30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI CARDIOMIOCITI DERIVATI DA...

30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI

CARATTERIZZAZIONE CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI ELETTROFISIOLOGICA DI

CARDIOMIOCITI CARDIOMIOCITI

DERIVATI DA CELLULE DERIVATI DA CELLULE STAMINALISTAMINALI

““IN GITA A FIRENZE!!!”IN GITA A FIRENZE!!!”

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Università degli Studi di FirenzeUniversità degli Studi di Firenze

Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica

"Mario Aiazzi Mancini"

FACOLTA’ DI MEDICINA

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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI

IL CUBOIL CUBO

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CENTRI OSPITATICENTRI OSPITATICentro Interdipartimentale di Servizi di Spettrometria di Massa (

C.I.S.M.)     

Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e Biofisica Applicata (

C.I.M.M.B.A.)

Centro per i Servizi di Stabulazione degli Animali di Laboratorio (

Ce.S.A.L.)     

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COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A?COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A?

LABORATORIO DI ELETTROFISIOLOGIA

CARDIACA

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Rimodellamento Elettrofisiologico e Molecolare della cellula e tessuto

cardiaco durante lo sviluppo fisiologico e durante alcune patologie cardiache

Studio di farmaci antiaritmici e delle sostanze che modulano la frequenza

cardiaca.

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QUALI MODELLI?QUALI MODELLI? Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di

cuore (umano o animale) patologico;cuore (umano o animale) patologico;

Cardiomiociti in vitro:Cardiomiociti in vitro: -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di

cellule staminali embrionali cellule staminali embrionali -cardiomiociti immortalizzati;-cardiomiociti immortalizzati;

Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e della regolazione dei canali HCN, che mediano della regolazione dei canali HCN, che mediano la corrente If.la corrente If.

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PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO?PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO?

ASSISTITO AD ALCUNI ESPERIMENTI DI

PATCH-CLAMP ESEGUTI CON DIVERSI SET-UP SU CARDIOMICITI DERIVATI DA CELLULE

STAMINALI EMBRIONALI, VOTLI A RACCOGLIERE DATI SU:

1. CORRENTI IONICHE;

2. POTENZIALI DI MEMBRANA;

3. POTENZIALI D’AZIONE;

4. EFFETI DI FARMACI E ALTRE SOSTANZE SU TALI GRANDEZZE.

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L’iter delle cellule:

PRODOTTE IN AUSTRALLIA

DIFFERENZIATE IN SVIZZERA (GINEVRA)

FATTE INVECCHIARE E CARATTERIZZATE A FIRENZE

10.000 EURO

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INVECCHIAMENTO

EARLY 15-40:

Più facile da mantenere.

LATE 50-110:

Più difficili da conservare.

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EARLY:1. ICal;2. IKr;3. If sparisce;

LATE:1. Ito2. IK1;

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PATCH -CLAMPPATCH -CLAMP

PRIMO PASSO: INVECCHIAMENTO

SECONDO PASSO: DIVISIONE (ENZIMA, VINCERE ELASTICITA’)

TERZO PASSO:PIASTRINE (SOSPESO ENZIMA, VETRO)

QUARTO PASSO: SOLUZIONI

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INTRA (ELETTRODO):

1. FISIOLOGICA;

2. IONI DI SELZIONE;

3. EGTA.

•PH=7.2;

•PRESSIONE OSMOTICA PARI ESTERNA;

•UNICA.

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EXTRA (PIASTRINA): TYRODE

1. NaCl 140 mM;2. KCl 5,4 Mm;3. MgCl2 1,2 mM;4. Glucosio;5. HEPES (Acido);

pH=7.3

Inseguito CaCl2 2mM;

DIFFERENZIATE

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Set-up: insieme di tutti gli elementi che permettono di fare la misura

1. microscopio;2. amplificatore Axon;3. multi canale;4. braccio e elettrodi;5. provette con dentro le

soluzioni extra-cellulari;6. perfusore per fare

entrare le soluzioni nei vetrini;

7. Aspiratore (occhio posizionamento);

8. Aspiratore per suzione9. Rilevatore temperatura.

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SEALSEAL

1. Elettrodo lontano Seal=200 MΏ;2. Elettrodo appoggiato Seal=3 MΏ;3. Suzione Seal=50 MΏ;4. Rottura Seal=80 MΏ;5. Perfusione e ulteriore suzione=100 MΏ.

Il GΏ E’ UN SOGNO!!!!!!!

•PROBLEMI DI PERFUSIONE (TROPPO, POCO…)

•TENUTA DELL’HOLDER.

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PROTOCOLLO

I=V/Rseal Rseal sale I scende

PULSE 2 mV

PERFUSIONE: AIUTA LA FORMAZIONE DEL SEAL

DIFFICOLTA’: CELLULE PICCOLE E PIATTEINCUBAZIONE;

ROTTURA OVERLOAD

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POSSO ANCHE CALCOLAREPOSSO ANCHE CALCOLARE

Capacità di membrana (automatico);Capacità di membrana (automatico); Reisitenza di membrana;Reisitenza di membrana; Time costantTime costant Resistenza foro (apertura protocollo)Resistenza foro (apertura protocollo) capacità foro;capacità foro;

Se c’è del leakage si elimina inserendo una Se c’è del leakage si elimina inserendo una resistenza in serie al seal (set-up nuovo).resistenza in serie al seal (set-up nuovo).

30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI

STUDIO DELLE CORRENTI E DEI STUDIO DELLE CORRENTI E DEI POTENZIALIPOTENZIALI

1. Perfondere con la soluzione extra adatta;

2. Applicare un protocollo;

3. Registrare;

4. Fare esperimenti con protocolli e soluzioni extra diverse (perfusione, aspirazione);

5. Ricominciare;

30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI

IfIf

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30 aprile 2009 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI EMANUELE SALIMBENI

ESPERIMENTOESPERIMENTO

ISOPRENALINA: ANTAGONISTA DEI RECETTORI BETA-ADRENERGICI (AUMENTA If) PER VEDERE COME VIENE MODULATA If NEL CORSO DELLA MATURAZIONE DELLE

CELLULE (CAMBIAMENTO CANALE)

REVERSIBILITA’ LAVAGGIO

ACETILCOLINA/CARBACOLO (ANALOGO STABILE):

CORRENTE DI POTASSIO, POICHE’ VENGONO ATTIVATI I RECETTORI MUSCARINICI CHE

AUMENTANO LA Gk

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INaCaINaCa

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REGISTRAZIONIREGISTRAZIONI

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THANKS TO THANKS TO ALL THE ALL THE CC33MIGersMIGers