Борисова П. Научны e руководители: Волкова П.А....

Поиск Поиск диагностических морфологических диагностических морфологических

признаковпризнаков и генетических маркеров и генетических маркеров

уу ели европейской (ели европейской (Picea abiesPicea abies) ) и и ели сибирской (ели сибирской (PP.. obovata obovata))

и определение видовой принадлежности и определение видовой принадлежности елей Северной Карелииелей Северной Карелии

Борисова П.Борисова П.

НаучныНаучныee руководители: руководители: Волкова П.А.Волкова П.А.

Ильинский В.В.Ильинский В.В.

Введение Введение

P. abies

P. obovata

Зона гибридизации

P. abiesP. obovata

Зона гибридизации

ледник

ЦельЦель

поиск видоспецифичных поиск видоспецифичных морфологических морфологических диагностических признаков и диагностических признаков и генетических маркеров угенетических маркеров у

PP. . abiesabies и и PP. . obovata obovata и определение и определение видовой принадлежности елей видовой принадлежности елей Северной Карелии.Северной Карелии.

Материалы и методыМатериалы и методы141 дерево (149 шишек), 10 популяций141 дерево (149 шишек), 10 популяций

Германия (3)

Северная Карелия (4) Ненецкий АО (1)

Красноярский край (2)

Наша работаНаша работа

МорфологияМорфология P. obovataP. abies

Длина шишек:10-16 см 4-6 (8)

см

коэффициент сужения:

DSL/HS*100

коэффициент вытянутости:

(LS-DS)/HS*100

значение разности коэффициентов сужения и вытянутости:

– 5 5

P. abies P. obovata

Геометрическая морфометрия – описание формы без размеров объекта

Классическая морфометрияКлассическая морфометрия Длина шишки, наибольшая Длина шишки, наибольшая

ее ширина и расстояние до ее ширина и расстояние до нее от основания шишки; нее от основания шишки; для чешуи – аналогичнодля чешуи – аналогично

Вторичные показатели: Вторичные показатели: отношение длины к отношение длины к ширине и отношение ширине и отношение положения наибольшей положения наибольшей ширины к длине для ширины к длине для чешуи и шишкичешуи и шишки

коэффициенты сужения и коэффициенты сужения и вытянутости и их разность вытянутости и их разность

Геометрическая Геометрическая морфометрияморфометрия

Распределение исследованных образцов в пространстве двух первых главных компонент (классификация по совокупности морфологических промеров)

ь ь

Длина шишек для популяцийP. abiesP.

obovataС. Карелия

Отношение длины шишки к ее ширине

С. Карелия

P. obovata

P. abies

Разность коэффициентовсужения и вытянутости

С. Карелия

P. obovata

P. abies

Распределение исследованных растений в пространстве двух первых главных компонент для результатов геометрической морфометрии

Усредненные контуры чешуйУсредненные контуры чешуй

Постепенный переходP. abies P. obovata

изменение частот аллелей некоторых генов с запада на восток

Маркеры в хлоропластной и митохондриальной ДНКРазграничивают виды, но важны

частоты маркеров в популяции => нужны большие выборки

полиморфизм одиночных нуклеотидных замен (Single nucleotide polymorphism, SNP)

Возможно использовать для различения видов

Молекулярно-генетическая Молекулярно-генетическая частьчасть

Материалы и методыМатериалы и методыПоиск нужных участков ДНК

(по базе данных)Подбор праймеров

Выделение ДНК

Получение копий этих участков (ПЦР)

Электрофорез

определение последовательности нуклеотидов

Выбранные последовательности ДНКВыбранные последовательности ДНК(в скобках – условные названия)(в скобках – условные названия)

4 участка ДНК – 4 участка ДНК – два ядерных (220два ядерных (220 ии 4 46677),), один митохондриальный (МТ)один митохондриальный (МТ) один хлоропластный (один хлоропластный (TRNTRN))

Результаты и Результаты и обсуждениеобсуждение

Подбор параметров ПЦРПодбор параметров ПЦР58°, 10 сек

60°, 10 сек

62°,10 сек 61°, 10 сек

64°, 5 сек

65°, 5 сек

67°, 5 сек

60°, 5 сек

Полученные последовательностиПолученные последовательностиSNPSNP в 427 позиции для участка для хлоропластного в 427 позиции для участка для хлоропластного

участка.участка. GB GB – последовательности – последовательности GenBankGenBank

вид P. abies (GB)

P. obovata (GB)

P. abies P. obovata Карельские ели

нуклеотид С A C A A

SNP SNP для ядерного участка (220)для ядерного участка (220) GB GB – последовательности – последовательности GenBankGenBank

Выводы Выводы Найден участок хлоропластной ДНК, который Найден участок хлоропластной ДНК, который

можно рекомендовать для дальнейшей разработки можно рекомендовать для дальнейшей разработки маркера для разграничения маркера для разграничения PP. . abies abies и и PP. . obovataobovata. . Разработаны праймеры и подобраны оптимальные Разработаны праймеры и подобраны оптимальные параметры ПЦР для анализа параметры ПЦР для анализа SNPSNP на этом участке. на этом участке.

PP. . abiesabies, , PP. . obovataobovata различаются длинной шишек и различаются длинной шишек и формой чешуи, описанной как классической, так и формой чешуи, описанной как классической, так и геометрической морфометрией. геометрической морфометрией.

Карельские ели, согласно данным геометрической Карельские ели, согласно данным геометрической морфометрии, относятся к морфометрии, относятся к P.P. × × fennicfennicaa, , согласно согласно классической морфометрии – к классической морфометрии – к PP. . obovataobovata ..

Благодарности Благодарности Часть материала для настоящей работыЧасть материала для настоящей работы собрана в ходе Беломорской экспедиции собрана в ходе Беломорской экспедиции

Московской гимназии на Юго-Западе (№1543). Московской гимназии на Юго-Западе (№1543). Автор благодарит научных руководителей Автор благодарит научных руководителей

Волкову Полину Андреевну и Ильинского Волкову Полину Андреевну и Ильинского Валерия Владимировича; Л. Абрамову, П. Валерия Владимировича; Л. Абрамову, П. Волкову, П. Петрова, А. Еськову, Е.Трушину, К. Волкову, П. Петрова, А. Еськову, Е.Трушину, К. Трушина за помощь в сборе материала.Трушина за помощь в сборе материала.

Д.В. Ребрикова за ценные указания и помощь в Д.В. Ребрикова за ценные указания и помощь в написании работы, а так же коллектив ЦКП написании работы, а так же коллектив ЦКП «Генный полиморфизм» за предоставленную «Генный полиморфизм» за предоставленную возможность проведения работы. возможность проведения работы.

Также автор признателен рецензенту Д. Кнорре Также автор признателен рецензенту Д. Кнорре за ценные замечания о данной работе и С. М. за ценные замечания о данной работе и С. М. Глаголеву за организацию практики.Глаголеву за организацию практики.

Спасибо за вниманиеСпасибо за внимание

Геометрическая Геометрическая морфометрияморфометрия

Метод тонких пластинМетод тонких пластин 20 равноудаленных точек по всему контуру20 равноудаленных точек по всему контуру Координаты меток – экранный дигитайзера Координаты меток – экранный дигитайзера

tpsDig tpsDig Координаты эталонной конфигурации, Координаты эталонной конфигурации,

значения главных, относительных и частных значения главных, относительных и частных трансформаций – программа трансформаций – программа tpsRelw tpsRelw

Усредненные контуры чешуй – программа Усредненные контуры чешуй – программа tpsSuper tpsSuper

Редактирование и конвертирование файлов Редактирование и конвертирование файлов данных – вспомогательная программа tpsUtil данных – вспомогательная программа tpsUtil

биостанция

Чупа

Расположение карельских Расположение карельских популяцийпопуляций

губа Чупа Кандалакшского залива Белого губа Чупа Кандалакшского залива Белого моряморя

Анализ главных компонентАнализ главных компонент Однофакторный дисперсионный Однофакторный дисперсионный

анализ с последущим попарным анализ с последущим попарным сравнением выборок тестом сравнением выборок тестом Вилкоксона с поправкой Вилкоксона с поправкой Бонферрони.Бонферрони.

Использовали статистическую Использовали статистическую среду среду R R

Вид

№попул

яции

LC LC/HC DC/LC LS/HS DS/LS CP CN CN – CP

Карелия

b 62±11 1.92±0.30 0.39±0.10 1.40±0.18 0.69±0.05 43±7 53±11 10±14

c 58±10 1.94±0.25 0.39±0.09 1.31±0.15 0.65±0.06 45±11 56±14 10±17

d 65±12 2.20±0.22 0.39±0.12 1.35±0.13 0.68±0.05 43±9 58±15 15±21

e 57±9 2.01±.28 0.33±0.1 1.36±0.16 0.67±0.05 45±8 59±13 15±15

P. obovata

f 57±9 2.04±0.31 0.34±0.08 1.32±0.19 0.63±0.06 50±13 71±8 21±19

g 61±8 2.17±0.23 0.41±0.0 1.30±0.11 0.71±0.08 37±11 73±8 35±12

h 68±4 1.99±0.48 0.40±0.1 1.42±0.08 0.68±0.08 46±12 62±6 16±14

P. abies

i 118±13 2.78±0.23 0.40±0.08 1.37±0.13 0.63±0.05 54±20 37±8 -14±13

j 110±18 2.50±0.15 0.40±0.07 1.48±0.13 0.64±0.06 53±10 43±3 -10±11

k 105±10 3.09±0.77 0.34±0.03 1.37±0.13 0.62±0.02 52±3 40±9 -12±6

значения коэффициента значения коэффициента вытянутости (вытянутости (CPCP))

коэффициент сужения (коэффициент сужения (CNCN ))

Отношение положения наибольшей ширины чешуи к ее длине (DC/LC)

Геометрическая Геометрическая морфометрияморфометрия

Выделение ДНКВыделение ДНК ДНК выделяли из высушенной хвои используя метод СТАВ. К ДНК выделяли из высушенной хвои используя метод СТАВ. К

10-20 хвоинкам добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,2 10-20 хвоинкам добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl pH 8,0, 0,05М EDTA, 2М NaCl, 2% СТАВ), образец М Tris-HCl pH 8,0, 0,05М EDTA, 2М NaCl, 2% СТАВ), образец вместе с буфером гомогенизировали в фарфоровой ступке. вместе с буфером гомогенизировали в фарфоровой ступке. После проводили очистку ДНК с помощью стандартной После проводили очистку ДНК с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции (методики фенол-хлороформной экстракции (ChomczynskiChomczynski, , SacchiSacchi, 1987):, 1987):

Добавляли 400 мкл фенола Добавляли 400 мкл фенола pHpH=7,2, хорошо перемешивали.=7,2, хорошо перемешивали. Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта

(24:1), хорошо перемешивали.(24:1), хорошо перемешивали. Центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин (16000 Центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин (16000 gg).). Переносили водную фазу в новую пробирку 1,5мл и добавляли Переносили водную фазу в новую пробирку 1,5мл и добавляли

в нее 800 мкл 100% изопропанола, хорошо перемешивали.в нее 800 мкл 100% изопропанола, хорошо перемешивали. Центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин.Центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин. Полностью удаляли надосадочную жидкость.Полностью удаляли надосадочную жидкость. Добавляли 400 мкл 70% этанола, хорошо перемешивали.Добавляли 400 мкл 70% этанола, хорошо перемешивали. Центрифугировали 5 мин при 13000 об/минЦентрифугировали 5 мин при 13000 об/мин Полностью удаляли надосадочную жидкость и высушивали Полностью удаляли надосадочную жидкость и высушивали

осадок при комнатной температуре (не более 10 мин).осадок при комнатной температуре (не более 10 мин). Растворяли осадок в 50 мкл Растворяли осадок в 50 мкл TETE ( (Tris EDTATris EDTA) буфера путем ) буфера путем

инкубирования при 65° С с периодическим перемешиванием.инкубирования при 65° С с периодическим перемешиванием. В дальнейшем образцы хранили при температуре – 20° С. В дальнейшем образцы хранили при температуре – 20° С.

Общий объем смеси для ПЦР Общий объем смеси для ПЦР на одну пробирку составлял на одну пробирку составлял

25 мкл 25 мкл 17,5 мкл воды17,5 мкл воды 2,5 мкл 10-ти кратного ПЦР-буфера2,5 мкл 10-ти кратного ПЦР-буфера 0,5 мкл раствора 0,5 мкл раствора dNTPdNTP''ss (25мМ каждого) (25мМ каждого)

– дезоксинуклеотидтрифосфатов– дезоксинуклеотидтрифосфатов 0,15 мкл каждого праймера0,15 мкл каждого праймера 1 мкл ДНК1 мкл ДНК 0,5 мкл 0,5 мкл HS TaqHS Taq-полимеразы (ЗАО -полимеразы (ЗАО

«Евроген»)«Евроген»)

Выбранные видоспецефичные Выбранные видоспецефичные последовательности ДНКпоследовательности ДНК

Результаты и Результаты и обсуждения обсуждения

Название участка

УчастокНомера в GenBank1 – P. abies2 – P. obovata

Праймеры/название праймера

467 conserved ortholog set (COS) PgTRX_WS00935.B21_B171. EU309976.12.EU309990.1

GTCAAGCAGGCCACGTGGGTC (467-D)AGTTGGAGGACCTAGGGAGGAG (467-R)

220 conserved ortholog set (COS) PgTRX_209921.EU309947.12.EU309961.1

GCTTGCTAAGAGTGGAACCTGTTC (220-D)ACGACTTGTTATGCACTGGGCTTG(220-R)

TRN isolate ABI2b tRNA-Thr (trnT) gene, partial sequence; tRNA-Leu (trnL) gene, complete sequence; and tRNA-Phe (trnF) gene1.EU364798.12.EF440555.1

TGAATGTAGATTGTAGATTCCTTCAAG (TRN-D)GTCCGTAGCGTCTACCGATTTCG (TRN-R)

MT NADH dehydrogenase subunit 1 (nad1) gene, intron 2 and partial cds1.EF440449.12.EF440476.1

TCTATAGATAGAGAGATAGTAGCGAG (MT-D)CTCAAAGGGCTAGCTAGAAGGTAAG(MT-R)