11

15 pitanjaMaks.: 25 bodovaMin.: 13 bodova

Zavrni ispit

Separacija:

Maks.: 25 + 10 = 35Min: 13 + 6 = 19

Elektrohemija:

5 pitanjaMaks.: 10 bodovaMin.: 6 bodova

ISPIT II deo(elektrohemija i separacija)

Instrumentalnemetode

22

SEPARACIONE METODE

dr Nataa Peji, vanr.prof.

33

PLAN PREDAVANJA

Uvod u separacione instrumentalne metode Principi razdvajanja Elektroforeza (princip i podela) Hromatografija (princip i podela)

44

LITERATURA

1. M. Medenica, D. Maleev, Eksperimentalna fizika hemijawww.pharmacy.bg.ac.rs/predmeti/instrumentalnemetode (5MRF20INM)/Udbenik: M. Medenica, D. Maleev: Eksperimentalna fizika hemija2. M. Medenica, Skripta: Instrumentalne metode, deo C

55

INSTRUMENTALNE METODE

Optike(spektroskopske i nespektroskopske)(refrakcija, rotacija, apsorpcija, emisija,

difrakcija, rasipanje)

Elektroanalitike(Q, U, I, ) Separacione

Detekcija i merenje karakteristinog signala za kvalitativnu i kvantitativnu analizu

VE STE NAUILIIM

6"Klasine"

SEPARACIONE METODE

Destilacija, ekstrakcija, itd.

Kvalitativna analiza:Boja, rastvorljivost, Tm, Tk,

indeks refrakcije, itd.

Kvantitativna analiza: Gravimetrijska i titrametrijska merenja

Instrumentalne

Hromatografija, elektroforeza, itd.

Kvalitativna analiza:tR, VR, oblik pika

Kvantitativna analiza: Merljive fiziko-hemijske osobine

(provodljivost, potencijal, apsorbancija, fluorescencija, itd.)

77

SEPARACIONE METODE

HROMATOGRAFIJA ELEKTROFOREZA

MASENASPEKTROMETRIJA

( m/e)CENTRIFUGA

( (veliini, obliku))

U analitike i preparativne svrhe

88

HROMATOGRAFIJA

Gasnahromatografija

(GC)

ELEKTROFOREZA

Tenahromatografija(LC i HPLC)

Fluidna hromatografija prisuperkritinim uslovima

(SFC)

KapilarnaPlanarna

99

Osobine molekulaosnova za separaciju

POLARNOST

Tena hromatografija Gasna hromatografija

VELIINA (MASA)

Ultrafiltracija Ultracentrifugiranje

Hromatografija iskljuenjem

NAELEKTRISANJE

Elektroforeza Jonoizmenjivaka hromatografija

Masena spektrometrija

OBLIK

Afinitetna hromatografija Imunohemijske metode

Enzimske metode

10

10

Separaciona metoda razdvajanje komponenata smee (naelektrisanih estica istog, ili predznaka) u polju jednosmernog

elektrinog napona

Kretanje koloidnih i drugih naelektrisanih estica kroz neku sredinu (rastvor, gel i sl.) uslovljeno prisustvom i delovanjem homogenog

elektrinog polja

ELEKTROFOREZA

Elektrokinetika pojava

Metoda

11

pokretne granice(slobodna)

Nobelova nagrada za hemiju (Nobelova nagrada za hemiju (elektroforezaelektroforezapokretne granice pokretne granice razdvajanje smerazdvajanje smee serum proteina)e serum proteina)

IstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorija

Arne Tiselius

19021971 Tiselijusova

elija

nekompletna separacija (mnogi proteini imaju isto ukupno naelektrisanje

komplikovana aparatura i skupa

1948.

ProblemiProblemiProblemiProblemi::::ProblemiProblemiProblemiProblemi::::

1937.

elektroforezaelektroforeza

Zbog toga ZONSKA

12

12

RAZDVAJANJE KOMPONENATA SMEENA OSNOVU:

PREDZNAKANAELEKTRISANJA

(KATJONI KA KATODIANJONI KA ANODI)

POKRETLJIVOSTI

ESTICE ISTOG PREDZNAKA

ZAVISI OD: KOLIINE naelektrisanja veliine i oblika estice jaine elektrinog polja T, karakteristika potporne sredine

na osnovu razliitih M proteina(SDSPAGE)

PrincipPrincip

13

13

ELEKTROFOREZAPrema nainu izvoenja

Slobodna(u rastvoru) Zonska(na vrstoj podlozi)

(pokretljivost)pH=const.

Izotahoforeza( elek.

pokretljivost)pHLpHT)

Izoelektrinofokusiranje

( pI)pH const.

papir, gel

u kapilari

kapilara

PodelaPodela

ZonskaZonskaZonskaZonska elektroforezaelektroforezaelektroforezaelektroforeza je slije slije slije slina na na na hromatografijihromatografijihromatografijihromatografiji, , , ,

osim osim osim osim to je migracija uslovljena dejstvom to je migracija uslovljena dejstvom to je migracija uslovljena dejstvom to je migracija uslovljena dejstvom elektrielektrielektrielektrinog polja, nog polja, nog polja, nog polja,

umesto mobilnom fazomumesto mobilnom fazomumesto mobilnom fazomumesto mobilnom fazom

Elektroforetske tehnike:

Pokretne granice

14

14

ZONSKA ELEKTROFOREZAPrema obliku podloge

Planarna Kapilarna

kapilara (L: 40100 cm, R: 2575 m)kvarc koji sadri sinanolne grupe

kompleksnabrzamoe se automatizovatidobra za kvantitivnu analizupotrebne male koliine uzorka (nL)

11 22

PodelaPodela

Podloga: papir, celuloza-acetat, polimerni gel(L: 210 cm)potopljena u pufer

jednostavnasporane moe se automatizovatiloa kvantifikacijapotrebne velike koliine uzorka (L)

15

15

U kome dolazi do razdvajanja komponenata smee tako da komponente u veoj (ili manjoj) meri prelaze u drugu fazu sa kojom je smea dovedena u

dodir

HROMATOGRAFIJA

PROCES

VE STE NAUILIFH

Razdvajanje komponenata smee izmeu DVE FAZE razliite pokretljivosti (stacionarne i mobilne) faze

METOD

Razdvajanje Izolovanje Identifikaciju Odreivanje

u preparativne svrhe

kvalitativnakvantitativna

16

16

adsorpciona

IstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorijaIstorija

Mikhail TswettMikhail TswettMikhail TswettMikhail Tswett

(1872(1872(1872(18721919)1919)1919)1919)

razdvajanje sastojaka zelenog lia (hlorofil, ksantofil) CaCO3 kao adsorbens, petrol-etar/etanol kao mobilna faza odvojeni pigmenti (obojene trake u koloni)

1906. god

.

hromatografijahromatografija

17

17

Rastvor analizirane smee u MOBILNOJ fazi proputa se kroz STACIONARNU fazu

Raspodela komponenata uzorka (rastvorljive u mobilnoj fazi) izmeu faza uzrokovana je fiziko-hemijskim procesima:

ADSORPCIJAPODELA IZMEU DVA RASTVARAA (RASTVORLJIVOST), iliJONSKA IZMENA

PRINCIP

VE STE NAUILIFH

POSLEDICA

Komponente smee se raspodeljuju izmeu faza i pod uticajem mobilne faze kreu se kroz stacionarnu fazu brzinama

Prelazak komponente izmeu faza deava se sve dok odnos cs i cm(NERNSTOV KOEFICIJENT RASPODELE) ne dostigne const. vrednost

K = f (prirode komponenti, osobina faza, T i afiniteta komp. prema fazama)m

s

c

cK =

18

18

Podsetiti se:Teorijski principi i tehnike izvoenja adsorpcione, particione i

jonoizmenjivake hromatografije

1. M. Medenica, D. Maleev, Eksperimentalna fizika hemijawww.pharmacy.bg.ac.rs/predmeti/instrumentalne

metode (5MRF20INM)/udbenik.pdf

M. Aleksi, Hromatografija-teorijski principiwww.pharmacy.bg.ac.yu/predmeti/fizika_hemija/predavanja_2007-

08/Hromatografija skripta. pdf

19

19

Faze (stacionarna i mobilna) u hromatografiji:ne meaju se

VE STE NAUILIFH

MOBILNA FAZA gas tenost

imaju pokretljivosti

STACIONARNA FAZA vrsto telo ( porozno ili granulisano) sloj tenosti adsorbovan na

vrstom telu jonoizmenjiva

20

20

HROMATOGRAFIJAPrema mehanizmu razdvajanja

Adsorpciona adsorpcioni

koeficijentiPodeona(particiona)

koeficijenti rastvorljivosti

Jonoizmenjivaka afinitetu sastojaka prema jonskoj izmeni

PodelaPodela

u koloni U koloniNa hartiji i na tankom sloju

u koloni

21

21

Adsorpciona hromatografija

Razdvajanje zasnovano na razlici u afinitetu adsorpcije sastojaka uzorka prema povrini vrste faze

(razdvajanje na osnovu adsorpcionih koeficijenata)

Podeona hromatografija

Razdvajanje bazirano na razlici u rastvorljivosti sastojaka uzorka Gasna hromatografija razlike u rastvorljivosti sastojaka uzorka u

nepokretnoj (STACIONARNOJ) fazi Tena hromatografija razlika u rastvorljivosti sastojaka uzorka u

pokretnoj (MOBILNOJ) i nepokretnoj (STACIONARNOJ) fazi

Jonoizmenjivaka hromatografija

Razdvajanje bazirano na razlici u afinitetu sastojaka uzorka prema jonskoj izmeni

Ovde je delimiOvde je delimiOvde je delimiOvde je delimino zastupljen i proces adsorpcijeno zastupljen i proces adsorpcijeno zastupljen i proces adsorpcijeno zastupljen i proces adsorpcije

22

22

HROMATOGRAFIJAPrema fizikom stanju mobilne i stacionarne faze

Gasna (mobilna)

Gasno tena Gasno vrsta

Tena (mobilna)

Teno tena Teno vrsta

PodelaPodela

23

HROMATOGRAFIJAPrema obliku hromatografske podloge

Planarna(hromatografija otvorene podloge)

U koloni (kapilara i punjena kolona)

Mobilna: tenost koja se kree pod dejstvom kapilarnih sila, ili zemljine tee

PodelaPodela

Stacionarna:H2O kojom je natopljena traka filter-papira

Kristalna voda inkorporirana u silika-gel

Mobilna: tenost koja se kree pod dejstvom sile zemljine tee i /ili p

Stacionarna:Kapilara: film tenostiili vrsti adsorbens

Punjena kolona: vrstizrnasti materijal

24

24

Prema primenjenoj radnoj tehnici

FRONTALNA ANALIZA

Na stacionarnu fazuse const. dodaje RASTVOR UZORKA i samo komponentakoja se najbre kree dobija se uistom stanju

RETKO SE KORISTI

ISTISKIVANJE

Na stacionarnu fazu se nanosi rastvor uzorka, a onda supstancija koja istiskuje komponente uzorka i tako ubrzavanjihovo kretanje

SAMO KVALITATIVNA

ELUIRANJE

Uzorak se unosi ukolonu, jedan krajpapira, ili tankog sloja vrste stac.faze iISPIRA MOBILNOMFAZOM (ELUENTOM)

KVALITATIVNA IKVANTITATIVNA

PodelaPodelaPodelaPodelaPodelaPodelaPodelaPodela

25

25

ELUIRANJE (ispiranje; RAZVIJANJE!!!)

ELUENT MOBILNA FAZA kojom se vri ispiranje ELUAT RASTVOR koji IZLAZIiz kolone

1) izokratsko: uvek ista mobilna faza2) gradijentno: sastav mobilne faze se menja za vreme eluiranja

(npr. 50% metanol (5 min), 60% metanol (drugih 5 min), 70% metanol (treih 5 min), itd.)

glavna tehnika razdvajanja kod hromatografije u koloni podrazumeva ispiranje prisutnih molekulskih vrsta kroz

kolonu stalnim dodavanjem istog rastvaraa proces moe biti zaustavljen dok su svi sastojci uzorka

jo na podlozi, ili se moe nastaviti dok svi sastojci ne napuste hromatografsku podlogu

26

26

ELUIRANJE

DETEKCIJA

Na kraj kolone postavi se detektor koji reaguje na prisustvo analita: signaldetektora u funkciji vremena daje dijagram sa nizom pikova HROMATOGRAM

DETEKTORureaj koji meri promene u sastavu eluata merenjem nekih fiziko-hemijskih osobina

27

27

HROMATOGRAFIJE U KOLONI

Gasna hromatografija (GC)

Tena hromatografija pod visokimpritiskom (HPLC)

28

28

HROMATOGRAFIJA

OSNOVNI ZAJEDNIKI POJMOVI

29

29

HROMATOGRAF

Ureaj kojim se vri hromatografsko razdvajanje komponenata smee

GC(HP)LC(HP)

HPLC(HP)

30

30

HROMATOGRAM

ZoneZone (razdvojene komponente) (razdvojene komponente) rasporeene rasporeene u stacionarnoj faziu stacionarnoj fazi

(u planarnoj hromatografiji: papir, ili tanki sloj na kome su zone)

Grafiki prikaz odziva detektora(koncentracije analita u eluatu ili neke druge veliine (srazmerne koncentraciji))u funkciji vremena ili zapremine eluata

OD = f(t), tj. c = f(t)OD = f(V), tj. c = f(t)

unutranji

spoljanji

31

31

Tipovi hromatograma

sastojci analize:prelaze udaljenosti

na podlozi za isto vremedetektuju se nasamoj podlozi

planarna hromatografija

UNUTRANJI SPOLJANJI

sastojci analize:prelaze isti put u vremenudetektuju se van podloge

hromatografija u koloni

i kod elektroforeze

11 22

32

32

SPOLJANJI HROMATOGRAM

detektor belei promenukoncentracije komponente(u mobilnoj fazi) u funkciji vremena eluiranja

Diferencijalni Integralni

detektor belei ukupnu koliinu izeluiranihsastojaka u vremenu

c = f(t)c

/

m

m

o

l

c

m

-

3

t

c

/

m

m

o

l

t

Ukupna koliina = f(t)

OD OD

BBAA

22

33

33

Diferencijalni i integralni hromatogram

AA

BB

34

34

HROMATOGRAM

Grafiki prikaz (zapis) hromatografskog razdvajanja

tt

V

Veliina merenog signala (OD) u funkciji vremena zadravanja komponente smee u koloni

ili

Veliina merenog signala (OD) u funkciji zapremine mobilne faze

koja je potrebna da eluira komponentu iz kolone

35

35

KARAKTERISTIKE HROMATOGRAMA(hromatografskog pika)

11 mrtvo vreme

22

33

44

retenciono vreme (nekorigovano i korigovano)

retenciona zapremina (nekorigovana i korigovana)

retencioni faktor

Pik = hromatografska kriva deo diferencijalnog hromatograma koji belei detektor pri eluiranju jednog sastojka iz kolone

36

36

Retencija (zadravanje)Komponente se razdvajaju jer se zadravaju u stacionarnoj fazi razliito vreme

Retenciono vremeNekorigovano rastojanje od starta do pika date kom.

Korigovano rastojanje od pika prazne zapreminedo pika date komponente

Retenciona zapremina

22

33

11Retenciono vreme

mrtvo vreme vreme od momenta unoenja uzorkado pojave pika mobilne faze

37

37

Karakteristike hromatograma

OD

t/min

t0 mrtvo vreme(retencionovreme u mobilnoj fazi)tR ukupno vreme zadravanja,

od trenutka ubacivanja uzorka do max. pika

tR korigovano retencionovreme (retenciono vreme u stacionarnoj fazi)

h visina pika ( rastojanje izmeu osnovne linije i vrha

pika )W irina pikaW0,5 irina pika na h

Vazduni pik (kod GC)Prazna zapremina

t0

Definicije

38

38

RETENCIONO VREME (L/v)

0ttt ,RR +=

REDUKOVANO (KORIGOVANO) RETENCIONO VREME

0R,

R ttt =

t0 (L/u) vreme od momenta unoenja uzorka do pojave pika mobilne faze

22

Matem

atiki iz

razi

39

39

Karakteristike hromatograma

OD

V/mL

Prazna zapremina

V0

VR,

RV

VR zapremina mobilne faze potrebne da se data komponenta eluira iz koloneVR korigovana retenciona zapremina

DefinicijeV0 prazna zapremina(zapremina mobilne faze koja bez zadravanja stie do detektora)

40

40

RETENCIONA ZAPREMINA

utV ,r,R =

REDUKOVANA (KORIGOVANA) RETENCIONA ZAPREMINA

0VVV ,RR +=

u brzina protoka mobilne faze (cm3 s1)

utV RR =

0VVV R

,R =

33

Matem

atiki iz

razi

41

41

RETENCIONI FAKTOR (k')

Mera zadravanja komponente u koloni

00

0

t

t

t

ttk

,RR,

=

=

44

Def.

Matematiki izraz

42

42

Vrste hromatografije u zavisnosti od sistema koji se analizira

Gel hromatografijaBioloki uzorci i jedinjenja velike M

Jonoizmenjivaka i gel hromatografija

Jonske od nejonskih

JonoizmenjivakaHromatografija na tankom sloju i

papiru

Neorganske i jonske supstancije

AdsorpcionaSupstancije slinog hemijskog tipa

PodeonaSupstancije razliitog hemijskog tipa

Gasna Gasovi i isparljive supstancije

Vrsta hromatografijeIspitivani sistem

43

43

HROMATOGRAFSKA ANALIZAVaVaVaVannnno o o o zazazaza hromatografskhromatografskhromatografskhromatografskuuuu analizanalizanalizanalizuuuu::::

vrsta stacionarne faze; sastav i priroda mobilne faze

sastav i priroda analiziranog uzorka

tehnika injektiranja uzorka i injektorski sistem (posebno kod GC)

T, p, brzina protoka mobilne faze

izbor detektora (osetljivost)

hromatogram

44

44

PRIMENA HROMATOGRAFIJE

identifikacija (preko tR, t'R, VR,V 'R, oblika pika)

tR je karakteristina vrednost na T = const., protoku i za datu kolonu

dodatne identifikacijepomou IR, NMR ili MS

Kvalitativna analiza

odreivanje koliine na osnovu h = f(c), P = f(c)(automatski (pomou integratora) ili raunski

kalibracija

Kvantitativna analiza

45

45

1. Ketoprofen2. Naproksen3. Fenoprofen Ca4. Flurbiprofen5. Ibuprofen

t/min

A

Nesteroidni anti-inflamatorni lekovi

Uslovi:Kolona: Kaseisorb LC ODS 2000 4.6mml.D.250mmMobilna faza: CH3CN/H2O/CH3COOHT: 25CBrzina protoka: 1 mL/minDetekcija: UV na 254 nm

HROMATOGRAMHROMATOGRAM

46

46

Poreenje elektroforeze i hromatografije

hromatogramOD = f(vreme provedeno u koloni)

OD = f(zapremina eluata)

elektroforezogram (elektroforegram)OD = f (migraciono vreme)

Zapis razdvajanja

spektrofotometar, fluorimetar, itd.UV/VIS, MS, itd.Detekcija

Retenciono vremeMigraciono vremeKvalitativnaanaliza

Analiziraju se

Separacija

Nain izvoenja

Agens

Primena

metoda

organska jedinjenja (lako (GC) i teko isparljiva (HPLC)

joni, koloidni rastvori, vitamini, lekovi, proteini, organske kiseline

polarnostraspodela izmeu 2 faze (razliiti

koeficijenti raspodele)

naelektrisanje, veliina i oblik

planarna (otvorene podloge) kolona (kapilara i punjena kolona)

planarna (vsta podloga: papir, gel)kapilara

mobilna fazaelektrino poljepreparativne i analitike svrhe

HromatografijaElektroforeza

47

47

SeparacioneSeparacioneSeparacioneSeparacione instrumentalneinstrumentalneinstrumentalneinstrumentalne metode (principi razdvajanja)metode (principi razdvajanja)metode (principi razdvajanja)metode (principi razdvajanja)

ElektroforezaElektroforezaElektroforezaElektroforeza ((((ta je, princip, podela)ta je, princip, podela)ta je, princip, podela)ta je, princip, podela)

HromatografijaHromatografijaHromatografijaHromatografija ((((ta je, princip, podela) ta je, princip, podela) ta je, princip, podela) ta je, princip, podela)

HromatogramHromatogramHromatogramHromatogram (karakteristike, definicije i matemati(karakteristike, definicije i matemati(karakteristike, definicije i matemati(karakteristike, definicije i matematiki izrazi za ki izrazi za ki izrazi za ki izrazi za

karakteristikarakteristikarakteristikarakteristine veline veline veline veliine)ine)ine)ine)

Poreenje Poreenje Poreenje Poreenje elektroforezeelektroforezeelektroforezeelektroforeze i i i i hromatografijehromatografijehromatografijehromatografije

I

Z

V

O

D