Люкманова Екатерина Назымовна Лаборатория...

БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ ТРАНСКРИПЦИИ-ТРАНСЛЯЦИИ: НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДЛЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ И ИХ ДОМЕНОВ

Люкманова Екатерина НазымовнаЛаборатория биоинженерии белка,

ИБХ РАН

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Биосинтез белка

транскрипция

трансляция

История открытия бесклеточных белоксинтезирующих систем (ББС)

•изучение биосинтеза белка и механизмов его регуляции

•скрининг белков с неизвестными функциями

•белковая инженерия in vitro

•аналитическая и препаративная продукция

рекомбинантных белков

1950, Winnick – демонстрация возможности белкового синтеза с использованием экстракта, полученного после разрушения клеток

1958, Roberts – используя отдельные компоненты разрушенной клетки, показана ключевая роль рибосом, как белок-синтезирующих машин

1960, Lamborg&Zamecnik – создание первых ББС, представляющих собой смесь неочищенного клеточного экстракта, аминокислот, АТФ и ГТФ.

1963, Nirenberg – удаление эндогенных мРНК из экстракта и внесение экзогенной мРНК привело к ее трансляции и синтезу целевого белка

1988, Спирин А.С. – создание белоксинтезирующей системы длительного действия

Бесклеточные белоксинтезирующие системы

Прокариотические

(основанные на экстракте Escherichia coli)

Эукариотические

(на основе экстракта пшеницы, ретикулоцитов

кролика, клеток насекомых или человеческих

клеток)

Приготовление экстракта

Компоненты экстрактов:

рибосомы, все ферменты и факторы,необходимые для транскрипции и трансляции

клеточный экстракт + аминокислоты + экзогенная матрица ++ энергетические компоненты + система регенерации энергии + кофакторы

=

бесклеточная белоксинтезирующая система

Экстракты:

Imataka et. al., 2011

Бесклеточные белоксинтезирующие системы. Матрицы. Ионный состав.

• ДНК-независимая ББС мРНК

• ДНК-зависимая ББС транскрипции-трансляции

плазмидная ДНК, содержащая ген целевого белка и Т7 промотор

ПЦР-фрагмент, содержащий ген целевого белка и Т7 промотор

+Т7-РНК-полимераза

Ионы, важные для работы ББС:

Mg2+, K+, NH4+

В каждом конкретном случае требуется

оптимизация по ионному составу и концентрации матрицы!

Bernhard et al

Бесклеточные системы транскрипции-трансляции. Пути расходования энергии.

• NTP → NDP при транскрипции

• GTP → GDP при трансляции

• ATP → AMP при присоединении АК к tRNA

ADP + X-P ATP + X

NDP + ATP NTP + ADP

X – фосфоенолпируват COOH, фермент - пируваткиназа

C-О-P

CH2

фермент

X – ацетилфосфат CH3, фермент - ацетилкиназа

C-О-P

X – креатинфосфат COOH, фермент - креатинкиназа

CH2

NH

C-NH2

N-P

Бесклеточные системы транскрипции-трансляции. Регенерация NTP.

НДК

Бесклеточные системы транскрипции-трансляции. Устройство реактора (batch).

выход белка ≤ 0.5 мг/мл,эффективность работы ≤ 2 часа

Бесклеточные системы длительного действия : диализного типа – CECF (continuous exchange cell-free) (А)

и проточного типа – CFCF (continuous flow cell-free)(Б)

выход белка до 6 мг/мл,эффективность работы до 24 часов

Компоненты питающей смеси:ATP, GTP, UTP, CTP,аминокислоты,энергетические компоненты

(А) Spirin et. al, Science, 1988 (Б) Endo et al, J Biotech 1992

Преимущества бесклеточных систем синтеза

Maslennikov et. al.,PNAS, 2010

• «Эксклюзивный» синтез целевого белка с чистотой до 80%

• Возможность манипулирования составом реакционной смеси

• «Открытость» системы для добавления лигандов, кофакторов, специальных агентов

• Низкая цена по сравнению с бактериальной продукцией

• Эффективность по времени (1 день → несколько миллиграмм целевого белка)

• Масштабируемость до 100 литров

Бесклеточные белоксинтезирующие системы

токсичные белки

белки,содержащие S-S связи

белки, содержащие селективные метки

мультимерныебелки

белки, содержащие неприродные АК

белки, содержащие пост-трансляционные модификации

мембранныебелки

Бесклеточный синтез N-гликозилированных белковЭукариотические

экстрактыПрокариотические

экстракты

Добавление в ТС микросом из клеток поджелудочной железы собаки

(Lingappa et al,PNAS 1978)

Добавление в ТС компонентов из pgl локуса Грамм-отрицательной бактерии Campylobacter jejuni продуцированных в E. coli и солюбилизированных в 0.1% DDM

• Фермента олигосахарилтрансферазы (OST, PglB)

• Липид-связанных олигосахаридов (LLO)(Guarino et al, Glycobiology 2011)

Встраивание эукариотическихN-гликанов возможно требует использования модифицированных LLO и дальнейшего ферментативного трансгликозилирования

(Schwarz et al, Nat Chem Biol, 2010)

Бесклеточный синтез белков, содержащих S-S связи

Эукариотические

экстракты

Прокариотические

экстракты

Добавление в ТС глутатиона GSSGв присутствии микросом

(Scheele et al, JBC 1982)

• Обработка экстракта йодацетамидом (IAM)

• Добавление в ТС глутатионов GSSG/GSH

• Добавление в ТС фермента дисульфид-изомеразы E. coli (DsbC)

(Goerke et al, Biotechnology&Bioengineering 2008)

(Swartz et al, J. Biotechnology, 2011)

Бесклеточный синтез белков, содержащих неприродные АК

Использование мутантных tyrosyl-tRNA синтетазы (TyrRS), и tRNATyr из археи Methanococcus jannaschii в БСС на основе экстракта E. coli позволяет встраивать неприродные аналоги тирозина и фенилаланина по стоп кодону TAG ("amber").

(Goerke et al, Biotechnology&Bioengineering 2009)

p-azido-L-phenylalanine

p-acetyl-Lphenylalanine

O-methyl-L-tyrosine

Бесклеточный синтез мембранных белков (МБ)

•Фармакология•Медицина•Промышленные ферменты•Экология•Нанотехнологии

Bernhard et. al., 2010

Синтез МБ:a. в виде осадка ТСb. в присутствии мицеллдетергентаc. в присутствии липидовС1. в присутствии бицеллС2. в присутствии липид-белковых нанодисковС3. в присутствии липосом

Использование ББС для структурных исследований МБ

Протеородопсин, NMR(Reckel et al, Angew Chem, 2011)

Бактериальные рецепторные His

киназы, NMR(Maslennikov et al,

PNAS, 2010)

(Junge et al, Cell Mol Life Sci, 2008)

multidrug транспортер EmrE,X-ray(Chen et al, PNAS, 2007)

МБ человека, NMR(Klammt, Maslennikov et al,

Nature methods, 2012)

Пространственные структуры МБ, полученные в ИБХ РАН

гомодимер ТМ домена рецепторной тирозин

киназы ErbB3 человека (TM-ErbB3)

(Mineev et al, BBA, 2011)

гомодимер ТМ домена рецептора фактора роста сосудистого эндотелия

VEGFR2

гомотример мутантного варианта VEGFR2(V769E)(Mineev, Arseniev et al, 2013)

Бесклеточная продукция МБ в присутствии липид-белковых нанодисков

Katzen et. al., Trends in Biotech., 2009

EmrE(multidrug transporter)

Сравнение различных подходов для продукции мембранных белков в структурированном виде

МБ с различной топологией

• TM-ErbB3 (гомодимерный трансмембранный домен тирозинкиназы человека ErbB3, 1TM)

• VSD (вольт-сенсорный домен K+ канала KvAP из Aeropyrum pernix, 4TM)

• ESR (бактериородопсин из Exiguobacterium sibiricum, 7TM)

Тестируемые подходы

синтез в присутствии

• детергентных мицелл

• липид-детергентных бицелл

• липид-белковых нанодисков (ЛБН)

• ренатурация из осадка трансляционной смеси

(Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Бесклеточная продукция МБ в присутствии мицелл детергентов

(Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Ни один из тестируемых детергентов не обеспечил синтеза функционально активного ESR и структурированных TM-ErbB3 и VSD

Бесклеточная продукция МБ в присутствии мицелл детергентов

(Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Бесклеточная продукция МБ в присутствии DMPC/DHPC бицелл

(Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Только ЛБН, состоящие из насыщенных липидов, стабильны при ко-трансляционном встраивании МБ

Пустые ЛБН TM-ErbB3 VSD ESR

Бесклеточная продукция МБ в присутствии липид-белковых нанодисков

Тестируемый липидный состав ЛБН

1) DMPC 2) DMPG3) POPC 4) POPC/DOPG (3:2)

(Lyukmanova et al, BBA, 2012)

Ни в одном случае с ЛБН не удалось синтезировать VSD в структурированном виде

Для продукции VSD были разработаны системы рефолдинга (ренатурации)из осадка ТС

Бесклеточная продукция МБ в присутствии липид-белковых нанодисков

(Lyukmanova et al, BBA, 2012)

N-концевые белки-партнеры для увеличения эффективности бесклеточной продукции рецепторов

семейства GPCR

Патентная заявка РФ,Люкманова и д.р., Acta Naturae 2012

эффективность синтеза GPCRвозросла в 5-38 раз

•~ 800 генов в геноме человека (отвечают за рецепцию света, гормонов, запахов,

нейромедиаторов)

•GPCR – мишени для ~ 30% современных лекарственных препаратов

Ренатурация мускаринового ацетилхолинового рецептора М1 типа из осадка трансляционной смеси

липосомы POPCмицеллы DPCбицеллы CHAPS/DMPC

смешанные мицеллы DDM/CHS

осадок трансляционной

смеси

солюбилизация 1% SDS

перевод в подходящую мембраномоделирующую

среду для ренатурации

ВЭЖХ анализ эффективностивзаимодействия с телензипином

Бесклеточная продукция ТМ фрагментовβ2-адренорецептора человека (GPCR)

MFERLQTVTNYFITSLAVADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTGSHHHHHHMERDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTVTNYFITSLAVADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTGSHHHHHH

S1S2S12

MERDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTGSHHHHHH

S1/DPC S2/DPC

S12/HFIP

Преимущества БСС:

• Быстрая наработка (прямая экспрессия) миллиграммовых количеств гидрофобных пептидов (ТМ фрагментов МБ)

• Эксклюзивный синтез целевого белка

• На ПЧД 2й псевдосубъединицы локализован участок связывания бета-токсинов из яда скорпионов• Каналы семейства Nav – перспективная мишень для создания новых лекарственных препаратов,

нацеленных на лечение судорожных расстройств, хронической боли, периодического паралича, миотонии, атаксии и аритмий

• Каналы семейства Nav – мишени для создания новых инсектицидов

Бесклеточная продукция потенциалочувствительных доменов Na+ каналов эукариот

ЯМР-исследование ПЧД-Nav1.4

•Исследование 13C 15N-меченого ПЧД-Nav1.4 (5% LPPG, pH 6.0)•Получен набор 2D и 3D спектров для отнесения сигналов•В спектрах наблюдаются ~ 130 спиновых систем (близко к ожидаемому)•В настоящее время получено последовательное отнесение для 63 остатков (~ 40%)•Наблюдаются нарушения спиральной структуры «вольт-сенсорной спирали» S4

-2

0

2

4

6

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

-2

0

2

4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

Δδ13Сα

Δδ13С’

S1 S2 S3 S4 S45

Благодарю за внимание!