4242

2. 酶解过程

配酶解体系

混匀

反应终止

酶解结果鉴定

4343

① 酶解体系

一般 20μl ，保证酶液体积不超过反应总体积的 10%前提下，尽量降低反应总体积。

加样顺序一般是：

ddH2O buffer DNA 酶

4444

大部分大部分 II II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：大部分大部分 II II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：

Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl 50 mM pH 7.550 mM pH 7.550 mM pH 7.550 mM pH 7.5

MgClMgCl22MgClMgCl22 10 mM10 mM10 mM10 mM

NaClNaClNaClNaCl 0 - 150 mM0 - 150 mM0 - 150 mM0 - 150 mM

DTTDTTDTTDTT 1 mM1 mM1 mM1 mM

0 - 50 mM 0 - 50 mM 低盐酶低盐酶0 - 50 mM 0 - 50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 100 mM 中盐酶中盐酶100 mM 100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶

VolumeVolumeVolumeVolume 20 - 100 ml20 - 100 ml20 - 100 ml20 - 100 ml

T TT TT TT T 37 37 ℃ ℃ 1 - 1.5 hr1 - 1.5 hr37 37 ℃ ℃ 1 - 1.5 hr1 - 1.5 hr

4545

② 混匀

移液枪吹打或手指轻弹管壁

若底物分子很大（如基因组 DNA ），应避免强烈振荡。

混匀后微量高速离心机进行短

暂离心，使管壁液体全部下沉。

4646

③反应终止

三种方法：

ⅰ）加乙二胺四乙酸（ EDTA ）至终浓度

10mmol/L; 加十二烷基硫酸钠（ SDS ）

至终浓度0.1%(W/V)

ⅱ） 65℃加热 20min 或者 70℃加热 10min

ⅲ）酚 /氯仿抽提

4747

④ 酶解结果鉴定

快速进行微型琼脂糖凝胶电泳

观察

然后决定是否终止反应

4848

酶切后发现除了目的酶切后发现除了目的 DNADNA条带外，还有其它条带条带外，还有其它条带

酶存在“星号”活性，造成非特异性切割；酶存在“星号”活性，造成非特异性切割；不正确的操作，导致其它内切酶污染；不正确的操作，导致其它内切酶污染；底物底物 DNADNA 中可能存在其它中可能存在其它 DNADNA污染。污染。

电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常 底物底物 DNADNA 不纯；不纯；内切酶不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与酶蛋白自身或其它杂蛋白与 DNADNA结合在一起使结合在一起使电泳条带移动距离异常电泳条带移动距离异常

4949

3. 限制性内切酶对 DNA 分子的消化

1986 年 J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现Ⅱ型限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。

CTTAAGGAATTC

（ 1 ）内切酶与识别序列的结合模式

5050

内切酶在 DNA 上的所有识别位点都被切开

1 2 3 4

1 2 3 4

（ 2 ） 完全消化

5151

只有有限数量的酶切位点被切开

通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。

1 2 3 4

1 4

（ 3 ） 局部消化

5252

（ 4 ） 几种常用限制酶识别位点

5353

5454

AATT AATT ACGT ACGT AGCT AGCT ATAT ATAT CATG CATG CCGG CCGG

**** ****

******** MaeII MaeII HpaⅡHpaⅡcc

MspIMspIcc

******* * Alu I Alu I

********

AA****T ****T Nla ⅢNla ⅢA*A****T ***T ApoIApoI HindHind

Ⅲ ⅢAfl IIIAfl III AgeIAgeI

BsrFI BsrFI

A**A****T **T

A***A****T *T SspI SspI

A****A****T T

（ 5 ）限制性内切酶识别序列的交叉列表

5555

AATT AATT ACGT ACGT AGCT AGCT ATAT ATAT CATG CATG CCGG CCGG

A****A****T T Nsp75Nsp7524 24

CC****G ****G NcoINcoI

StyIStyI

Dsa IDsa I

XmaIXmaI

AvaI AvaI

C*C****G ***G NdeI NdeI

C**C****G **G Pml IPml I

BsaAI BsaAI

PvuIIPvuII

NspBINspBIII

SmaI SmaI

C***C****G *G

C****C****G G

GG****C ****C EcoRIEcoRI

ApoI ApoI

NgoMINgoMI

BsrFI BsrFI

5656

AATT AATT ACGT ACGT AGCT AGCT ATAT ATAT CATG CATG CCGG CCGG

G*G****C***C BseHI BseHI

G**G****C**C Ecl136II Ecl136II EcoRVEcoRV NaeI NaeI

G***G****C*C

G****G****C C AatII AatII SacISacI

BanIIBanII

HgiAIHgiAI

Bsp1286Bsp1286

SphISphI

Nsp752Nsp7524 4

TT****A ****A BspHI BspHI BspMII BspMII

T*T****A ***A

T**T****A **A SnaBISnaBI

BsaAIBsaAI

T***T****A *A

T****T****A A

5757

CGCG CGCG CTAG CTAG GATC GATC GCGC GCGC GGCC GGCC

**** **** MboIMboIcc

Sau3AISau3AIcc

******** BfaI BfaI HinpI HinpI

******* * BstUI BstUI DpnI DpnI HaeIII HaeIII

******** HhaIHhaI

AA****T ****T

A*A****T ***T MluIMluI

Afl III Afl III

SpeI SpeI Bgl IIBgl II

BstYI BstYI

A**A****T **T

A***A****T *T Eco47III Eco47III StuI StuI

A****A****T T

5858

CGCG CGCG CTAG CTAG GATC GATC GCGC GCGC GGCC GGCC

A****A****T T HaeIIHaeII

CC****G ****G DsaI DsaI AvrIIAvrII

StyI StyI

EagIEagI

EaeIEaeI

GdiIIGdiII

C*C****G ***G

C**C****G **G NspBII NspBII

C***C****G *G SacII SacII PvuI PvuI

C****C****G G BsiEI BsiEI BsiEI BsiEI

GG****C ****C BssHII BssHII NheI NheI BamHIBamHI

BstYI BstYI

KasIKasI

BanI BanI

Bsp120I Bsp120I

5959

CGCG CGCG CTAG CTAG GATC GATC GCGC GCGC GGCC GGCC

G*G****C***C NarINarI

BsaHI BsaHI

G**G****C**C

G***G****C*C

G****G****C C

TT****A ****A BbeIBbeI

HaeII HaeII

ApaIApaI

BanIIBanII

Bsp128Bsp12866

T*T****A ***A XbaI XbaI Bcl I Bcl I EaeI EaeI

T**T****A **A NruI NruI FspI FspI MscI MscI

T***T****A *A

T****T****A A

6060

GTAC GTAC TATA TATA TCGA TCGA TGCA TGCA TTAA TTAA

**** ****

******** Csp61 Csp61 TaqI TaqI MseI MseI

******* * RsaI RsaI

********

AA****T ****T

A*A****T ***T

A**A****T **T ClaI ClaI AseI AseI

A***A****T *T ScaI ScaI

A****A****T T

6161

GTAC GTAC TATA TATA TCGA TCGA TGCA TGCA TTAA TTAA

A****A****T T Nsi I Nsi I

CC****G ****G Bsi WI Bsi WI SfcI SfcI XhoI XhoI AvAvaI aI

AvaI AvaI SfcI SfcI

C*C****G ***G

C**C****G **G

C***C****G *G

C****C****G G PstI PstI

GG****C ****C Asp718Asp718BaBanI nI

Sal I Sal I ApaLI ApaLI

6262

GTAC GTAC TATA TATA TCGA TCGA TGCA TGCA TTAA TTAA

G*G****C***C AccI AccI AccIAccI

G**G****C**C Bsrl107I Bsrl107I HincII HincII HpaIHpaI

HincII HincII

G***G****C *C

G****G****C C KpnI KpnI Bsp128Bsp12866

HgiAI HgiAI

TT****A ****A

T*T****A ***A BstBIBstBI

T**T****A **A DraI DraI

T***T****A *A

T****T****A A

6363

4. 限制性内切酶酶解反应中的注意事项

① 大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液

1U的酶液足以在 1h 内消化 10μg DNA ，酶和底物比例 2-10U/ug DNA,避免使用过高的酶浓度

② 浓缩液使用前可用 1×限制酶缓冲液稀释

③ 限制性内切酶在含 50%的甘油的缓冲液 中，于 -20℃稳定保存

6464

④ 酶分装成小份，避免反复冻融

⑤ 反应中尽可能少加水，使反应体积减到最低

⑥ 通常增加反应时间，可降低酶量

6565

DNA 中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 S

DS 、 EDTA等都会影响酶的活性。

1. DNA 的纯度

五、影响限制性内切酶活性的因素

①纯化 DNA

② 加大酶的用量， 1ugDNA 用 10U

酶③延长保温时间④扩大反应体积（ >20l ）

一般采取

6666

需要合适的底物：底物（ DNA ）纯度要高 . 不能含有 RNA 和蛋白质 ; 也不能含有过高的 EDTA 。更不能含有酚、氯仿、乙醇、 SDS 和其他有机试剂。

DNA 的浓度不宜过高，高浓度的 DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为 50ul 内含 1ug DNA 。

6767

大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：

2. DNA 的甲基化程度

DNA 腺嘌呤甲基化酶（ DNA adenine methylas ,dam) （修饰 GATC 中的 A ）；DNA胞嘧啶甲基化酶（ DNA cytosine ethylas ,dcm) （修饰 CCA/TGG 的 C ）。

基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。

6868

不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是 37 oC ，少数要求 40-65 oC 。每微克 DNA 用1～ 5 单位的酶，保温 1~2 小时。

酶酶 最适温最适温度度 ooCC 酶酶 最适温最适温

度度 ooCC 酶酶 最适温最适温度度 ooCC

ApaApa I IBclBcl I IMaeMae II IITaqTaq I I

3030

5050

5050

6565

Apy Apy IIBstE BstE IIIIMaeMae III III

3030

6060

5555

BanBan I IMae Mae IISmaSma I I

5050

4545

2525

3. 温度

6969

是影响限制酶活性的重要因素

4. 缓冲液 (Buffer)

（ 1 ）缓冲液的化学组成

MgCl2 、 NaCl/KCl ： 提供Mg2+ 和离子强度Tris-HCl ： 维持 pH,大多数为 7-7.6二硫苏糖醇（ DTT ）： 防止酶氧化 ,保持酶稳定性牛血清白蛋白（ BSA ）等：中性蛋白质 , 防止酶在低 浓度的蛋白质溶液中变性

商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液

7070

（ 2 ）两种或两种以上的酶切割 DNA样品

① 在相同的缓冲液中反应同时进行

② 若需要不同的缓冲液 , 采用 3 种方法

ⅰ) 先用要求低离子强度的酶切割（低盐酶） ,再加 NaCl调节

离子强度 ,并用第二种酶切割（高盐酶）；

ⅱ) 先用一种酶切割 , 然后用 2.5倍体积的乙醇沉淀酶解产物 ,

再重悬于另一种缓冲液中进行第二种酶切割；

ⅲ) 使用所有限制性酶的通用 buffer, 如 KGB(谷氨酸钾

buffer),经适当稀释可达到各种限制性酶要求的 buffer条件。

7171

练习题练习题何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用和特点和特点

什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影响？响？

限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是 【 】Ａ 修复自身的遗传缺陷 Ｂ 促进自身的基因重组 Ｃ 强化自身的核酸代谢 Ｄ 提高自身的防御能力 Ｅ 补充自身的核苷酸消耗

7272

从细菌 DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条 DNA 双链连接到一起的酶。

第二节 DNA 连接酶一、 DNA 连接酶（ ligase) 的发

现

DNA 复制一定有断口

7373

DNA 连接酶 :

一种能够催化在两条 DNA 链之间形成磷酸二酯键的酶

1967 年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在 2条 DNA 链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA 连接酶。

7474

（ 1 ）大肠杆菌连接酶

1. 两种共价连接 DNA 限制片段的 DNA 连接酶

只能连接粘性末端，背景低，准确性高

二、 DNA ligase 的特点

（ 2 ） T4 噬菌体的连接酶

不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端

7575

（ 1 ）必须是两条双链 DNA

（ 2 ） DNA3’ 端有游离的 -OH ， 5’ 端有一个磷酸基团（ P ）（ 3 ）需要能量

动物或噬菌体中： ATP大肠杆菌中： NAD+

2. 连接条件

7676

（（ 44 ）） DNADNA 连接酶的反应条件连接酶的反应条件（（ 44 ）） DNADNA 连接酶的反应条件连接酶的反应条件

Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl 50 - 100 mM50 - 100 mM ，， pH 7.5pH 7.550 - 100 mM50 - 100 mM ，， pH 7.5pH 7.5MgClMgCl22MgClMgCl22 10 mM10 mM10 mM10 mM

ATPATPATPATP 0.5 - 1 mM0.5 - 1 mM0.5 - 1 mM0.5 - 1 mM

DTTDTTDTTDTT 5 mM5 mM5 mM5 mM

VolumeVolumeVolumeVolume 10 - 20 ml10 - 20 ml10 - 20 ml10 - 20 ml

T TT TT TT T 4 - 15 ℃4 - 15 ℃ ， ， 4 - 16 hr4 - 16 hr 4 - 15 ℃4 - 15 ℃ ， ， 4 - 16 hr4 - 16 hr

1 U DNA1 U DNA 连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 15 15

℃℃反应 反应 1 1 小时，完全连接 小时，完全连接 1 1 g g -DNA-DNA （（ HHindind ⅢⅢ片段）所需的酶量。片段）所需的酶量。

1 U DNA1 U DNA 连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 15 15

℃℃反应 反应 1 1 小时，完全连接 小时，完全连接 1 1 g g -DNA-DNA （（ HHindind ⅢⅢ片段）所需的酶量。片段）所需的酶量。

7777

1. ATP （ NAD+) 提供激活的 AMP 。

三、连接反应的机理

2. AMP 与连接酶形成共价“连接酶 -AMP”复合物，并释放出焦磷酸 PPi （ NMN ） 。

3. AMP 与连接酶的赖氨酸 -氨基相连。

OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+

+H3N

AMP

ATP

PPi

7878

4. AMP随后从连接酶的赖氨酸 -氨基转移到 DNA 一 条链的 5’ 端 P 上，形成“ DNA- 腺苷酸”复合物。

-OH HO-P-AMP

-OH O-P-

AMP

7979

5. 3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，释放出 AMP 。

8080

如何连接由限制性内切酶切割形成如何连接由限制性内切酶切割形成片断的末端 片断的末端 ？？

8181

连接酶反应的最佳温度是 37C 。

四、连接反应的温度

1. 最佳温度

但在 37℃下粘性末端的结合很不稳定。

2. 实用温度

所以一般采用 4~16C

8282

增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。

1. DNA 末端的浓度

五、影响连接反应的因素

10~20倍

2. 插入片段与载体的浓度比例

两种构型：线状分子和环状分子

与 DNA浓度及 DNA 分子长度相关

8383

3. 反应温度

黏性末端： 12～ 16℃平头末端： 10～ 20℃

4. ATP浓度

一般， ATP最适的终浓度为 0.5mmol/L.ATP浓度高至 5mmol/L，影响平头末端的连接

ATP浓度高至 7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。

8484

六、六、 DNADNA 连接的反应体系连接的反应体系

酶切纯化后的酶切纯化后的 DNADNA 片断片断

连接缓冲液连接缓冲液

DNADNA 连接酶连接酶

8585

从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创

造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平

头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反

应速度要慢得多。应速度要慢得多。

七七、、平头双链平头双链 DNADNA 片段的连接操作片段的连接操作

8686

加大连接酶用量（加大连接酶用量（ 1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接） 加大连接酶用量（加大连接酶用量（ 1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会

加入加入 10% PEG800010% PEG8000 ，促进大分子之间的有效作用 ，促进大分子之间的有效作用 加入加入 10% PEG800010% PEG8000 ，促进大分子之间的有效作用 ，促进大分子之间的有效作用

加入单价阳离子（加入单价阳离子（ NaClNaCl ），最终浓度），最终浓度 150-200 mM150-200 mM加入单价阳离子（加入单价阳离子（ NaClNaCl ），最终浓度），最终浓度 150-200 mM150-200 mM

提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：

8787

第三节 DNA 聚合酶

DNA 聚合酶（ DNA polymerase)

能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多

核苷酸连续地加到双链 DNA 分子引物链的

3’－ OH 末端，催化核苷酸的聚合作用 .

8888

一、基因工程中常用的 DNA 聚合酶

1.大肠杆菌 DNA 聚合酶2. Klenow fragment3. T7 DNA 聚合酶4. T4 DNA 聚合酶5. 修饰过的 T7 DNA 聚合酶6. 逆转录酶7.Taq DNA 聚合酶

8989

1. 共同特点

把 dNTPs 连续地加到引物的 3’－ OH 端

2. 主要区别

T7 DNA 聚合酶可以连续添加数千个 dNTPs而不从模板上掉下来。

其它几种 DNA 聚合酶只能连续添加 10多个 dNTPs就会从模板上解离下来。

二、常用的 DNA 聚合酶的特点

持续合成能力和外切酶活性不同。

9090

DNADNA 聚合酶聚合酶3’3’5’5’外外切酶活性切酶活性

5’5’3’3’外切酶活外切酶活性性

聚合聚合速率速率

持续持续能力能力

大肠杆菌大肠杆菌 DNADNA 聚合酶聚合酶 低低 有有 中中 低低Klenow fragmentKlenow fragment 低低 无无 中中 低低T4 DNAT4 DNA 聚合酶聚合酶 高高 无无 中中 低低T7 DNAT7 DNA 聚合酶聚合酶 高 无无 快快 高高化学修饰化学修饰 T7 DNAT7 DNA 聚合酶聚合酶 低低 无无 快快 高高遗传修饰 T7DNA 聚合酶 无 无 快 高逆转录酶逆转录酶 无无 无无 低低 中中TaqTaq DNA DNA 聚合酶聚合酶 无无 有有 快快 高高

3. 常用 DNA 聚合酶的特性比较

9191

三、 DNA 聚合酶在基因工程中的用途

1. 大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ主要用来制备带放射性标记的 DNA探针（ 32P标记）。

（ 1 ）大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的性质① 一条单链多肽

②②5’5’3’3’ 外切酶活性位于外切酶活性位于 NN 端端③ 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉 N 端的5’5’3’3’ 外切酶活性外切酶活性部分 ,就成为Klenow fragment 。

9292

① 底物：dNTPs （ dATP 、 dGTP 、 dCTP 、dTTP ）② Mg2+

③ 带有 3’-OH游离端的引物

④ DNA模板

（ 2 ） DNA 聚合酶 I （ Pol I ）的反应条件

-OH5’3’

dNTPs

9393

标记

① ① 核酸探针（核酸探针（ probprobee ））

能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。

（ 3 ）用 DNA 聚合酶Ⅰ制备探针

已知序列的核酸片断

显示位置 与互补的待测序列杂交

9494

标记 已知序列的核酸片断

② ② 探针的标记方式探针的标记方式

标记已知序列的核酸片断

带有放射性的已知序列的核酸片断

5’

3’

9595

③ ③ DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 对探针序列的标对探针序列的标记记

切口平移法 (nick translation ) ：

a.放射性同位素标记：

当存在 dNTP时， DNA 聚合酶 I 同时具备5’3’ 外切酶活性和 5’3’ 的聚合酶活性。

9696

5’3’ 外切酶活性从 DNA缺口的下一段 DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在缺口的上一段 DNA 的 3’ 一侧补上一个新的核苷酸。

缺口 缺口

5’

5’ 3’

3’

5’ 3’

5’ 3’

9797

纯化的 DNA 片断

DNase I 制造单链缺口

DNA Pol I 进行切口转移

一种 -32P-dNTP 和 dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’3’

3’

3’

3’

3’

3’3’

32P-dNTP

32P-dNTP

从头至尾都被标记

9898

2. Klenow fragment2. Klenow fragment

具有 5’3’ 聚合酶活性和 3’5’ 外切酶活性。（失去了 5’3’ 外切酶活性）。

（ 1 ） Klenow fragment 的性质

DNA Pol I Klenow fragment (76KD ） 枯草杆菌蛋白酶

9999

① 3’ 端补平

5’

5’klenow

② ② DNA 3’DNA 3’ 末端标记末端标记

补平限制性内切酶切后形成的 3’隐蔽端。

在 3’隐蔽端加上放射性标记的 dNTP 。

klenow

（ 2 ）主要用途

100100

3’隐蔽末端的 DNA片断

Klenow fragment补平

根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs

末端标记的 DNA

限制性内切酶切

5’----G3’3’----CTTAA5’

5’----GAA3’3’----CTTAA5’

5’----GAATT3’3’----CTTAA5’

5’----G3’3’----CCTAG5’

5’----GG3’3’----CCTAG5’

5’----GGATC3’3’----CCTAG5’

EcoR I BamH I

-32P-dATP -32P-dGTP

25oC 1h

101101

③ ③ cDNAcDNA 第二链的合成第二链的合成

mRNA

cDNA 第一链逆转录

cDNA 第二链

klenow

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

引物

102102

（ 1 ） T4 DNA 聚合酶的性质

3. T4 DNA 聚合酶

从 T4 噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化，由噬菌体基因 43 编码。

有 5’3’ 聚合酶活性和 3’5’ 外切酶活性（降解单链更快）。

① 来源

② 酶活性

103103

③ ③ 特点特点

A 当没有 dNTP时， T4 DNA 聚合酶行使3’5’ 外切酶功能，制造出 3’隐蔽端。B 如果只有一种 dNTP ，则降解到该 dNTP 的位置。C 在四种 dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。

104104

5’5’3’

3’

5’5’3’

3’

T4 DNA 聚合酶无 dNTPs

T4 DNA 聚合酶有 dNTPs

5’5’

105105

（ 2 ） T4 DNA 聚合酶的用途

标记末端（取代合成法或置换合成法）

用 3’5’ 外切酶活性作用于所有末端形式的3’ 端（平端、 3’隐蔽端、 5’隐蔽端）制造出 3’隐蔽端。再利用它的 5’3’ 聚合酶活性补平，并加入放射性标记的 dNTP 。

① 补平隐蔽末端② DNA 3’ 末端标记

106106

酶切中间产生两个末端标记

加入某种 32P-dNTP 和 dNTPs

T4 DNA 聚合酶（ 3’5’ 外切）

DNA 酶切片断

T4 DNA 聚合酶（ 5’3’ 聚合）

5’5’3’

3’

5’5’

3’3’

5’ 5’

3’3’

5’5’3’

3’

5’5’3’

3’

内切酶切

无 dNTPs

107107

a. 放射性标记的优缺点：

制作简单高比放射性放射自显影效果好

优点：

缺点：

半衰期短（ 32P只有 14.3天）不易保存对人体有害要求在专门实验室操作

108108

b. b. 非放射性标记非放射性标记

i ）生物素标记

生物素（ biotin ），又称维生素 H 、辅酶 R

可以与 dNTP酰化结合成为biotin -1,6-dUTP 、 biotin -1,4-dATP 、 biotin -1,1-dUTP等。

CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH

也可以被生物素连接酶（ biotin ligase ）催化与蛋白质共价结合。

109109

纯化的 DNA 片断

DNase I 制造单链缺口

DNA Pol I 进行缺口转移

biotin -dTTP 和 dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’3’

3’

3’

3’

3’

3’3’

生物素 -dTTP

生物素 -dTTP

利用切口转移法将生物素掺入 DNA探针中

110110

ii ）地高辛标记：

可以与 dNTP 连接成地高辛 -dUTP等，参入 DNA 合成过程，形成地高辛标记的 DNA探针。

生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit) 。

地高辛的结合物是抗地高辛抗体。

111111

4. T7 DNA 聚合酶

（ 1 ）来源从 T7 噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：

① T7 噬菌体基因 5 编码的大亚基：T7 噬菌体 5蛋白。有 5’3’ 聚合酶和 3’5’ 外切酶活性。

② 大肠杆菌编码的小亚基：

硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。

112112

（ 2 ） T7 DNA 聚合酶的特点

① 持续合成能力强

一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。

② 3’5’ 外切酶活性高

单链和双链都能降解。

③ 不受 DNA 二级结构的影响

其它 DNA 聚合酶受 DNA 二级结构的阻碍

113113

② 进行末端标记

① 催化大分子量 DNA为模板的合成

如 M13 噬菌体

③ 补平隐蔽末端

（ 3 ） T7 DNA 聚合酶的用途

合成补平 3’隐蔽末端；水解修平 3’突出末端。

114114

5. 修饰后的 T7 DNA 聚合酶

（ 1 ） T7DNA 聚合酶的化学修饰

去除 3’5’ 外切酶活性，使 DNA 聚合能力和聚合速率提高了 3倍。

（ 2 ）修饰后的 T7 DNA 聚合酶的用途① DNA测序 双脱氧法。

② 标记 DNA 3’隐蔽末端

③ 更有效地补平末端

115115

6. 逆转录酶

最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（ avian myeloblastosis virus, AMV）：

依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（ RNA指导的 DNA 聚合酶）。

（ 1 ）来源 RNA肿瘤病毒。

（ 2 ） AMV的性质

由和两条多肽链组成，最适反应温度为 41～ 45℃

116116

① 链 有反转录活性和 RNaseH活性。

RNaseH ：以 5’3’ 或 3’5’方向特异地水解 RNA-DNA杂交双链中的 RNA 链。

RNaseH

RNADNA

RNADNA

117117

（ 3 ）逆转录酶的用途

② 链 RNA-DNA杂交双链中 5’3’DNA 外切酶活性。

① 合成 cDNA以 oligo dT为引物（与 mRNA 的 polyA尾巴互补结合）。

AAAAATTTTT 5’

3’mRNA 5’

cDNA

118118

② 合成 DNA探针

用随机引物（ random primer ）或 oligo dT做引物。随机引物：

随机顺序形成的寡聚 DNA 片断。

（理论上它能与各种序列的模板结合）

119119

第四节 DNA 修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶

1. 来源 小牛胸腺。

2. 组成 大小两个亚基。

3. 特性 5’3’DNA 聚合酶活性

（ terminal transferase ）

120120

② 不需要模板！

① 需要 3’—OH 、二甲胂酸缓冲液。

③ 底物可以是单链 DNA 、是 3’—OH突出的双链 DNA 、平末端需 Co2+激活，但反应效率低。④ 随机添加的 dNTPs 。 如果只有一种 dNTP ，就添加上同聚物。

DNA 5’ 3’

TTTdTTP ，末端转移酶

121121

4. 末端转移酶的用途

（ 1 ）同聚物加尾给外源 DNA 片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。

外源 DNA 载体 DNA5’ 3’ 5’ 3’

CCCCCC

GGGGGG

dGTPdCTP 末端转移酶

122122

（ 2 ）再生酶切位点 便于回收克隆片断。

AAGCTTTTCGAA

5’5’

HindⅢ酶切ATTCGA

AGCTT A

Klenow补平

123123

AAGCTTTCGA

AGCTTTCGAA

AAGCATTTTTCGA

AGCTTTTTTCGAA

末端转移酶dTTP

AAAAAA外源 DNA

124124

（ 3 ） DNA3’－ OH末端标记

AAGCTTTTTTCGA

AGCTTTTTTCGAAAAAAAA

HindⅢ位点

HindⅢ位点

连接

催化非放射性或放射性标记物掺入 DNA 片断的 3’端。 （生物素 -11-dUTP等）

125125

二、 T4多核苷酸激酶

1. 来源

T4 噬菌体的 pseT 基因编码。从 T4 感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2. 功能

其激酶活性位于 N－端附近，磷酸酶活性位于 C－端附近。催化 -磷酸从 ATP转给双链或单链 DNA 或 RNA 的 5’-OH 端。不论 5’-OH 端突出与否。

126126

5’3’HO- -OH5’

3’HO- -OH

3’P- -OH5’3’HO- -P 5’

ATP T4多核苷酸激酶

如果 ATP 的 -磷酸带有 32P标记，就可见被转移到 DNA 的 5’ 端。

但天然的 DNA 的 5’ 端都是磷酸化的。

127127

3. 多核苷酸激酶的用途DNA 5’-OH 端磷酸化、标记 DNA 的 5’ 端。

5’

3’HO- -OH5’3’ HO- -OH

3’32P- -OH5’3’ HO- -32P 5’

(-32P)ATP 多核苷酸激酶

3’P- -OH5’3’ HO- -P 5’

碱性磷酸酶

（ 1 ）正向反应（ forward reaction ）

128128

（ 2 ）交换反应标记法

反应混合物中具有超量 (-32P)ATP 和 ADP时，多核苷酸激酶能催化 (-32P)ATP 的 -32P 与 DNA5’ 端的磷酸交换。

3’P- -OH5’3’ HO- -P 5’

3’32P- -OH5’3’ HO- -32P 5’

(-32P)ATP 、 ADP 多核苷酸激酶

反应效果不理想。

129129

三、碱性磷酸酶三、碱性磷酸酶

1. 碱性磷酸酶种类

从大肠杆菌中分离出来。Bacterial alkaline phosphatase ， BAP

（ 1 ）细菌性碱性磷酸酶

（ 2 ）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase ， CIP

从小牛肠中纯化出来。

具有抗热性。

SDS 中加热 68oC可完全失活。

130130

2. 碱性磷酸酶的特性催化脱掉 DNA （或 RNA ） 5’ 端的磷酸根。

3’P- -OH5’3’ HO- -P 5’

5’3’HO- -OH5’

3’ HO- -OH

碱性磷酸酶

3. 碱性磷酸酶的功能

（ 1 ）防止线性化的载体份子自我连接

131131

单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。

AAGCTTTTCGAA

HindⅢ酶切A-OHTTCGA-P

P-AGCTT HO-A

碱性磷酸酶

5’

5’

5’

132132

A-OHTTCGA-OH

HO-AGCTT HO-A

OH 与 OH 不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。同一酶切后的外源 DNA 的 5’ 端有 P ，能与脱磷酸的载体 OH 连接。

133133

ATTCGA

AGCTT A

AGCTT AA TTCGA

连接酶-OH 与 -OH 连不住

其中每条链上都有一个 nick，但转入细菌后会被修复。

3’P-AGCTT A-OH5’3’ HO-A TTCGA-P 5’外源 DNA

134134

第五节 核酸外切酶（ Exonucleases ）是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。

一、单链 DNA 外切酶

1. 大肠杆菌核酸外切酶 I （ exo I ）

5’3’ 外切 识别 5’-OH

2. 大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（ exo Ⅶ）

5’3’ 、 3’5’ 外切识别 3’-OH 、 5’-P

135135

二、双链 DNA 外切酶1. 核酸外切酶Ⅲ（ exo Ⅲ）

3’5’ 外切 识别 3’-OH

主要用途：

在 DNA 双链的末端产生出单链区域。5’

5’

5’5’

exo Ⅲ

与 klenow配合进行 3’ 端标记

-OHHO-

136136

2. 核酸外切酶（ exo ）5’3’ 外切。

主要用途：使 DNA 双链变成单链（短）。

5’ P--P 5’

5’ 5’

exo

成为测序模板。

识别 5’-P （但不能降解 5’-OH ）

137137

3. T7 基因 6 核酸外切酶

5’3’ 外切。

用途与 exo 一样。

既能识别 5’-P ，又能识别 5’-OH 。

5’5’

5’ 5’

已被克隆到大肠杆菌中表达。

138138

DNADNA 外切酶外切酶 切割方式切割方式 识别位点识别位点单单链链

大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶 II（（ exo Iexo I ））

5’3’ 5’-OH

大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（（ exo Ⅶexo Ⅶ））

5’3’3’5’

5’-P3’-OH

双双链链

核酸外切酶Ⅲ（核酸外切酶Ⅲ（ exo exo ⅢⅢ））

3’5’ 3’-OH

核酸外切酶（ 核酸外切酶（ exexoo ））

5’3’ 5’-P

T7T7 基因基因 66 核酸外切酶核酸外切酶 5’3’ 5’-P5’-OH

139139

第六节 单链 DNA 内切酶

一、 S1 核酸酶1. 来源

稻谷曲霉（ Aspergillus oryzae ）。2. 特性

（ 1 ）高度单链特异性

（ 2 ）反应条件

① 低水平Zn2+

② pH4.0~4.3

140140

3. S1 核酸内切酶的功能

（ 1 ）催化单链 RNA 或 DNA降解。（ 2 ）切掉双链核酸中的单链区。

S1

S1

发卡或有缺口的部位。

141141

（ 4 ）几乎不能降解双链 DNA 或 RNA-DNA杂交链

ATGCAT GCATGCTACGTA CGTACG

T

甚至能识别单个核苷酸的单链区！

（ 3 ）降解限制酶切形成的单链突出端。

142142

4. S1 核酸酶的用途（ 1 ）定位 RNA

DNA

RNA S1

S1

200bp 400bp

某限制酶切后再与 RNA杂交

某限制酶位点（参照物）

内切酶位点不能位于内含子序列中！

RNA

143143

RNA 位于某限制酶位点左 200bp 和右 400bp 。

RNA 位置

不能配对的内含子区域形成的单链环被 S1 切掉。

mRNA

DNA

（ 2 ）用 mRNA测定基因中的外显子序列

144144

二、 Bal 31 核酸酶1. 来源埃氏交替单胞菌（ Alteromonoas espejiana ）

2. 功能既有单链特异的 DNA （ RNA ）内切酶；又有双链特异的 DNA 外切酶。降解双链 DNA 或其上的单链缺口、未配对的单链区域。

145145

4. Bal31 的用途

定位测定 DNA 片断中的限制酶位点分布。

3. 反应条件Mg2+ 、 Ca2+

EGTA （乙二醇双四乙酸）专一性螯合 Ca2+ ，可终止反应。

EcoR I EcoR IBamH I

Hind III

146146

② 与对照组（不用 Bal31消化）只用相同的酶切的电泳比较。③根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原 DNA 中的位置。

① 用 Bal31消化线性 DNA ，并在不同的时间加入 EGTA终止反应，再酶切电泳。

Bal31控制消化法：

147147

EcoR I EcoR IBamH I

Hin

d III

分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。

EcoR I

BamH

I

Hind III

Mar

ker

148148

EcoR I EcoR IBamH I

Hind III

EcoR I EcoR IBamH I

Hind IIIBal31

分别用原内切酶切后电泳，判断片断数目和大小。

Hin

d III

EcoR I

BamH

I

Mar

ker

149149

150150