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ANALISI CAMPIONI CRIOPRESERVATI PRELEVATI DALL’AZIENDA OSPEDALIERA “SPEDALI CIVILI DI BRESCIA” NELL’AMBITO DELL’INDAGINE
RIGUARDANTE LA “STAMINA FOUNDATION”
Laboratorio di Biologia Cellulare e Terapie Oncologiche Avanzate Dipar:mento di Scienze Mediche e Chirurgiche Materno Infan:li e dell’Adulto Università di Modena e Reggio Emilia Azienda Ospedaliera Universitaria di Modena Prof. Massimo Dominici massimo.dominici@unimore.it Azienda Ospedaliera – Universitaria di Modena
Roma, Senato della Repubblica, Commissione Sanità, 30 Luglio 2014
Le Potenzialità delle Staminali
Lung injury
Bone injury
Graaf T, Blood 2003; Dominici M JBR 2001, PNAS 2004, Blood 2008, Blood 2009, TransplantaLon 2008
Come Agiscono le Staminali?
• Staminali maMone à Differenziamento
• Staminali di supporto à Rilascio di Molecole
• Entrambe
Horwitz EM & Dominici M Cytotherapy 2008
DANNO !
Midollo Osseo
Midollo
OSSO ESC
MSC
Lichtman MA. Exp Hematol 1981
IL MIDOLLO OSSEO Cellule Staminali EmatopoieLche: ESC Cellule Staminali Mesenchimali: MSC CELLULE IMMUNITA’+ SANGUE
R2
0,01%
ANALISI CITOMETRICHE SUBITO DOPO ESTRAZIONE
Le Staminali MSC sono Rare
ESC
MSC
Il CD73, CD105, CD90 Sono marcatori di Staminali MSC
CELLULE IMMUNITA’ + SANGUE
Immagine Microscopica (100X)
Ecco Cosa Accade in Vitro
Dominici M et al. JBR 2001 & Transplantation 2008
ANALISI CITOMETRICHE DOPO AMPLIFICAZIONE
Un’Appropriata Amplificazione in Vitro “Purifica” le Staminali Riducendo ed Eliminando
Le Cellule dell’Immunità
CD73, CD105, CD90: Sono marcatori di MSC
ESC
MSC
CELLULE IMMUNITA’ + SANGUE
L’Esperienza Americana-‐USA 2007-‐2011 (su ~115 casi sperimentali per la medicina rigeneraLva )
Bailey AM Sci Transl Med 2012
TIPO DI CELLULE FONTE TESSUTO
MSC
Infusioni singole o mulLple di 1-‐5 milioni di cellule/kg se e.v.
Donatori ed Indicazioni Cliniche Nella Medicina Rigenera:va
Ratcliffe E et al Br Medical Bullein 2013
Paziente
Isolamento ex-‐vivo
Espansione Purificazione CaraMerizzazione IdenLficazione Congelamento
Trapianto Autologo ed Allogenico di MSC
Trapianto
Cellule dell’immunità
Staminali MSC
Autologo
Donatore Sano
Isolamento ex-‐vivo
Espansione Purificazione CaraMerizzazione IdenLficazione Congelamento
Trapianto
Paziente
Allogenico
1. Non servono 2. Sono dannose perchè provocano reazioni avverse legate alla
capacità delle cellule del donatore di aggredire i tessu: del ricevente
3. Possono innescare una risposta del ricevente verso le cellule immunitarie trapiantate con una reazione „allergica“ anche mortale oltre che invalidare il trapianto
4. QuesL aspei non sono significaLvi per il trapianto Autologo
Perchè è Necessario Eliminare L’Immunità nel Trapianto Allogenico di MSC?
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Aspirato Midollare Isolamento Amplificazione In
Laboratorio
Analisi Laboratorio
Congelamento N2 Scongelamento TraMamento Con
Acido ReLnoico
Infusioni mulLple di
200.000 cellule
IN VENA Nel Midollo Spinale -‐ Rachide
Quello che è stato compreso del “Protocollo STAMINA”
VALUTAZIONI INIZIALI CAMPIONI “STAMINA”
• I campioni sono staL consegnaL il giorno 01/08/2012 presso il ns. Laboratorio da Ufficiali autorizzaL dei NAS.
• La valutazione ispeiva al momento della consegna dimostrava la presenza di due campioni in apparente buono stato di criopreservazione.
• In sostanza poco/non leggibili i caraMeri siglaL sulle fiale da congelamento
ANALISI IMMUNOFENOTIPICA E MORFOLOGICA DEI CAMPIONI POST-‐SCONGELAMENTO
• I campioni venivano quindi analizzaL immediatamente dopo scongelamento mediante parametri definiL da Dominici et al. (Cytotherapy 2006)
• Le cellule venivano quindi poste in coltura al fine di: à monitorarne il comportamento in vitro à amplificarle per i test necessari a definirne le caraMerisLche
biologiche e la staminalità (immunologia e differenziamento) à valutarne le capacità di divenire cellule della linea
neuroectodermica (definito qui “neuronale” in senso lato)
BM-‐MSC
Criteri Dominici & ISCT per Minima Definizione di Staminalità in Cellule Stromali/Staminali Mesenchimali: il Normale Aspe[o in Coltura
Criteri Dominici & ISCT per Minima Definizione di Staminalità in Cellule Stromali/Staminali Mesenchimali: IL FENOTIPO IMMUNOLOGICO ATTESO
Cellule dell’immunità
Staminali MSC
Criteri Dominici & ISCT per Minima Definizione di Staminalità in Cellule Stromali/Staminali Mesenchimali: LA CAPACITA‘ DI DIFFERENZIARE
GRASSO Osso Car:lagine
INDO
TTI
NON IN
DOTTI
Staminali
Adulte
In Vitro
Oil R
ed A
lizarin Red
Alcian B
lue
Feno:po Immunologico
Appropriato senza Contaminan:
Capacità di
Differenziamento
GRASSO
Criteri Dominici & ISCT per Minima Definizione di Staminalità: SINTESI
Osso
Car:lagine
I Criteri Applica: alle cellule “Stamina” • L’analisi immunofenoLpica mostrava una contaminazione fino al 18.8% di
cellule CD45+ (in accordo con quanto visto nell’analisi citofluorimetrica effeMuata dall’IsLtuto Superiore di Sanità) di esse il 61.7% sono CD14+/HLADR+
à contaminazione di cellule in grado di generare reazioni mortali
• Il CD105 appariva inferiore al 15,8%. à Mancanza di marker di staminalità
LIMITI RICONOSCIUTI:
Anomalie in Coltura: Contaminan: Immunitari
Campione cresciuto con “protocollo stamina” o[enuto “breve[o” (con siero bovino)
Campione cresciuto con terreno standard privo di siero bovino
I Protocolli di Infusione Stamina: il Punto di Vista Immunologico
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Autologo Allogenico
Da Donatore a Paziente
Allogenico da Paziente a Paziente
à Contaminazione di cellule immunità in grado di generare reazioni avverse à Mancanza di marcatori di staminalità
UN BIZZARRO ESEMPIO AGLI ATTI: Paziente XY “I TRAPIANTI ETEROLOGHI MULTIPLI”
Autologo 1° infusione
Allogenico Da Donatore Sano a
Paziente XY 2° Infusione !!
Allogenico da Paziente ZZ a Paziente XY
3° Infusione !!!!
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à Contaminazione di cellule immunità in grado di generare reazioni avverse à Mancanza di marcatori di staminalità
LE “CELLULE STAMINA” DA NOI ANALIZZATE MOSTRANO ELEVATI LIVELLI DI CELLULE DELL’IMMUNITA’ IN GRADO DI GENERARE
PERICOLOSE REAZIONI AVVERSE
Anomalie del Differenziamento O
il Red
Alizarin R
ed A
lcian Blue
GRASSO
Osso
Car:lagine INDO
TTO
NON IN
DOTTO
GRASSO CELLULE STAMINA COME DOVREBBE ESSERE
Anomalie del Differenziamento O
il Red
Alizarin R
ed A
lcian Blue
GRASSO
Osso
Car:lagine INDO
TTO
NON IN
DOTTO
OSSO CELLULE STAMINA COME DOVREBBE ESSERE
Oil R
ed A
lizarin Red
Alcian B
lue GRASSO
Osso
Car:lagine INDO
TTO
NON IN
DOTTO
CARTILAGINE CELLULE STAMINA COME DOVREBBE ESSERE
Anomalie del Differenziamento
LE CELLULE STAMINA NON RISPETTANO LE MINIME DEFINIZIONI DI NORMALITA’ PER CELLULE STAMINALI ADULTE
QUALI LE CELLULE STROMALI/STAMINALI MESENCHIMALI: NON SONO STAMINALI
TENTATIVO DI DIFFERENZIAMENTO “NEURONALE”
• Al fine di monitorare le capacità differenziaLve delle cellule in oggeMo in senso “neuronale”, dopo 2 passaggi in coltura le cellule sono state indoMe secondo il protocollo descriMo nel BreveMo US 0149099 del 2012 in capo ai Sig. Vannoni e Molino.
• Secondo il protocollo descriMo nel BreveMo US 0149099 del 2012, 6 ul/ml di una soluzione madre di Acido ReLnoico in etanolo 98% (1mg/ml corrispondente a 3x10-‐3 M) sono staL aggiunL al mezzo di coltura (SIERO) per 2 ore
• Al termine delle 2 ore di differenziamento sono state effeMuate analisi morfologiche
Acido re:noico INDOTTO NON INDOTTO 2H
ARTEFATTI nel Differenziamento “NEURONALE”
NON INDOTTO 2 H Acido re:noico INDOTTO
• Dopo 2 ore di induzione non si sono osserva: cambiamen: significa:vi nella stru[ura cellulare.
• Abbiamo osservato struMure simil-‐dendriLche ed assonali sia nei campioni indoi che nei controlli che apparentemente non appaiono indicaLve di un divenuto differenziamento. Medesimi risultaL sono staL oMenuL alle 24 ore.
• TuMavia, anche la presenza di un’alterazione morfologica simil-‐neuronale non pare indicaLva di una reale potenzialità rigeneraLva Lssutale come documentato nei seguenL lavori pubblicaL:
• ReevaluaLon of in vitro differenLaLon protocols for bone marrow stromal cells: disrupLon of acLn cytoskeleton induces
rapid morphological changes and mimics neuronal phenotype. Neuhuber B, Gallo G, Howard L, Kostura L, Mackay A, Fischer I. J Neurosci Res. 2004 Jul 15; 77(2):192-‐204
• InducLon of bone marrow stromal cells to neurons: differenLaLon, transdifferenLaLon, or arLfact? Lu P, Blesch A, Tuszynski MH. J Neurosci Res. 2004 Jul 15; 77(2):174-‐91.
• Chemically-‐Induced RAT Mesenchymal Stem Cells Adopt Molecular ProperLes of Neuronal-‐Like Cells but Do Not Have Basic Neuronal FuncLonal ProperLes. Gabriela F. Barnabé, Telma T. Schwindt, Maria E. CalcagnoZo, Fabiana L. MoZa, Gilberto Mar[nez, Jr., Allan C. de Oliveira, Leda M. N. Keim, Vânia D'Almeida, Rosália Mendez-‐Otero, Luiz E. Mello. PLoS ONE. 2009; 4(4): e5222
ARTEFATTI nel Differenziamento “NEURONALE”
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