View
157
Download
2
Category
Preview:
DESCRIPTION
Uvod u separacione metode
Citation preview
11
15 pitanjaMaks.: 25 bodovaMin.: 13 bodova
Zavrni ispit
Separacija:
Maks.: 25 + 10 = 35Min: 13 + 6 = 19
Elektrohemija:
5 pitanjaMaks.: 10 bodovaMin.: 6 bodova
ISPIT II deo(elektrohemija i separacija)
Instrumentalnemetode
22
SEPARACIONE METODE
dr Nataa Peji, vanr.prof.
33
PLAN PREDAVANJA
Uvod u separacione instrumentalne metode Principi razdvajanja Elektroforeza (princip i podela) Hromatografija (princip i podela)
44
LITERATURA
1. M. Medenica, D. Maleev, Eksperimentalna fizika hemijawww.pharmacy.bg.ac.rs/predmeti/instrumentalnemetode (5MRF20INM)/Udbenik: M. Medenica, D. Maleev: Eksperimentalna fizika hemija2. M. Medenica, Skripta: Instrumentalne metode, deo C
55
INSTRUMENTALNE METODE
Optike(spektroskopske i nespektroskopske)(refrakcija, rotacija, apsorpcija, emisija,
difrakcija, rasipanje)
Elektroanalitike(Q, U, I, ) Separacione
Detekcija i merenje karakteristinog signala za kvalitativnu i kvantitativnu analizu
VE STE NAUILIIM
6"Klasine"
SEPARACIONE METODE
Destilacija, ekstrakcija, itd.
Kvalitativna analiza:Boja, rastvorljivost, Tm, Tk,
indeks refrakcije, itd.
Kvantitativna analiza: Gravimetrijska i titrametrijska merenja
Instrumentalne
Hromatografija, elektroforeza, itd.
Kvalitativna analiza:tR, VR, oblik pika
Kvantitativna analiza: Merljive fiziko-hemijske osobine
(provodljivost, potencijal, apsorbancija, fluorescencija, itd.)
77
SEPARACIONE METODE
HROMATOGRAFIJA ELEKTROFOREZA
MASENASPEKTROMETRIJA
( m/e)CENTRIFUGA
( (veliini, obliku))
U analitike i preparativne svrhe
88
HROMATOGRAFIJA
Gasnahromatografija
(GC)
ELEKTROFOREZA
Tenahromatografija(LC i HPLC)
Fluidna hromatografija prisuperkritinim uslovima
(SFC)
KapilarnaPlanarna
99
Osobine molekulaosnova za separaciju
POLARNOST
Tena hromatografija Gasna hromatografija
VELIINA (MASA)
Ultrafiltracija Ultracentrifugiranje
Hromatografija iskljuenjem
NAELEKTRISANJE
Elektroforeza Jonoizmenjivaka hromatografija
Masena spektrometrija
OBLIK
Afinitetna hromatografija Imunohemijske metode
Enzimske metode
10
10
Separaciona metoda razdvajanje komponenata smee (naelektrisanih estica istog, ili predznaka) u polju jednosmernog
elektrinog napona
Kretanje koloidnih i drugih naelektrisanih estica kroz neku sredinu (rastvor, gel i sl.) uslovljeno prisustvom i delovanjem homogenog
elektrinog polja
ELEKTROFOREZA
Elektrokinetika pojava
Metoda
11
pokretne granice(slobodna)
Nobelova nagrada za hemiju (Nobelova nagrada za hemiju (elektroforezaelektroforezapokretne granice pokretne granice razdvajanje smerazdvajanje smee serum proteina)e serum proteina)
IstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorija
Arne Tiselius
19021971 Tiselijusova
elija
nekompletna separacija (mnogi proteini imaju isto ukupno naelektrisanje
komplikovana aparatura i skupa
1948.
ProblemiProblemiProblemiProblemi::::ProblemiProblemiProblemiProblemi::::
1937.
elektroforezaelektroforeza
Zbog toga ZONSKA
12
12
RAZDVAJANJE KOMPONENATA SMEENA OSNOVU:
PREDZNAKANAELEKTRISANJA
(KATJONI KA KATODIANJONI KA ANODI)
POKRETLJIVOSTI
ESTICE ISTOG PREDZNAKA
ZAVISI OD: KOLIINE naelektrisanja veliine i oblika estice jaine elektrinog polja T, karakteristika potporne sredine
na osnovu razliitih M proteina(SDSPAGE)
PrincipPrincip
13
13
ELEKTROFOREZAPrema nainu izvoenja
Slobodna(u rastvoru) Zonska(na vrstoj podlozi)
(pokretljivost)pH=const.
Izotahoforeza( elek.
pokretljivost)pHLpHT)
Izoelektrinofokusiranje
( pI)pH const.
papir, gel
u kapilari
kapilara
PodelaPodela
ZonskaZonskaZonskaZonska elektroforezaelektroforezaelektroforezaelektroforeza je slije slije slije slina na na na hromatografijihromatografijihromatografijihromatografiji, , , ,
osim osim osim osim to je migracija uslovljena dejstvom to je migracija uslovljena dejstvom to je migracija uslovljena dejstvom to je migracija uslovljena dejstvom elektrielektrielektrielektrinog polja, nog polja, nog polja, nog polja,
umesto mobilnom fazomumesto mobilnom fazomumesto mobilnom fazomumesto mobilnom fazom
Elektroforetske tehnike:
Pokretne granice
14
14
ZONSKA ELEKTROFOREZAPrema obliku podloge
Planarna Kapilarna
kapilara (L: 40100 cm, R: 2575 m)kvarc koji sadri sinanolne grupe
kompleksnabrzamoe se automatizovatidobra za kvantitivnu analizupotrebne male koliine uzorka (nL)
11 22
PodelaPodela
Podloga: papir, celuloza-acetat, polimerni gel(L: 210 cm)potopljena u pufer
jednostavnasporane moe se automatizovatiloa kvantifikacijapotrebne velike koliine uzorka (L)
15
15
U kome dolazi do razdvajanja komponenata smee tako da komponente u veoj (ili manjoj) meri prelaze u drugu fazu sa kojom je smea dovedena u
dodir
HROMATOGRAFIJA
PROCES
VE STE NAUILIFH
Razdvajanje komponenata smee izmeu DVE FAZE razliite pokretljivosti (stacionarne i mobilne) faze
METOD
Razdvajanje Izolovanje Identifikaciju Odreivanje
u preparativne svrhe
kvalitativnakvantitativna
16
16
adsorpciona
IstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorija
Mikhail TswettMikhail TswettMikhail TswettMikhail Tswett
(1872(1872(1872(18721919)1919)1919)1919)
razdvajanje sastojaka zelenog lia (hlorofil, ksantofil) CaCO3 kao adsorbens, petrol-etar/etanol kao mobilna faza odvojeni pigmenti (obojene trake u koloni)
1906. god
.
hromatografijahromatografija
17
17
Rastvor analizirane smee u MOBILNOJ fazi proputa se kroz STACIONARNU fazu
Raspodela komponenata uzorka (rastvorljive u mobilnoj fazi) izmeu faza uzrokovana je fiziko-hemijskim procesima:
ADSORPCIJAPODELA IZMEU DVA RASTVARAA (RASTVORLJIVOST), iliJONSKA IZMENA
PRINCIP
VE STE NAUILIFH
POSLEDICA
Komponente smee se raspodeljuju izmeu faza i pod uticajem mobilne faze kreu se kroz stacionarnu fazu brzinama
Prelazak komponente izmeu faza deava se sve dok odnos cs i cm(NERNSTOV KOEFICIJENT RASPODELE) ne dostigne const. vrednost
K = f (prirode komponenti, osobina faza, T i afiniteta komp. prema fazama)m
s
c
cK =
18
18
Podsetiti se:Teorijski principi i tehnike izvoenja adsorpcione, particione i
jonoizmenjivake hromatografije
1. M. Medenica, D. Maleev, Eksperimentalna fizika hemijawww.pharmacy.bg.ac.rs/predmeti/instrumentalne
metode (5MRF20INM)/udbenik.pdf
M. Aleksi, Hromatografija-teorijski principiwww.pharmacy.bg.ac.yu/predmeti/fizika_hemija/predavanja_2007-
08/Hromatografija skripta. pdf
19
19
Faze (stacionarna i mobilna) u hromatografiji:ne meaju se
VE STE NAUILIFH
MOBILNA FAZA gas tenost
imaju pokretljivosti
STACIONARNA FAZA vrsto telo ( porozno ili granulisano) sloj tenosti adsorbovan na
vrstom telu jonoizmenjiva
20
20
HROMATOGRAFIJAPrema mehanizmu razdvajanja
Adsorpciona adsorpcioni
koeficijentiPodeona(particiona)
koeficijenti rastvorljivosti
Jonoizmenjivaka afinitetu sastojaka prema jonskoj izmeni
PodelaPodela
u koloni U koloniNa hartiji i na tankom sloju
u koloni
21
21
Adsorpciona hromatografija
Razdvajanje zasnovano na razlici u afinitetu adsorpcije sastojaka uzorka prema povrini vrste faze
(razdvajanje na osnovu adsorpcionih koeficijenata)
Podeona hromatografija
Razdvajanje bazirano na razlici u rastvorljivosti sastojaka uzorka Gasna hromatografija razlike u rastvorljivosti sastojaka uzorka u
nepokretnoj (STACIONARNOJ) fazi Tena hromatografija razlika u rastvorljivosti sastojaka uzorka u
pokretnoj (MOBILNOJ) i nepokretnoj (STACIONARNOJ) fazi
Jonoizmenjivaka hromatografija
Razdvajanje bazirano na razlici u afinitetu sastojaka uzorka prema jonskoj izmeni
Ovde je delimiOvde je delimiOvde je delimiOvde je delimino zastupljen i proces adsorpcijeno zastupljen i proces adsorpcijeno zastupljen i proces adsorpcijeno zastupljen i proces adsorpcije
22
22
HROMATOGRAFIJAPrema fizikom stanju mobilne i stacionarne faze
Gasna (mobilna)
Gasno tena Gasno vrsta
Tena (mobilna)
Teno tena Teno vrsta
PodelaPodela
23
HROMATOGRAFIJAPrema obliku hromatografske podloge
Planarna(hromatografija otvorene podloge)
U koloni (kapilara i punjena kolona)
Mobilna: tenost koja se kree pod dejstvom kapilarnih sila, ili zemljine tee
PodelaPodela
Stacionarna:H2O kojom je natopljena traka filter-papira
Kristalna voda inkorporirana u silika-gel
Mobilna: tenost koja se kree pod dejstvom sile zemljine tee i /ili p
Stacionarna:Kapilara: film tenostiili vrsti adsorbens
Punjena kolona: vrstizrnasti materijal
24
24
Prema primenjenoj radnoj tehnici
FRONTALNA ANALIZA
Na stacionarnu fazuse const. dodaje RASTVOR UZORKA i samo komponentakoja se najbre kree dobija se uistom stanju
RETKO SE KORISTI
ISTISKIVANJE
Na stacionarnu fazu se nanosi rastvor uzorka, a onda supstancija koja istiskuje komponente uzorka i tako ubrzavanjihovo kretanje
SAMO KVALITATIVNA
ELUIRANJE
Uzorak se unosi ukolonu, jedan krajpapira, ili tankog sloja vrste stac.faze iISPIRA MOBILNOMFAZOM (ELUENTOM)
KVALITATIVNA IKVANTITATIVNA
PodelaPodelaPodelaPodelaPodelaPodelaPodelaPodela
25
25
ELUIRANJE (ispiranje; RAZVIJANJE!!!)
ELUENT MOBILNA FAZA kojom se vri ispiranje ELUAT RASTVOR koji IZLAZIiz kolone
1) izokratsko: uvek ista mobilna faza2) gradijentno: sastav mobilne faze se menja za vreme eluiranja
(npr. 50% metanol (5 min), 60% metanol (drugih 5 min), 70% metanol (treih 5 min), itd.)
glavna tehnika razdvajanja kod hromatografije u koloni podrazumeva ispiranje prisutnih molekulskih vrsta kroz
kolonu stalnim dodavanjem istog rastvaraa proces moe biti zaustavljen dok su svi sastojci uzorka
jo na podlozi, ili se moe nastaviti dok svi sastojci ne napuste hromatografsku podlogu
26
26
ELUIRANJE
DETEKCIJA
Na kraj kolone postavi se detektor koji reaguje na prisustvo analita: signaldetektora u funkciji vremena daje dijagram sa nizom pikova HROMATOGRAM
DETEKTORureaj koji meri promene u sastavu eluata merenjem nekih fiziko-hemijskih osobina
27
27
HROMATOGRAFIJE U KOLONI
Gasna hromatografija (GC)
Tena hromatografija pod visokimpritiskom (HPLC)
28
28
HROMATOGRAFIJA
OSNOVNI ZAJEDNIKI POJMOVI
29
29
HROMATOGRAF
Ureaj kojim se vri hromatografsko razdvajanje komponenata smee
GC(HP)LC(HP)
HPLC(HP)
30
30
HROMATOGRAM
ZoneZone (razdvojene komponente) (razdvojene komponente) rasporeene rasporeene u stacionarnoj faziu stacionarnoj fazi
(u planarnoj hromatografiji: papir, ili tanki sloj na kome su zone)
Grafiki prikaz odziva detektora(koncentracije analita u eluatu ili neke druge veliine (srazmerne koncentraciji))u funkciji vremena ili zapremine eluata
OD = f(t), tj. c = f(t)OD = f(V), tj. c = f(t)
unutranji
spoljanji
31
31
Tipovi hromatograma
sastojci analize:prelaze udaljenosti
na podlozi za isto vremedetektuju se nasamoj podlozi
planarna hromatografija
UNUTRANJI SPOLJANJI
sastojci analize:prelaze isti put u vremenudetektuju se van podloge
hromatografija u koloni
i kod elektroforeze
11 22
32
32
SPOLJANJI HROMATOGRAM
detektor belei promenukoncentracije komponente(u mobilnoj fazi) u funkciji vremena eluiranja
Diferencijalni Integralni
detektor belei ukupnu koliinu izeluiranihsastojaka u vremenu
c = f(t)c
/
m
m
o
l
c
m
-
3
t
c
/
m
m
o
l
t
Ukupna koliina = f(t)
OD OD
BBAA
22
33
33
Diferencijalni i integralni hromatogram
AA
BB
34
34
HROMATOGRAM
Grafiki prikaz (zapis) hromatografskog razdvajanja
tt
V
Veliina merenog signala (OD) u funkciji vremena zadravanja komponente smee u koloni
ili
Veliina merenog signala (OD) u funkciji zapremine mobilne faze
koja je potrebna da eluira komponentu iz kolone
35
35
KARAKTERISTIKE HROMATOGRAMA(hromatografskog pika)
11 mrtvo vreme
22
33
44
retenciono vreme (nekorigovano i korigovano)
retenciona zapremina (nekorigovana i korigovana)
retencioni faktor
Pik = hromatografska kriva deo diferencijalnog hromatograma koji belei detektor pri eluiranju jednog sastojka iz kolone
36
36
Retencija (zadravanje)Komponente se razdvajaju jer se zadravaju u stacionarnoj fazi razliito vreme
Retenciono vremeNekorigovano rastojanje od starta do pika date kom.
Korigovano rastojanje od pika prazne zapreminedo pika date komponente
Retenciona zapremina
22
33
11Retenciono vreme
mrtvo vreme vreme od momenta unoenja uzorkado pojave pika mobilne faze
37
37
Karakteristike hromatograma
OD
t/min
t0 mrtvo vreme(retencionovreme u mobilnoj fazi)tR ukupno vreme zadravanja,
od trenutka ubacivanja uzorka do max. pika
tR korigovano retencionovreme (retenciono vreme u stacionarnoj fazi)
h visina pika ( rastojanje izmeu osnovne linije i vrha
pika )W irina pikaW0,5 irina pika na h
Vazduni pik (kod GC)Prazna zapremina
t0
Definicije
38
38
RETENCIONO VREME (L/v)
0ttt ,RR +=
REDUKOVANO (KORIGOVANO) RETENCIONO VREME
0R,
R ttt =
t0 (L/u) vreme od momenta unoenja uzorka do pojave pika mobilne faze
22
Matem
atiki iz
razi
39
39
Karakteristike hromatograma
OD
V/mL
Prazna zapremina
V0
VR,
RV
VR zapremina mobilne faze potrebne da se data komponenta eluira iz koloneVR korigovana retenciona zapremina
DefinicijeV0 prazna zapremina(zapremina mobilne faze koja bez zadravanja stie do detektora)
40
40
RETENCIONA ZAPREMINA
utV ,r,R =
REDUKOVANA (KORIGOVANA) RETENCIONA ZAPREMINA
0VVV ,RR +=
u brzina protoka mobilne faze (cm3 s1)
utV RR =
0VVV R
,R =
33
Matem
atiki iz
razi
41
41
RETENCIONI FAKTOR (k')
Mera zadravanja komponente u koloni
00
0
t
t
t
ttk
,RR,
=
=
44
Def.
Matematiki izraz
42
42
Vrste hromatografije u zavisnosti od sistema koji se analizira
Gel hromatografijaBioloki uzorci i jedinjenja velike M
Jonoizmenjivaka i gel hromatografija
Jonske od nejonskih
JonoizmenjivakaHromatografija na tankom sloju i
papiru
Neorganske i jonske supstancije
AdsorpcionaSupstancije slinog hemijskog tipa
PodeonaSupstancije razliitog hemijskog tipa
Gasna Gasovi i isparljive supstancije
Vrsta hromatografijeIspitivani sistem
43
43
HROMATOGRAFSKA ANALIZAVaVaVaVannnno o o o zazazaza hromatografskhromatografskhromatografskhromatografskuuuu analizanalizanalizanalizuuuu::::
vrsta stacionarne faze; sastav i priroda mobilne faze
sastav i priroda analiziranog uzorka
tehnika injektiranja uzorka i injektorski sistem (posebno kod GC)
T, p, brzina protoka mobilne faze
izbor detektora (osetljivost)
hromatogram
44
44
PRIMENA HROMATOGRAFIJE
identifikacija (preko tR, t'R, VR,V 'R, oblika pika)
tR je karakteristina vrednost na T = const., protoku i za datu kolonu
dodatne identifikacijepomou IR, NMR ili MS
Kvalitativna analiza
odreivanje koliine na osnovu h = f(c), P = f(c)(automatski (pomou integratora) ili raunski
kalibracija
Kvantitativna analiza
45
45
1. Ketoprofen2. Naproksen3. Fenoprofen Ca4. Flurbiprofen5. Ibuprofen
t/min
A
Nesteroidni anti-inflamatorni lekovi
Uslovi:Kolona: Kaseisorb LC ODS 2000 4.6mml.D.250mmMobilna faza: CH3CN/H2O/CH3COOHT: 25CBrzina protoka: 1 mL/minDetekcija: UV na 254 nm
HROMATOGRAMHROMATOGRAM
46
46
Poreenje elektroforeze i hromatografije
hromatogramOD = f(vreme provedeno u koloni)
OD = f(zapremina eluata)
elektroforezogram (elektroforegram)OD = f (migraciono vreme)
Zapis razdvajanja
spektrofotometar, fluorimetar, itd.UV/VIS, MS, itd.Detekcija
Retenciono vremeMigraciono vremeKvalitativnaanaliza
Analiziraju se
Separacija
Nain izvoenja
Agens
Primena
metoda
organska jedinjenja (lako (GC) i teko isparljiva (HPLC)
joni, koloidni rastvori, vitamini, lekovi, proteini, organske kiseline
polarnostraspodela izmeu 2 faze (razliiti
koeficijenti raspodele)
naelektrisanje, veliina i oblik
planarna (otvorene podloge) kolona (kapilara i punjena kolona)
planarna (vsta podloga: papir, gel)kapilara
mobilna fazaelektrino poljepreparativne i analitike svrhe
HromatografijaElektroforeza
47
47
SeparacioneSeparacioneSeparacioneSeparacione instrumentalneinstrumentalneinstrumentalneinstrumentalne metode (principi razdvajanja)metode (principi razdvajanja)metode (principi razdvajanja)metode (principi razdvajanja)
ElektroforezaElektroforezaElektroforezaElektroforeza ((((ta je, princip, podela)ta je, princip, podela)ta je, princip, podela)ta je, princip, podela)
HromatografijaHromatografijaHromatografijaHromatografija ((((ta je, princip, podela) ta je, princip, podela) ta je, princip, podela) ta je, princip, podela)
HromatogramHromatogramHromatogramHromatogram (karakteristike, definicije i matemati(karakteristike, definicije i matemati(karakteristike, definicije i matemati(karakteristike, definicije i matematiki izrazi za ki izrazi za ki izrazi za ki izrazi za
karakteristikarakteristikarakteristikarakteristine veline veline veline veliine)ine)ine)ine)
Poreenje Poreenje Poreenje Poreenje elektroforezeelektroforezeelektroforezeelektroforeze i i i i hromatografijehromatografijehromatografijehromatografije
I
Z
V
O
D
Recommended