View
225
Download
2
Category
Preview:
Citation preview
1
La diagnostica mediante NMR
Raffaele Lamanna CR Trisaia – Biotec-AgroRaffaele Lamanna CR Trisaia – Biotec-Agro
2
La NMR è una tecnica spettroscopica in cui le transizioni osservate sono quelle fra i livelli energetici creati per effetto Zeeman quando il campione è sottoposto ad un forte campo magnetico.
Iom mBE Condizione di risonanza
Eo
1H
1,4 T 60 MHz
9.4 T 400 MHz
13C
1 T 10.7 MHz
oo B mI = ± 1
Mz
Effetto ZeemanEffetto Zeeman: In presenza di un campo magnetico esterno la degenerazione sui livelli si spin è rimossa e la magnetizzazione nucleare è diversa da zero.
Nella moderna NMR l’insieme di spin è eccitato mediante impulsi a r.f. e il segnale rivelato è nel dominio del tempo.
Solo dopo una Trasformata di Fourier è possibile ottenere lo spettro in frequenza.
3
Esistono essenzialmente quattro tipi di interazione:
• Zeeman e chemical sheilding
• Interazione indiretta mediata dagli elettroni.
• Interazione diretta (dipolare)
• Interazione di quadrupoloLe interazioni fra gli spin nucleare hanno intensità dell’ordine di KT. Ciò ci permette di modificare tali interazioni mediante delle perturbazioni esterne facendo in modo da evidenziare in un determinato esperimento solo alcuni tipi di interazione piuttosto che altri.La potenza è la versatilità dell’NMR sta proprio in questa capacità.
4
Differenze fra solidi, liquidi e semisolidi (soft matter)
• I liquidi sono caratterizzati da moti browniani traslazionali e rotazionali veloci che mediano tutte le anisotropie delle interazioni.
•La conseguenza è che lo spettro NMR è composto da righe generalmente strette e ben risolte.
• In un solido gli atomi assumomo posizioni fisse così piccole differenze nelle loro posizioni ed orientazioni o nell’ambiente che li circonda modulano le interazioni fra nuclei che risultano eseere così leggermente diverse da atomo ad atomo.
•Questa distribuzione anisotropa delle interazioni induce una distribuzione delle frequenze NMR, che essendo molto vicine le une alle altre si sovrappongono dando origine ad una riga molto larga.
5
Informazioni Strutturali
• Struttura stereochimica di molecole in soluzione
Informazioni Dinamiche
• Moti intramolecolari
• Rotazioni di gruppi chimici
• Moti intermolecolari
• Processi diffusivi
Informazioni Chimiche
• Analisi qualitativa e quantitativa di miscele
• Reazioni chimiche : cinetica e rivelazione di specie transienti
• Transizioni di fase
Chemical fingerprinting
6
Spettro 1H NMR a 600 MHz di succo di pomodoro
• In uno spettro 1H di succo di pomodoro ci sono diverse centinaia di righe di cui alcune sovrapposte.
7
Spettro Homonuclear 2D J-resolved di succo di pomodoro
L’analisi dello spettro 2D J-resolved permette di assegnare le componenti dei multipletti e permette di
misurare le costanti di accoppiamento 1H-1H J-couplings.
8
Spettro 1H-1H COSY di succo di pomodoro
Thr
Ala
Asp
Asn
GlnGlu
9
ppm
3.43.63.84.04.24.4 ppm
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
-glucose
-glucose
O OH
HH
OH
OH
H
H
OH
H
H HOH
Spettro 1H-1H TOCSY di succo di pomodoro
10
Spettro di correlazione 1H-13C di succo di pomodoro
13C
1H
11
•In un liquido a causa dell’energia termica le molecole sono sottoposte ad un moto casuale (Moto Browniano).
•Le caratteristiche di questo moto diffusivo sono funzione della forma della perticella diffondente e dell’interazione con il solvente e con le altre particelle.
FickdileggeIIPDt
P 2
•I moti diffusivi possono essere misurati mediante NMR facendo uso di gradienti di campo magnetico
• Ciascun nucleo emette O.E.M. a frequenza proporzionale al campo magnetico che esso sente.
•Un gradiente lineare di campo fa si che nuclei aventi posizioni differenti sentano campi magnetici differenti e quindi risuonino a frequenza diversa. Ciò equivale a fare una codifica fra la frequenza e la posizione dei nuclei..
12
Gli spin raggiungono insieme la linea di partenza solo se non cambiano la loro posizione.
Ripetendo l’esperimento a diversi tempi di diffusione o con diverse intensità di gradiente è possibile contare gli spin che hanno rifocalizzato e quindi determinare il loro coefficiente di diffusione.
La Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY) permette di individuare le righe NMR associate con i nuclei della medesima molecola attraverso il suo coefficiente di diffusione.
13
Spetto DOSY di succo di pomodoro
14
Importanza dell’algoritmo di analisi
R. Lamanna “NMR Data Processing:The TNMR SoftwarePackage”
XXXII National Congress on Magnetic Resonance Pavia 18-21 settembre 2002
Sof
twar
e co
mm
erci
ale
TN
MR
15
List of components of tomato juice fully assigned in 1H NMR spectra
Sugars-D-Glucose, -D-Glucose,-D-Fructopyranose, -D-Fructofyranose
Organic acidsCitric acid, Malic acid, Acetic acid, Formic acid
Amino acidsAlanine, Threonine, Glutamic acid, Glutammin, Aspartic acid, Asparagin, Phenylalanine, Triptophane, Tyrosine, Valine, Ileucine, -Aminobutyric acid
AlcoholsEthanol, Methanol.
16
Monitoraggio della maturazione del pomodoro mediante NMR
Contenuto molare relativo dei componenti principali del pomodoro a tre diversi gradi di
maturazione.
17
Idrolisi Enzimatica dell’amido in miscele acqua-farina
-maltose-glucose
A30 min
B270 min
“B-A”
18
tka
aia
ik
a
i
i
eEE
Ekdt
dE
EE
0
M
tkG
tkM
K
MeVtMg
eVtMSf
iG
iM
0
0
.
,,
t
M
G eK
V
G
MM
G
MM eMV
KV
V
KVtM
1
00
0
0
00
)(
t
M
G eK
V
G
MMtM eMV
KVe
VGtG
1
00
000
0
11)(
Il Modello Cinetico
),(
),(,,
tMgdt
dG
tMgtMSfdt
dM
M
G
SM
KM
MVMg
KS
SVMSf
,
La forma delle funzioni f e g dipende dal tipo di reazioni coinvolteNel caso di una cinetica di tipo Michaelis-Menten si ha:
se
M
G
M
K
MVMg
VMSf
,
M<<KM.
S>>KS
acat EkV
Iniattivazione enzimatica del primo ordine
19
Int
(a.u
.)
0
50
Chey
Int
(a.u
.)
0
100
AL1
Int
(a.u
.)
0
100 AL2
Int
(a.u
.)
0
5
10
ChSp
Int
(a.u
.)
0
20
40
AX
Int
(a.u
.)
0
20DxDy
Int
(a.u
.)
0
100
CAP
Int
(a.u
.)
0
50 SIM
Int
(a.u
.)0
50
Lb45
Int
(a.u
.)
0
100LAT
Int
(a.u
.)
0
100
BxBy
Int
(a.u
.)
0
50
Lb42
Time, 104 s2 4
Time, 104 s 2 4
[1]
t
M
G ek
V
G
MM
G
MM eMV
kV
V
kVtM
1
00
0
0
00
)(
t
M
G ek
V
G
MMtM eMV
kVe
VGtG
1
00
000
0
11)(
20
(ppm)
D (cm2 s –1)
Maltose
Glucose
long chain polysaccharides
21
Lin
kag
e D
ista
nce
0
10
20
30
40
50
60
AL1 SIM
LAT CAP
BXBY Lb42
Lb45 ChSp
AL2 Chey
AX DXDY
S
H
ROOT
M0
Chey
DxDy
AL2
ChSp
AX
SIMLb42
LATLb45CAP
BxBy
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
Pattern Recognition
PCA, Cluster Analysis, LDA, Anova, Logica Fuzzy, Reti neurali, teniche Bayesiane etc.
Cluster Analysis
LDA
Recommended