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Approfondissement des
connaissances en biologie
moléculaire
nicolas.glaichenhaus@unice.fr
Master IADE – Année 2013-2014
Plan du cours
• Rappels de biologie moléculaire et de biologie
cellulaire
– Les molécules du vivant
– Le support de l’information génétique et son
décodage
– L’organisation de la cellule animale
• Les outils et les approches expérimentales
utilisées par les chercheurs
• Les mécanismes qui permettent aux cellules
de communiquer entre elles
Les outils et approches
expérimentales utilisées par les
chercheurs
Master IADE – Année 2013-2014
Les outils et les approches
expérimentales
• Les méthodes de purification et d’analyse des
molécules présentes dans les cellules
• Les cultures bactériennes
• Clonage et manipulation de l’ADN dans des bactéries
• Les cultures de cellules eucaryotes
• Les techniques de biologie cellulaire
• Souris transgéniques et souris porteuses de
mutations génétiques ciblées
Les méthodes de purification et d’analyse des
molécules présentes dans les cellules (1)
• Lyse de cellules en absence ou en présence de
détergents
• Selon les cas :
– Purification des organelles, des membranes et du cytosol
par centrifugation
– Fractionnement par chromatographie d’exclusion,
chromatographie sur couche mince ou chromatographie en
phase gazeuse
– Purification des acides nucléiques par extraction
phénol/chloroforme et précipitation en présence d’éthanol
• Séparation et visualisation des protéines par
électrophorèse à travers un gel de polyacrylamide
• Séparation et visualisation de fragments d’ADN par
électrophorèse à travers un gel d’agarose
• Détermination de la séquence nucléotidique d’un
gène
• Détermination de la séquence d’acides aminés d’une
protéine
Les méthodes de purification et d’analyse des
molécules présentes dans les cellules (2)
Centrifugation
Chromatographie d’exclusion
Séparation de protéines par
électrophorèse
Séparation de fragments d’ADN
par électrophorèse
Les cultures de bactéries
• Boites de Pétri, fioles de culture, pipettes
• Milieux de culture liquides (tubes,
Erlenmeyer) ou gélosés (Boites de Pétri)
• Centrifugeuse
• Microscope
• Incubateur à 37°C
Les cultures bactériennes
Les plasmides bactériens
• Molécules d'ADN
surnuméraires et circulaires
distinctes de l'ADN
chromosomique
• Non essentielle à la survie de
cellule
• Capables de réplication
autonome
• Peuvent contenir des gènes qui
permettent à une bactérie
d’être résistante à une
antibiotique
• Peuvent être modifiés par des
Les plasmides bactériens
• Molécules d'ADN surnuméraires et
circulaires distinctes de l'ADN
chromosomique
• Non essentiels à la survie de cellule
• Capables de réplication autonome
• Peuvent contenir des gènes qui
permettent à une bactérie d’être
résistante à une antibiotique
• Peuvent être modifiés par des
techniques de recombinaison
génétique in vitro
• Peuvent être réintroduits dans des
bactéries par transfection
Le clonage
d’un gène
dans un
plasmide
Les principales enzymes utilisées pour
modifier des plasmides
• Enzymes des restriction : protéines qui peut couper un
fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides
caractéristique appelée « site de restriction ». Chaque
enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique. Il en
existe plusieurs centaines qui reconnaissent chacune une
séquence différente.
• ADN ligase : protéine qui répare les brins cassés d'ADN et qui
peut former des liaisons phospho-diester covalentes, et donc
lier ou connecter des brins d'ADN entre eux.
Exemples d’enzyme de restriction
Exemple de ligation
Les cultures de cellules eucaryotes
• Boites de Petri, fioles de culture, pipettes
• Milieu de culture (isotonique, pH neutre)
– Acides aminés, glucose, vitamines, ions (chlorure
de calcium, chlorure de magnesium,...)
• Hotte à flux laminaire
• Centrifugeuse
• Microscope
• Incubateur (37°C, CO2)
Fibroblastes de souris en culture Cellules issues d’une tumeur cérébrale
Lymphocytes de souris Neurones en culture
Le dénombrement direct des cellules permet de déterminer un nombre absolu de cellules dans un volume déterminé. Ce type de numération est bien adapté aux cellules eucaryotes.
Les méthodes d’analyse et de modification
génétique des cellules eucaryotes (1)
• Identification et quantification d’ARN messagers
– Hybridation moléculaire avec une sonde spécifique (Northern)
– Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) avec des amorces
spécifiques
– Analyse globale du transcriptome par hybridation sur des puces
à ADN
• Identification et quantification des protéines exprimées
– Immunofluorescence
– Electrophorèse à travers un gel de polyacrylamide et détection
de la protéine d’intérêt avec un anticorps spécifique
– Analyse globale du protéome
Réaction de polymérisation en chaîne
Hybridation moléculaire
Les méthodes d’analyse et de modification
génétique des cellules eucaryotes (2)
• Transfert de gènes
– Transfection au phosphate
de calcium
– Electroporation
– Lipofection
– Infection avec un virus
recombinant
• Invalidation d’un gène par
transfert d’ARN interférents
Production de souris transgéniques
par micro-injection dans un oocyte
Production de souris transgéniques
par micro-injection dans un oocyte
Production de souris transgéniques par
injection de cellules ES modifiées génétique
dans un blastocyste
Les mécanismes qui permettent aux
cellules de communiquer entre elles
Master IADE – Année 2013-2014
Deux grands modes de communication
• Contacts directs entre cellules adjacentes
– Via des jonctions communicantes « gap » entre cytoplasmes de
cellules adjacentes
– Via des molécules d’adhérence présentes à la surface cellulaire
• Communication à distance via la sécrétion et la capture de
molécules solubles
– Radicaux libres et gazeux: CO, NO
– Molécules hydrophobes: hormones stéroïdes, hormones
thyroïdiennes, rétinoïdes, vitamine D
– Molécules hydrosolubles: acides aminés et leurs dérivés (glutamate,
GABA), peptides et protéines (cytokines, facteurs de croissance,…)
Les jonctions communicantes (gap)
• Mise en relation des cytoplasmes de deux cellules
adjacentes et échanges de métabolites et d’ions
entre cellules adjacentes
• Permettent
– le maintien de l'homéostasie tissulaire
– le maintien des concentrations et du pH intracellulaire,
– le comportement synchronisé des cellules
– l'amplification de la réponse hormonale (couplage
métabolique)
– la transmission de signaux (couplage électrique)
Les molécules d’adhérence
Rôle des molécules d’adhérence
• Adhésion avec les cellules adjacentes ou la matrice
extracellulaire (ECM)
• Impliquées dans des interactions homophiliques ou
hétérophiliques
• Réparties en 4 classes
– Membres de la superfamille des immunoglobulines
– Intégrines
– Cadhérines
– Sélectines
Sécrétion et capture de molécules
hydrosolubles
• Radicaux libres et gazeux
– CO
– NO
• Molécules hydrophobes
– Hormones stéroïdes ou thyroïdiennes
– Rétinoïdes
– Vitamine D
• Molécules hydrosolubles
– Acides aminés et leurs dérivés : glutamate, GABA, …
– Peptides: ocytocine, vasopressine, hypocrétine,…
– Protéines : lipoprotéines, glycoprotéines,…
Sécrétion
autocrine,
paracrine
et
endocrine
Monoxide d’azote (NO)• Caractéristiques
– Radical libre gazeux instable (5 à 10 secondes) : NO > NO2 > NO3-
– Diffusion libre à travers les membranes cellulaires
– Synthèse et libération simultanée
• Fonctions physiologiques affectées
– Pression artérielle
– Mémorisation
– Sommeil
– Angiogenèse
– Inflammation
– Métabolisme du fer
• Mode d’action moléculaire
– Activation de l’enzyme guanidylate cyclase
– Interactions avec plusieurs molécules : 02, hémoglobine
– Inhibition de l’activité de plusieurs enzymes
Molécules hydrophobes (1)Exemples
• Hormones stéroïdes : lipides dérivant de lipides à 30 atomes de carbones
– Oestrogènes
– Androgènes
– Gluco-corticoïdes et minéralo-corticoïdes
– Progestérone
• Hormones thyroïdiennes : produites par la thyroïde
– Thyroxine
– Tri-iodothyronine
• Rétinoïdes : dérivés de la vitamine A, utilisés en médecine notamment pour leur
activité de régulation de la croissance et de la différenciation des cellules
épithéliales
• Vitamine D: synthétisée dans l'organisme à partir d'un dérivé du cholestérol sous
l'action des rayonnements UVB1 de la lumière. Intervient dans l'absorption du
calcium et du phosphore par l’intestin, et dans leur réabsorption par les reins
Molécules hydrophobes (2)caractéristiques et mode d’action
• Caractéristiques moléculaires
– Hydrophobes …. et donc capables de diffuser à travers les
membranes cellulaires
– Durée de vie longue : plusieurs heures / jours
– Jouent un rôle dans le développement, le métabolisme et
l’homéostasie
– Agissent via la fixation à des récepteurs nucléaires qui ont
la capacité de se lier à l’ADN de contrôler la transcription
des gènes
Structure des récepteurs
nucléaires
Les domaines des récepteurs nucléaires
• Région A/B: région amino-terminale très variable
selon le récepteur
• Région C: très conservée, contient deux domaines dit
« doigts Zinc » qui permettent la fixation à des
séquences d’ADN appelées HRE « Hormone
Responsive Element »
• Région D: charnière
• Région E: domaine de fixation du ligand
• Région F: région carboxy-terminale très variable
selon le récepteur
Mécanismes d’action
• Deux mécanismes d’action selon la
localisation subcellulaire du récepteur en
absence de ligand
– Type I: Localisation cytoplasmique
• Récepteurs des androgènes, récepteur
des oestrogènes, récepteur des
glucocorticoïdes, récepteur de la progestérone
– Type II: Localisation nucléaire
• Récepteur de l’acide rétinoïque, récepteur des
enzymes thyroïdiennes
Récepteurs nucléaires de type 1
HSP :protéine de choc thermique HRE: élément de réponse aux hormonesNR: récepteur nucléaire
Récepteurs nucléaires de type 1
• L’hormone traverse la membrane plasmique
• L’hormone se lie au récepteur qui est localisé dans le cytoplasme
• Le récepteur change de conformation et se dissocie des protéines de choc
thermique auxquelles il était associé
• Le récepteur s’associe à lui même (dimérisation) et migre dans le noyau
via des pores nucléaires
• Le récepteur se fixe à l’ADN de la cellule sur des séquences appelées
« HRE » qui sont localisées en amont de certains gènes
• Le récepteur recrute d’autres protéines (coactivateur, ARN polymérase)
qui vont permettre la transcription des gènes cibles
Récepteurs nucléaires de type 2
LBD : domaine de fixation du ligandHRE: élément de réponse aux hormonesTR: récepteur de l’hormone thyroïdienne
Récepteurs nucléaires de type 2
• L’hormone traverse la membrane plasmique
• L’hormone se lie au récepteur qui est localisé dans le noyau
• Le récepteur change de conformation et se dissocie des
protéines co-répresseur auxquelles il était associé
• Le récepteur s’associe à la protéine RXR et cet hétérodimère
se fixe à l’ADN de la cellule sur des séquences appelées
« HRE » qui sont localisées en amont de certains gènes
• Le récepteur recrute d’autres protéines (coactivateur, ARN
polymérase) qui vont permettre la transcription des gènes
cibles
Agonistes et antagonistes des récepteurs
nucléaires
• Agonistes : Molécules qui miment l’effet d’hormones endogènes et
activent la transcription de gènes cellulaires via la fixation à des
récepteurs nucléaires
– La dexaméthasone est un agoniste du récepteur des glucocorticoïdes
• Antagonistes : Molécules qui bloquent l’action des hormones endogènes
en se fixant au récepteur nucléaire sur le même site (fixation
compétitive). La fixation d’un antagoniste à un récepteur nucléaire induit
une modification conformationnelle durécepteur qui empêche la fixation
des co-activateurs et facilite la fixation des co-répresseurs
– La mifépristone est un antagoniste du récepteur des glucocorticoïdes et de
celui de la progestérone
• Représentation
schématique
du mode
d’action des
agonistes et
antagonistes
du récepteur
des
oestrogènes
Sécrétion et capture de molécules
hyodrosolubles• Les différents types de ligands
– Acides aminés et leurs dérivés : glutamate, GABA
– Peptides: ocytocine, vasopressine, hypocrétine…
– Protéines : lipoprotéines, glycoprotéines,…
• Les différents types de récepteurs
– Récepteurs couplés aux protéines G
• Récepteurs de l’adrénaline, de l’hormone lutéinisante (LH), du peptide vasoactif
intestinal (VIP),….
– Récepteurs enzyme
• Récepteurs du facteur de croissance épithélial (FGF), de l’insuline, de l’IGF-1, du
TGF-beta,...
– Récepteurs couplés à un enzyme
• Récepteurs des cytokines, des interleukines, de l’hormone de croissance (GH)
– Récepteurs canaux
• Récepteurs du GABA, de l’acétylcholine, de l’inositol tri-phosphate (IP3)
Récepteurs couplés aux protéines G
Récepteurs “enzyme”
Mécanismes moléculaires
• Le segment cytoplasmique contient un domaine à activité
« kinase » qui appartient soit à la classe des sérine/thréonine
kinases soit à la classe des tyrosine kinases
• Les récepteurs forment des dimères après fixation du ligand
(à l'exception du récepteur de l'insuline qui est déjà sous
forme de dimère) et subissent une trans-sphosphorylation qui
rend leur domaine catalytique « compétent »
• Cette activation est à l'origine de nombreuses autres
phosphorylations du segment intracellulaire du récepteur, ce
qui entraîne la liaison de plusieurs molécules effectrices et
forme ainsi le complexe récepteur de signalisation (”receptor
signalling complex”)
Récepteurs couplés à un enzyme
Récepteurs canaux
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