Anne Murati Laboratoire de Biopathologie Hématologie ... · Institut Paoli-Calmettes, Marseille...

Place des nouveaux marqueurs moléculaires dans le

diagnostic et le pronostic des Syndromes Myéloprolifératifs

BCR-ABL négatifs.

Anne MuratiLaboratoire de Biopathologie

Hématologie cellulaireInstitut Paoli-Calmettes, Marseille

Modérateur: Chantal Garabedian

ACNBH

ODPC N°1495

DECLARATION D’INTERETDANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION 

REALISEES POUR L’ACNBH

43ème Colloque National des Biologistes des HôpitauxMarseille, 5‐7 novembre 2014

Dr.Murati Anne exerçant à l’Institut Paoli‐Calmettes déclare sur l’honneur 

ne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprises pharmaceutiques, du diagnostic ou d’édition de logiciels susceptible de modifier mon jugement ou mes propos, concernant le DMDIV et/ou le sujet présenté.

Heuck G, 1879; Vaquez H, 1892; Epstein E, 1879. Dameshek W, 1951

1879

1892

1934

1951 Syndromesmyéloprolifératifs

Hyperglobulie

Blood

Myélofibrose

Thrombocytosehémorragique

• Les SMP sont des maladies clonales de la CSH• Hyperplasie myéloïde de la moelle osseuse • Prédominant sur 1 lignée : base de la classification • Hypersensibilité des progéniteurs aux cytokines• Peu d’anomalies de maturation• Augmentation des cellules sanguines

Physiopathologie des syndromes myéloprolifératifs

Caractéristiques communes

? Expansion clonale

Anomalie moléculaire de la CSH conférant avantage de prolifération et de survie

Classification des syndromes myéloprolifératifs (OMS 2001)

D’après Tefferi, 2003

Syndromes myéloprolifératifs chroniques

LMC SMP non LMC SMP atypiques

Polyglobulie de Vaquez

MyélofibroseThrombocytémie essentielle

Bcr-abl

MFP MF post TE MF post PV

PDGFRFGFR1

LeucémieMyéloïde

Chronique (LMC)

ThrombocytémieEssentielle

(TE)

Polyglobuliede Vaquez (PV)

Myélofibrose idiopathique(MFI) Autres SMP

Élévation de l’Hb/HtEPO basse

Thrombocytose (>450 G/L)

SMP OMS 2001

PDGFRFGFR1

Bcr-abl

PV

MFI

TE

PV,TE et MFICritères diagnostiques OMS

Révision classification en 2008 Tefferi,Vardiman, Leukemia

Boom moléculaire

Révision des critères OMS proposée en 2014

A. Tefferi, J. Thiele, AM. Vannucchi et T. Barbui,Leukemia Janvier 2014

Découverte mutationJAK2V617F2005

Marqueurs de clonalité en 2014Le caryotype

- Anomalies dans 33% des MFI, 11% des PV et 7% des TE

20q-, +8, +1q, -5/5q-, -7/7q-, 12p-, i(17q), inv3,réarrangements 11q23

- Anomalies non spécifiques des SMP (dans les SMD)

13q-, +9- Anomalies relativement plus spécifiques des SMP

- Bon pronostic : 20q-, 13q-, +9, +1 isolées- Mauvais pronostic : +8, -7/7q-, i17q, -5/5q-, 12p-,réarrangements 11q23 et caryo complexe

Hussein et al., EJH 2009, Gangat et al., EJH 2008, 2009

Marqueurs de clonalité en 2014Les mutations

1/Mutations spécifiques des SMP

2/Mutations non spécifiques des SMP, retrouvées dans les autres hémopathies myéloïdes

Impact diagnostique et pronostique

Mutations spécifiques des SMP

1/Mutations de JAK2 exon 14 (JAKV617F) et exon 12

2/MPLW515

3/ Mutations de la Calréticuline (CALR)

James C, 2005

MUTATIONS JAK2 Exon 14 et exon 12

TE MF

PV

50%

JAK2V617F

95%

60%

Scott, 2007

PV1‐5%

37 mutations différentes JAK2 Exon 12

PV~100%

Mutées JAK2 exon 14 et exon 12

– 0% PV– 30 à 40% des TE– environ 50% des MF

Mutations MPLW515 dans les SMP non mutés pour JAK2 (exons 12 et 14)

Pikman, Plos Med 2006Pardanani, Blood 2006Beer, et al   Blood, 2008

Mise en évidence de mutations de MPL (Récepteur TPO)

TE MF

PV

10%

0%

5%

Pikman, 2006

N Engl J Med. 19 déc 2013;369(25):2391N Engl J Med. 19 déc 2013;369(25):2379

Séquençage exome sur 6 MFI Séquençage exome sur 151 SMP

Mutations de la calréticuline (CALR) dans les SMP

Décembre 2013

7 à 10 % des patients sont JAK2, MPL, CALRnon mutés : triple négatifs

Mutations de CALR dans les TE et MFAbsence dans les PV

Klampfl et al., NEJM 2013

35%25%

Thrombocytémie essentielle Myélofibrose primitivePolyglobulie primitive

MPLmutation MPLmutation

Non mutés JAK2, MPL et CALR

Non mutés JAK2, MPL et CALR

Non mutés JAK2, MPL et CALR

Troisième grandes mutations dans les SMP

Les mutations de CALR sont (quasi) exclusives TE et MF:SMP à prédominance Mégacaryocytaire

Klampfl et al., NEJM 2013

12,5%

25% 35%

Hommes jeunes,Taux plaquettes plus élevéCompte de leucocytes plus bas

- Absence dans les tumeurs solidesNangalia et al, NEJM, 2013, Hou et al, Leukemia 2014, Broseus et al, Leukemia, 2014

La Calréticuline

Calréticuline protéine chaperone localisée - dans la lumière du réticulum endoplasmique essentiellement- noyau, membranes cellulaires et la matrice extracellulaire

Codée par le gène de la calréticuline- localisé sur le Chr 19p13.2 et contient 9 exons - Souris KO CALR létale

Fonctions de la Calréticuline :- Liaison au Ca2+ : réservoir - Maintien du repliement des protéines

N‐domaine P‐domaine C‐domaine (charge négative)KDEL

Domaine KDEL des protéines permet leur passage du golgi au RE (sitede liaison du Ca2+)

décalage du cadre de lecture (frameshifts)

Klampfl et al., NEJM 2013

Mutations hétérozygotes exon 9 de CALR : insertions ou délétions

Nouvelle séquence peptidiquecommune (Chargée positivement)

Domaines fonctionnels de la protéine CALR

près de 55 types

Lignée cellulaire de souris Ba/F3 exprimant les mutants CALR : Hyperphosphorylation de STAT5

Klampfl et al., NEJM 2013

Activation de la voie JAK/STAT

Fréquence des différents types de mutations de la calréticuline (près de 55 types)

Type 1 : 52-bp délétion (p.L367fs*46)

Type 2 : 5-bp TTGTC insertion (p.K385fs*47)

80% des mutations

CALR

Cabagnols X. et al., Leukemia 2014

Etude franco-belge sous l’égide du FIM

Type 2

Autres types

Type 1

CALR TE CALR MF

Comment recherche-t-on les mutations de CALR ?

Nangalia et al., NEJM 2013, Klampfl et al., NEJM 2013

Analyse de fragment

Exemple (insTTGTC= Type 2)

Technique HRM (High Resolution Melting Analysis)

Séquençage Sanger classique

del52= Type 1 insTTGTC= Type 2

Vannucchi et al., Leukemia, 2014

Anticorps spécifique des mutants CALR

Impact diagnostique de ces mutations:

Classification OMS des SMPEn 2014

Polyglobulie de Vaquez

OMS 2014

Majeurs (M)1 Hb > 16,5 g/dL (H) et > 16 g/dL (F) ou

Ht>49% (H) >48% (F)2 Prolifération des 3 lignées myéloïdes (BOM)

et dystrophie mégacaryocytaire3 Présence mutation JAK2V617F ou exon 12Mineurs (m)1 EPO sérique subnormale

PV = 3M ou 2M + 1m Distinguer « PV

masquée » de la TE

mutée JAK2

Barbui, AJH 2014

OMS 2008 Hb >18,5 g/dL (H) et >16,5 g/dL (F)

Ou Masse sanguine>125%

OMS 2008 Pousse spontanée des

progéniteurs érythroïdes

A. Tefferi, J. Thiele, AM. Vannucchi et T. Barbui, Leukemia 2014

Majeurs (M)1 Plaquettes > 450 x 109/L2 Hyperplasie mégacaryocytaire (mature) avec

augmentation de leur taille3 Aucun des critères de l’OMS pour PV, MF,

LMC, SMD ou autre néoplasie myéloïde4 Présence mutation JAK2, CALR, MPLMineurs (m)

1 Autre marqueur de clonalité ou absence d’évidence pour thrombocytose réactionnelle

Thrombocytémie essentielle

4M ou 3M + 1mOMS 2014

A. Tefferi, J. Thiele, AM. Vannucchi et T. Barbui, Leukemia 2014

Myélofibrose primitive

Critères majeurs(M)

1 Prolifération mégacaryocytaire + atypies + fibrose (réticuline/collagène) ou critères pré-fibrotique

2 Absence de critères LMC, PV, TE, MDS, autres

3 Présence mutation JAK2, CALR, MPLCritères mineurs (m)1 Autre marqueur de clonalité, ou pas d’évidence

pour fibrose réactionnelle2 Erythromyélémie (EB+myélémie+dacryocytes) ou

LDH élevées3 Anémie ou Splénomégalie palpable

3M ou 2M+3mOMS 2014

A. Tefferi, J. Thiele, AM. Vannucchi et T. Barbui, Leukemia 2014

RECEPTEURS CYTOKINES

Extracellulaire

Intracellulaire

Noyau

STAT 5 orSTAT3

P

PP

P

Régulation expression des gènes

Gab2

Akt

p85

p110PI3K

GRB2

SHP‐2

MAPKinases

ShcGRB2

SOS

Ras

P

STAT 5STAT 5

P

NF1

LNK

CBL

EPO RMPL

KIT

REGULATEURS NEGATIFS

SURVIE, PROLIFERATION,DIFFERENCIATION des progéniteurs myéloïdes

Mutations

Signalisation: prolifération cellulaire

CALR

Mutations non spécifiques des SMP

●Décrites dans les SMD et LAM

● et les SMP: implication dans la progression de la maladie;

impact pronostique

EpigénétiqueMéthylation des histones

Méthylation de l’ADN

Chromatine compacteRépression transcription ASXL1 : répression transcription locus HoxA

PRC2

Abdel-wahab et al., Leukemia 2012

XAltération méthylation de l’ADNAltération méthylation de l’ADN

2-Hydroxyglutarate

Mutation

Epissage de l’ARN messager

Mutations des membres du spliceosomePapaemmanuil et al., NEJM 2011, Yoshida et al., Nature 2011, Visconte et al., Leukemia 2012, Lasho et al., Leukemia 2012

Adapté de Abdel-wahab and Levine, Cancer cell 2011

Mutation SMPSF3B1SRSF2

PV MF

Mutations ASXL1, TET2, EZH2…

Complexité génétique des SMP non LMCn=30 n=53 n=66

ASXL126%

TET214%

EZH28%

DNMT3A5%

SRSF26%

SF3B1

NF1

LNK5%

PTPN113%CBL

2%NRAS2%

MPL2%

TP533%

Non muté12%

JAK270%

27%

6%

5%

TE n=53

Brecqueville et al, GCC 2012

PV MF

Complexité génétique des SMP non LMCn=30 n=53 n=66

ASXL126%

TET214%

EZH28%

DNMT3A5%

SRSF26%

SF3B1

NF1

LNK5%

PTPN113%CBL

2%NRAS2%

MPL2%

TP533%

Non muté12%

JAK270%

27%

6%

5%

0

10

20

30

40

50

60Répartition des

mutationsau sein des MF

TE n=53

Brecqueville et al, GCC 2012

Valeur pronostique des mutations

Thrombocytémie essentielle

- Pas d’impact des mutations de CALR et JAK2 sur lasurvie et le risque de progression en MF

- Patients mutés CALR et patients triple négatif ont unfaible risque de thrombose / à ceux mutés JAK2 et MPL

Klampfl et al., NEJM 2013, Rotunno et al, Blood 2014, Gangat et al., Blood 2014

- Fort taux d’allèle JAK2V617F: risque de thrombose

MARQUEURSMOLECULAIRES

PRONOSTIC REFERENCES

JAK2Faibles taux

d’allèles mutés

Mauvais pronostic (survie)Tefferi et al, leukemia 2008Guglielmelli et al, Blood 2009

CALR Bon pronosticSurvie et risque de thrombose

Klampfl et al., NEJM 2013Tefferi, Leukemia 2014

Myélofibroses

n= 305n= 570

Valeur pronostique des mutations

MARQUEURSMOLECULAIRES

PRONOSTIC REFERENCES

JAK2Faibles taux

d’allèles mutés

Mauvais pronostic (survie)Tefferi et al, leukemia 2008Guglielmelli et al, Blood 2009

CALR Bon pronosticSurvie et risque de thrombose

Klampfl et al., NEJM 2013Tefferi, Leukemia 2014

ASXL1 Mauvais pronostic (survie et LAM) Brecqueville et al, GCC 2012Vannucchi et al, Leukemia 2013

SRSF2 Mauvais pronostic (survie et LAM) Lasho et al, Blood 2012Vannucchi et al, Leukemia 2013

EZH2 Mauvais pronostic (survie) Guglielmelli et al, Blood 2010Vannucchi et al, Leukemia 2013

IDH Mauvais pronostic (survie et LAM) Tefferi et al, leukemia 2011Vannucchi et al, Leukemia 2013

TP53 Mauvais pronostic (survie et LAM) Lundberg et al, Blood 2014

TET2 Mauvais pronostic (survie et LAM) Lundberg et al, Blood 2014

Myélofibroses

n=187

n=301

n= 305n= 570

Valeur pronostique des mutations

n= 879

Tefferi, triple neg Leukemia 2014

- Survie plus courte des triple négatifs et JAK2 mutés comparéaux CALR mutés- Entre CALR et MPL mutés peu significatif

MFI: survie globale en fonction statut mutationnel CALR, JAK2 et MPL

n= 253 MFI

CALR muté

MPL mutéJAK2mutéTriple négatif

MFI: survie sans progression en fonctionstatut mutationnel CALR, JAK2 et MPL

n= 253 MFI

Patients triple négatifs ont plus de risque d’évoluer enleucémie aiguë

Tefferi, triple neg Leukemia 2014

Triple négatif

MPL muté

CALR mutéJAK2muté

Survie globale stratifiée en fonction du statut mutationnel de CALR et ASXL1, EZH2, SRSF2 et IDH1/2

(mutations défavorables dans les SMP)

CALR-/ASXL1+ mauvais pronostic

n= 253 MFI

Tefferi, triple neg Leukemia 2014

CALR+/ASXL1-

CALR-ASXL1+ CALR-/ASXL1-

CALR+/ASXL1+

Chao, M. et al., Blood 2014

maladie aux deux visages

ConclusionThrombocytémie essentielle

- Patients « Triple négatif » et « CALR-/ASXL1+ »

- Patients mutés ASXL1, SRSF2, IDH1/2, EZH2et caryo défavorable

A valider sur de grandes séries de patients

Maladies à haut risque moléculaire:

Conclusion Myélofibroses

Tefferi, triple neg Leukemia 2014

Suspicion PV, TE ou MF

Suspicion TE Suspicion MF

JAK2V617F

+

Confirmation SMP

-

Suspicion PV

+

Confirmation PV

JAK2 exon 12

Nouveau score pronostique?Orientation thérapeutique?

ASXL1, SRSF2, EZH2, IDH1/2 Autres gènes?

MF

-

Mutations MPLW515+

TET2, DNMT3A, CBL, LNK, SF3B1, PTPN11

Discussion nouveauxmarqueurs moléculaires

ASXL1, SRSF2, EZH2, IDH1/2

Morpho?

+

ConfirmationTE/MF

Mutations CALR

Morpho

-Thrombocytose

et fibrose réactionnelles

éliminées

-

Discussion nouveauxmarqueurs moléculaires

LNK, TET2, ASXL1,…R-EPO,VHL, PHD2, HIF2a

Polyglobulie secondaire

éliminée

Morpho

En pratique…

o NFS : − HB: 20g/dL et Hte 59%− GB: 14 G/L avec PNn : 80%− PLT : 380 G/L− Absence de myélémie et de dacryocytes

Suspicion de Polyglobulie de Vaquez

Bilan d’une polyglobulie

o EPO : 6UI/L (5,7-19,4)o JAK2V617F : négatif

JAK2V617F-

Recherche Mutations exon 12 JAK2

Absence de mutations exon 12 JAK2 chez ce patient

Volémie sanguine ?Mesure isotopique des GR : > 125 %

Ou > 37ml/Kg1

Mutations récepteurs EPOMutations VHL, PHD2, HIF2a5

Si ATCD familiaux

2-3% des PV

BOM/myélo et caryotype

Culture de progéniteurs sur moelle

p50 normale

3

4

5% des PV

Bilan polyglobulies secondaires (avec ou sans hypoxie): EFR-Gaz du sang, echo abdo, scanner, bilan cardiaque …

Bilan négatif

Gaz du sang déficit 2,3biphosphoglycerate, )(Hb hyperaffine,

déficit 2,3biphosphoglycerate, MetHb)2 p50

Polyglobulie Congénitale

Le myélogramme dans les PV

X10

Myélogramme

Cluster « large »

SMP de type PV

X10

MyélogrammePolylobulation du noyau

MGC de grand taille

SMP de type PV

774 Dystrophie des mégacaryocytes Dystrophie des mégacaryocytes typique de

Polyglobulie de Vaquez

X10

GB 9.6 G/l (80% PNN, absence de myélémie)Hb 15g/dl Ht 46%Plaquettes 811 G/l

Bilan d’une thrombocytose

TE triple négatives ~20% des cas

Pas de syndrome inflammatoirePas de syndrome inflammatoireBilan martial normal1

BOM/myélo et caryotype Eliminer LMC débutante, 5q-3

Dystrophie mégacaryocytaire typique de TE

JAK2V617Frecherche des mutations CALR MPL21 2 3

SMP de type TE

Myélogramme

X10

Myélogramme

SMP de type TE X10

Myélogramme

SMP de type TE X10

Laboratoire d’Oncologie Moléculaire UMR1068Dr. Daniel BirnbaumDr. Max Chaffanet

Dr. Marie-Joelle MozziconacciDr. Véronique Gelsi-Boyer

Nadine CarbucciaNathalie Cervera

José Adelaïde

Laboratoire de Biopathologie, Hématologie cellulaire

Pr. Luc Xerri

Département Clinique,Pr. Norbert Vey

Dr. Jérome ReyDr. Christine ArnouletDr. Marie-Joelle Mozziconacci

Dr. Véronique Gelsi-BoyerDr. Sophie Laibe

Dr. Anne Catherine Lhoumeau

Remerciements