View
15
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Скоблов Михаил Юрьевич
Молекулярная биология
Лекция 7. Репликация и репарация.
Часть 1. Репликация ДНК
Эксперимент Мезельсона и Сталя
1958 год
Артур Корнберг
ДНК-полимераза
• В 1956 г. Корнберг выделил из клеток бактерии Е. coli фермент ДНК-полимеразу (ДНК-полимераза I).
• Этот фермент осуществлял синтез ДНК при наличии в реакционной смеси всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов: АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и молекулы ДНК
• В 1959 г. получил нобелевскую премию «За открытие механизмов биологического синтеза рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот».
Основные этапы репликации:
1. Инициация
2. Элонгация
3. Терминация
Репликация ДНК
Репликация ДНК — процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК.
«Каждая цепь двуцепочечной ДНК служит матрицей при синтезе комплементарной цепи и в результате образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской» – Уотсон и Крик.
Основные ферменты репликации
• ДНК-полимераза - фермент катализирующий полимеризацию дезоксирибонуклеотидов на матрице ДНК по принципу комплементарности
• ДНК-лигаза – фермент катализирующий образование фосфодиэфирных связей между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва двуцепочечной ДНК
• ДНК-хеликаза – фермент разделяющий цепи двухцепочечной ДНК на одинарные.
• ДНК-топоизомераза - фермент изменяющий степень сверхспиральности ДНК, путем внесения одноцепочечных разрывов в ДНК.
• ДНК-праймаза — это фермент РНК-полимераза, синтезирующий короткий фрагмент РНК, называемый праймером, комплементарный одноцепочечной матрице ДНК.
Ориентация цепей в ДНК
Репликация ДНК у E.coli
STEP1: DnaB helicase(blue) separates a dsDNA into two ssDNAs, as cutting the hydrogen bands between base pairs. Topoisomerase(lime green) has a role in rewinding the twist of double helices which was generated by the dsDNA separation. STEP2: The separated ssDNA has a tendency of annealing. For preventing annealing, Single-Stranded DNA Binding Protein: SSB bind to separated ssDNA. STEP3: DnaG primase(purple) is activated by binding to DnaB helicase, and synthesizes a short RNA primer approximately 10 nucleotides long using a ssDNA as a template. STEP4: DNA polymerase III elongates a new ssDNA strand by adding a deoxyribonucleotide at a time in the 5'-3' direction to the RNA primer, using a ssDNA as a template.
Репликация ДНК у E.coli
• Лидирующая цепь удлиняется ДНК-полимеразой в направлении 3’-конца
• Отстающая цепь удлиняется по иному механизму:
Репликация ДНК у E.coli
Репликации у прокариот
Инициация репликации • Репликация ДНК начинается в специфических местах называемых точками начала
репликации (origin). • Чем больше размер генома организма, тем большее количество точек репликации
ему необходимо: у E.coli, бактериофага лямбда, вируса SV40 – один origin, в эукариотических клетках – множественные начала репликации расположеные на расстоянии 20 т.п.н..
• Скорость репликации у бактерий порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту, у эукариот - 500—5000.
Элонгация
• Репликация E.coli занимает около 40 минут, в то же время клетки делятся примерно каждые 20 минут – репликация ДНК инициируется при не законченной предыдущей.
Репликации у прокариот
Терминация репликации
Топоизомераза II также принимает участие в рахсождении двух дочерних кольцевых ДНК - конкатамеров
Репликация ДНК по принципу катящегося кольца
Одноцепочечная ДНК Двухцепочечная ДНК
Репликации у эукариот
Ori - AT-богатые, легкоплавкие участки длинной ~200 пн, расположенные, как правило, между генами в промоторных областях.
Репликация теломер Теломе́ры (от др.-греч. τέλος — конец и μέρος — часть) — концевые участки хромосом
Нобелевская премия по физиологии и медицине 2009 года американских учёных Элизабет Блэкбёрн (Elizabeth H. Blackburn), Кэрол Грейдер (Carol W. Greider) и Джек Шостак (Jack W. Szostak) «за открытие того, как теломеры и фермент теломераза защищают хромосомы»
Репликация теломер Теломераза — фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК (TTAGGG у позвоночных) к 3'-концу цепи ДНК на участках теломер, которые располагаются на концах хромосом в эукариотических клетках.
Клеточный цикл и его регуляция
• Период существования клетки от одного деления до другого называется митотическим или клеточным циклом.
• У высших организмов он занимает от 10 до 30 часов, у человека 24 часа
• У бактерий – менее часа, около 20 минут
Разница в репликации у прокариот и эукариот
Часть 2. Репарация
• У бактерии кишечной палочки E.coli известно более 50 генов, контролирующих процессы репарации.
• В среднем в процессе репликации генома млекопитающего длинной 3 млрд нуклеотидов возникает не более 3 ошибок
• Ежедневно в молекулах ДНК каждой клетки человеческого тела около 100000 звеньев повреждаются за счет разнообразных эндогенных процессов и экзогенных генотоксичных воздействий.
• Менее 1 повреждения ДНК из 1000 превращается в мутацию.
Источники повреждения ДНК
Репарация ДНК
• Репарация генетических повреждений – свойство живых организмов восстанавливать нарушения и повреждения, возникшие в ДНК в результате ошибок репликации, а также при воздействии разнообразных эндогенных и внешних мутагенных факторов.
• Повреждение ДНК – это не мутация.
• Мутация – это наследственное (фиксированное) изменение в нуклеотидной последовательности генома организма.
Основные повреждения ДНК
Наследственные заболевания
• Частота генетических заболеваний варьируется от 1:10 000 до 1:1 000 000 • Бывают и уникальные заболевания, 1 на 6 000 000 000 • Общая частота генетических заболеваний в популяции составляет около 3% • В арабских странах около 6% (за счет близкородственных браков)
Генетический груз популяции
каждый человек является носителем в среднем трех аутосомно-рецессивных аллелей
Болезни ассоциированые с дефектами системы репарации
Репарация ДНК
1. Репарация неспаренных оснований.
2. Восстановление исходной структуры.
3. Эксцизионная репарация • Вырезание оснований • Вырезание нуклеотидов.
4. Пострепликативная репарация
• Рекомбинационная репарация • SOS-репарация – мутагенный или
«ошибочный» путь репарации.
Прямая репарация
• В следствии УФ-излучения возникают пиримидиновые димеры (часто тиминовые димеры) или 6-4-фотопродукт
• В основном они блокируют транскрипцию, и только небольшая часть приводит к мутациям.
Тиминовый димер 6-4-фотопродукт
Фотореактивация
• В фотореактивации участвует фермент фотолиаза, мономерный флавин-
зависимый фермент, и кофакторы : FADH- и 5,10-метенилтетрагидрофолат
(5,10-MTHF)
• Фотолиаза связывается в темноте с димерами ТТ
• На свету кофактор абсорбирует фотон
• Используя эту энергию фотолиаза расщепляет ТТ димер
• Фотолиаза освобождает ДНК
Фотолиазы
• Принадлежат большому семейству фотолиаз-криптохромов.
• Представители этого семейства широко распространены во всех царствах
• У растений криптохромы регулируют рост, регулируемый синим светом, а у животных – циркадные ритмы.
Эксцизионная репарация
Mismatch repair
Nucleotide excision repair (NER)
Base excision repair (BER)
Mismatch repair (MMR)
Мисматч репарация: выявляет некомплементарную пару только на дочерней цепи ДНК и производит замену неправильного основания только на дочерней цепи.
Mismatch repair (MMR)
Перед репликацией ДНК находится в метилированной форме, вновь синтезированная цепь - неметилирована
Mismatch repair (MMR)
Основные белки метил-направляемой MMR в E. Coli:
• Mut S и Mut L узнают ММ
• Mut H - • Узнает полуметилированный • сайт GATC и делает надрез
• MutU (UvrD) –геликаза II
раскручивает дуплекс и освобождает надрезанную область
Mismatch repair у человека
Mismatch repair у человека
• Система MMR у эукариот организована сложнее функционирует эффективнее по сравнению с бактериями.
• У эукариот MMR исправляет все некомплементарные пары оснований и, кроме того, репарирует делеции или инсерции в рекомбинационных гетеродуплексах размером до 12 н.
• У бактерий MMR неспособна исправлять пары С*С и репарирует делеции/инсерции не более 3 н. в рекомбинационных гетеродуплексах.
• Ключевые белки MMR – MutL и MutS высококонсервативны, их гомологи обнаружены у всех организмов от E.coli до человека.
• Если у E.coli эти белки (и кодирующие их гены) уникальны, то у эукариот имеется по несколько их гомологов (паралогов). Например, у дрожжей Saccharomyces cerevisiae обнаружены 3 гомолога MutL и 6 гомологов MutS, у человека – 11 гомологов MutL и 4 MutS.
Эксцизионная репарация
Base excision repair - BER
• ДНК гликозилазы, распознают аномальные основания ДНК и катализируют гидролитическое расщепление N-glycosyl связи, между основанием и сахаром.
• Образуется AP-сайт (apurinic/apyrimidinic) • АП-сайт распознается АП-эндонуклеазой,
которая вводит в нить ДНК разрыв. • Фосфодиэстераза отщепляет от ДНК
сахарофосфатную группу, к которой не присоединено основание.
• Брешь размеров в 1 н. застраивается ДНК-полимеразой I и концы ДНК соединяются ДНК-лигазой.
В каждой клетке млекопитающих за одну 20-ти часовую генерацию спонтанно возникает около 10000 апуриновых сайтов и около 500 – апиримидиновых.
Эксцизионная репарация
Nucleotide excision repair - NER
• Узнавание повреждений
• Связывание мультисубъединичного комплекса с поврежденным сайтом
• Двойное надрезание поврежденной цепи на несколько нуклеотидов от поврежденного сайта в обоих направлениях 5' и 3'
• Освобождение олигонуклеотида, содержащего повреждение между двумя надрезами
• Заполнение образовавшейся бреши ДНК полимеразой
• Лигирование
Эксцизионная репарация
• У эукариот система эксцизионной репарации нуклеотидов функционирует по той же схеме, что и у бактерий, но организована сложнее и работает эффективнее, по сравнению с бактериями.
• Эукариотическая эксцинуклеаза включает, по крайней мере 17 белков, и при эксцизии вырезаются 29 н.
Пострепликативная репарация
• Этот способ восстановления целостности ДНК заключается в репарации пробелов, образующихся в дочерних цепях напротив не удаленных в ходе репликации димеров.
• Основная часть таких пробелов репарируется путем рекомбинационных обменов между двумя сестринскими цепями. В процессе используются ферменты ДНК-полимераза I и лигаза, и белок RecA.
SOS-репарация • Ключевая роль в SOS-индукции принадлежит белку RecA. Он
связывается с белком SSB и с однонитевой ДНК и образует ДНК-белковые филламенты, представляющие собой активную форму белка, обозначаемую как RecA*.
• RecA* является сигналом, запускающим индукцию SOS-регулона (около 30 генов), продукты которых необходимы для выживания клетки при массовых повреждениях ДНК.
• В SOS-регулон входят гены UmuD, UmuC и DinB, продукты которых необходимы для «обходной» (translesion) репликации.
• Обходная репликация является неточной, склонной к ошибкам. В результате повышается частота мутаций.
Recommended