View
11
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Az egér median raphe régió citoarchitektúrája
Doktori értekezés
Szőnyi András
Semmelweis Egyetem
Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Nyiri Gábor Ph.D., tudományos főmunkatárs
Hivatalos bírálók: Dr. Lőrincz Magor László, Ph.D., tudományos
főmunkatárs
Dr. Kovács Tibor, med. habil., Ph.D., egyetemi docens
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Ádám Veronika, az MTA tagja,
egyetemi tanár
Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Rácz Bence, Ph.D., egyetemi docens
Dr. Tamás Gertrúd, Ph.D., egyetemi
adjunktus
Budapest
2018
2
Shiki soku zeku, ku soku zeshiki
________________
Az ürességből lesz a forma,
és a formából lesz az üresség.
3
I. TARTALOMJEGYZÉK
I. TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................... 3
II. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ..................................................................................... 5
III. ELŐSZÓ ..................................................................................................................... 8
IV. BEVEZETÉS ............................................................................................................. 9
IV.1. A median raphe régió funkcionális anatómiája ................................................... 9
IV.1.1. A median raphe anatómiai és szövettani leírása ........................................... 9
IV.1.2. A MRR szerotonerg sejtjeinek eredete és fejlődése – a PET-1 transzkripciós
faktor szerepe .......................................................................................................... 12
IV.1.3. A median raphe régió érett szerotonerg sejtjeinek heterogenitása .............. 15
IV.1.4. A median raphe régió hatása az előagyi hálózati aktivitásra ...................... 17
IV.1.5. A median raphe régió hatása a viselkedésre ............................................... 20
IV.2. Az egér hippokampusz funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása ........ 21
IV.2.1. A hippokampális működés modelljei – szerepe a deklaratív memóriában . 22
IV.2.2. A hippokampális működés modelljei – szerepe a térbeli memória
folyamataiban .......................................................................................................... 23
IV.2.3. A hippokampális formáció anatómiája ....................................................... 24
IV.2.4. A hippokampuszban található interneuronok ............................................. 28
IV.2.5. A hippokampális hálózati aktivitás mintázatok rövid összefoglalása ......... 32
IV.3 A mediális szeptum funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása .............. 33
IV.3.1. A mediális szeptum viselkedésben betöltött szerepe .................................. 33
IV.3.2. A mediális szeptum anatómiai viszonyai és sejtes felépítése ..................... 34
IV.3.3. A mediális szeptum hatása az előagyi aktivitás mintázatokra .................... 36
IV.4. A mediális prefrontális kéreg funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása
.................................................................................................................................... 39
IV.5. A hippokampusz, a mediális szeptum és a mediális prefrontális kéreg
összeköttetései ............................................................................................................ 41
IV.6. A median raphe régió vetítése az előagyi területekre ........................................ 42
IV.7. A szerotonerg és glutamaterg neurotranszmisszió molekuláris elemei ............. 43
IV.7.1. A szerotonerg neurotranszmisszió .............................................................. 43
IV.7.2. A glutamaterg neurotranszmisszió .............................................................. 45
V. CÉLKITŰZÉSEK ...................................................................................................... 49
VI. MÓDSZEREK ......................................................................................................... 51
VI.1. Etikai állásfoglalás ............................................................................................. 51
4
VI.2. Felhasznált kísérleti állatok ............................................................................... 51
VI.3. Sztereotaxiás műtétek, anterográd és retrográd pályajelölés ............................. 52
VI.4. Állatok kezelése, szövetek előkészítése a kísérletekhez.................................... 53
VI.5. Használt antitestek jellemzése ........................................................................... 54
VI.6 Fluoreszcens immunhisztokémia és konfokális lézer-pásztázó mikroszkópia ... 57
VI.7. Sztereológiai mérések ........................................................................................ 61
VI.8. Beágyazás előtti immunhisztokémia ................................................................. 62
VI.9. Elektronmikroszkópos mérések ......................................................................... 63
VII . EREDMÉNYEK .................................................................................................... 65
VII.1. A median raphe régió sejttípusai ...................................................................... 65
VII.2. Az ePet-pozitív sejtek eloszlása a median raphe régióban ............................... 72
VII.3. A median raphe régió sejtjeinek előagyi vetítési mintázata ............................. 73
VII.4. A median raphe régió sejtjei egyszerre több agyterületet is beidegeznek ........ 75
VII.5. A median raphe régió előagyban létrehozott szinapszisai NMDA-receptorokat
tartalmaznak ................................................................................................................ 80
VIII. MEGBESZÉLÉS ................................................................................................... 88
VIII.1. A median raphe régió sejtszintű felépítése ..................................................... 88
VIII.2. Az ePet nem specifikus a median raphe régió szerotonerg sejtjeire ............... 90
VIII.3. A median raphe régió 5HT-és/vagy vGluT3-tartalmú sejtjeinek jellemzése .. 92
VIII.4. A median raphe régióból felszálló pályát döntően glutamaterg rostok alkotják
.................................................................................................................................... 93
VIII.5. A glutamaterg és a szerotonerg neurotranszmisszió kapcsolódási pontjai ..... 94
IX. KÖVETKEZTETÉSEK ........................................................................................... 96
X. ÖSSZEFOGLALÁS .................................................................................................. 98
XI. IRODALOMJEGYZÉK ......................................................................................... 100
XII. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE .............................................................. 121
XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................. 123
5
II. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
10 kDa BDA – 10 kilodalton molekulatömegű biotinilált dextrán-amin
5-HIAA – 5-hidroxi-indolecetsav
5HT – szerotonin
5-HTP – 5-hidroxi-triptofán
ab – anguláris köteg
ACd – anterior cinguláris kéreg, dorzális rész
Acv – anterior cinguláris kéreg, ventrális rész
al – alveus
amg – amygdala
AADC – aromás aminosav dekarboxiláz
AC – adenilát-cikláz
acb – nucleus accumbens
AMPA - α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazol-propánsav
ATP – adenozin-trifoszfát
BSA-c/TBS – TBS-ben oldott Aurion BSA-c oldat
CA1,2,3 – cornu ammonis (ammonszarv) 1,2,3-mas régió
cAMP – ciklikus adenozin-monofoszfát
CB – calbindin
CCK – kolecisztokinin
Cer – kisagy
CTB – kolera-toxin B alegység
cx – agykéreg
DAG – diacil-glicerol
DG – gyrus dentatus
dt – dorzális talamusz
DRR – dorzális raphe régió
EAAT – serkentő aminosav-transzporter
EC – entorhinális kéreg
ePet – enhancer of PET-1
ETS – E26 traszformáció-specifikus domén
fi – fimbria
6
FG – FluoroGold retrográd pályajelölő anyag
FGF8 – fibroblaszt növekedési faktor 8
fr – fasciculus retroflexus
Fr2 – mediális precentrális terület
GABA – gamma-amino-vajsav
GABAA-R – A-típusú GABA receptor
gcl – stratum granulosum
Gln – glutamin
Glu – glutamát
hip – hippokampusz
HIPP – hippokampusz
hf – hippokampális hasadék
hyp – hipotalamusz
IG – induseum griseum
iGluR – ionotróp glutamát receptor
IL – infralimbikus kéreg
IP3 – inozitol-trifoszfát
is – isthmus
KO – génkiütött egértörzs (pl. PET-1 KO)
MAO-A – monoamin-oxidáz A
mGluR – metabotróp glutamát receptor
MS – mediális szeptum
ml – stratum moleculare
mlf – mediális előagyi köteg
mPFC – mediális prefrontális kéreg
MO – mediális orbitális kéreg
MR – median raphe
MRR – median raphe régió
NL2 – neuroligin 2
NMDA – N-metil-D-aszpartát
NMDA-R – NMDA-receptor
nNOS – neuronális nitrogén-monoxid-szintáz
7
ob – szaglógumó
OLM – oriens-lacunosum moleculare sejt
Para – parasubiculum
PB – foszfátpuffer
PC – foszfolipáz C
pcl – stratum pyramidale
PIP2 – foszfatidilinozitol 4,5-bifoszfát
pl – hilus
PL – prelimbikus kéreg
PMR – paramedian raphe
Pre – presubiculum
REM – rapid eye movement (alvási szakasz)
se – szeptum
SERT – szerotonin plazmamembrán transzporter
Shh – sonic hedgehog transzkripciós faktor
SNARE – vezikulaürülésben résztvevő fehérjék
sl – stratum lucidum
sl-m – stratum lacunosum-moleculare
so – stratum oriens
sr – stratum radiatum
Sub – subiculum
st – striatum
TB – tris puffer
TBS – tris pufferelt fiziológiás sóoldat
th – talamusz
TpH – triptofán-hidroxiláz
TRYP – triptofán
TT – taenia tecta
VGLUT – vezikuláris glutamát transzporter
vGluT1,2,3 – 1-es, 2-es, vagy 3-mas típusú vezikuláris glutamát transzporter
VIP – vazoaktív intesztinális polipeptid
VMAT2 – 2-es típusú vezikuláris monoamin transzporter
8
III. ELŐSZÓ
A világon talán semmi nem rendelkezik bonyolultabb felépítéssel az emberi
agynál. Az agyunkban összehuzalozott idegsejtek milliárdjai, melyek sejtenként több ezer
kapcsolatot létesítenek egymással, világegyetemünk egyik legnagyobb csodáját jelentik.
Ezek a kapcsolatok teszik lehetővé a reggeli ébredés első gondolatait, az előző nap
eseményeire való emlékezést, annak a felismerését, hogy azok vagyunk, akik, és nem
azok az emberek, akiket szintén agyműködésünk segítségével ismerünk fel a közös
asztalnál vagy a munkába menet. Ez a kapcsolathalmaz hozza létre a barátaink láttán
bennünk feltörő örömöt, a tavasz első illataira felbuzgó várakozással teli izgalmat, egy
szerettünktől való elköszönéskor a szomorúság érzését, és a gondolatainkba merült séta
közben ránk ugató kutyától való zsigeri ijedtséget, félelmet és a villámgyors védekező
mozdulatokat. Nem kétséges, hogy ezeknek a sokrétű funkcióknak a vizsgálata, jobb
megértése az emberiség legnagyobb és talán legnemesebb kihívásai közé tartozik.
Elménk játékai azonban legalább ugyanilyen gyakran megkeserítik életünket.
Szorongásaink, elnyomott vágyaink, félelmeink és szokásaink mind-mind a sejtek közötti
szinapszisok erdejében bújnak meg, és ha valamelyik alkotóelem működése hibát
szenved, abból különböző, súlyos betegségek alakulhatnak ki, olyanok, mint a
skizofrénia, a depresszió vagy a pánikbetegség. Különösen érvényes ez az agytörzsből
felszálló rendszerekre, melyek agyunk legősibb részei közé tartoznak, és minden agyi
működést befolyásolnak. Disszertációmban ezen rendszerek egyikét, az agytörzsben
elhelyezkedő median raphét veszem górcső alá. A median raphe régióból felszálló pálya
a szerotonerg rendszerek egyike, mely az egyik igen sokrétű hatással bíró ingerületátvivő
anyag az agyban, és szinte minden kognitív funkciónk létrehozásában részt vesz.
Munkám azokra az alapokra is támaszkodik, melyeket az idegtudományi iskola,
melyben volt szerencsém tanulni, már korábban lefektetett. Ezért itt szeretném kiemelni
Szentágothai János és Grastyán Endre munkásságát, akik a XX. század magyar
idegtudományának legfüggetlenebb gondolkodó elméi voltak, és akiknek úttörő
iskolateremtő tevékenysége idegtudósok százainak gondolkodását határozza meg mind a
mai napig. Az általuk, valamint közvetlen és sokadik generációs tanítványaik által
véghezvitt temérdek kísérlet határozta meg ennek a munkának a kereteit is.
9
IV. BEVEZETÉS
IV.1. A median raphe régió funkcionális anatómiája
IV.1.1. A median raphe anatómiai és szövettani leírása
Az agytörzsben több olyan magcsoport is található, amelyek felszálló pályákon
keresztül létesítenek kapcsolatot az előagyi területekkel, és hatékonyan befolyásolják a
magasabb rendű kérgi funkciókat, mint a tanulás és memória, a különböző érzelmekhez
köthető reakciók és az alvás-ébrenlét ciklusok. Ezeknek a pályáknak egy része
monoaminerg ingerületátvitel segítségével – dopamin, noradrenalin vagy szerotonin
(5HT) ürítésével – gyakorol hatást az előagyi területekre. Ez utóbbi felszálló rendszerek
közé tartozik az a pálya is, amely az úgynevezett raphe magokból ered.
A raphe magokat először Dahlström és Fuxe (1964) azonosította a Falck-Hillarp-
féle fluoreszens technika segítségével. A raphe magok közös tulajdonsága, hogy
találhatók bennük olyan sejtek, melyek 5HT-t képesek termelni és azt ingerületátvivő
anyagként használni. Ezek a magok a középagyban és hídban elhelyezkedő, többé-
kevésbé egymástól elkülönült sejtcsoportok; anatómiai helyzetük szerint Dahlström és
Fuxe 9 szerotonerg magot különített el egymástól, melyekről később kiderült, hogy
funkcionálisan két nagyobb rendszerbe tartoznak (1. ábra). A B1-B4 jelölésű magok a
leszálló szerotonerg rendszer részei, melyek a nyúltvelő és a gerincvelő felé küldenek
axonokat, a B5-B9 jelölésű magok alkotják a felszálló szerotonerg rendszert, mely az
előagy felé vetít (Hendricks és mtsai 1999, Hensler 2006). Ez utóbbi magok közül kettőbe
csoportosul a szerotonerg sejtek legnagyobb része: a dorzális raphe régióba (DRR; B6 és
B7 magok) és a median raphe régióba (MRR; B5 és B8 magok).
A MRR a középagy és a híd területén helyezkedik el; rosztrálisan az
interpeduncularis mag és a ventrális tegmentális terület, dorzálisan a felső kisagykarok
kereszteződése és a DRR, ventrálisan a reticulotegmentális mag, kaudálisan a pontin
raphe, laterálisan pedig a nucleus pontis oralis határolja. A MRR-n belül a szerotonerg
sejtek a középvonalban sűrűsödnek össze, ez a terület a median raphe (MR). A MR-t a
jelentős részben GABAerg sejteket tartalmazó paramedian raphe (PMR) veszi körül
10
(Behzadi és mtsai 1990). A MR és PMR közötti átmenet folytonos, az egyes sejtek
dendritjei átlépik ezeket a határokat (Calizo és mtsai 2011; Domonkos és mtsai 2016).
1. ábra: A szerotonerg
rendszer a fejlődő és a
felnőtt egér agyában: a
fejlődő agyról az
embrionális 11-dik
napon (E11) készült
szagittális metszet
rajzán látható, hogy a
szerotonerg sejtek
előalakjai (lila pöttyök)
az agytörzsben, az
isthmustól kaudálisan
helyezkednek el. Az embrionális 14-dik napon a szerotonerg sejtek rosztrális (lila pöttyök,
B6-B9) és kaudális (sárga pöttyök, B1-B3) csoportja is kialakult, melyek a felszálló (lila
nyíl), illetve a leszálló (sárga nyíl) szerotonerg rendszert alkotják. A felszálló pálya
bizonyos pontokon a fejlődő agyba kollaterálisokat ad (lila leágazó nyilak). Rövidítések:
cx: agykéreg, dt: dorzális talamusz, fr: fasciculus retroflexus, hyp: hipotalamusz, mlf:
mediális előagyi köteg, se: szeptum.
A felnőtt agyban kialakultak az egyes szerotonerg magok (B1-B9), és vetítő rostjaik is. A
leágazó lila nyilak a felszálló szerotonerg rendszer által legsűrűbben beidegzett
területeket mutatják. Rövidítések: acb: nucleus accumbens, amg: amygdala, Cer: kisagy,
cx: agykéreg, hip: hippokampusz, hyp: hipotalamusz, ob: szaglógumó, st: striatum, th:
talamusz. A kép forrása: Serotonin homeostasis and serotonin receptors as actors of
cortical construction: special attention to the 5-HT3A and 5-HT6 receptor subtypes,
Vitalis és mtsai 2013. Engedéllyel módosítva és felhasználva.
A MRR sejtjeinek számáról, fenotípusáról eddig nem rendelkeztünk pontos,
adatokkal, bár több vizsgálatot is folytattak az itt található sejtek neurokémiai
jellemzésével kapcsolatban (Araneda és mtsai 1999; Fremeau és mtsai 2004; Fu és mtsai
11
2010; Hioki és mtsai 2004; Hioki és mtsai 2010). Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy
a MRR-ban található szerotonerg sejtek mellett 3-mas típusú vezikuláris glutamát
transzportert (vGluT3) kifejező glutamaterg sejtek is találhatók a MRR-ban. Ezek egy
része átfed a 5HT-pozitív sejtekkel, de vannak olyan sejtek is a MRR-ban, amelyek csak
vGluT3-mat fejeznek ki (Calizo és mtsai 2011; Herzog és mtsai 2004; Jackson és mtsai
2009). Emellett a glutamát-dekarboxilázt kifejező GABAerg, valamint neuronális
nitrogén-monoxid szintázt (nNOS) kifejező nitroxiderg sejtek is találhatók a MRR-ban,
továbbá különböző neuropeptidek (szomatosztatin, galanin, kortikotropin releasing
faktor, neuropeptid Y, kolecisztokinin, tachykinin B, vazoaktív intesztinális peptid)
jelenlétét is leírták ezen a területen. Ezen sejtpopulációk egymással, illetve a
monoaminerg, glutamaterg vagy GABAerg ingerületátvitellel működő populációkkal
való átfedését csak részben vizsgálták (Araneda és mtsai 1999; Calizo és mtsai 2011; Fu
és mtsai 2010). Nem ismertek továbbá kellő pontossággal a MRR-ban található sejtek
egymással létrehozott kapcsolatai sem.
A MRR különböző sejttípusai eltérően vesznek részt az előagyi vetítés
kialakításában. A MRR szerotonerg sejtjei az egész agyba küldenek felszálló rostokat, és
olyan fontos funkciókban vesznek részt, mint a cirkadián ritmus és az alvás-ébrenlét
ciklusok szabályozása (Yamakawa és Antle 2010), különböző tanulási és
memóriafolyamatok (Stäubli és Xu 1995; Wang és mtsai 2015), stressz- és
szorongásszabályozás (Andrade és mtsai 2013; Richardson-Jones és mtsai 2010; Teissier
és mtsai 2015) valamint a félelemmel kapcsolatos reakciók (Avanzi és mtsai 1998; Wang
és mtsai 2015). Azonban úgy tűnik, hogy a MRR egyes nem szerotonerg sejtjei is
rendelkeznek előagyi célpontokkal, és a szerotonerg rendszerrel együttműködve vesznek
részt a fenti funkciók szabályozásában (Aznar és mtsai 2004; Crooks és mtsai 2012). Ezek
a sejtek, legalábbis részben, a vGluT3-pozitív, glutamaterg populációba tartoznak, és igen
hatékonyan képesek befolyásolni az előagyi működést (Amilhon és mtsai 2010; Jackson
és mtsai 2009; Varga és mtsai 2009). A MRR-ban található, nNOS-t, galanint vagy
szomatosztatint kifejező sejtek szintén rendelkeznek előagyi vetítéssel, bár a fenti
peptideket kifejező populációk jelentős átfedést mutattak a szerotonerg sejtekkel
(Araneda és mtsai 1999; Lu és mtsai 2010). A MRR-ban található GABAerg sejtek
előagyi vetítésével kapcsolatban nincsenek információink, a szakirodalom ezeket a
sejteket a MRR vetítő sejtjeit lokálisan gátló populációnak tartja (Wang és mtsai 2015).
12
Bár a 5HT-t kifejező sejtek a MRR-nak csak kisebb hányadát teszik ki, jó
vizsgálhatóságuk miatt ezek működéséről és szerepéről tudunk a legtöbbet. A következő
fejezetekben sorra veszem a szerotonerg sejtek eredetét, fejlődését, és kitérek az utóbbi
időben megfigyelt funkcionális és molekuláris sokféleségükre.
IV.1.2. A MRR szerotonerg sejtjeinek eredete és fejlődése – a PET-1 transzkripciós
faktor szerepe
A majdani szerotonerg idegsejtek progenitor sejtjei a rhombencephalonban
találhatók, a kialakuló negyedik agykamra alatti állományban, a r1-r3, valamint a r5-r7
rhombomérákban (Deneris és Wyler 2012; Hendricks és mtsai 1999; Jensen és mtsai
2008; Lidov és Molliver 1982; Okaty és mtsai 2015). A r1-r3 rhombomérákban található
rosztrális szerotonerg csoportból fejlődnek ki a felszálló, míg a r5-r7 rhombomérákban
található kaudális csoportból a leszálló szerotonerg rendszer sejtjei (Hendricks és mtsai
1999; Okaty és mtsai 2015). A két rendszer fejlődése időben is elkülönül: a rosztrális
csoport fejlődése egérben és patkányban is mintegy egy nappal megelőzi a kaudális
csoport fejlődését (Hendricks és mtsai 1999).
Ezek a progenitor sejtek a fejlődésnek már igen korai szakaszában megjelennek a
fejlődő agyban: egérben az embrionális 9.5 és 12 nap (E9.5-12) között, patkányban E11-
14 között (Hendricks és mtsai 1999; Pfaar és mtsai 2002). A szerotonerg irányba való
elköteleződést egy sor transzkripciós és növekedési faktor összehangolt működése
szabályozza. Ezek között kezdetben fontos szerepet tölt be a sonic hedgehog (Shh) és a
fibroblast növekedési faktor 8 (FGF8), melyek további homeobox gének bekapcsolását
indukálják ezekben a sejtekben (Deneris és Wyler 2012). Ilyenek a Nkx2.2, Foxa2, Gata2
és Gata3 gének, végül a Lmx1b és a PET-1 veszi át a posztmitotikus fejlődésben az
elsődleges szerepet (Deneris és Wyler 2012; Jensen és mtsai 2008).
A PET-1 a fejlődő szerotonerg sejtekre jellemző fehérje, mely az E26
transzformáció-specifikus (ETS) doménnel rendelkező transzkripciós faktorok
családjába tartozik (Fyodorov és mtsai 1998; Hendricks és mtsai 1999; Pfaar és mtsai
2002). A PET-1 az evolúció során megőrződött, homológja az emberben is megtalálható
Fifth Ewing Variant transzkripciós faktor. A PET-1 mRNS-ét rágcsálókban a fejlődés
során kizárólag a raphe magoknak megfelelő régiókban lehet kimutatni in situ
13
hibridizációs technikával; a MRR-n belül a PET-1-et kifejező sejtek főleg a
középvonalban, a szerotonerg sejtek nagy részét is tartalmazó MR-ban tömörülnek (2.
ábra; Hendricks és mtsai 1999; Pfaar és mtsai 2002). A PET-1 kifejeződése megelőzi a
szerotonerg sejtekre jellemző géntermékek kifejeződését mind a rosztrális, mind a
kaudális szerotonerg csoportban. Patkányban az első PET-1-et kifejező sejtek P12.5-nél
jelennek meg a rosztrális csoportban, ezek fél nappal később válnak 5HT-pozitívvá; P14-
re már a kaudális csoport sejtjei is 5HT-pozitivitást mutatnak (Hendricks és mtsai 1999).
2. ábra: Az autoradiográfiával megjelölt PET-1 transzkripciós faktor mRNS-e csak a
raphe magvakban (B1-B9) mutatható ki, mint ahogy az a fenti, agytörzsről készült
koronális metszeteken is látható. A kép forrása: „The ETS domain factor Pet-1 is an early
and precise marker of central serotonin neurons and interacts with a conserved element
in serotonergic genes, Hendricks és mtsai 1999”. Engedéllyel módosítva és felhasználva.
Pár évvel a PET-1 felfedezése után kiderült, hogy ennek a transzkripciós faktornak
a kifejeződését és működését egy enhancer régió is segíti. Ez a 1.8kb hosszúságú régió
közvetlenül a PET-1-et kódoló gén előtt elhelyezkedő ePet, mely folyamatos pozitív
visszacsatolásban áll a PET-1-gyel, a posztmitotikus, már kialakult szerotonerg sejtekben
14
( Liu és mtsai 2010; Scott és mtsai 2005a; Scott és mtsai 2005b). Az ePet/PET-1 rendszer
tehát együttműködve segíti elő a szerotonerg sejtek megfelelő működését.
A PET-1 kifejeződése a szerotonerg sejtek jelentős részében alapvetően fontos a
szerotonerg fenotípus kialakulásához. PET-1 génkiütött (KO) állatban ugyanis mintegy
70%-kal csökken a 5HT-t kifejező sejteknek a száma az egyes raphe magokban, továbbá
a szerotonerg rendszerre jellemző fehérjék, mint a triptofán-hidroxiláz (TpH), szerotonin
transzporter (SERT), 2-es típusú vezikuláris monoamin-transzporter (VMAT2), aromás
aminosav dekarboxiláz (AADC) és a tetrahidrobiopterin-szintézis enzimeinek génjei sem
íródnak át mRNS-é megfelelően (Hendricks és mtsai 2003; Liu és mtsai 2010; Wyler és
mtsai 2015; Wyler és mtsai 2016). Ezekben az állatokban a kérgi szerotonerg rostok
mennyisége, és a belőlük felszabaduló 5HT szintje is jelentősen csökkent, továbbá ennek
megfelelő viselkedésbeli eltéréseket is mutatnak: rosszabbul tűrik a stresszt, fajtársaikkal
szemben aggresszívabbak, és szorongásra hajlamosak (Hendricks és mtsai 2003;
Kiyasova és mtsai 2011; Liu és mtsai 2010).
A PET-1 kifejeződése azonban nem csak a szerotonerg sejtek kifejlődéséhez
szükséges, hanem azok szerotonerg fenotípusának fenntartásához is. ePet-Cre::PET-1loxP/-
állatok létrehozásával a már kialakult, posztmitotikus szerotonerg sejtekből kiütötték a
PET-1-et. Azt találták, hogy bár ezekben az egerekben jelen vannak az érett szerotonerg
sejtek, azokban a TpH, SERT, VMAT2, AADC és az 5HT1A szerotonin-autoreceptor
mRNS-ének szintje jelentősen csökkent. Hasonló eredményeket mutattak ki olyan
egerekben is, melyekben doxycyclin-függő módon időzítetten, fiatal felnőttkorban
csendesítették el a PET-1 kifejeződését; ezek az egerek, hasonlóan a PET-1 KO
egerekhez, szorongásra hajlamosabbak voltak vad típusú társaikhoz képest (Liu és mtsai
2010). Továbbá a PET-1 KO egerek szerotonerg sejtjeire az éretlen, fejlődő szerotonerg
sejtekhez hasonló membrántulajdonságok és szinaptikus kapcsolatrendszer jellemző még
felnőttkorban is (Rood és mtsai 2014; Wyler és mtsai 2016).
A fenti szakirodalmi adatok úgy kezelték az ePet/PET-1 rendszert, mint ami
specifikus a raphe magokban található szerotonerg sejtekre, és azok döntő többségében
kifejeződik. Bár valóban igaz, hogy az ePet/PET-1 rendszer a raphe magok területén kívül
nem aktiválódik, specificitása nem közelíti meg a 100%-ot a szerotonerg sejtekre nézve.
Mind egérben, mind patkányban kimutatták, hogy az ePet/PET-1 rendszer csupán a 5HT-
pozitív sejtek mintegy 70%-ban található meg; azok a szerotonerg sejtek, akik nem fejezik
15
ki a PET-1-et, külön populációt képeznek a raphe magokban, és jellemző agyi vetítési
mintázattal is rendelkeznek, bizonyos agyterületeken funkcionális aszimmetrikus
szinapszisokat létrehozva (Hendricks és mtsai 2003; Kiyasova és mtsai 2011; Pfaar és
mtsai 2002; Wang és mtsai 2015). Továbbá kimutatták, hogy a DRR-ban és a MRR-ban
található vGluT3-pozitív sejtek mintegy 30%-a is kifejezi a PET-1-et (Gaspar és Lillesaar
2012). Az ePet/PET-1 rendszernek a MRR különböző típusú sejtjeiben való kifejeződését
azonban eddig nem vizsgálták, így nem volt világos, hogy – még ha megkötésekkel is, de
- az használható volna-e a szerotonerg rendszer specifikus vizsgálatára.
IV.1.3. A median raphe régió érett szerotonerg sejtjeinek heterogenitása
A felszálló szerotonerg rendszer sejtjei már fentebb bemutatott fejlődésük alapján
sem képeznek egy homogén populációt. A DRR és MRR sejtjei három rhombomérából
(r1-r3) alakulnak ki, és ezeknek a sejteknek az elhelyezkedése, vetítési mintázata és
rostjaik anatómiája is különbségeket mutat. A különböző rhombomérákban mindegyikre
jellemző, különböző transzkripciós faktorok fejeződnek ki; a szerotonerg sejtek nagy
része pedig kifejezi a PET-1-et. A rhomboméra-specifikus transzkripciós faktorokat és a
PET-1-et kifejező sejtpopulációk keresztmetszetébe tartozó sejteket célzott genetikai
módszerekkel megjelölve lehetett leírni. Így megismerhetők a különböző
rhombomérákban található szerotonerg sejtek jellemzői (Bang és mtsai 2012; Jensen és
mtsai 2008; Muzerelle és mtsai 2016).
Az r1 rhombomérából fejlődő szerotonerg sejtek a DRR-ban és kisebb részben a
MRR elülső részében helyezkednek el. Ezek a sejtek az előagyban, a DRR-ra jellemző
vetítési mintázatot mutatják, rostjaik között sok a vékony, kis megvastagodásokat
létrehozó axon. Ezzel szemben a hippokampuszban (HIPP), az r1-ből származó sejtek a
MRR-ra jellemző rétegspecifikus vetítési mintázatot adják a stratum radiatum és
lacunosum-moleculare határán, ahol vastag rostokat és nagy méretű terminálisokat lehet
megfigyelni, ami arra utal, hogy a hippokampuszba a MRR r1 rhombomérából származó
sejtjei is vetítenek.
Az r2 rhombomérából kialakuló sejtek a MRR szerotonerg sejtjeinek nagy
többségét adják, vetítési mintázatuk a MRR-ból anterográd pályajelöléssel leírtnak
16
megfelelő, rostjaik anatómiája, a fent leírt morfológiát mutatja, vastag rostokkal és nagy
méretű terminálisokkal (Vértes és mtsai. 1999).
Az r3 rhombomérából fejlődő sejtek a MRR hátsó részében helyezkednek el,
kevésbé jellemző rájuk a kérgi területekre való vetítés, hangsúlyosabbak a helyi és
agytörzsi magokkal létrehozott kapcsolataik, rostjaik szintén vastagok és egyértelmű
terminálisokat képeznek (Mamounas és mtsai 1991; Vértes és mtsai 1999). A MRR 5HT-
pozitív sejtjeit tehát már eredetük szerint is legalább 3 populáció alkotja.
További heterogenitást okoz a MRR szerotonerg sejtjei között a fent bemutatott
PET-1 pozitivitás. Egyes sejtek a MRR-ban annak ellenére is megtartják szerotonerg
fenotípusukat, hogy a PET-1 génjét kiütötték az állat genomjából, ezek a sejtek pedig
működőképes szinapszisokat hoznak létre több előagyi területen is. A PET-1-negatív
szerotonerg sejtek által egyik legerősebben beidegzett agyterület a bazolaterális amygdala
(Kiyasova és mtsai 2011). Később leírták, hogy a bazolaterális amygdalába vetítő sejtek
elektrofiziológiai tulajdonságai és „genetikai ujjlenyomata” eltérőek a mediális
prefrontális kéregbe (mPFC) vagy a hippokampuszba vetítő sejtekhez képest, ami további
bizonyíték az eltérő szerotonerg alpopulációk létezése mellett (Fernandez és mtsai 2016).
A szerotonerg sejtek heterogenitását elektrofiziológiai és genetikai módszerek
segítségével is vizsgálták. Ezen vizsgálatok szerint a szerotonerg sejtek több populációba
sorolhatóak membrántulajdonságok, tüzelési mintázat és 5HT1A-autoreceptor
aktiválására adott válasz alapján. Ezek a sejtek különböző módon kapcsolódnak az
előagyi hálózati aktivitáshoz is (Beck 2003; Calizo és mtsai 2011; Kiyasova, Bonnavion,
Scotto-lomassese, és mtsai 2013; Kocsis és mtsai 2006; Richardson-Jones és mtsai 2010).
Genetikai vizsgálatok is arra mutattak rá, hogy a szerotonerg sejtek több, különböző
„genetikai ujjlenyomattal” rendelkező csoportba sorolhatóak. Az egyes szerotonerg
alpopulációk mind a raphe magok között, mind az egyes raphe magokon – így a MRR-n
– belül is jelentős eltéréseket mutattak (Fernandez és mtsai 2016; Okaty és mtsai 2015).
A különböző genetikai tulajdonságokkal rendelkező sejtek különböző, a szerotonerg
rendszerhez kapcsolódó funkciókat tölthetnek be, például azon keresztül, hogy különböző
agyterületekre vetítenek (Commons 2016; Fernandez és mtsai 2016).
Talán az egyik legfontosabb tényező a szerotonerg sejtek heterogenitásában azok
vGluT3-pozitivitása, így glutamát felszabadítására való képessége. Mind a DRR-ban,
mind a MRR-ban találhatók olyan sejtek, melyek vGluT3-mat fejeznek ki, és ezek egy
17
része átfed a szerotonerg sejtekkel (Fremeau és mtsai 2004; Herzog és mtsai 2004;
Jackson és mtsai 2009). A vGluT3 génje több, szerotonerg fenotípust meghatározó
génhez hasonlóan felnőtt korban is a PET-1 rendszer szabályozása alatt áll (Liu és mtsai
2010), ami a szerotonerg rendszerrel való szoros együttműködést feltételez. Anterográd
és retrográd pályakövetési vizsgálatokkal patkányban már kimutatták, hogy a MRR nem
szerotonerg vetítéséhez jelentősen hozzájárulnak a vGluT3-pozitív sejtek a
hippokampusz és a mediális szeptum (MS) területén (Aznar és mtsai 2004; Jackson és
mtsai 2009; Shutoh és mtsai 2008; Somogyi és mtsai 2004). A hippokampuszban ennek
a gyors és hatékony glutamaterg vetítésnek igen fontos szerepe van a hálózati aktivitás
szabályozásában, ahogy csoportunk egy korábbi munkája azt kimutatta (Varga és mtsai
2009). Azonban pontos vizsgálatok eddig még nem történtek a MRR 5HT- és vGluT3-
pozitív sejtjeinek számának és egymáshoz viszonyított arányának meghatározására.
IV.1.4. A median raphe régió hatása az előagyi hálózati aktivitásra
Az élőlények a külvilágból érkező ingerekre, illetve a saját belső állapotukból
származó motivációkra különböző viselkedéssel reagálnak, és ezekre a viselkedési
mintákra különböző előagyi aktivitásmintázatok jellemzőek. Ennek a jelenségnek az
egyik legismertebb példája a szeptohippokampális rendszerben figyelhető meg. Több
fajban, a rágcsálóktól az emberig kimutatható, hogy a környezet felmérése, tájékozódás,
aktív figyelem, valamint a paradox, REM-alvás alatt a hippokampuszban 5-12 Hz
frekvenciájú, 1-2mV amplitúdójú szinkron hullámtevékenység, az úgynevezett theta-
oszcilláció jelenik meg, mely a hippokampális piramissejtek szinkron aktivitását tükrözi.
Ezzel szemben nyugalomban, táplálkozás közben vagy mély alvás során a hippokampális
EEG nagy amplitúdójú irreguláris aktivitást mutat, melyet időnként éleshullám-aktivitás
szakít meg (Buzsáki és mtsai 1979; Buzsáki 2002; Stumpf és mtsai 1962; Vértes és Kocsis
1997).
A MRR szerepét a szeptohippokampális oszcillációk szabályozásában már igen
korán kimutatták: a MRR elektromos ingerlése a hippokampális theta-ritmus
deszinkronizációjával járt (Assaf és Miller 1978). Ezeket a megfigyeléseket később
további vizsgálatok is igazolták, mely munkákat kiválóan összefoglalta Vértes és Kocsis
18
(1997). A MRR aktiválása a serkentő szinaptikus transzmisszió kémiai úton történő
fokozásával, vagy a MRR GABAerg gátlásának blokkolásával mind hasonló eredményre
vezettek (Kinney és mtsai 1996; Li és mtsai 2005).
Ezzel szemben a MRR léziója, vagy a MRR-ben található sejtek kémiai úton
történő gátlása prokainnal vagy 5HT1A-receptorokon keresztül, fokozott
szeptohippokampális theta-aktivitáshoz vezetett. Hasonló eredménnyel járt a lokális
serkentő glutamaterg transzmisszió blokkolása vagy a GABAerg gátlás fokozása is
(Crooks és mtsai 2012; Kinney és mtsai 1994; Kinney és mtsai 1995; Kinney és mtsai
1996; Li és mtsai 2005; Maru és mtsai 1979). A MRR mind a mediális szeptumba, mind
a hippokampuszba, nagy mennyiségben küld rostokat, lehetővé téve ezeknek a régióknak
a közvetlen szabályozását (Vértes és mtsai 1999).
Több bizonyíték is arra utal, hogy a MRR theta-deszinkronizáló hatása
szerotonerg neurotranszmisszión keresztül valósul meg. Először is a szerotonerg sejtek
célzott kiirtása 5,7-dihidroxitriptaminnal folyamatos theta-ritmust idézett elő szabadon
mozgó patkányokban (Vanderwolf és mtsai 1989). Ezenfelül a MRR szerotonerg sejtjei
célzottan blokkolhatók 5HT1A-agonistákkal (Beck 2003; Crooks és mtsai 2012), és ennek
a blokkolásnak a hatására szintén theta-ritmust lehet kiváltani a szeptohippokampális
rendszerben (Crooks és mtsai 2012; Kinney és mtsai 1996; Vertes és mtsai 1994). Így pl.
a MRR elektromos stimulálása deszinkronizálta a theta-ritmust, de a szerotonin
szintézisének gátlása, vagy a szerotonerg rostok célzott kiirtása ezt a hatást képes volt
kivédeni (Assaf és Miller 1978; McNaughton és mtsai 1980). Továbbá a szerotonin
prekurzor 5-hidroxitriptofán intraperitoneális injektálásának hatására az állatban hosszú
ideig blokkolódott a theta-ritmus (Yamamoto és mtsai 1979). Úgy tűnik tehát, hogy a
szerotonerg transzmisszió elősegíti a hippokampusz és az élőlény aktív, feltérképező
állapotából a nyugalmi állapotba való átmenetet.
A MRR sejtjeinek theta-oszcillációkra való hatása azonban nem egyforma. A nem
szerotonerg rostok, melyek szintén részt vesznek a felszálló pálya létrehozásában, eltérő
hatásúak lehetnek. Ezeket a rostokat jórészt a MRR vGluT3-pozitív sejtjei alkotják
(Aznar és mtsai 2004; Jackson és mtsai 2009; Varga és mtsai 2009). A MRR theta-ritmusú
tüzeléssel való ingerlésének hatására a hippokampuszban nem deszinkronizáció, hanem
épp ellenkezőleg, theta-ritmusban történő oszcilláció jött létre, az ingerlés fázisához
szorosan fáziskapcsolt módon. Emellett a MRR ingerlésének hatására a hippokampális
19
theta fázisa újraindult (Jackson és mtsai 2008). A MRR rostjai a hippokampuszban
célzottan bizonyos interneuronokkal létesítenek szinapszisokat (Freund és mtsai 1990;
Halasy és mtsai 1992). Kutatócsoportunk korábbi munkája kimutatta, hogy a MRR
rostjainak optogenetikai stimulálása a hippokampuszban nagyon hatékonyan képes
serkenteni ezeket az interneuronokat, mely interneuronok által létrehozott gátlás
hatékonyan áttevődik a hippokampális piramissejtekre. Az interneuronokon létrehozott
posztszinaptikus serkentő áramok amplitúdójának döntő részéért a glutamaterg
neurotranszmisszió volt felelős, mint ahogy azt AMPA- és NMDA-receptor blokkolókkal
kimutattuk (Varga és mtsai 2009).
A MRR-ból felszálló szerotonerg és nem szerotonerg pályák szeptohippokampális
ritmikus aktivitásra való eltérő hatását Crooks és munkatársai (2012) elegáns kísérletei
világították meg a legalaposabban. Az első kísérletek során a MRR minden sejtjét
blokkolták prokain MRR-ba történő lokális injektálásával, ennek hatására a
hippokampuszban erős theta-ritmus jött létre. Ezt a theta-ritmust a MS teljes blokkolását
előidéző intraszeptális prokain-injekció, és a MS-ban található kolinerg sejteket célzottan
blokkoló atropin-injekció is megszüntette. Ha a MRR-ben található szerotonerg sejteket
célzottan blokkolták 5HT1A-autoreceptor agonistával, akkor szintén theta-ritmus volt
megfigyelhető a hippokampuszban. Ezt a theta-ritmust azonban csak a MS általános,
prokainnal történő blokkolása volt képes megszüntetni; amennyiben csak a MS kolinerg
sejtjeit blokkolták atropinnal, a hippokampális theta-ritmus továbbra is megfigyelhető
volt. Ennek az lehet a magyarázata, hogy a MRR-ból felszálló pálya nem szerotonerg
része célzottan serkenti a MS-ban található, parvalbumin-pozitív GABAerg sejteket,
melyek a hippokampális theta-ritmus létrehozásában alapvető szerepet töltenek be
(Borhegyi 2004; Freund és Antal 1988; Hangya és mtsai 2009).
A korábbi szakirodalmi adatok azt mutatják, hogy patkányban a MRR felszálló,
nem szerotonerg rostjai megcélozhatják a MS parvalbumin- vagy calbindin-pozitív
sejtjeit, és ezek a rostok feltehetőleg a MRR vGluT3-pozitív sejtjeitől erednek (Aznar és
mtsai 2004; Jackson és mtsai 2009; Leranth és Vertes 1999). A MRR vGluT3-pozitív
sejtjei tehát valóban alapvető hatással bírhatnak a hippokampális oszcillációk
kialakulására.
Tovább árnyalja a MRR szerepét a hippokampális theta-ritmus szabályozásában
az a jelenség, hogy az epitalamuszban található laterális habenula kiirtásának hatására a
20
hippokampuszban csökken a theta-ritmusban töltött időszakok gyakorisága és hossza. Ezt
a hatást a MRR szerotonerg sejtjeinek célzott kiirtása kivédte, amely azt mutatja, hogy a
laterális habenulának hippokampális theta-ritmust elősegítő hatása a MRR-n keresztül
valósult meg (Aizawa és mtsai 2013).
A MRR nem csak a theta-ritmusra, hanem a hippokampális éleshullám-aktivitásra
is erős hatással bír. A MRR szerotonerg sejtjeinek tüzelése a hippokampális éleshullám-
események előtt közvetlenül lecsökken, míg a MRR GABAerg sejtjeinek aktivitása ezzel
párhuzamosan emelkedik. Ezzel összefüggésben a MRR optogenetikai ingerlése a
hippokampuszban csökkentette, míg optogenetikai gátlása elősegítette az éleshullámok
kialakulását (Wang és mtsai 2015). A hippokampális éleshullám-aktivitás alapvető
fontosságú a memóriafolyamatok helyes működésében, az emlékek megjegyzésében (Wu
és mtsai 2017). Ha a MRR-t ritmusosan aktiválták azokban az időszakokban, mikor az
állat nyugalomban volt, így gátolva az éleshullám-aktivitást, az állat memóriája zavart
szenvedett (Wang és mtsai 2015). A MRR különböző típusú sejtjeinek tehát eltérő, de
alapvető szerepek is juthatnak az előagyi ritmusos aktivitás szabályozásában, melynek az
élőlény viselkedésére is komoly hatása lehet.
IV.1.5. A median raphe régió hatása a viselkedésre
A MRR hatását a viselkedésre a fenti, hálózati működésre gyakorolt befolyása
alapján kezdték el tanulmányozni. A szerotonerg rendszert már korábban kapcsolatba
hozták a szorongás és a félelmi reakciók szabályozásával, illetve a szerotonerg rendszer
hibás működése megfigyelhető olyan betegségekben, mint a depresszió, pánikbetegség,
generalizált szorongás vagy skizofrénia (Andrade és mtsai 2013; Hensler 2006).
A MRR szorongással és félelmi reakciókkal kapcsolatos vizsgálatai abba az
irányba mutatnak, hogy a MRR inaktiválása szorongásoldó, míg a MRR aktiválása
szorongást keltő hatású; ezeket a kísérleteket kiválóan foglalták össze Andrade és
munkaársai (2013). A MRR léziója akár elektromos, akár kémiai úton csökkentette
patkányok szorongását vagy félelmét több különböző viselkedési paradigmában is, mint
az emelt keresztpalló, az erőltetett úszási teszt vagy a kontextuális félelmi teszt (Almada
és mtsai 2009; Almeida és mtsai 2013; Andrade és Graeff 2001; Avanzi és mtsai 1998;
Avanzi és Brandão 2001; Borelli és mtsai 2005; Melik és mtsai 2000). Ez a viselkedés,
21
legalábbis részben, szerotonerg sejteken keresztül valósul meg, ugyanis ha 5HT1A-
autoreceptor agonista MRR-ba való injektálásával gátolták a szerotonerg sejtek
működését, hasonló szorongásoldó hatást tapasztaltak a fenti tesztekben (Andrade és
mtsai 2013; Avanzi és Brandão 2001). A MRR elektromos ingerlése ezzel ellentétben
szorongást váltott ki (Graeff és Silveira Filho 1978), és összhangban a fenti kísérletekkel,
az 5HT1A-autoreceptor antagonista patkány MRR-ba való injektálása is fokozta az állatok
szorongását (Vicente és mtsai 2008).
A fent bemutatott elektrofiziológiai kísérletekkel összhangban, melyek a MRR
szeptohippokampális aktivitásmintázatokra való hatását mutatták be, a MRR viselkedési
hatásai is részben a hippokampuszon keresztül valósulnak meg. 5HT1A-receptor agonista
patkány hippokampuszba való injektálása szintén csökkentette a félelmi reakciókat a
kontextuális félelmi paradigmában (Almada és mtsai 2009). Mivel a 5HT1A-receptorok
preszinaptikusan helyezkednek el a szerotonerg terminálisokon, és azokon gátló hatást
fejtenek ki, csökkentik a hippokampuszban a szerotonin szintjét, ami a fenti kísérletekkel
összhangban szorongásoldó hatású (Fischette és mtsai 1987). Továbbá egerekben a MRR
optogenetikai ingerlése az állat nyugalmi állapotában csökkentette a hippokampális
éleshullám-aktivitást, amely a kontextuális félelmi emléknyomok rögzítésének zavarával
járt (Wang és mtsai 2015).
A MRR viselkedésre gyakorolt hatását tehát vagy a MRR-ban található
sejtpopulációk mindegyikének befolyásolásával, vagy a szerotonerg sejtek működésének
módosításával vizsgálták, mely kísérletek abba az irányba mutatnak, hogy a MRR
működésének a negatív, szorongással összefüggő viselkedési minták szabályozásában,
illetve az azokkal kapcsolatos emléknyomok létrehozásában van szerepe.
IV.2. Az egér hippokampusz funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása
A temporális lebenyben elhelyezkedő hippokampusz az agy első vizsgálatai óta
az idegtudománnyal foglalkozó szakemberek figyelmének központjában van. Ennek
magyarázata jól elkülöníthető anatómiai elhelyezkedése és jól láthatóan strukturált
felépítése, amely nem csupán funkcionális anatómiai, de esztétikai szempontból is
csodálatra méltó. Az utóbbi időben ugrásszerűen fejlődő funkcionális és elektrofiziológiai
vizsgálatoknak köszönhetően a hippokampusz működéséről és kognitív folyamatokban
22
betöltött szerepéről is egyre többet tudunk meg. Annyira központi tárgya volt a XX. és
XXI. század idegtudományának a hippokampusz, hogy 2014-ben az orvosi és
élettudományi Nobel-díjat is ennek az agyterületnek a vizsgálatáért adományozták.
Disszertációm következő fejezeteiben a hippokampusz működésével kapcsolatos
ismereteinket szeretném nagyon röviden összefoglalni, és bemutatni az ezeknek a
funkcióknak a megvalósítását lehetővé tevő anatómiai felépítést.
IV.2.1. A hippokampális működés modelljei – szerepe a deklaratív memóriában
A hippokampuszt és a hozzá tartozó temporális lebenyi struktúrákat már egészen
korán kapcsolatba hozták a tanulás és memória egyes fajtáival. Ehhez az egyik
legnagyobb segítséget egy H.M. nevű beteg egész életen át tartó vizsgálata adta, akinek
súlyos, a korabeli kezelésekre nem reagáló epilepsziás rohamai miatt 27 éves korában
eltávolították mindkét oldali temporális lebenyét. Ennek a műtétnek a hatására H.M. élete
végéig anterográd amnéziában szenvedett, nem volt képes megjegyezni élete egyetlen
olyan eseményét sem, amely a műtét után történt vele, és agya nem tudott új adatokat sem
elraktározni. Ennek ellenére képes volt új mozgásminták elsajátítására, bár soha nem
emlékezett arra, hogy valaha tanulta volna azokat. Ezek a megfigyelések arra utalnak,
hogy a hippokampusz az úgynevezett deklaratív memóriafolyamatokban tölt be alapvető
szerepet.
A deklaratív vagy explicit memória olyan emlékek rögzítését jelenti, melyek
tudatosan, szándékosan előhívhatók. A deklaratív memóriafolyamatoknak két típusát
különböztetjük meg: a szemantikus memóriát, mely egyes adatok, tények megjegyzését
teszi lehetővé (például az ember születési helye, tárgyak nevei, különböző fogalmak,
stb.), valamint az epizodikus memóriát, amely az ember életében történt eseményeket és
a hozzájuk tartozó körülményeket rögzíti (Eichenbaum 2001, Szirmai és mtsai 2011). A
hippokampusz szerepe mind az epizodikus, mind a szemantikus memóriafolyamatokban
elengedhetetlen. Mivel fogalmainkat a velünk történt eseményeken keresztül alkotjuk
meg, nem meglepő, hogy az amnéziában szenvedő embereknél nem csak az új események
megjegyzése, hanem például új szavak jelentésének elmagyarázása is zavart szenved
(Eichenbaum, 2001).
23
A hippokampusz szerepe a deklaratív memóriában Eichenbaum elmélete szerint
három pontban foglalható össze. Először is a hippokampuszban jönnek létre az
epizodikus memóriához tartozó emléknyomok. Másodszor, a hippokampusz megtalálja
az epizodikus emléknyomok közötti közös elemeket. Végül a hippokampuszban jönnek
létre az epizodikus emléknyomok közötti asszociációk, ami egy „emléktér”
kialakulásához vezet. Ez az emléktér adja meg azt a keretet, amelyhez aztán a többi emlék
is kapcsolódik (Eichenbaum, 2001).
A hippokampusz azonban az epizodikus emléknyomok létrejöttének csak egy
szakaszában vesz részt. A munkamemóriában, mely az éppen beérkező információk
átmeneti tárolására szolgál, vagy a hosszútávú memóriába már bekerült régi emlékek
felidézésében a hippokampusznak nincs szerepe: ezek a funkciók az amnéziás betegekben
is megtartottak (Eichenbaum, 2001; Szirmai, 2005). A hippokampusz tehát a beérkező,
egy modalitású szenzoros információkból azok közös elemeit felismerve, közöttük
asszociációkat létrehozva, egy komplex, feldolgozott, a többi emléknyomba beágyazott
kontextust hoz létre (Lovett-Barron és mtsai 2014).
IV.2.2. A hippokampális működés modelljei – szerepe a térbeli memória
folyamataiban
A hippokampális funkciók feltárásának hatalmas lökést adott az úgynevezett
„helysejtek” felfedezése, amelyekkel kapcsolatos vizsgálatokat a 2014-es évben Nobel-
díjjal is honorálták (O’Keefe és Dostrovsky 1971). Ezeknek a sejteknek a jelenlétét több
különböző fajban, így rágcsálókban, denevérekben és főemlősökben is kimutatták
(O’Keefe és Conway 1978; Rubin és mtsai 2014; Wirth és mtsai 2017). A hippokampális
helysejtek a tér bizonyos kitüntetett pontjain megnövelik tüzelésük frekvenciáját, ezzel
kódolva az adott helyre vonatkozó információt. Az egyes hippokampális helysejtek tehát
egy térképet hoznak létre az élőlény környezetéről, amelyben minden pontnak
megfelelően egy helysejt-populáció tüzelése fokozódik (Dragoi és Buzsáki 2006).
A hippokampusz azonban nem önmagában vesz részt a kognitív térkép
létrehozásában. A hippokampusz egyik legfontosabb be- és kimeneti kapcsolódási
pontjában, az entorhinális kéregben, leírtak olyan sejteket, amelyek a helysejtek térbeli
kódolásához szükséges egyfajta skálaként egy hálót hoznak létre. Ebben a hálóban az
24
úgynevezett „hálósejtek” egyenlő oldalú háromszögek csúcsaiban fokozzák tüzelési
frekvenciájukat. Ezeknek a háromszögeknek a mérete és orientációja egyforma, azonban
egymáshoz képest el vannak csúsztatva, így alkalmasak a teljes tér lefedésére,
folytonossági hiány nélkül (Hafting és mtsai 2005). Az entorhinális kéreg hálósejtjeiből
származó információ eléri a hippokampusz helysejtjeit, így segítve a kognitív térkép
létrehozását (de Almeida és mtsai 2012).
Ez a hippokampális térkép, azon túl, hogy lehetővé teszi a térbeli tájékozódást,
megteremti annak a lehetőségét, hogy a beérkező információk a térkép megfelelő
pontjaihoz asszociálódjanak, így térben elhelyezhetőek legyenek. A térbeli
memórianyomok tehát a deklaratív memóriafunkciók részeként beépülnek a
hippokampusz által létrehozott emléktérbe, és ott kapcsolódási pontként szolgálnak a
többi emléknyom számára (Eichenbaum, 1999, 2001).
Éppen ezért a hippokampusznak alapvető szerepe van az olyan viselkedésminták
létrehozásában, mint a kontextuális félelmi reakció, ahol az állatot egy adott környezetben
negatív inger (enyhe elektrosokk) éri. Az ingerrel kapcsolatos térbeli és szenzoros
információkat megjegyezve, ha az állat ugyanabba a környezetbe kerül, jellemző félelmi
viselkedési reakciókat mutat (Fanselow, 2000; LeDoux, 2000). Ez utóbbi félelmi reakció
kialakításában a fent bemutatott módon a MRR-nak is fontos szerep jut.
IV.2.3. A hippokampális formáció anatómiája
A hippokampális formáció az idegtudósok által leginkább tanulmányozott agyi
struktúrák egyike, melynek felépítését már Ramón y Cajal is leírta. Itt csak nagyon
röviden szeretném bemutatni ennek a limbikus rendszeri területnek a felépítését, és
elemeinek egymással való főbb kapcsolatait. A lenti leírás alapját Andersen és
munkatársai 2007-es szakkönyve adja ahol a specifikus hivatkozások megtalálhatóak, így
a hippokampusz felépítésével kapcsolatban további hivatkozásokat nem adok meg.
A hippokampális formáció részeinek a különböző szerzők más-más agyi
struktúrákat tekintenek, azonban abban egyetértenek a leírások, hogy az entorhinális
kéreg, a gyrus dentatus, a hippokampusz ammon-szarvai (CA1-3), és a subiculum
alkotják ennek a temporális kérgi területnek a központi részeit. A gyrus dentatust és az
ammonszarvakat együtt szokták hippokampusznak is nevezni, és disszertációmban én is
25
ezt a nevezéktant követem. Ezeknek a területeknek a glutamaterg sejtjei egymással egy
döntően egyirányú kapcsolatrendszerrel vannak összekötve. Ebben a
kapcsolatrendszerben a kiindulási pont az entorhinális kéreg, mely a többi kérgi
struktúrából származó különböző szenzoros információkat begyűjti. Az entorhinális
kéreg II-III rétegében található piramissejtek axonjaikat két pályán keresztül küldik a
hippokampuszba: a perforáns pályán keresztül megcélozzák a gyrus dentatus
szemcsesejtjeit, míg a temporoammonikus pályán keresztül közvetlenül a CA1-be küldik
rostjaikat. A gyrus dentatus szemcsesejtjei az általuk létrehozott moharostokon keresztül
érik el a CA3 piramissejtjeit. A CA3 piramissejtjei végül a Schaffer-kollaterálisoknak
nevezett axonjaikkal küldenek információt a CA1-es piramissejtek dendritjeire. A CA1
alkotja a hippokampusz fő kimenetét: a CA1-ben található piramissejtek kizárólag a
subiculumba, valamint az entorhinális kéreg V. rétegébe vetítenek. A subiculum sejtjeiből
származó információ szintén eléri az entorhinális kéreg V. rétegének sejtjeit; ezek a sejtek
a többi kérgi struktúra felé közvetítik a hippokampuszban feldolgozott információt. Az
entorhinális kéreg-gyrus dentatus-CA3-CA1 régiók közötti közvetlen kapcsolatok
alkotják az úgynevezett három szinapszisos hurkot, mely a hippokampusz
információfeldolgozásának alapszerkezetét adja (3. ábra).
A hippokampális formáció az agyban ívelten helyezkedik el, melynek egyik
pólusa dorzomediálisan, a szeptális magokhoz közel, másik pólusa pedig
ventrolaterálisan, a temporális kéregben található. A subiculum, és a hozzá tartozó
területek a szeptotemporális tengely egyharmadánál jelennek meg; az entorhinális kéreg
ezekhez a struktúrákhoz képest még kaudálisabban helyezkedik el. A subiculum és az
entorhinális kéreg között helyezkedik el az anguláris köteg, amely az entorhinális kéreg
és a hippokampális formáció többi része közötti információt közvetítő axonokat gyűjti
össze. A szeptális pólus előtt helyezkedik el a hippokampális formációt a többi
agyterülettel összekötő axonköteg, a fimbria, mely anterior irányban a fornixban
folytatódik a corpus callosum alatt, a középvonalban. A kétoldali hippokampuszokat a
kommisszurális rostok kötik össze egymással.
26
3. ábra: A hippokampusz fő serkentő sejttípusai és kapcsolataik: a fenti ábra a
hippokampuszról készített első rajzolt ábrák egyike, Santiago Ramón y Cajal, a neves
spanyol neuroanatómus Golgi-festéssel készült munkája alapján. A Golgi-festéssel
megjelölt sejteket és dendritjeiket feketével ábrázolta, a hippokampális formáció
különböző részeiben (a részleteket lásd a szövegben). A sejtekből eredő axonok által
létrehozott pályák is felismerhetők. Az oldalsó, kis téglalapban a hippokampális
információáramlás stilizált ábrája látható. Rövidítések: CA1: cornu ammonis 1, CA3:
cornu ammonis 3, DG: gyrus dentatus, EC: entorhinális kéreg, Sub: subiculum. A kép
forrása: Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des Vertebretes, Ramón y Cajal
1909. Engedéllyel módosítva és felhasználva.
Az entorhinális kéreg egy neokortikális struktúra, a kéreg általános felépítését
mutatva 6 rétegből épül fel, melyekben különböző sejttípusok találhatóak. A gyrus
dentatus felépítése ezzel szemben jóval egyszerűbb: fő be- és kimeneti szemcsesejtjei egy
sejtrétegbe rendeződnek, a stratum granulosumba, mely V-alakban meghajlított: a V-betű
felső, CA1 és CA3 között elhelyezkedő szára a szuprapiramidális él, a CA3 alatti alsó
szár pedig az infrapiramidális él. Az ammonszarvak piramissejtjei szintén egy rétegben
27
találhatók, a stratum pyramidaléban, mely a CA1-3 régiókon keresztül megtartott. Az
egyes CA-régiók közötti határokat a piramissejtek morfológiai tulajdonságai alapján lehet
meghatározni: A CA3 és CA2-es piramissejtek nagyobbak, mint a CA1 piramissejtjei,
viszont csak a CA3 piramissejtjei kapnak a gyrus dentatus szemcsesejtjeinek
moharostjaitól bemenetet a stratum lucidum rétegében. A gyrus dentatus és az
ammonszarvak között helyezkedik el a hippokampális hasadék, amely egyúttal a
hippokampusz mély és felszíni sejtrétegeinek egymáshoz képesti meghatározásának is
referenciapontja. A hippokampusz ugyanis az egyedfejlődés során megtekeredik, így az
eredetileg a felszínen található hippokampális hasadék a mélybe kerül: így a
hippokampális hasadékhoz közelebbi rétegek jobban a felszínen elhelyezkedőnek
tekintendőek az attól távolabbi, mély rétegekhez képest. Így fordulhat elő, hogy a
hippokampusz legkülső rétegét képző, a piramissejtek és a fimbria ki- és bemenő rostjait
tartalmazó alveus egyúttal a legmélyebb réteg is. Ez alatt helyezkedik el a piramissejtek
bazális dendritjeit tartalmazó stratum oriens. Az ezt követő stratum pyramidale alatt
található a piramissejtek apikális dendritjeit tartalmazó stratum radiatum; a CA3-ban a
piramissejtek dendritjein lévő tüskés kinövések és az azokra a szemcsesejtek
moharostjaitól érkező bemenetek a stratum lucidumban találhatók meg. Végül az apikális
dendritek legvékonyabb ágait tartalmazó stratum lacunosum-moleculare következik,
legközelebb a hippokampális hasadékhoz, leginkább a felszínen. A hippokampális
hasadék alatti gyrus dentatusban szintén a felszínhez közel helyezkednek el a
szemcsesejtek dendritjei, melyek a stratum molecularét alkotják. A stratum granulosumba
rendeződött szemcsesejtek V-alakú élei között helyezkedik el a polimorf réteg, a gyrus
dentatus hilusa, mely interneuronokat, mohasejteket és a szemcsesejtek moharostjait
tartalmazza (4. ábra).
A különböző CA-régiókban található piramissejtek hippokampális formáción
belüli kapcsolatrendszere egymástól jelentősen eltér: A CA3 piramissejtjei bemenetet
kapnak a gyrus dentatus moharostjaitól. Kimeneteik a CA1-be tartó Schaffer
kollaterálisok mellett kommiszurális-asszociációs rostokat is képeznek, melyekkel az
ellenoldali, illetve azonos oldali CA3 piramissejtekkel létesítenek kapcsolatokat. A CA1-
es piramissejtek ezzel szemben a temporo-ammonikus pályán keresztül az entorhinális
kéregből közvetlenül is kapnak bemenetet, de csak kevéssé vannak egymással
összekötve.
28
A hippokampális formáció fő sejtjeinek tüzelését azonban több helyi gátlósejt is
szabályozza; a következő fejezetben ezeknek az interneuronoknak a tulajdonságait
szeretném áttekinteni.
4. ábra: A hippokampuszformáció rétegei: A: Nissl-festéssel készült horizontális metszet
a patkány hippokampuszformációról. B: Az A ábrán bemutatott hippokampusz stilizált
rajza. Rövidítések: ab: anguláris köteg, al: alveus, CA1-3: cornu ammonis 1-3, DG:
gyrus dentatus, EC: entorhinális kéreg, fi: fimbria, gcl: stratum granulosum, hf:
hippokampális hasadék, ml: stratum moleculare, Para: parasubiculum, pcl: stratum
pyramidale, Pre: presubiculum, pl: hilus, sl: stratum lucidum, sl-m: stratum lacunosum-
moleculare, so: stratum oriens, sr: stratum radiatum, Sub: subiculum. A római számok a
EC, Para és Pre területek rétegeit mutatják. Lépték: 500 μm. A kép forrása: The
Hippocampus Book, Andersen 2007. Engedéllyel módosítva és felhasználva.
IV.2.4. A hippokampuszban található interneuronok
Mivel vizsgálataink során a hippokampális formáción belül csak a
hippokampusszal foglalkoztunk, ebben a fejezetben csupán ennek a régiónak az
interneuronjairól szeretnék egy rövid összefoglalót adni.
A hippokampuszban található interneuronok közös tulajdonsága, hogy GABAerg
ingerületátvitel segítségével gátolják a piramissejteket, és szabályozzák azok működését
térben és időben. Jelenleg legalább 21 különböző típusú interneuront tudunk
megkülönböztetni a hippokampuszban (5. ábra); ezekről több kiváló összefoglaló munka
is elérhető (Bezaire és Soltesz 2013; Freund és Buzsáki 1996; Klausberger és Somogyi
29
2008). A következőkben az egyes interneuronoknak a piramissejtek szomatodendritikus
tengelyén létrehozott kapcsolatai alapján sorolom be a sejteket.
a. A piramissejtek szomatodendritikus régióját célzó interneuronok
Két fő típusuk különböztethető meg: a kosársejtek a piramissejtek sejttestjét és
proximális dendritjeit idegzik be, a kandelábersejtek pedig a piramissejtek axondombjára
adnak gátló szinapszisokat.
A kosársejtek sejttestjei többnyire a stratum pyramidaléhoz közel helyezkednek
el; dendritjeik minden rétegben megtalálhatók, axonjaik a stratum pyramidalét célozzák,
ahol a nevüket is adó kosárszerű terminálisokkal veszik körbe a piramissejteket. Egy
kosársejt akár 10 000 kapcsolatot is létrehozhat, egy piramissejten 8-11darabot, így egy
kosársejt akár 1000 piramissejtet is gátolhat egyidejűleg (Bezaire & Soltesz 2013; Miles
és mtsai. 1996). Neurokémiai tulajdonságaik szerint két típusukat különböztetjük meg: a
parvalbumin-pozitív és a kolecisztokinin-pozitív kosársejteket, melyeknek teljesen eltérő
szerepe van a hippokampális aktivitás szabályozásában (Freund 2003; Freund és Katona
2007). Ez utóbbi sejtek legnagyobb része vGluT3-mat is kifejez sejttestjében és
terminálisaiban (Somogyi és mtsai 2004).
A kandeláber- vagy axo-axonikus sejtek sejttestjei, hasonlóan a kosársejtekhez, a
stratum pyramidale közelében találhatók, dendritjeik is minden rétegben megtalálhatók.
Axonjaikkal akár 1200 piramissejtet is beidegezhetnek, átlag 6 szinaptikus kapcsolatot
létrehozva azok axondombján (Bezaire & Soltesz 2013; Li és mtsai. 1992; Somogyi és
mtsai. 1985).
b. A piramissejtek dendritjeit célzó interneuronok
Elsőként tárgyalt típusuk az úgy nevezett oriens-lacunosum moleculare (OLM)
sejt, mely onnan kapta nevét, hogy sejttestje és dendritjei a stratum oriensben találhatóak,
míg axonjaival a piramissejtek legtávolabbi dendritjeit idegzi be a stratum lacunosum-
molecularéban. Fő serkentő bemenetüket a piramissejtek által adott kollaterálisok adják;
rajtuk keresztül a piramissejteken létrejön egy negatív visszacsatoló gátló kör, melynek
fontos szerepe van a hippokampális piramissejtek aktivitásának szabályozásában (Blasco-
Ibáñez és Freund 1995; Klausberger és mtsai 2003).
30
A stratum radiatumban és lacunosum-molecularéban interneuronok több altípusa
is található, melyek sejttestjei ugyan szétszórtan helyezkednek el, de dendritjeik az egyes
rétegekbe lokalizáltak, axonjaikkal pedig a piramissejtek különböző dendritszakaszait
célozzák meg (Lacaille és Schwartzkroin 1988a; Lacaille és Schwartzkroin 1988b; Vida
és mtsai 1998). Ezekben a sejtekben több különböző neurokémiai markert is
azonosítottak, mint a vGluT3, a neuronális nitrogén monoxid szintáz, calbindin,
calretinin, neuropeptid Y, stb. Részletesebb leírásukat több munka is összefoglalja (pl.
Freund és Buzsáki 1996).
c. Interneuron-specifikus interneuronok
Három típusukat különböztetjük meg, melyek sejttestje és dendritjei különböző
rétegekben helyezkednek el, de jellemző közös tulajdonságuk, hogy célzottan bizonyos
interneuronokkal létesítenek szinaptikus kapcsolatokat. Ezek a sejtek jellemzően
calretinint vagy vazoaktív intesztinális peptidet fejeznek ki, bemenetük jelentős része
kéreg alatti magokból ered (Acsády és mtsai 1996; Gulyás és mtsai 1996; Papp és mtsai
1999). Az interneuron-specifikus sejteknek fontos szerepe lehet nagy számú
hippokampális piramissejt egyszerre történő szabályozásában, hasonlóan a neokortexben
nemrégiben leírt működésükhöz (Ayzenshtat és mtsai 2016; Muñoz és mtsai 2017; Pi és
mtsai 2013).
d. Vetítő interneuronok
Ezeknek a sejteknek is több típusát különböztetjük meg, sejttestjeik legnagyobb
része a stratum oriensben található, de más rétegekben is gyakoriak, dendritjeik minden
réteget átérnek (Gulyás és mtsai 2003; Jinno és Kosaka 2002; Jinno és mtsai 2007; Katona
és mtsai 2017; Takács és mtsai 2008). Ezek a sejtek jellemzően szomatosztatint vagy a
muszkarinos acetilkolinreceptor 2-es típusát fejezik ki (Hájos és mtsai 1997; Jinno és
mtsai 2007; Katona és mtsai 2017); axonjaikkal a mediális szeptumba, a szubikulumba
és az entorhinális kéregbe, valamint egyes sejtek esetében – a hippokampuszban történő
fő információáramlással ellentétesen – a gyrus dentatusba vetítenek (Gulyás és mtsai
2003; Jinno és mtsai 2007; Katona és mtsai 2017; Melzer és mtsai 2012; Takács és mtsai
2008). Ezeknek a sejteknek fontos szerepe lehet a mediális szeptumban és a
31
hippokampális formációban az információfeldolgozás és a hálózati aktivitás
szabályozásában (Katona és mtsai. 2017; Manseau és mtsai. 2008; Mattis és mtsai. 2014).
5. ábra: A hippokampusz interneuronjai: a hippokampusz CA1-es régióban található
piramissejtjeit (kék sejtek) legalább 21 különböző típusba sorolható interneuron idegzi
be. A hippokampusz főbb glutamaterg bemenetei bal oldalt vannak jelölve. A
piramissejtek szomatikus régióját beidegző interneuronokat narancssárgával, a
dendritikus gátlósejteket, melyek egy része távoli projekciókat is ad, pirossal, az
interneuronokat beidegző interneuronokat rózsaszínnel jelöltük. A lila nyilak jelzik a
projekciós axonok célpontját. Rövidítések: CB: calbindin, CCK: kolecisztokinin, OLM:
oriens-lacunosum moleculare sejt, vGluT3: 3-mas típusú vezikuláris glutamát
transzporter, VIP: vazoaktív intesztinális polipeptid. A kép forrása: Neuronal Diversity
and Temporal Dynamics: The Unity of Hippocampal Circuit Operations, Klausberger és
Somogyi 2008. Engedéllyel módosítva és felhasználva.
32
IV.2.5. A hippokampális hálózati aktivitás mintázatok rövid összefoglalása
A hippokampusz anatómiai viszonyai és hálózati kapcsoltsága teszi lehetővé
azoknak a hálózati aktivitás mintázatoknak a létrejöttét, melyek hippokampális rendszer
funkcióinak betöltéséhez szükségesek. Ezeket a mintázatokat a kutatók már a legkorábbi
vizsgálatok során is megfigyelték, és azóta rendkívüli tudásanyag gyűlt össze róluk,
melyeket több összefoglaló munka is bemutat (pl. Colgin 2016; Vertes & Kocsis 1997).
Itt csak rendkívül röviden szeretném összefoglalni a hippokampális hálózatban megjelenő
főbb elektromos aktivitási mintázatokat.
A hippokampuszban alapvetően két fő aktivitás mintázat figyelhető meg, melyek
kölcsönösen kizárják egymást, és más viselkedési jelenségek alatt is figyelhetőek meg: a
lassú hullámú, szinkron aktivitás melyet theta-oszcillációnak neveznek, illetve a nagy
irreguláris aktivitás, melyben időnként éleshullám-aktivitás figyelhető meg. Ezeket a
jellemző aktivitásmintázatokat több fajban is leírták a rágcsálóktól a főemlősökön át az
emberig (Bland és Oddie 1998; Colgin 2016).
A theta-ritmus az állat aktív viselkedése során megjelenő, 4-12 Hz frekvenciájú,
1-2 mV amplitúdójú, a hippokampális piramissejtek szinkron működését tükröző hálózati
aktivitás. Akkor figyelhető meg, ha az állat valamilyen szenzoros bemenetet kap, aktívan
felfedezi a környezetét, mozog, vagy REM-fázisú alvásban van (Colgin 2016; Vertes és
Kocsis 1997). A theta-oszcillációk létrehozásában a mediális szeptum, az entorhinális
kéreg és a lokális hippokampális interneuronok alapvető szerepet játszanak. Ezeknek az
elemeknek a pontos szerepét a hippokampuszban jelenleg is sokan vizsgálják, és több
kiváló összefoglaló is elérhető ezekről a kísérletekről (pl. Colgin 2016). A theta-
oszcillációknak alapvető szerepet tulajdonítanak a hippokampusz „online” működésében:
a szenzoros bemenetek feldolgozásában, az ezek közötti asszociációk létrehozásában, új
emléknyomok felvételében.
Ezzel szemben az élőlény nyugalmi állapotában, táplálkozás közben, vagy lassú
hullámú alvásakor a hippokampuszban nagy amplitúdójú, 2-25 Hz frekvenciájú
irreguláris aktivitás figyelhető meg (Bland és Oddie 1998; Dragoi és mtsai 1999).
Ezekben időnként a hippokampális piramissejtek nagy frekvenciájú (>200Hz), de rövid
33
ideig tartó szinkron kisülései, az éles-hullámok is megjelennek. Ez utóbbiak
létrehozásában a hippokampális hálózat belső felépítéséből következő kapcsolatokat
tartják főszereplőnek (Colgin 2016; Schlingloff és mtsai. 2014). A hippokampális éles-
hullámok a már felvett emléknyomok rögzítésében, a már megszerzett emlékek
előhívásában játszhatnak alapvető szerepet.
IV.3 A mediális szeptum funkcionális anatómiájának rövid összefoglalása
A mediális szeptum a hippokampusszal talán legszorosabban együttműködő
bazális előagyi struktúra. Szerepét a hippokampális hálózati aktivitás szabályozásában és
ezen keresztül a különböző hippokampális funkciókban, memóriafolyamatokban már
régóta vizsgálják, és az idegtudomány utóbbi időben bekövetkezett robbanásszerű
technikai fejlődésének köszönhetően már a mediális szeptum különböző sejtpopulációi is
külön-külön vizsgálhatóvá váltak. A következőkben a mediális szeptális terület
működéséről, viselkedésben betöltött szerepéről és anatómiájáról szerzett
ismeretekeinket szeretném bemutatni.
IV.3.1. A mediális szeptum viselkedésben betöltött szerepe
Már a MS első funkcionális vizsgálatai során is előtérbe került annak
hippokampusszal való szoros kapcsolata (Bird és Aghajanian 1975; Clody és Carlton
1969; Hagan és mtsai 1988). Így nem meglepő, hogy a MS-ot összefüggésbe hozták a
különböző tanulási és memóriafolyamatokkal, beleértve a tájékozódást és térbeli
memóriát (Brioni és mtsai 1990; Elvander-Tottie és mtsai 2009; Hagan és mtsai 1988;
Kelsey és Landry 1988), a térbeli munkamemóriát (Ma és mtsai 2009; Nategh és mtsai
2015) és a tárgyak felismerését (Cai és mtsai 2012; Gangadharan és mtsai 2016). A MS
léziója akár elektromos, akár kémiai úton a fenti memóriafolyamatok hibás működéséhez
vezetett (Hagan és mtsai 1988; Kelsey és Landry 1988; Lehmann és mtsai 2003; Pang és
Nocera 1999). Hasonló hatást váltott ki a lokális GABAerg tónus fokozása GABAA
receptor agonista muszcimol intraszeptális injektálásával is (Brioni és mtsai 1990). A
mediális szeptumban található acetilkolin-tartalmú sejtek pusztulása az Alzheimer-kór
egyik legkorábbi és legjellemzőbb tünete, amely szintén az epizodikus és a térbeli
34
memóriafolyamatok károsodásával jár együtt (Colom 2006; Kesner és mtsai 1989). A MS
és a hippokampusz közötti kapcsolat a fornix-fimbria kötegen keresztül valósul meg;
ennek a struktúrának az átvágása szintén súlyos, memóriafolyamatokat érintő tünetekkel
jár, mely hatásokat rágcsálókban és főemlősökben is megfigyeltek (Gaffan és Gaffan
1991; Mumby 2001; Murray és mtsai 1989; van der Staay és mtsai 1989). Továbbá a MS-
ot összefüggésbe hozták különböző érzelmi reakciókkal is, beleértve a szorongást és a
kontextuális félelmi reakciót, melyek szintén a hippokampusszal közös működésre
utalnak (Degroot és Treit 2003; Knox és Keller 2016; Lovett-Barron és mtsai 2014;
Menard és Treit 1996).
A legfrissebb vizsgálatok a MS-ban újabb sejtcsoportokat tártak fel, illetve a MS
különböző típusú sejtjeinek szelektív megjelölésével, és aktivitásuk módosításával sokkal
célzottabban adtak információt ennek a struktúrának a pontos működéséről. A
következőkben a MS anatómiáját és különböző populációkba tartozó sejtjeinek az előagyi
aktivitás mintázatokra vonatkozó hatását szeretném röviden bemutatni.
IV.3.2. A mediális szeptum anatómiai viszonyai és sejtes felépítése
A MS a szeptális magok közé tartozó bazális előagyi terület, mely magok a
középvonalban, a két oldalkamra mediális falában helyezkednek el. A szeptális magok
közé rágcsálókban 4 nagyobb magcsoport tartozik: a ventrális, a poszterior, a laterális és
a mediális magcsoportok (Paxinos, 2004), mely utóbbi része a mediális szeptum és a
Broca-féle diagonális köteg (6. ábra). Rosztrálian és dorzálisan a corpus callosum,
laterálisan az agykamrák és a nucleus accumbens, kaudálisan a fornix határolja. A MS-
on több fő pályarendszer is áthalad, beleértve a mediális előagyi köteget, a commissura
anteriort és a fornixot, melyeken keresztül az agytörzsi és előagyi struktúrákkal, illetve a
hippokampusszal áll összeköttetésben (Paxinos 2004; Unal és mtsai 2015).
35
6. ábra: A mediális szeptális terület az
előagyban, az oldalkamrák között
helyezkedik el, mint ahogy az a fenti
koronális metszeten is látható. A
szeptum kolinerg sejtjeit fluoreszcens
immun-hisztokémiai eljárás
segítségével jelöltük meg (piros sejtek).
Rövidítések: HDB: Broca-féle
diagonális köteg, horizontális szár,
MS: mediális szeptum, VDB: Broca-
féle diagonális köteg, vertikális szár.
A MS-ban eddig 4 különböző sejtpopulációt írtak le:
- kolinerg sejteket, melyek felismerhetők kolin-acetiltranszferáz-
pozitivitásukról és lassú tüzelésükről (Sotty és mtsai 2003; Vandecasteele és mtsai 2014).
Ezek a sejtek vékony rostokat küldenek a hippokampuszba, melyekkel interneuronokat
és piramissejteket is megcéloznak (Freund és Antal 1988; Kiss és mtsai 1990; Nyakas és
mtsai 1987). Kutatócsoportunk nemrégiben kimutatta, hogy a korábban gondoltakkal
ellentétben ezek a rostok a hippokampuszban – és más agyterületeken is – neuroligin 2
(NL2)-tartalmú szinaptikus kapcsolatokat hoznak létre, melyek a klasszikus besorolás
szerinti aszimmetrikus-szimmetrikus szinapszisok csoportjaiba nem illeszkednek
(Aznavour és mtsai 2005; Takács és mtsai 2013; Umbriaco és mtsai 1995). Bernardo
Sabatini munkacsoportjának legutóbbi vizsgálatai azt feltételezik, hogy egyes bazális
36
előagyi kolinerg sejtek GABA ürítésére is képesek az agykéregben, bár ezeket a
vizsgálatokat a MS és hippokampusz viszonyában még nem végezték el (Granger és mtsai
2016; Saunders és mtsai 2015).
- parvalbumin-pozitív GABAerg sejteket, melyek vagy gyorsan vagy
csomagokban tüzelnek (Manseau és mtsai 2008; Sotty és mtsai 2003). Ezek a sejtek
vastag rostjaikkal és jól elkülönült terminálisaikkal célzottan interneuronokat idegeznek
be a hippokampuszban (Borhegyi 2004; Freund és Antal 1988; Hangya és mtsai 2009).
- a vezikuláris glutamát transzporter 2-es típusát (vGluT2) kifejező
glutamaterg sejteket, melyeket nemrégiben fedeztek fel, és a szeptohippokampális pálya
mintegy negyedét alkotják rostjaikkal (Huh és mtsai 2010; Sotty és mtsai 2003). Ezek a
sejtek kifejezetten a stratum oriens interneuronjait célozzák meg serkentő
szinapszisaikkal, de az entorhinális kéregbe is vetítenek, ahol többnyire piramissejteket
céloznak meg (Fuhrmann és mtsai 2015; Justus és mtsai 2016; Robinson és mtsai 2016).
- calbindin-pozitív GABAerg sejteket, melyek főként lokális
kollaterálisokat adnak, de a legutóbbi tanulmányok szerint az entorhinális kéregbe is
vetítenek (Aznar és mtsai 2004; Fuchs és mtsai 2016; Kiss és mtsai 1997).
A fenti sejttípusok mindegyike alakítja valamilyen módon a szeptohippokampális
hálózati aktivitás különböző formáit: az aktív felfedező viselkedés és REM-alvás közben
megjelenő theta-oszcillációkat vagy a nyugalmi állapotban előforduló éleshullám-
aktivitást. A következőkben a MS ezekre az aktivitás mintázatokra való hatását szeretném
összefoglalni.
IV.3.3. A mediális szeptum hatása az előagyi aktivitás mintázatokra
A MS különböző sejttípusai eltérő módon hatnak az előagyban megjelenő hálózati
oszcillációkra. Az utóbbi években lehetővé vált a MS-ban található sejtcsoportok
szelektív ingerlése vagy gátlása optogenetikai módszerek segítségével, mely
tanulmányoknak köszönhetően sokkal részletgazdagabb képet kaptunk a MS
működéséről.
A MS kolinerg sejtjeinek theta-ritmust elősegítő hatását eleinte a muszkarinos
acetilkolinreceptor-agonista karbakol vagy antagonista atropin hippokampuszba való
injektálásával írták le: karbakol hatására theta-ritmus indukálódott a hippokampuszban,
37
és ezt az atropin képes volt kivédeni (Colom és Bland 1991; Konopacki és mtsai 1987;
Manseau és mtsai 2008). Később a MS kolinerg sejtjeinek szelektív optogenetikai
ingerlése szabadon mozgó patkányokban ezeket a megfigyeléseket tovább erősítette
(Vandecasteele és mtsai 2014). A MS-ban található kolinerg sejtek szelektív léziója 192-
IgG-saporinnal jelentősen csökkentette a hippokampális theta-ritmus erősségét, ezzel
együtt az állatok képességét a tárgyak helyzetének azonosítására (Lee és mtsai 1994; Cai
és mtsai 2012). A kolinerg sejtek szelektív léziója azonban nem volt hatással a theta-
ritmus domináns frekvenciájára (Bassant és mtsai 1995; Lee és mtsai 1994), ami arra utal,
hogy nem a kolinerg sejtek felelősek elsődlegesen a hippokampális theta ritmusának
generálásáért.
A MS kolinerg sejtjeinek a hippokampális éleshullám-aktivitásra még
erőteljesebb hatása van: szabadon mozgó, nyugalmi állapotban lévő patkányban a
kolinerg sejtek ingerlésének hatására az éleshullám-aktivitás szinte teljesen megszűnt
(Vandecasteele és mtsai 2014). Ugyanekkor a theta-aktivitás erőssége jelentősen
fokozódott, ami további bizonyíték a theta és az éleshullám-aktivitás eltérő hálózati
állapotban való megjelenése mellett, és hogy a kolinerg sejtek elősegítik a hálózat theta-
oszcillációba való átsegítését (Kvirkvelia és mtsai 1987).
A MS parvalbumin-pozitív sejtjei a hippokampális theta-oszcillációk más
modalitásait befolyásolják. Ezeknek a sejteknek a szelektív optogenetikai ingerlése
uretánnal altatott egerekben nem segítette elő a theta-ritmusba való átmenetet, de ha az
állat hippokampuszából theta-ritmust lehetett elvezetni, ugyanez az ingerlés fokozta a
theta-ritmus erősségét. A parvalbumin-pozitív sejtek szelektív optogenetikai gátlása
csökkentette a hippokampális theta-ritmus erősségét (Gangadharan és mtsai 2016).
Ezeket a megfigyeléseket további elektrofiziológiai vizsgálatok is megerősítik, melyek
azt mutatják, hogy a MS és a diagonális köteg parvalbumin-pozitív sejtjei azok, amelyek
a theta-ritmus generálásáért felelősek, aktivitásuk megelőzi a hippokampális
interneuronok és piramissejtek aktiválódását, tüzelésük fáziskapcsolt a hippokampális
theta-oszcillációkkal (Borhegyi 2004; Hangya és mtsai 2009; Kaifosh és mtsai 2013).
Ritmusgeneráló szerepüket tovább bizonyítja, hogy működőképes HCN-csatornákat
fejeznek ki (Morris és mtsai 2004; Varga és mtsai 2008). Továbbá a MS vezikuláris
GABA transzportert kifejező sejtjeinek REM-fázisú alvás alatti gátlása jelentősen
csökkentette az erre az alvási fázisra jellemző theta-ritmus erősségét, és az előző napon
38
szerzett emlékek megjegyzését is (Boyce és mtsai 2016). Ez utóbbi felfedezés azonban a
kolinerg sejtekben esetleg jelenlévő GABAerg neurotranszmisszió és a MS-ban található
calbindin-pozitív GABAerg sejtekre való hatás miatt nem tekinthető teljesen szelektívnek
a parvalbumin-pozitív sejtekre.
A MS parvalbumin-pozitív sejtjeinek egy része a hippokampális éleshullám-
aktivitás alatt fokozott tüzelést mutat (Viney és mtsai 2013). Ennek magyarázata az lehet,
hogy a hippokampális éleshullám-események elindításában és fenntartásában nagy
szerepe van a CA3-ban található piramissejtek lokális kollaterálisainak, melyek gyors
glutamaterg serkentéssel segítik fenntartani egymás fokozott aktivitását (Schlingloff és
mtsai 2014). A piramissejtek kimenetét gátló axoaxonikus sejtek megakadályozzák ennek
a serkentő hatásnak a létrejöttét és megfigyelhető hogy az axoaxonikus sejtek az
éleshullám-események alatt nem tüzelnek. Azonosított axoaxonikus sejteken a MS-ban
található parvalbumin-pozitív sejtek szinapszisokat hoznak létre, működésükkel gátolva
azok tüzelését (Viney és mtsai 2013). Azonban nem minden MS-ban található
parvalbumin-pozitív sejt fokozta tüzelését az éleshullámok alatt, és egy korábbi
munkában azt figyelték meg, hogy az éleshullám-aktivitás alatt a MS sejtjei többségének
csökken a tüzelési frekvenciája (Dragoi és mtsai 1999). Ez utóbbi populációba
beletartozhatnak egyes parvalbumin-pozitív sejtek is.
A MS vGluT2-pozitív sejtjeinek szintén alapvető szerepük van a hippokampális
theta-ritmus szabályozásában. Elegáns optogenetikai kísérleteikkel Stefan Remy és
munkacsoportja kimutatta, hogy a MS-ban található glutamaterg sejtek szelektív
aktivitása megelőzi a hippokampális theta-oszcilláció kialakulását. A sejtek tüzelési
frekvenciájának növelésével a hippokampuszban gyorsabban alakult ki a theta-ritmus és
nagyobb volt az oszcilláció frekvenciája is, mellyel párhuzamosan az egerek aktív
mozgásba kezdtek és mozgási sebességük is egyenesen arányos volt a vGluT2-pozitív
sejtek ingerlési frekvenciájával (Fuhrmann és mtsai 2015). Hasonló hatásokat figyeltek
meg az entorhinális kéregben is, ahol a MS vGluT2-pozitív sejtjeiből származó rostok
aktivitása theta- vagy sebesség-modulált változásokat mutatott (Justus és mtsai 2016).
Emellett a vGluT2-es sejtek lokális kollaterálisai is fontos szerepet játszhatnak a
hippokampális theta-ritmus létrehozásában, a többi szeptális sejttípus aktivitásának
fokozásával (Leao és mtsai 2014; Robinson és mtsai 2016). Ez összhangban van azzal,
hogy ha MS parvalbumin-pozitív sejtjeinek ingerelhetősége fokozódik, a
39
hippokampuszban megnő a theta-oszcilláció gyakorisága és erőssége (Gangadharan és
mtsai 2016). A MS vGluT2-pozitív sejtjeinek hatását a hippokampális éleshullám-
aktivitásra eddig még nem vizsgálták.
A MS különböző sejtjei tehát alapvető fontossággal bírnak az előagyi hálózati
aktivitás szabályozására és ezen keresztül az állat kognitív folyamataira és viselkedésére
is. A MS-ra ható, külső magokból (mint például a MRR-ból) származó bemenetek tehát
jelentősen befolyásolhatják a szeptohippokampális rendszer működését.
IV.4. A mediális prefrontális kéreg funkcionális anatómiájának rövid
összefoglalása
Az agykéreg az agy fejlődéstanilag legfiatalabb, legkésőbb kialakult része. A
gerincesek evolúciója során az agy testtömeghez viszonyított mérete jellemzően
növekszik, és ezen a növekedésen belül is az agykéreg növekedése a legszembetűnőbb.
Az egyes agykérgi területek fejlődése között is eltérések mutatkoznak, és a főemlősökben
egyértelműen a homloklebenyben található prefrontális kéreg, illetve annak a középvonal
felé néző, mediális része mutatja a legnagyobb növekedést (Shepherd, 2004).
A mediális prefrontális kéregnek (mPFC) több, a legmagasabbrendű kognitív
tevékenységgel kapcsolatos funkcióját írták le, mint a döntéshozás, motiváció, a figyelem
fenntartása, a viselkedési gátlás és a hibafelismerés (Szirmai, 2005). Több tanulmány
foglalkozott a mPFC munkamemóriában, illetve hosszú távú memóriában betöltött
szerepével is (Euston és mtsai 2012). A mPFC rendkívül gazdag kapcsolatrendszerrel
rendelkezik, információt kap a kívülről érkező szenzoros információkat feldolgozó kérgi
területektől és az érzelmeket és az élőlény belső állapotát felmérő agytörzsi és bazális
előagyi magoktól is (Heidbreder és Groenewegen 2003). A mPFC így a korábbi emlékek
és benyomások alapján, a szenzoros ingereket és a belső állapotot feldolgozva képes
döntést hozni az élőlény reakciójáról, és ezt a döntést szándékká alakítva elindítani a
válaszreakciót (Euston és mtsai 2012). A mPFC működésének bizonyos aspektusai tehát
csak emberben vizsgálhatóak hatékonyan; erre bizonyos emberre specifikus
neuropszichiátriai megbetegedésekben való érintettsége is utal, mint például a skizofrénia
(Szirmai, 2005). Egyes funkciói azonban rágcsálókban is tanulmányozhatóak.
40
7. ábra: A mediális prefrontális kéreg
anatómiája: A-F: a rosztrokaudális
tengelyen egymás után következő, Nissl-
festéssel megjelölt koronális metszeteken
a mPFC alrégiói láthatók. Az A kép a
legrosztrálisabb, az F a legkaudálisabb. A
fehér és fekete nyílhegyek jelölik az
alrégiók határait. Rövidítések: ACd:
anterior cinguláris kéreg, dorzális rész,
Acv: anterior cinguláris kéreg, ventrális
rész, Fr2: mediális precentrális terület,
IL: infralimbikus kéreg, IG: induseum
griseum, MO: mediális orbitális kéreg,
PL: prelimbikus kéreg, TT: taenia tecta. A
kép forrása: The medial prefrontal cortex
in the rat: evidence for a dorso-ventral distinction based upon functional and anatomical
characteristics, Heidbreder és Groenewegen 2003. Engedéllyel módosítva és
felhasználva.
A mPFC legalább 5, a sejtfelépítése alapján különböző területre osztható
rágcsálókban. Ezek a mediális precentrális terület (Fr2), az anterior cinguláris kéreg
(A24), a prelimbikus terület (A32), az infralimbikus terület (A25) és a mediális orbitális
kéreg (7. ábra). Egyes besorolásokban azonban egy dorzoventrális tengely menti
felosztás érvényesül, mely a mPFC dorzális részébe helyezi a Fr2, A24 és a dorzális A32
területet, és a mPFC ventrális részének a ventrális A32 és az A25 területeket tekinti
(Heidbreder és Groenewegen 2003). Ezek a területek az agykéregre jellemző, 6 rétegű
felépítést mutatják, az egyes rétegekben különböző típusú principális sejtek találhatóak.
Ezeknek a sejteknek a működését a kéregben elhelyezkedő GABAerg interneuronok gátló
szinapszisaikkal szabályozzák, melyek sokfélesége a hippokampális interneuronokét is
felülmúlja (Tremblay és mtsai 2016). Ezen interneuronok egy része – egyes
hippokampális interneuronokhoz hasonlóan – kéreg alatti területektől, mint a MRR vagy
a MS is kap bemenetet (Puig és mtsai 2004).
41
IV.5. A hippokampusz, a mediális szeptum és a mediális prefrontális kéreg
összeköttetései
A fent bemutatott agyterületek egymással szoros összeköttetésben vannak, így
képesek összehangoltan hatni az élőlény viselkedésére. A hippokampusz és a MS
egymással több sejttípuson keresztül összeköttetésben áll a fornixban haladó pályákon
keresztül. A MS kolinerg, GABAerg és glutamaterg sejtjeinek a hippokampuszba való
vetítését fentebb részletesen tárgyaltam; azonban a hippokampusz felől a MS-ba is folyik
információáramlás. A hippokampuszban található vetítő GABAerg sejtek (hippokampo-
szeptális, azaz HS sejtek) a MS több sejtpopulációját is beidegzik gátló, GABAerg
szinapszisaikkal, azonban a parvalbumin-pozitív GABAerg sejteket valamivel nagyobb
arányban célozzák meg (Manseau és mtsai 2008; Mattis és mtsai 2014). Azonban in vitro
szepto-hippokampális preparátumban a HS sejtekből származó GABAerg bemenet
elősegítette a parvalbumin-pozitív sejtek ritmikus tüzelését a HCN-csatornákon keresztül
folyó áram aktiválásával (Hangya és mtsai 2009; Manseau és mtsai 2008). A HS sejtek
fő serkentő bemenetüket a hippokampusz lokális piramissejtjeitől kapják, de a MS
GABAerg sejtjeitől is kapnak gátló bemeneteket, tehát ideális helyzetben vannak a
hippokampális hálózati állapot felméréséhez (Takács és mtsai 2008). A HS sejtek
hippokampuszban, MS-ban és a retrohippokampális területeken létrehozott kapcsolataik
segítségével képesek lehetnek ezeknek a területeknek a működését összehangoltan
szabályozni (Gulyás és mtsai 2003; Jinno és mtsai 2007; Katona és mtsai 2017; Takács
és mtsai 2008).
A MS és mPFC között kétirányú összeköttetés figyelhető meg, mely
topografikusan szervezett. A mPFC ventrálisabb részei a szeptális magok mediálisabb
részére, azaz a MS-ba és a ventrális diagonális kötegbe vetítenek, míg a mPFC
dorzálisabb részei inkább laterálisan, a horizontális diagonális kötegbe küldenek rostokat.
Ezek a rostok a MS kolinerg és GABAerg sejtjeit is elérik (Heidbreder és Groenewegen
2003). Ezzel szemben a szeptális magok mediális részéről a mPFC mediális oldalára,
laterális részéről pedig inkább a mPFC laterálisabb területeire halad a vetítés, mely
jellemzően a kolinerg sejtekből származik (Gaykema és mtsai 1990; Paxinos 2004).
A mPFC és a hippokampusz közötti vetítés azonban egyirányú, ugyanis a mPFC
nem vetít közvetlenül a hippokampuszba, bár az abból származó információ az
42
entorhinális kérgen keresztül elérheti a hippokampuszt; ezzel szemben a hippokampusz
ventrális CA1 régiójának piramissejtjei megcélozzák a mPFC ventrálisabban fekvő
területeit (Heidbreder és Groenewegen 2003; Thierry és mtsai 2000). A hippokampusz és
a mPFC képes theta-ritmusban összehangoltan működni, melyre a térbeli munkamemória
helyes működéséhez lehet szükség (O’Neill és mtsai 2013; Numan 2015).
IV.6. A median raphe régió vetítése az előagyi területekre
A MRR hatását a fent tárgyalt előagyi hálózati aktivitásmintázatokra az egyes
agyterületekre való vetítésén keresztül éri el. A MRR-ból származó rostok szinte minden
agyterületet elérnek, ahol nagyon célzottan idegeznek be bizonyos sejteket (Vertes és
mtsai 1999). A következőkben csak a MRR fenti agyterületekkel kapcsolatos vetítési
mintázatát mutatom be.
A MRR a hippokampuszban specifikus vetítési mintázattal rendelkezik: a stratum
oriensbe és a stratum radiatum és lacunosum-moleculare határára adja legtöbb rostját,
melyek átmérője vastag, és azokon nagy méretű, terminálisok találhatóak (Somogyi és
mtsai 2004). A MRR a hippokampuszban célzottan interneuronokat idegez be, azok
sejttestjein akár 40 terminálist is létrehozva (Freund és mtsai 1990; Halasy és mtsai 1992).
Ezek az interneuronok több csoportba tartoznak, leírtak calbindin, kolecisztokinin,
calretinin, neuropeptid Y és szomatosztatin-tartalmú sejteket is a célsejtek között (Freund
és mtsai 1990; Halasy és mtsai 1992; Miettinen és Freund 1992; Varga és mtsai 2009),
azonban a MRR elkerüli a parvalbumin-pozitív sejteket a hippokampuszban (Freund és
mtsai 1990). A MRR hippokampuszba vetítő rostjai 5HT- és/vagy vGluT3-pozitívak, és
igen hatékonyan, ionotrop 5HT3- és AMPA-receptorokon keresztül képesek serkenteni
ezeket az interneuronokat, rajtuk keresztül pedig erős hatást gyakorolnak a hippokampális
hálózati működésre (Chittajallu és mtsai 2013; McMahon és Kauer 1997; Morales és
Bloom 1997; Ropert és Guy 1991; Varga és mtsai 2009).
A MRR a MS-ba nagyon sűrű rosthálózatot küld, ahol ezek a rostok, hasonlóan a
hippokampális vetítéshez, GABAerg sejteket céloznak meg, beleértve a parvalbumin- és
a calbindin-pozitív populációt is (Aznar és mtsai 2004; Leranth és Vertes 1999). A MRR
rostjai ezeken a sejteken gyakran kosárszerű beidegzést hoznak létre, 5-15 terminálissal
körülvéve azokat (Aznar és mtsai 2004). A MS-ban is 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív
43
terminálisok találhatóak, bár úgy tűnik, hogy ezek mellett még legalább egy sejtpopuláció
erőteljesen vetít a MRR-ból a MS-ba (Jackson és mtsai 2009). A MRR szeptális hatásait,
melyet különböző ionotróp és metabotróp szerotonin- és glutamát-receptorokon keresztül
hoz létre, feljebb tárgyaltam.
A mPFC-ben a MRR szintén interneuronokat céloz meg, melyek
tulajdonságaikban nagyon hasonlítanak a MRR hippokampális célsejtjeihez (Puig és
mtsai 2004). Ezek a sejtek általában a kéreg felszíni, I vagy II/III rétegében találhatóak,
kolecisztokinin-pozitívak, és membránjukon kifejeznek 5HT3-receptorokat. Ezeknek a
célsejteknek megfelelő a MRR rostjainak kérgi eloszlása is, mely a legnagyobb sűrűséget
a fenti rétegekben mutatja (Mamounas és mtsai 1991; Vertes és mtsai 1999).
A MRR számos sejtje képes egyszerre több agyterületet is beidegezni
kollaterálisaival, pl. az ellenoldali hippokampuszokat, az azonos oldali hippokampuszt és
entorhinális kérget, vagy a hippokampuszt és MS-ot (Acsády és mtsai 1996; Köhler és
Steinbusch 1982; McKenna és Vertes 2001). Ezeknek a sejteknek egy jelentős része
szerotonerg, de találtak kettősen vetítő nem szerotonin-pozitív sejteket is, melyek
pontosabb neurokémiai tulajdonságait eddig még nem vizsgálták.
IV.7. A szerotonerg és glutamaterg neurotranszmisszió molekuláris elemei
IV.7.1. A szerotonerg neurotranszmisszió
A szerotonin egy aminosavszármazék: triptofánból a triptofán-hidroxiláz (TpH)
nevű enzim 5-hidroxitriptofánt készít (8. ábra, a), amelyet az aromás aminosav-
dekarboxiáz (AADC) tovább alakít 5-hidroxi-triptaminná (8. ábra, b), azaz szerotoninná
(5HT). A központi idegrendszerben a 5HT-t a vezikuláris monoamin-transzporter
(VMAT2) juttatja a szinaptikus vezikulákba (8. ábra, c). A 5HT vezikulákból való
kiürülése után (8. ábra, d) hat a receptorain (8. ábra, e), majd a szinaptikus résből és
környezetéből a szerotonin-transzporter (SERT) segítségével kerül visszavételre a
terminális vagy a sejttest citoplazmájába (8. ábra, f). Innen vagy visszakerül a
vezikulákba (8. ábra, g), vagy a monoamin-oxidáz A enzim (MAO-A) segítségével
lebomlik (8. ábra, h) hidroxi-indolecetsavvá (5-HIAA; Adam és mtsai 2006; Gyires és
mtsai 2011; Wong és mtsai 2005).
44
8. ábra: A szerotonerg neurotranszmisszió: az ábrán egy kékkel jelölt szerotonerg sejt és
egy barna színnel jelölt célsejt ábrázolása látható. A szerotonerg sejtben láthatók a
szerotoninszintészis fő lépései, és a preszinaptikus szerotonin-receptor típusok jellemző
elhelyezkedése, a posztszinaptikus sejtben pedig a posztszinaptikus szerotonin-receptor
típusok, és jelátviteli útvonalaik. Részletek a szövegben. Rövidítések: 5-HIAA: 5-
hidroxiindolecetsav, 5-HT: szerotonin, 5-HTP: 5-hidroxitriptamin, AC: adenilát-cikláz,
AADC: aromás aminosav dekarboxiláz, ATP: adenozin-trifoszfát, cAMP: ciklikus
adenozin-monofoszfát, DAG: diacilglicerol, IP3: inozitol-trifoszfát, MAO: monoamin-
oxidáz, PC: foszfolipáz C, PIP2: foszfatidilinozitol 4,5-bifoszfát, TRYP: triptofán. A kép
forrása: The discovery of fluoxetine hydrochloride (Prozac), Wong és mtsai 2005.
Engedéllyel módosítva és felhasználva.
A 5HT-nak nagyon sok különböző receptora van az agyban: a szerotonin-
receptorok családját a 5HT1-7 nevű receptorok alkotják, melyek különböző sejteken, vagy
a sejtek különböző membránszakaszain helyezkednek el, és a legkülönfélébb hatásokkal
rendelkeznek (Gyires és mtsai 2011). A 5HT egyetlen jelenleg ismert ionotróp receptora
a 5HT3-receptor, a többi receptor mind metabotróp, G-fehérje kapcsolt 7-transzmembrán
fehérje. A 5HT1 és 5HT5 családba tartozó receptorok Gi/o-fehérjékhez kapcsoltan
csökkentik az adenilát cikláz aktivitást; a 5HT2 családba tartozó receptorok Gq/11 kapcsolt
módon az intracellulláris Ca2+-szint emelkedését váltják ki; az 5HT4, 5HT6 és 5HT7
45
családba tartozó receptorok pedig Gs-fehérje kapcsolt módon növelik az adenilát-cikláz
aktivitását. Ezeknek a receptoroknak a működését és elhelyezkedését a központi
idegrendszerben több összefoglaló munka is taglalja (pl. Barnes és Sharp 1999).
A 5HT3-receptorok jelenlétét mind a hippokampuszban, mind a MS-ban, mind a
mPFC-ben kimutatták bizonyos GABAerg sejteken; ezeknek a sejteknek az
elhelyezkedése a MRR-ból érkező beidegzéssel megegyező mintázatot mutat. Továbbá a
fenti agyterületeken a 5HT3-receptorok funkcionálisak, és posztszinaptikus serkentő
potenciálok kialakításában vesznek részt (Chittajallu és mtsai 2013; McMahon és Kauer
1997; Morales és Bloom 1997; Morales és mtsai 1998; Puig és mtsai 2004; Ropert és Guy
1991). Ezen receptorok szerepét a MRR rostjai által a fenti agyterületekre közvetített
információ átvitelében, illetve a glutamaterg neurotranszmisszióval való
együttműködésben még mindig nem pontosan értjük.
IV.7.2. A glutamaterg neurotranszmisszió
A glutamát a központi idegrendszerben előforduló leggyakoribb
neurotranszmitter, serkentő hatását már az 1950-es években leírták. A glutamát egy
aminosav, ingerületátvivő szerepe mellett több metabolikus folyamatban is részt vesz,
ezért a sejtekben bőségesen elérhető. A vér-agy gáton nem képes átmenni, ezért az agyban
szintetizálódik, több lehetséges úton: vagy alfa-ketoglutarátból glutamát-dehidrogenáz
segítségével; vagy transzaminálással; vagy glutaminból glutamináz segítségével. Ez
utóbbi reakcióhoz a gliasejtek közreműködése is szükséges: a gliasejtekben lévő
glutamátból a glutamin-szintáz glutamint készít, amely a neuronokba transzportálódik, és
ott a mitokondriumok belső membránján található glutamináz segítségével alakul vissza
glutamáttá (Adam és mtsai 2006). A glutamátot a vezikuláris glutamát transzporterek 3
típusa (vGluT1-3) juttatja a szinaptikus vezikulákba; ezeknek a transzportereknek az
elhelyezkedése agyterületenként és sejttípusonként különböző. A vGluT1 főleg a kérgi
sejtekben található; a vGluT2-t többnyire a kéreg alatti struktúrák glutamaterg sejtjei
fejezik ki; a vGluT3 pedig olyan sejtekben található, amelyek jellemzően más
neurotranszmittereket is használnak kommunikációjuk során; ezek lehetnek kérgi
GABAerg interneuronok, illetve monoaminerg magokban található sejtek (Fremeau és
46
mtsai 2004; Somogyi és mtsai 2004). A szinaptikus résbe ürített glutamátot a serkentő
aminosav-transzportereknek nevezett fehérjék távolítják el az extracelluláris térből.
A glutamátnak metabotróp (mGluR) és ionotróp (iGluR) receptorai is vannak a
központi idegrendszerben. A nyolc metabotróp glutamát-receptor három csoportba
tartozik, melyek különböző típusú G-fehérjékhez kapcsolódnak. A mGluR I csoportba
tartozó mGluR1 és mGluR5 Gq/11 kapcsolt módon az intracellulláris Ca2+-szint
emelkedését váltják ki, és jellemzően posztszinaptikusan helyezkednek el. A mGluR II
csoportba tartozó mGluR2 és mGluR3 Gi/o-fehérjékhez kapcsoltan csökkentik az adenilát
cikláz aktivitást, és a DCG-IV nevű anyag agonistaként hat rajtuk. A mGluR III csoportba
tartozó mGluR4, mGluR6, mGluR7 és mGluR8 szintén Gi/o-fehérjékhez kapcsolt, és az
L-AP4 nevű anyag hat rajtuk agonistaként. Ez utóbbi két csoportba tartozó receptorok
tagjai jellemzően preszinaptikusan helyezkednek el (Conn és Pin 1997).
Az iGluR-ok három főbb csoportba sorolhatók. Az AMPA-receptoroknak 4
alegységét tartjuk számon (GluA1-4), melyek jellemzően heterotetramerek formájában
állnak össze egy receptorrá. A következő csoport a kainát-receptoroké, melyek a kis-
affinitású GluK1-3 (régen GluR5-7) illetve a nagy-affinitású GluK4-5 (régen KA1-2)
alegységekből épülhetnek fel. Végül az NMDA-receptorok csoportjába tetramer
szerkezetű receptorok tartoznak, melyek alegységei további 3 alcsoportba sorolhatók:
ezek a GluN1, GluN2A-D, illetve a GluN3A-B alegységek (Dingledine és mtsai 1999).
Az NMDA-receptorok heterotetramerek, jellemzően 2 konstitutív GluN1 és 2 GluN2
alegységből épülnek fel. A GluN2 alegységek felelősek a glutamát megkötéséért, a
GluN1 alegységek pedig a NMDA-receptorok membránba való kihelyeződéséért és a ko-
agonista glicin megkötéséért felelősek (Paoletti, 2011). Az NMDA-receptorok ligand- és
feszültségfüggő csatornák, ugyanis nyugalmi állapotban egy Mg2+-ion zárja el a csatorna
nyílását, amely csak egy bizonyos membránpotenciál-érték felett lökődik ki, és enged
szabad utat az ionáramlásnak, amennyiben a glutamát és glicin (vagy D-szerin) is jelen
van (Dingledine és mtsai 1999; Paoletti 2011).
A glutamát szinaptikus résből való kiürülése után a szinaptikus ingerületátvitelt
az AMPA-receptorok indítják el. Az ezeken a receptorokon keresztül a posztszinaptikus
sejtbe áramló Na+-ionok depolarizálják a posztszinaptikus membránt, így elősegítik a
NMDA-receptorok Mg2+-ion általi blokádjának feloldását. Az NMDA-receptorokhoz
kötődő glutamát (illetve a ko-agonista glicin vagy D-szerin) hatására nyit a csatorna, és
47
Ca2+-ionok áramlanak be a sejtbe. Ezek a Ca2+-ionok nem csak erős depolarizációt
váltanak ki, hanem különböző másodlagos hírvivő rendszerek aktiválásán keresztül
hosszabb léptékben érvényesülő változásokat is elindítanak a sejtekben (Paoletti, 2011).
Ilyen például a szinapszis membránjában az AMPA-receptorok mennyiségének
megnövelése, mely a szinapszis megerősödésével jár együtt: ezt a jelenséget nevezzük
hosszútávú potenciációnak, mely a tanulás- és memóriafolyamatok egyik alapját képezi
(Malenka és Bear 2004). A glutamaterg neurotranszmisszió összefoglalása a 9. ábrán
látható.
48
9. ábra: A glutamaterg neurotranszmisszió: a kékkel jelölt glutamaterg sejtben a glutamát
vezikulákba töltődik (a), majd felszabadul a szinaptikus résbe a preszinaptikus aktív
zónában (b) mely folyamat a terminális membránjában elhelyezkedő ioncsatornáktól függ
(c). Glutamát a lilával jelölt gliasejtekből is felszabadulhat (d), miután vagy különböző
receptorokon hat, melyek vagy a szürkével jelölt posztszinaptikus sejt posztszinaptikus
denzitáshoz (f) vannak kihorgonyozva a klasszikus aszimmetrikus szinapszisokban (g,h),
vagy extraszinaptikusan helyezkednek el (e,i), vagy preszinaptikus autoreceptorok (k). A
glutamát receptorain való hatása után a gliasejtekbe kerül visszavételre (j), ahol
metabolikus átalakulás után glutaminná alakul, mely visszakerülhet az idegsejtbe.
További részletek a szövegben. Rövidítések: EAAT: serkentő aminosav-transzporter, Gln:
glutamin, Glu: glutamát, SNARE: vezikulaürülésben részt vevő fehérjék, VGLUT:
vezikuláris glutamát transzporter. A kép forrása: Targeting the glutamatergic system to
develop novel, improved therapeutics for mood disorders, Sanacora és mtsai 2008.
Engedéllyel módosítva és felhasználva.
49
V. CÉLKITŰZÉSEK
1. A median raphe régió (MRR) szerotonerg sejtjeinek kialakulása egy
meghatározott genetikai programhoz kötött, melyben különböző transzkripciós faktorok
játszanak szerepet. Ezek közé a transzkripciós faktorok közé tartozik az ePet/PET-1
rendszer is, mely a szerotonerg fenotípus kialakítása mellett annak fenntartásában is részt
vesz. Az ePet/PET-1 rendszert a szerotonerg sejtekre specifikusnak gondolták. Az utóbbi
időben azonban a szerotonerg sejtektől eltérő, velük részben átfedő, egyéb neurokémiai
tulajdonságokkal rendelkező sejteket is leírtak a MRR-ban, mint a vGluT3-pozitív
glutamaterg sejtek, vagy az ezek mellett elhelyezkedő GABAerg sejtek, melyek
funkcióját még csak most kezdik feltárni. E sejtek pontos számát és egymáshoz
viszonyított arányukat, MRR-ban való pontos eloszlásukat még mindig nem ismerjük.
Első kísérleteinkben tehát a következő kérdésekre kerestük a választ:
Kérdéseink:
1a) Mi a MRR-ban található, különböző fenotípusú idegsejtek pontos száma?
1b) Milyen arányban képviseltetik magukat a különböző sejtpopulációk?
1c) Melyek között van átfedés, és annak mi a pontos mértéke?
1d) Az ePet/PET-1 rendszer valóban specifikus-e a szerotonerg sejtekre?
2. A MRR-ból felszálló pályarendszer az egész agyat elárasztja rostjaival, és erős
hatással bír az előagyi hálózati aktivitás mintázatokra. A MRR szerotonerg és vGluT3
pozitív sejtjei (melyek részben átfednek) mind vetítenek az előagyba. A vGluT3 pozitív,
nem szerotonerg előagyi vetítésnek a mértéke még mindig nem ismert.
Kérdésünk:
2a) Mennyire jellemző a MRR-ra a nem szerotonerg, glutamaterg vetítés?
3. Kutatócsoportunk korábbi munkáiból kiderült, hogy a MRR vGluT3-pozitív
vetítő sejtjei a hippokampuszban gyors és hatékony glutamaterg ingerületátvitelen
keresztül szabályozzák a MRR célsejtjeit. Ennek a glutamaterg ingerületátvitelnek a
50
molekuláris elemei azonban nem mind azonosítottak a MRR előagyi szinapszisaiban. Bár
kutatócsoportunk leírta a MRR szinapszisaiban az AMPA-típusú glutamát-receptorok
jelenlétét, a hosszú távú szinaptikus plaszticitási és tanulási folyamatokban alapvető
fontosságú NMDA-receptorok jelenlétéről nem volt információnk ezekben a
szinapszisokban. Továbbá nem volt ismert, hogy a MRR-ból számazó glutamaterg
transzmisszió a MRR által beidegzett többi agyterületen is megvalósulhat-e.
Kérdésünk:
3a) Megtalálhatók-e az AMPA-típusú glutamát-receptorok mellett az NMDA-
receptorok is a MRR hippokampális szinapszisaiban?
3b) Vajon a MRR mediális szeptumban és mediális prefrontális kéregben létrehozott
szinapszisai is tartalmaznak NMDA-receptorokat, azaz ott is jellemző-e a glutamaterg
jelátvitel?
4. A MRR egyes sejtjei képesek egyszerre több agyterületet beidegezni, azonban
a MRR-ban található nem szerotonerg vGluT3-pozitív sejtek több agyterületre való
vetítési képességét nem vizsgálták. Ha ez megvalósul, akkor az a gyors és hatékony
glutamaterg ingerületátvitel segítségével szinkron szabályozhatná célterületének hálózati
aktivitását.
Kérdésünk:
4a) Képesek lehetnek-e a MRR glutamaterg sejtjei több agyterület összehangolt
beidegzésére? Mi ezeknek a sejteknek a neurokémiai profilja?
51
VI. MÓDSZEREK
VI.1. Etikai állásfoglalás
Minden kísérletet a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi
Kutatóintézet (MTA KOKI) Etikai Kódexe és a kísérleti állatok védelméről szóló
hatályos magyar törvény alapján végeztünk, mely összhangban van az Európai Közösség
által 2010. szeptember 22-én elfogadott irányelvekkel (2010/63/EU). A kísérleteket az
MTA KOKI Állatkísérleti Bizottsága és a Pest Megyei Kormányhivatal a PE/EA/2553-
6/2016 ügyiratszámon engedélyezte.
VI.2. Felhasznált kísérleti állatok
A kísérletek során minden esetben hím egereket használtunk, melyek különböző típusú
törzsekbe tartoztak. Ezen egértörzsek típusát, a kísérletenként felhasznált állatok
darabszámát és az állatok származási helyét az 1. táblázat mutatja. A kísérletekhez
vGAT-IRES-Cre egereket kereszteztünk Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 vagy
Gt(ROSA26)Sor_CAG/tdTomato riporter egerekkel, vagy ePet-IRES-Cre egereket
Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 riporter egerekkel. Az utódokban mindazok a sejtek,
amelyekben a vGAT vagy az ePet promotere aktív volt, zöld vagy piros színű
fluoreszcens fehérje volt detektálható. Az állatok életkora 29-118 nap között mozgott; a
sztereológiai kísérletekhez korban illő, fiatal, ivarérett felnőtt 42-49 napos állatokat
használtunk fel.
52
1. táblázat: A kísérletek során felhasznált állattörzsek típusa és származási helye és a
felhasznált állatok darabszáma.
VI.3. Sztereotaxiás műtétek, anterográd és retrográd pályajelölés
Az egereket a műtét kezdete előtt izoflurán (Forane, Abbvie) gőzével elbódítottuk,
majd intraperitoneális altatókoktél injekciót kaptak (8.3 mg/ml ketamin és 1.7 mg/ml
xylazin-hidroklorid fiziológiás sóoldatban, 10ml/ttkg mennyiségben). A műtéti
anesztézia elérése utén az egereket egy sztereotaxiás készülékbe fogtuk. A műtétekhez
egy Recording Nanoject-R típusú mikroinjektort, és a hozzá tartozó boroszilikát
Egértörzs Kísérlet típusa
Darabszám
(állatok
azonosítója)
Származási
hely
C57Bl/6 vad típus
sztereológia 1 (WT)
MTA KOKI
anterográd pályajelölés 3
retrográd pályajelölés
(mPFC-HIPP)
3 (Egér 1, Egér 2,
Egér 5)
retrográd pályajelölés
(mPFC-MS)
4 (Egér 3, Egér 4,
Egér 6, Egér 7)
immunhisztokémiai
vizsgálatok 5
vGAT-IRES-Cre ::
Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 sztereológia
3 (GM1, GM2,
GM3)
Jackson
Laboratories
vGAT-IRES-Cre ::
Gt(ROSA26)Sor_CAG/tdTomato sztereológia 1 (GM4)
Jackson
Laboratories
ePet-IRES-Cre ::
Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 sztereológia
3 (PM1, PM2,
PM3)
Jackson
Laboratories
vGluT3 KO immunhisztokémiai
vizsgálatok 1
Jackson
Laboratories
53
mikropipettákat használtunk (Drummond, Broomall, PA, USA), melyek hegyét 28-36µm
vastagságúra törtük.
Az anterográd pályajelöléshez 5-9nl 10kDa molekulatömegű biotinilált dextrán
amint (10 kDa BDA; Molecular Probes) injektáltunk az egerek median raphe régiójába
(MRR), Paxinos és Franklin egér sztereotaxiás atlasza (Paxinos és Franklin 2012, 4.
kiadás) alapján meghatározott koordinátákra, mely a bregmától 4.4 mm-re poszterior, a
középvonalban, a bregma és a lambda által meghatározott horizontális síktól (nullszint)
4.5 mm-re ventrálisan helyezkedtek el. Bár a szakirodalom szerint a 10kDa BDA csak
anterográd terjedésre képes (Lanciego és Wouterlood 2011), ellenőriztük más
agyterületeken is az esetleges retrográd pályajelölődést, de csupán pár BDA-val jelölt
sejtet figyeltünk meg a MRR közvetlen közelében; valószínűtlen, hogy ezek a sejtek az
általunk vizsgált előagyi területekre észlelhető mennyiségben küldtek volna rostokat.
A retrográd pályajelöléshez először 14-18 nl 2%-os FluoroGoldot (FG;
Fluorochrome, Denver, CO, USA) injektáltunk a mediális prefrontális kéregbe. Három
egérben csak a bal oldali mPFC-be injektáltunk, a bregmától 1.8 mm-re anterior, a
középvonaltól 0.3 mm-re laterális, és a nullszinttől 2.7 mm-re ventrális pozícióba.
Ezekben az állatokban további 3 darab, egyenként 18-23 nl 0.5%-os koleratoxin-B (CTB;
List Biologicals, Campbell, CA, USA) injekcióval árasztottuk el a bal oldali
hippokampuszt, a bregmától 2.5 mm, 2.8 mm, 3.2 mm-re poszterior, a középvonaltól 1.6
mm, 1.6 mm, 1.7 mm-re laterális, és a nullszinttől 2.1 mm, 2.1 mm és 2.2 mm-re ventrális
koordinátákon. További 4 állatban a fent meghatározott koordinátákon mindkét
agyfélteke mPFC-be injektáltunk FG-ot, és a medialis szeptumba injektáltunk CTB-t, a
bregmától 1.0 mm anterior, középvonali, és a nullszinttől 4.1 mm-re ventrális
koordinátákon.
A műtétek befejezése után az egerek 0.03-0.05 mg/ttkg meloxicam (Metacam,
Boehringer-Ingelheim, Németország) injekciót és 0.5 ml fiziológiás sóoldatot kaptak
intraperitoneálisan, majd 8-14 napig elkülönítve, ketrecekben éltek túl a perfúziókig.
VI.4. Állatok kezelése, szövetek előkészítése a kísérletekhez
Az egereket izoflurán használatával elbódítottuk, majd intraperitoneális
altatókoktél injekció segítségével altattuk el (8.3 mg/ml ketamin, 1.7 mg/ml xylazin-
54
hidroklorid és 0.8 mg/ml promethazinium-klorid fiziológiás sóoldatban). A teljes
anesztézia elérése után az állatokon transzkardiális perfúziót hajtottunk végre: 2 percig
fiziológiás sóoldatot, 40 percig 4%-os frissen beoldott paraformaldehidet, majd 10 percig
7.4-es pH-jú 0.1M-os foszfát puffert (PB) keringettünk át rajtuk. A perfúzió végeztével
az állatok agyát eltávolítottuk a koponyából, majd a vizsgálni kívánt régiókból vibratóm
segítségével (VT1200S, Leica, Németország) metszeteket készítettünk. A metszetek
vastagsága a sztereológiai kísérletek esetében 60 µm volt, ezeket egymást követően, 8
üvegbe metszettük fel, a sztereológiai technikához szükséges szisztematikus
véletlenszerű mintavétel szem előtt tartásával; a többi esetben 50 µm-es volt a
metszetvastagság. A metszeteket a metszés után 0.1M-os PB-ben mostuk, majd 10%-os
és 30%-os szacharóz oldatban tartottuk legalább 2-2 órán keresztül. Az
immunhisztokémiai kísérletek megkezdése előtt a metszeteket 3-5 alkalommal folyékony
nitrogén gőze felett megfagyasztottuk, majd 0.1M-os PB-ben mostuk őket tovább.
Azokon a metszeteken, amelyeken az NMDA-receptorokat jelöltük meg, 1 mg/ml
pepszines előkezelést végeztünk 0.2M-os sósavban, 37⁰C-on, az epitóp feltárása céljából.
VI.5. Használt antitestek jellemzése
A kísérleteinkben használt primer és szekunder antitestek jellemzőit a 2. és 3.
táblázatok tartalmazzák. A vGluT3-, GluN2A-, és NL2-elleni antitestek specificitását
vGluT3 KO (Seal és mtsai 2008; Szabadits és mtsai 2011), GluN2A KO (Watanabe és
mtsai 1998), illetve NL2 KO (Takács és mtsai 2013) génkiütött állatok használatával már
tesztelték. A tengerimalacban termeltetett vGluT3-elleni antitest specificitását mi is
ellenőriztük vGluT3 KO egérben (10. ábra).
A szerotonin (5HT)- és a 5HT-szintézisért felelős triptofán-hidroxiláz (TpH)-
elleni antitestek jól ismertek és karakterizáltak, a megfelelő festési mintázatot mutatták;
a nyúlban illetve a patkányban termeltetett 5HT-elleni antitestek ugyanazt a
sejtpopulációt jelölik (Amilhon és mtsai 2010; Calizo és mtsai 2011; Fox és Deneris
2012). Azokban a kísérletekben, ahol az ePet kifejeződési mintázatát tanulmányoztuk,
különbséget fedeztünk fel az ePet-et és a 5HT-t kifejező sejtpopulációk között. Ezért mi
is ellenőriztük, hogy a nyúlban termeltetett 5HT-elleni és az egérben termeltetett TpH-
elleni antitest azonos festési mintázatot ad-e, mert el akartuk kerülni, hogy a sztereológiai
55
mérések során egyes sejteket tévesen szerotonin-negatívnak számoljunk. A 160
megszámolt 5HT-pozitív sejt mindegyike TpH-pozitív volt és fordítva; ezért az észlelt
különbség nem lehet a használt szerotonin-elleni antitest alacsony szenzitivitásának
következménye, hiszen azon sejtek, amelyek a 5HT szintéziséért felelős enzimet
kifejezték, minden esetben 5HT-pozitívak voltak (11. ábra).
10. ábra: A vGluT3 elleni, tengerimalacban készült antitest tesztelése vGluT3 KO
egérben. A vad típusú egerekben erőteljes, specifikus vGluT3-jelölés látszik, mind a HIPP
str. pyramidale (WT/pyr), mind a str. lacunosum-moleculare (WT/lmr) rétegeiben DAB-
csapadékkal előhívva, fénymikroszkópiával, mind a MRR-ban (WT/MRR) fluoreszcens
mikroszkópiával. Ezzel szemben a vGluT3 KO egértörzsben sem a HIPP-ban (KO/pyr
illetve KO/lmr), sem a MRR-ban (KO/MRR) nem kaptunk jelölést.
A léptékek 30 μm-t jelölnek minden képen. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban
Mayer Márton munkájának eredménye.
11. ábra: A konfokális lézer-pásztázó mikroszkópiával készült képek azt mutatják, hogy
amennyiben egy sejt kifejezi a szerotonin-szintézisben kulcsfontosságú triptofán
hidroxilázt (TpH), az minden esetben 5HT-pozitív is, a kolokalizáció 100%-os.
Lépték: minden képen 50 μm. Az ábra 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin
Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredménye.
56
2. táblázat: A kísérletek során felhasznált primer antitestek jellemzése.
A NeuN, egy neuronokra specifikus DNS-kötő magi fehérje, valamint a FG- és
CTB-elleni antitestek specificitását szintén korábbi szakirodalmi adatok támasztják alá
(Dederen és mtsai 1994; Hamorsky és mtsai 2013; Mullen és mtsai 1992; Varga és mtsai
2002).
A sztereológiai mérések esetében rigorózusan figyeltünk arra, hogy az antitestek
a metszetek belsejébe is penetráljanak, így az immunreakció egyenletes, jó minősége
biztosított legyen. A szekunder antitestek lehetséges keresztreakcióit a többi primer és
szekunder antitesttel teszteltük, de nem láttunk erre utaló jeleket; továbbá a primer
antitestek elhagyásával készült immunreakciókban a szekunder antitestek nem mutattak
jelölést.
Primer antitestek
Antigén Gazdaállat Törzsoldat konc. Hígítás
(fluoreszcens)
Hígítás
(beágyazás
előtt)
Forrás Referencia
FluoroGold nyúl nem ismert 1:10000-
1:30000 - Millipore Varga és mtsai. 2002
Koleratoxin B egér 1 mg/ml 1:500 - Abcam Hamorsky és mtsai 2013
Koleratoxin B kecske nem ismert 1:20000 - List
Biologicals Dederen és mtsai 1994
GluN2A nyúl 542 µg/ml - 1:150-
1:250
M.
Watanabe
ajándéka
Watanabe és mtsai 1998
Neu-N egér 1 mg/ml 1:500 - Chemicon Mullen és mtsai 1992
Neuroligin 2 nyúl 1000 µg/ml - 1:600 Synaptic
Systems Takács és mtsai 2013
Szerotonin nyúl 25 µg/ml 1:10000 - ImmunoStar Fox és Deneris 2012
Szerotonin patkány nem ismert 1:500 - Millipore Amilhon és mtsai 2010
TpH egér nem ismert 1:3000 - Sigma-
Aldrich Calizo és mtsai 2011
vGluT3 nyúl 1 µg/ml 1:500 - Synaptic
Systems Seal és mtsai 2008
vGluT3 tengerimalac nem ismert 1:1000 1:4000 Millipore Szabadits és mtsai 2011 ,
jelen tanulmány
57
3. táblázat: A kísérletek során felhasznált szekunder antitestek és egyéb reagensek
jellemzése.
VI.6 Fluoreszcens immunhisztokémia és konfokális lézer-pásztázó mikroszkópia
A metszetek fent leírt előkészítése után azokat tris-pufferelt fiziológiás sóoldatban
(TBS) alaposan átmostuk, majd egy órán keresztül TBS-ben oldott 1%-os humán szérum
albuminnal (Sigma-Aldrich) blokkoltuk őket, elkerülendő a primer antitestek aspecifikus
kötődését a szövethez. A sztereológiai kísérletekhez használt metszetek esetében ebben a
lépésben 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), illetve 700 µg/ml Digitonin (Sigma-
Aldrich) is került az oldatba, elősegítendő a primer antitestek penetrációját. A blokkolás
után a metszeteket 3 napig a primer antitesteket tartalmazó TBS-alapú oldatban
inkubáltuk. Ezután TBS-sel alaposan átmostuk a metszeteket, majd a szekunder
antitesteket tartalmazó TBS-alapú oldatokban egy éjszakán keresztül inkubáltuk őket.
Azokban a kísérletekben, ahol a retrográd pályajelöléssel megjelölt MRR sejtek
neurokémiai karakterizálását végeztük, ezután további TBS-mosást végeztünk, majd
DyLight 405 konjugált streptavidin oldatában inkubáltuk a metszeteket 5 órán keresztül.
Szekunder antitestek, egyéb reagensek
Konjugálva Gazdaállat Milyen állat ellen? Hígítás Forrás Molekula
1.4 nm nanogold kecske nyúl 1:100-1:300 Nanoprobes Fab-fragment
Biotin kecske tengerimalac 1:200 Vector Laboratories teljes IgG
Alexa 488 szamár egér 1:500 Life Technologies teljes IgG
Alexa 488 szamár nyúl 1:500-1:1000 Life Technologies teljes IgG
Alexa 488 kecske tengerimalac 1:500 Molecular Probes teljes IgG
DyLight 549 szamár egér 1:500 Jackson Immunores. teljes IgG
Alexa 594 szamár egér 1:500 Life Technologies teljes IgG
Alexa 594 szamár kecske 1:500 Life Technologies teljes IgG
Cy3 szamár nyúl 1:500 Jackson Immunores. teljes IgG
Alexa 647 csirke patkány 1:500 Life Technologies teljes IgG
Alexa 647 szamár nyúl 1:500 Jackson Immunores. teljes IgG
- - - 1:10000 Sigma-Aldrich DAPI
DyLight 405 - - 1:500 Jackson Immunores. Streptavidin
58
Végül alaposan kimostuk a metszeteket TBS-ben, majd PB-ben és tárgylemezre
szárítottuk, majd Aquamount (BDH Chemicals LTD.) segítségével lefedtük őket. Az
egyes kísérlettípusok során használt primer és szekunder antitestek kombinációit a 4.
táblázat tartalmazza.
A retrográd pályajelölések esetében minden egyes beadási helyet teljesen
rekonstruáltunk egy Zeiss Axioplan 2 mikroszkóp segítségével, hogy megbecsüljük, hogy
a megcélozni kívánt agyterület mekkora hányadára jutott el a pályajelölő anyag (FG vagy
CTB). Ha a legkisebb mértékben is észleltük egy adott területen a pályajelölő anyagot,
akkor azt a területet a beadási hely részének tekintettük. Minden egyes 50 µm vastag
metszetet illesztettünk az egér sztereotaxiás atlasz (Paxinos és Franklin 2012, 4. kiadás)
vonatkozó képével, és a Fiji/ImageJ szoftver segítségével határoztuk meg az agyterület
és a beadási hely által befogott terület térfogatának arányát. Az agyterületek, melyeket az
atlasz alapján meghatároztunk, a következők voltak: a hippokampusz esetében a CA1-3
régiók és a gyrus dentatus; a medialis szeptális terület esetében a medialis szeptum és a
Broca-féle diagonális köteg; a medialis prefrontális kéreg esetében az A24a-b (anterior
cinguláris kéreg), az A25 (infralimbikus kéreg), az A32 (prelimbikus kéreg) és a medialis
orbitális kéreg.
Minden kísérletben külön értékeltük ki az egér sztereotaxiás atlasz (Paxinos és
Franklin 2012, 4. kiadás) által definiált median raphét (MR) és paramedian raphét (PMR).
A két régiót együttesen median raphe régiónak (MRR) neveztük. A retrográd
pályajelölések esetében az egyes alterületeken vizsgált sejtek mért tulajdonságaiban nem
találtunk eltéréseket, így a vonatkozó adatokat a teljes MRR-ra vonatkozóan adjuk meg.
A sztereológiai mérések esetén az alterületeken talált különbségeket is jeleztük, és az
adatokat a teljes MRR-ra vonatkozóan is megadtuk (12. ábra)
A retrográd pályajelölések kettős jelölései esetében a kiértékelést egy Olympus
Optical FluoView 300-as konfokális lézer-pásztázó mikroszkóppal végeztük, melyben a
két csatornában soronkénti váltással pásztáztuk a MRR-t tartalmazó metszeteket.
59
12. ábra: A fluoreszcens mikroszkópiával készült képeken 5HT-festéssel láthatók a MRR
rosztrokaudális tengelye mentén különböző koronális síkokban elhelyezkedő átmetszeti
képek. A MR és a PMR határait a sztereotaxiás atlasz (Paxinos és Watson, 2012) alapján
határoztuk meg. Lent láthatók a metszetek bregmától számított koordinátái. Lépték: minden
képen 100 μm. Az ábra 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin Eszter, 25%-ban
Mayer Márton munkájának eredménye.
Minden egyes 50 µm-es metszetet rekonstruáltunk, 5 µm-es képsíkok közötti
távolsággal; a sejteket Adobe Photoshop szoftver segítségével számoltuk meg.
A retrográd pályajelölések négyes jelöléseit egy Nikon A1R lézer-pásztázó
konfokális mikroszkóprendszer segítségével értékeltük ki, mely egy Ti-E fordított
elrendezésű mikroszkópra épült, egy 0.45 NA CFI Super Plan Fluor ELWD 20XC Nikon
objektívvel. A mikroszkópot a NIS-Elements AR 4.3 szoftver vezérelte. Zöld argon ion
lézert (457–514 nm, 40 mW), sárga DPSS lézert (561 nm, 20 mW), ibolya dióda lézert
(405 nm) és egy távoli vörös dióda lézert (647 nm, 100 mW) használtunk a fluorofórok
gerjesztésére, a hozzájuk tartozó szűrőkkel. A MRR-t tartalmazó metszeteket 2 µm-es
képsíkok közötti távolsággal teljesen rekonstruáltuk, majd NIS-Elements szoftver
segítségével azonosítottuk a FG- és CTB-tartalmú sejteket, és meghatároztuk vGluT3-
vagy 5HT-tartalmukat. Ezekben a metszetekben a sejtméretből adódó esetleges
sztereológiai torzítást elkerülendő, Abercrombie-korrekcióval határoztuk meg az egyes
populációkba tartozó sejtek relatív, százalékos arányát.
A sztereológiai mérések esetében a képalkotást szintén a fent leírt Nikon A1R lézer-
pásztázó konfokális mikroszkóprendszer segítségével végeztük; a MRR-t tartalmazó
metszeteket 1 µm-es képsíkok közötti távolsággal teljesen rekonstruáltuk, a sejtek
alakjának minél pontosabb meghatározása céljából.
60
4. táblázat: A fluoreszcens immunhisztokémiai kísérletek során használt primer és
szekunder antitestek kombinációi az egyes kísérlettípusokban.
Egértörzs Kísérlet Primerek és reagensek Szekunderek Megjegyzés
C57Bl/6 vad típus
sztereológia, A
típus
5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni
csirke Megkülönböztethető
5HT- és vGluT3-festés,
az eltérő fluoreszcens
csatornák miatt.
vGAT-IRES-Cre ::
Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1
vGluT3 elleni nyúl Cy3 nyúl elleni szamár
ePet-IRES-Cre ::
Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1 DAPI -
vGAT-IRES-Cre ::
Gt(ROSA26)Sor_CAG/
tdTomato
sztereológia, A
típus
5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni
csirke
Megkülönböztethető
5HT- és vGluT3-festés,
az eltérő fluoreszcens
csatornák miatt.
vGluT3 elleni nyúl Alexa 488 nyúl elleni szamár
DAPI -
vGAT-IRES-Cre ::
Gt(ROSA26)Sor_CAG/ZsGreen1
sztereológia, B
típus
5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni
csirke
Nem
megkülönböztethető
5HT- és vGluT3-festés,
de alkalmas más sejtek
detektálására a külön
csatornában történt Neu-
N festés miatt.
vGluT3 elleni nyúl Alexa 647 nyúl elleni szamár
NeuN elleni egér Alexa 594 egér elleni szamár
DAPI -
vGAT-IRES-Cre ::
Gt(ROSA26)Sor_CAG/tdTomato
sztereológia, B
típus
5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni
csirke
Nem
megkülönböztethető
5HT- és vGluT3-festés,
de alkalmas más sejtek
detektálására a külön
csatornában történt Neu-
N festés miatt.
vGluT3 elleni nyúl Alexa 647 nyúl elleni szamár
NeuN elleni egér Alexa 488 egér elleni szamár
DAPI -
C57Bl/6 vad típus
retrográd
pályajelölés
(kettős)
FG elleni nyúl Alexa 488 nyúl elleni szamár A sejtek neurokémiai
karakterizálása nélkül. CTB elleni kecske Alexa 594 kecske elleni
szamár
C57Bl/6 vad típus
retrográd
pályajelölés
(négyes)
FG elleni nyúl Alexa 488 nyúl elleni szamár
A sejtek neurokémiai
karakterizálására is
alkalmas.
CTB elleni egér DyLight 549 egér elleni
szamár
5HT elleni patkány Alexa 647 patkány elleni
csirke
vGluT3 elleni
tengerimalac
biotinilált tengerimalac elleni
kecske, majd DyLight 405
konjugált streptavidin
C57Bl/6 vad típus antitest tesztelése
vGluT3 elleni
tengerimalac
Alexa 488 tengerimalac
elleni kecske -
vGluT3 KO
61
VI.7. Sztereológiai mérések
A torzításmentes, tervezésen alapuló sztereológiai mérést az optikai hányadolásos
módszerrel végeztük (Gundersen 1986; Schmitz és Hof 2005; Sterio 1984; West és mtsai
1991), melynek alapja, hogy egy vizsgálni kívánt térfogatban található objektumok száma
meghatározható egy, az adott térfogatból kivett, előre meghatározott térfogatmintában
jelenlévő objektumok megszámolásával (Dorph-Petersen és mtsai 2001). A teljes
sejtszám meghatározásához a megszámolt sejtek számát három tört reciprokával kell
megszorozni: ezek a törtek a metszet-mintavételezési, a terület-mintavételezési és a
vastagság-mintavételezési hányadosok (West és mtsai 1991). Minden kísérletben
szisztematikus véletlenszerű mintavételezést alkalmaztunk: a 8 üvegbe szisztematikusan,
egymást követően felvett metszetsorozatok páratlan számú üvegein a vGluT3- és 5HT-
pozitív sejtek megkülönböztetésére alkalmas immunreakciókat (sztereológia A típusú
kísérlet), a páros számú üvegeken a MRR-ban található egyéb neuronok azonosítására
alkalmas immunreakciót (sztereológia B típusú kísérlet) végeztünk (4. táblázat). Ebből
következően a metszet-mintavételezési hányados 1/2-nek adódott. A beágyazott
metszeteken csupán egy előre meghatározott négyzetháló négyzeteinek egy részén
végeztük a mérést. Az erre vonatkozó terület-mintavételezési hányados az A-típusú
kísérletben, a MR-ra vonatkozóan 152/402-nek, a B-típusú kísérletben a MR-ra
vonatkozóan 152/802-nek, illetve mindkét kísérlettípusban a PMR-re vonatkozóan
102/802-nek adódott. Végül, a vastagság-mintavételezési hányados a 60 µm-es metszetek
átlagosan 28 µm-re való zsugorodásának köszönhetően 15/28-nak adódott, mert csupán
a metszet belsejében, egy 15 µm vastag térrészben végeztük a számolást, melyet a metszet
felszínétől egy legalább 5 µm-es biztonsági zóna ráhagyásával helyeztünk el. A nagyobb
pontosság érdekében minden egyes mérési ponton meghatároztuk a beágyazott metszet
vastagságát. A mérési térfogatokban minden egyes sejtet megszámoltunk, melyek a
befoglaló síkokhoz értek, de mindet kizártuk, amelyek megérintették a kizáró síkokat.
Mindent összevetve, a MRR teljes sejtpopulációjának (mintegy 126 500 db) kb. 10%-át
számoltuk meg, összesen kb. 12 300 db sejt azonosításával, 8 egérben. A méréseket a
StereoInvestigator program segítségével végeztük (MicroBrightField Bioscience); a
sejtek neurokémiai tulajdonságait párhuzamosan a NIS-Elements Documentation
szoftverrel végeztük.
62
VI.8. Beágyazás előtti immunhisztokémia
A metszetek fent leírt előkészítése után azokat tris-pufferelt fiziológiás sóoldatban
(TBS) alaposan átmostuk. A tengerimalacban termeltetett vGluT3-ellenes antitest
tesztelésére és a neuroligin-2 (NL2) detektálására használt metszeteket egy órán keresztül
TBS-ben oldott 1%-os humán szérum albuminnal (HSA; Sigma-Aldrich) blokkoltuk. Az
NMDA-receptorok detektálására használt metszetek blokkolásához először fél órán
keresztül 50mM-os glicint, majd egy órán keresztül 1%-os HSA-t, végül 10 percen át
TBS-ben oldott BSA-c oldatot (BSA-c/TBS; Aurion) használtunk. A blokkolás után a
metszeteket 3 napig a primer antitesteket tartalmazó TBS vagy BSA-c/TBS-alapú
oldatban inkubáltuk. Ezután a metszeteket alaposan átmostuk TBS-sel vagy BSA-c/TBS-
sel. A neuroligin-2 (NL2) detektálására használt metszeteket egy órán keresztül blokkoló
oldattal (Gel-BS) kezeltük, mely 0.5% hidegvízi hal bőréből kivont zselatint (GE
Healthcare, Little Chalfont, UK) és 0.5% HSA-t tartalmazott TBS-ben oldva. A blokkolás
után a metszeteket 1 napig a szekunder antitesteket tartalmazó TBS vagy BSA-c/TBS-
alapú oldatban inkubáltuk. Az egyes kísérletekben használt antitestek kombinációit az 5.
táblázat tartalmazza.
5. táblázat: a beágyazás előtti immunhisztokémiai kísérletek során használt primer és
szekunder antitestek kombinációi az egyes kísérlettípusokban.
Egértörzs Kísérlet Primerek Szekunderek Megjegyzés
C57Bl/6 vad típus antitest tesztelése
vGluT3 elleni
tengerimalac
biotinilált tengerimalac
elleni kecske
TBS-ben oldott
reagensek vGluT3 KO
C57Bl/6 vad típus anterográd pályajelölés GluN2A elleni
nyúl
1.4nm arany konjugált
nyúl elleni kecske
BSA-c/TBS-ben
oldott reagensek
C57Bl/6 vad típus
NMDA-receptor
kimutatása vGluT3-pozitív
terminálisokban
vGluT3 elleni
tengerimalac
biotinilált tengerimalac
elleni kecske BSA-c/TBS-ben
oldott reagensek GluN2A elleni
nyúl
1.4nm arany konjugált
nyúl elleni kecske
C57Bl/6 vad típus NL2 kimutatása vGluT3-
pozitív terminálisokban
vGluT3 elleni
tengerimalac
biotinilált tengerimalac
elleni kecske TBS-ben oldott
reagensek NL2 elleni nyúl
1.4nm arany konjugált
nyúl elleni kecske
63
A metszetek alapos TBS-sel vagy BSA-c/TBS-sel történő átmosása után a NL2 és
az NMDA-receptorok detektálására használt metszeteken 15 percig 2%-os
glutáraldehides fixálást alkalmaztunk, hogy az aranyszemcséket a szövethez rögzítsük.
Ezután a vGluT3- vagy a BDA-jelölés előhívásához a metszeteket 3 órán keresztül
avidin-biotinilált tormaperoxidáz komplex oldatban inkubáltuk (ABC Elite, 1:1:300,
Vector Laboratories), melyet TBS-ben, majd 7.6-os pH-jú tris pufferben (TB) történő
mosás és 3,3’diaminobenzidinben (DAB; Sigma-Aldrich) való inkubáció követett. A
DAB-ot 1 ml-enként 2 µl 0.5%-os hidrogén-peroxid hozzáadásával hívtuk elő. Az
immunperoxidáz reakciót alapos, 0.1M-os PB-ben történő mosás követte, majd a NL2 és
az NMDA-receptorok kimutatására használt metszeteket intenzifikálás előkészítő
oldatban (ECS; Aurion) inkubáltuk. Az immunarany jelölést ezüst-intenzifikálással tettük
erősebbé (SE-EM kit; Aurion). A metszeteket végül 0.5%-os ozmium-tetroxid oldattal
kezeltük és felszálló alkoholsorral és acetonitrillel víztelenítettük. A víztelenítés során a
metszeteket 1%-os uranilacetáttal kontrasztoztuk. A metszeteket végül epoxigyantába
(Durcupan, ACM, Fluka, Buchs, Svájc) ágyaztuk. A beágyazás után a metszetekből a
vizsgálni kívánt területeket kivágtuk, azokat epoxigyanta blokkokra ragasztottuk, és
ultramikrotóm (Leica EM UC6, Nussloch, Németország) segítségével 70-100 nm-es
ultravékony metszeteket készítettünk belőlük. A mintákat Hitachi H-7100-as
elektronmikroszkóp (Tokió, Japán) segítségével vizsgáltuk, a felvételek készítéséhez egy
Veleta CCD-kamerát (Olympus Soft Imaging Solutions) használtunk.
VI.9. Elektronmikroszkópos mérések
Teljesen rekonstruáltunk véletlenszerűen kiválasztott, vGluT3-pozitív
terminálisokat a hippokampuszban, melyek a stratum radiatum és lacunosum-moleculare
határán található interneuronok sejttestjére vagy proximális dendritjeire adtak
szinapszisokat; ezen terminálisok legnagyobb része a MRR-ban található sejtektől ered
(Somogyi és mtsai 2004). Az anterográd pályajelölést tartalmazó kísérletekben a
hippokampusz, a medialis szeptum és a medialis prefrontális kéreg területén található
BDA-pozitív terminálisokat rekonstruáltunk. Ezeknek a szinapszisoknak a
posztszinaptikus membránjához asszociált (attól 40 nm-nél nem távolabb található)
immunarany jelölés alapján határoztuk meg a szinapszisok NL2- és NMDA-receptor
64
tartalmát. A 40nm-es távolságot a következők alapján határoztuk meg: a NL2 és a
NMDA-receptorok GluN2A alegységének C-terminális vége pár nm-re belóg a membrán
intracelluláris oldalán. Ehhez egy primer IgG antitest és egy szekunder Fab’-töredék
antitest kötődik. Atomerő-mikroszkópos, és egy-részecske elektrontomográfiai adatok
alapján (San Paulo és García 2000; Zhang és Ren 2012) egy IgG molekulát 15-18nm, egy
Fab’-töredéket pedig 6-7 nm hosszúságúnak számolva, hozzászámolva az
ezüstintenzifikált aranyszemcse 10-15 nm-es átmérőjét, adódik a 40 nm-es sáv, amiben a
mérést végeztük, ezzel biztosítva, hogy ne zárjunk ki valós jelölést.
A posztszinaptikus membránhoz asszociált jelölés mellett megszámoltuk a
GluN2A-immunarany-jelölés sűrűségét jelöletlen aszimmetrikus szinapszisok
posztszinaptikus membránján, az ugyanezen szinapszisok szélétől 200-200 nm-re
kétoldalt található extraszinaptikus membránszakaszokon, valamint a háttérjelölés
erősségének meghatározása érdekében ugyanezen szinapszisok preszinaptikus
terminálisainak membránján. A NL2-immunarany-jelölés jel-zaj arányát már korábban,
hasonló mérések segítségével megállapítottuk (Takács és mtsai 2013). Méréseink során
az immunarany-jelölés sűrűsége a posztszinaptikus membránokhoz asszociáltan a
GluN2A-jelölés esetében 30-120-szor nagyobbnak, a NL2-jelölés esetében 240-szer
nagyobbnak adódott a háttérhez képest, mely tovább bizonyítja az immunreakciók jó
minőségét és az antitestek specificitását.
A vizsgált szinapszisok területét minden esetben sorozatmetszeteken teljesen
rekonstruáltuk. Mivel a nagyobb szinapszisok felülreprezentáltak lehetnek, ha nem
alkalmazunk sztereológiai szabályokat, így egy adott, véletlenszerűen kiválasztott,
elegendő hosszúságú metszetsorozaton minden szinapszis területét megmértük, amely
egy adott metszeten kezdődött, de az eggyel felette lévő biztonsági metszeten nem volt
megtalálható. Így a szinapszisok méretére való tekintet nélkül tudtuk megmérni azok
területét. Mivel a legnagyobb jelöletlen aszimmetrikus szinapszisok is legfeljebb 6 db 100
nm vastag metszetből rekonstruálhatók voltak, csak olyan metszetsorozatokat
használtunk, melyek legalább 6 metszetet tartalmaztak a tesztelt térfogat alatt.
65
VII . EREDMÉNYEK
VII.1. A median raphe régió sejttípusai
A célkitűzéseink 1a-1d pontjainak vizsgálata céljából immunhisztokémiai
festéseket végeztünk, és sztereológiai módszereket alkalmaztunk. Ezek segítségével 10
különböző fenotípusú sejtet tudtunk elkülöníteni a MRR-ban. Három különböző,
genetikailag módosított egértörzsekből származó egereket, és egy darab vad típusú egeret
használtunk fel ezekhez a vizsgálatokhoz. Az egerek egymáshoz korban illő, fiatal,
ivarérett hímek voltak; a vizsgálatok során azt tapasztaltuk, hogy a becsült sejtszámokat
nem befolyásolja az, hogy az egerek milyen genetikai háttérrel rendelkeztek.
Két kísérlettípust (A-típusú és B-típusú kísérlet) hajtottunk végre annak
érdekében, hogy a MRR sejtjeinek fenotípusát feltérképezzük. Az A-típusú kísérletben
az volt a cél, hogy meghatározzuk a MRR-ban található „csak 5HT-pozitív” (SO), „csak
vGluT3-pozitív” (GO), „5HT és vGluT3-pozitív” (SG), vGAT-pozitív és ePet-pozitív
idegejtek számát és egymáshoz viszonyított arányát. Ezért ebben a kísérletben külön
festettük meg a 5HT-t és a vGluT3-mat. A B-típusú kísérletben az elsődleges cél az összes
MRR-ban található neuron számának és a többi sejttípushoz képesti arányának
meghatározása volt; ebben a festésben a Neu-N jelölésnek köszönhetően azokat a sejteket
is azonosítani tudtuk, amelyek a fenti markerekre immunonegatívak voltak, viszont mivel
csak négy fluoreszcens csatornát tudtunk elkülöníteni, itt a 5HT-t és vGluT3-mat
ugyanabban a fluoreszcens csatornában hívtuk elő (4. táblázat).
A sejtmagokat DAPI-val jelöltük meg; a vGAT illetve ePet-pozitív sejteket
genetikailag kódolt fluoreszcens fehérjék segítségével azonosítottuk; a Neu-N, a 5HT, és
a vGluT3 megjelöléséhez immunhisztokémiai reakciókat használtunk (13. és 14. ábra).
Az egyes markerek általános jelölési mintázata megfelelt annak, amelyet előzetesen
vártunk; továbbá minden egyes jelölésünk egyértelműen meghatározható festést adott,
mely a háttértől jól elkülönült. A torzításmentes sztereológiai módszereknek
köszönhetően meg tudtuk határozni a MRR különböző fenotípusú
66
13. ábra: A MRR különböző sejttípusainak sztereológiai méréseihez használt képek,
melyek vGAT-IRES-Cre-zsGreen (A és B sorozat) és vGAT-IRES-Cre-tdTomato (C és D
sorozat) transzgenikus egerek agyából, konfokális lézer-pásztázó mikroszkópiával
készültek. A vGAT-pozitív sejtek megjelöléséhez használt genetikai markert mindkét
egértörzsben zöldre színeztük (A3-D3). A sejtmagokat minden esetben DAPI-val jelöltük
meg (A4-D4). A „B-típusú” kísérletekben (A1-A4, C1-C4) az idegsejteket Neu-N festéssel
azonosítottuk (piros), a 5HT és/vagy vGluT3-pozitív sejteket pedig ugyanabban a
fluoreszcens csatornában hívtuk elő (fehér). Egyes sejtek csak Neu-N-pozitívak („hármas
negatív”) voltak (teli kör), mások 5HT és/vagy vGluT3-pozitivitást is mutattak (teli
négyzet), megint mások csak vGAT-pozitívak voltak (csillag). Az „A-típusú” kísérletekben
(B1-B4, D1-D4) a 5HT-pozitív (fehér) és a vGluT3-pozitív (piros) sejteket külön
fluoreszcens csatornákban jelenítettük meg. SO (teli kör), GO (teli négyzet), SG (üres
kör), „vGluT3- és vGAT”-pozitív (üres négyzet), valamint „csak vGAT-pozitív” (csillag)
sejteket tudtunk megkülönböztetni. Lépték: minden képre 50 μm. Az ábra 13%-ban Szőnyi
András, 62%-ban Sós Katalin Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredménye.
67
sejtjeinek abszolút számát, ebből pedig ki tudtuk számolni azok egymáshoz viszonyított
arányát.
Minden kísérletben használtunk DAPI-festést, mely a sejtmagokat erősen
megjelölte; ez a jelölés szolgált a sejtek azonosítására (15. ábra, A). Az egyes
állattörzsekben használt genetikailag kódolt fluoreszcens jelölőanyagok egyenletesen
erős szomatikus jelet adtak a vGAT- illetve ePet-pozitív sejtek citoplazmájában. Minden
kísérletben találtunk olyan sejteket, amelyek csak ezt a genetikailag kódolt jelölőanyagot
tartalmazták, ezek voltak a „csak vGAT-pozitív” illetve „csak ePet-pozitív” sejtek.
14. ábra: A MRR különböző sejttípusainak sztereológiai méréseihez használt képek,
melyek ePet-IRES-Cre-zsGreen transzgenikus egerek agyából, konfokális lézer-pásztázó
mikroszkópiával készültek, az „A-típusú” kísérletben. Az ePet genetikai jelölését zölddel,
a DAPI-t kékkel, a 5HT-t fehérrel, a vGluT3-mat pirossal jelöltük, külön fluoreszcens
csatornákban. Egyes SO sejtek ePet-pozitívak voltak (teli kör), mások ePet-negatívak
(üres kör); találtunk ePet-pozitív GO sejteket (tele négyzet) és ePet-negatív GO sejteket
(üres négyzet); és voltak ePet-pozitív SG (tele rombusz) és ePet-negatív SG (üres
rombusz) sejtek is. Végül egyes sejtek csak ePet-pozitívak (csillag) voltak.
Lépték: minden képre 50 μm. Az ábra 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin
Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredménye.
68
A B-típusú kísérletben használt Neu-N jelölés szintén egyértelműen erős jelet
adott a neuronok sejtmagjában, illetve valamivel halványabbat azok citoplazmájában.
Ezekben a kísérletekben is találtunk olyan sejteket, amelyek csak a Neu-N-t fejezték ki,
ezeket „hármas negatív” (a három neurotranszmitter-rendszer jelöléseire negatív, azaz
5HT-, vGluT3- és vGAT-negatív) sejteknek neveztük. A B-típusú kísérletekben találtunk
továbbá olyan sejteket is, amelyek 5HT-t és/vagy vGluT3-mat tartalmaztak (13. ábra,
A1-A4, C1-C4).
Az A-típusú kísérletekben mind a 5HT-, mind a vGluT3-jelölés megfestette a
sejtek szómájának és proximális dendritjeinek citoplazmáját, valamint azok lokális
terminálisfelhőjét is. Azon A-típusú kísérletekben, ahol a vGAT-pozitív sejtek
tartalmaztak fluoreszcens jelölőanyagot, meg tudtunk különböztetni „csak 5HT-pozitív”
(SO), „csak vGluT3-pozitív” (GO), „5HT és vGluT3-pozitív” (SG), „vGluT3- és vGAT-
pozitív”, valamint „csak vGAT-pozitív” sejteket is (13. ábra, B1-B4, D1-D4). Azokban
az A-típusú kísérletekben, ahol az ePet-pozitív sejtek tartalmaztak fluoreszcens
jelölőanyagot, meg tudtunk figyelni ePet-pozitív, illetve ePet-negatív SO, GO és SG
típusú sejteket is (14. ábra). A fentiek alapján megszámolt különböző típusú sejtek
darabszámát az egyes állatokban és agyterületekben a 6. és 7. táblázat mutatja be
(célkitűzéseink 1a pontjának megfelelően).
Célkitűzéseink 1b-1c pontjainak megfelelően a fenti számok alapján meg tudtuk
határozni az egyes sejtek százalékos arányát a MRR-ban, és annak alrégióiban, a MR-ban
és a PMR-ban is (15. ábra). Röviden összefoglalva azt találtuk, hogy a MR-ban a
neuronoknak mintegy 8.5%-a SO sejt, mintegy 26%-uk GO sejt, és 12.8%-uk SG sejt. Az
idegsejtek 37.2%-a „csak vGAT-pozitív” volt, és mintegy 14.4%-uk tartozott a „hármas
negatív” populációba (15. ábra, B). A PMR-ban az idegsejteknek összesen csupán
mintegy 6.4%-a tartalmazott 5HT-t és/vagy vGluT3-mat, de ezek a sejtek többnyire a
PMR MR-hoz közeli határán helyezkedtek el, melyet az egér sztereotaxiás atlasz (Paxinos
és Franklin, 2012) alapján határoztunk meg. Az összes PMR-ben található neuron
mintegy 66.8%-a volt „csak vGAT-pozitív”, és mintegy 27.7%-uk tartozott a „hármas
negatív” csoportba. Soha nem figyeltünk meg kolokalizációt az 5HT és a vGAT esetében,
és a „vGluT3- és vGAT-pozitív” sejtek száma is nagyon alacsony volt (15. ábra, C).
69
6. táblázat: A median raphéban található különböző sejttípusok darabszámának
sztereológiai becslése. A táblázat adatai 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin
Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredményei.
A median rapheban mért sejtszámok 8 egérben
Jelölt sejttípusok GM1 GM2 GM3 GM4 WT PM1 PM2 PM3 Átlag
Nem neuronális sejtek,
csak DAPI-pozitív 11269 10449 10672 11928 - - - - 11079
Minden idegsejt (az összes egérből gyűjtött adatok alapján kiszámolva, minden jelölt sejttípus átlagos
számát felhasználva) 8160
Minden 5HT-pozitív sejt,
vGluT3 jelölés nélkül -
“SO”-ként rövidítve
1310 515 573 662 640 807 351 697 695
⇾ ezekből az ePET-pozitív
sejtek: - - - - - 380 240 378 333
Minden vGluT3-pozitív
sejt , 5HT jelölés nélkül -
“GO”-ként rövidítve
1840 2078 2209 2055 2041 2209 2591 1957 2123
⇾ ezekből az ePET-pozitív
sejtek: - - - - - 906 886 959 917
Minden 5-HT és vGluT3
kettős pozitív sejt -
“SG”-ként rövidítve
627 890 904 940 1408 1427 1014 1126 1042
⇾ ezekből az ePET-pozitív
sejtek: - - - - - 1002 705 891 866
Minden 5-HT és/vagy
vGluT3-pozitív sejt 3655 3450 3426 3620 4089 4862 3957 3780 3855
Minden vGAT-pozitív sejt,
5-HT és vGluT3 jelölés
nélkül
3105 3190 2619 3222 - - - - 3034
Minden vGAT és vGluT3
kettős pozitív sejt,
5-HT jelölés nélkül
35 149 93 65 - - - - 86
Minden Neu-pozitív sejt
(hármas negatív),
5HT, vGluT3 és VGAT
jelölés nélkül
597 712 1632 1782 - - - - 910
Minden ePET-pozitív sejt,
5-HT és/vagy vGluT3 jelölés
nélkül
- - - - - 68 451 296 271
70
7. táblázat: A paramedian raphéban és a median raphe régióban található különböző
sejttípusok darabszámának sztereológiai becslése. A táblázat adatai 13%-ban Szőnyi
András, 62%-ban Sós Katalin Eszter, 25%-ban Mayer Márton munkájának eredményei.
A paramedian rapheban mért sejtek száma
A MRR-ban
mért sejtek
száma
(A MR-ban és
PMR-ban
mért
sejtszámok
összege)
Jelölt sejttípusok GM1 GM2 GM3 GM4 Mean
Nem neuronális sejtek, csak DAPI-
pozitív 69924 59634 71573 71472 68151 79230
Minden idegsejt (az összes egérből gyűjtött adatok alapján kiszámolva, minden jelölt
sejttípus átlagos számát felhasználva) 39298 47458
Minden 5HT-pozitív sejt, vGluT3 jelölés
nélkül –
“SO”-ként rövidítve
264 0 795 221 320 1015
⇾ ezekből az ePET-pozitív sejtek: (a 15. ábrán lévő arányok alapján számolva): 153 533
Minden vGluT3-pozitív sejt , 5HT
jelölés nélkül -
“GO”-ként rövidítve
751 1143 2094 899 1222 3344
⇾ ezekből az ePET-pozitív sejtek: ( a 15. ábrán lévő arányok alapján számolva): 528 1445
Minden 5-HT és vGluT3 kettős pozitív
sejt -
“SG”-ként rövidítve
1438 217 555 460 668 1710
⇾ ezekből az ePET-pozitív sejtek: a 15. ábrán lévő arányok alapján számolva): 555 1421
Minden 5-HT és/vagy vGluT3-pozitív
sejt 2514 1535 3013 1785 2212 6067
Minden vGAT-pozitív sejt, 5-HT és
vGluT3 jelölés nélkül 33486 25728 25035 19445 25924 28958
Minden vGAT és vGluT3 kettős pozitív
sejt, 5-HT jelölés nélkül 244 578 234 130 297 383
Minden Neu-pozitív sejt (hármas
negatív), 5HT, vGluT3 és VGAT jelölés
nélkül
9017 8646 11991 13820 10710 12049
Minden ePET-pozitív sejt, 5-HT és/vagy vGluT3 jelölés nélkül ( a 15. ábrán lévő
arányok alapján számolva) 159 430
71
15. ábra: A sztereológiai mérések alapján meghatározott különböző sejttípusok száma és
aránya a MRR-ban, 8 egérben végzett mérések alapján meghatározva. A: a MRR-ban és
annak részterületein található idegsejtek és egyéb sejtek száma. B, C: A MR-ban és a
PMR-ban található különböző sejttípusok, és azok ePet-pozitvitása. D: A vGluT3- és
5HT-pozitivitás eloszlása az ePet-pozitív sejtekben a MR-ban és a PMR-ban. Mivel a
PMR-ben csak szemikvantitatív módszerrel határoztuk meg az ePet-pozitív sejtek számát,
pontos értéket nem közlünk, de az érték a többi kördiagramból kiszámolható (1395 db).
E: A MRR-ban található különböző sejttípusok, és azok ePet-pozitvitása, összesítve. Az
ábra 13%-ban Szőnyi András, 62%-ban Sós Katalin Eszter, 25%-ban Mayer Márton
munkájának eredménye.
72
Mivel az egér MR igen kicsi terület, és az egyes, MR-ban található idegsejtek
dendritjei átnyúlnak a PMR-ba, valamint a PMR-ben található idegsejtek dendritjei is
beleérnek a MR területébe, célszerűnek tartottuk a fenti adatokat a teljes MRR területére
is megadni. Funkcionális szempontból is helytállónak tűnik ez a megközelítés, hiszen
gyakorlatilag lehetetlen, a MR-ban vagy a PMR-ban található idegsejtpopulációk külön
történő vizsgálata akár elektromos stimulációt, akár farmakológiai, akár a legmodernebb
optogenetikai módszereket vesszük számításba. Bár az egyes idegsejtpopulációk
genetikai megjelölése a MRR-ban található neuronok alpopulációit külön-külön
vizsgálhatóvá teszi, a MR-ban és a PMR-ban található, azonos alpopulációba tartozó
idegsejtekre is hatnának ezek a vizsgálatok.
Ez alapján azt találtuk, hogy a MRR-ban található összes idegsejt mintegy csupán
2.1%-a SO sejt, 7.0%-a GO sejt és 3.6%-a SG sejt; a „csak vGAT-pozitív” sejtek aránya
mintegy 61.0%, a „hármas negatív”, még nem azonosított populációba tartozó sejtek
pedig mintegy 25.4%-ot tesznek ki (15. ábra, E).
VII.2. Az ePet-pozitív sejtek eloszlása a median raphe régióban
A korábbi szakirodalmi adatok alapján úgy gondolták, hogy a PET1 trankripsziós
faktor enhancer régiójának, az ePet-nek a kifejeződése specifikus a szerotonerg sejtekre;
ennek a kérdésnek a pontosabb vizsgálatát célozta célkitűzéseink 1d pontja. Saját
kísérleteink során azonban azt tapasztaltuk, hogy részben eltérő festési mintázatot ad az
ePet és a 5HT megjelölése. Még olyan neuronokat is találtunk, amelyek a „hármas
negatív” populációba tartoztak, és kifejezték az ePet-et („csak ePet-pozitív sejtek”).
Habár ebben a kísérleti felállásban nem tudtuk direkt módon bizonyítani, hogy az ePet-
és a vGAT-pozitív idegsejtek között nincs átfedés, mégis ezt tartjuk a legvalószínűbbnek.
Ennek egyfelől az az oka, hogy a két sejtpopuláció eloszlása nagyon eltérő, az ePet-
pozitív sejtek legnagyobb része a MR-ban, míg a vGAT-pozitív sejtek legnagyobb része
a PMR-ban helyezkedik el. Emellett az SO és SG sejtek, melyek részben ePet-pozitívak,
soha nem mutattak vGAT-pozitivitást. Továbbá általában véve a serkentő és a gátló
neurotranszmittereket kifejező sejtek eltérő sejtvonalból erednek, így valószínűtlennek
tűnik hogy a „csak vGAT-pozitív” sejtek ePet-et is kifejeznének. Így minden ePet-pozitív
idegsejtet, mely nem mutatott 5HT és/vagy vGluT3-pozitivitást, a „hármas negatív”
73
populációba soroltunk. Összesen 4 különböző sejtpopulációban is találtunk ePet-pozitív
sejteket (14. ábra).
Mivel a MR és PMR közötti határvonal mesterséges, minden okunk megvan azt
feltételezni, hogy az egyes idegsejtpopulációk a MRR-ban ugyanazokba a
populációtípusokba tartoznak, függetlenül attól, hogy a MR-ban vagy a PMR-ban
helyezkednek-e el. Mivel ez vonatkozik az ePet-pozitív sejtekre is, a PMR-ban található
ePet-pozitív sejtek arányát a MR-ban számolt arányokból következtettük vissza.
Azonban, hogy tovább erősítsük a PMR-ben található ePet-pozitív sejtekre vonatkozó
adatainkat, egy egér PMR-ban egy szemikvantitatív módszerrel megszámoltuk az ott
található ePet-pozitív sejteket. Ehhez egy reprezentatív mintát vettünk a PMR-ban
található ePet-pozitív sejtekből (összesen 425 db-ot számoltunk meg), egy A-típusú
kísérletből. Itt ez a módszer bizonyult hatékonyabbnak, ugyanis a teljesen kvantitatív,
torzításmentes sztereológiai méréssel a PMR-ben elfogadhatatlanul kicsi ePet-pozitív
sejtmintához jutottunk volna. Ebben a mérésben az arányok hasonlóak voltak a MR-ban
talált arányokhoz, mely tovább bizonyítja, hogy a MR-ban és a PMR-ban található sejtek
ugyanabba a populációba tartoznak (15. ábra, D)
VII.3. A median raphe régió sejtjeinek előagyi vetítési mintázata
A MRR-ból az előagyba való vetítést klasszikusan egy szerotonerg pályának
tartjuk (Hensler és mtsai 2006). Kvantitatív, torzításmentes sztereológiai méréseink azt
mutatják, hogy a MRR sejtjeinek legnagyobb része nem 5HT-tartalmú, továbbá a 5HT-
tartalmú sejtek jelentős része vGluT3-mat is tartalmaz, így glutamaterg transzmisszióra
is képes (15. ábra). Ezen adatok tükrében, a célkitűzéseink 2a pontjának megfelelően,
meg akartuk vizsgálni, hogy mennyire jellemző a különböző típusú sejtek vetítése az
előagy területére. Három agyterületet választottunk ki erre a célra: a hippokampuszt
(HIPP), a mediális szeptumot (MS) és a medialis prefrontális kérget (mPFC), melyek
mind erős beidegzést kapnak a MRR-ból. Ezekre az agyterületekre különböző retrográd
pályajelölő anyagokat juttatunk: 3 egérben a mPFC területére FG-ot, 2 egérben a MS
területére CTB-t valamint 1 egérben a HIPP területére CTB-t injektáltunk. Mivel
patkányban a MRR-ból a HIPP-ba és a MS-ba vetítő rostok neurokémiai tulajdonságait
már leírták (Jackson és mtsai 2009), mi egérben csupán megerősítő vizsgálatokat
74
végeztünk. 8-14 nappal a retrogád pályajelölő anyagok injektálása után fluoreszcensen
megjelöltük a MRR-ban a 5HT- és vGluT3-tartalmú sejteket. Minden fluoreszcens
csatornában egyértelmű jelölést kaptunk; a 5HT és vGluT3 a már fent leírt festési
mintázatot mutatta; a FG és a CTB a retrográd megjelölt idegsejtek szómájában és
legproximálisabb dendritjeiben adott erős citoplazmatikus jelölést.
8. táblázat: A retrográd pályajelöléssel megjelölt sejtek neurokémiai tulajdonságai. A
táblázat adatai 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban Mayer Márton munkájának
eredményei.
Retrográd pályajelölő
anyaggal
jelölt célterület
A MRR-ban
retrográd
visszajelölt
sejtek száma
A MRR-ben retrográd visszajelölt sejtek
neurokémiai tulajdonságai
SG
sejtek
GO
sejtek
SO
sejtek
jelöletlen
sejtek
Hippokampusz (egér 5) 391 49% 31% 8% 12%
Mediális szeptum (egér 6) 850 19% 34% 13% 34%
Mediális szeptum (egér 7) 710 21% 47% 10% 21%
Mediális PFC (egér 5) 506 32% 38% 21% 9%
Mediális PFC (egér 6) 555 24% 45% 16% 15%
Mediális PFC (egér 7) 334 29% 46% 10% 15%
A méréseink során kapott értékeket a 8. táblázat mutatja. Röviden összefoglalva
azt tapasztaltuk, hogy a mPFC-be vetítő sejtek átlagosan mintegy 45%-a csak vGluT3-
mat tartalmazott, átlagosan mintegy 30%-uk 5HT- és vGluT3-pozitív volt, és csupán
átlagosan mintegy 15%-uk tartalmazott csak 5HT-t. A HIPP és MS esetében a patkányban
már leírt számadatokhoz hasonló eredményeket kaptunk: a HIPP-ba vetítő sejtek mintegy
31%-a csak vGluT3-pozitív, mintegy 49%-a 5HT- és vGluT3-pozitív, és mintegy 8%-a
csak 5HT-pozitív volt; a MS-ba vetítő sejtek átlagosan mintegy 40%-a volt csak vGluT3-
pozitív, átlagosan mintegy 20%-a 5HT- és vGluT3-pozitív, és átlagosan mintegy 10%-a
csak 5HT-pozitív.
Minden pályajelölés során megfigyeltünk olyan sejteket is, amelyek sem 5HT-t,
sem vGluT3-mat nem tartalmaztak. A HIPP és a mPFC esetében ez a visszajelölt sejtek
legfeljebb 15%-át érintette, a MS-ba történt beadások esetén azonban akár a visszajelölt
sejtek 34%-át. Mivel a kísérletekben használt antitestek szenzitivitását alaposan teszteltük
75
(lásd VIII.1. fejezet), ezek a sejtek valóban negatívnak tekinthetőek. Valószínűnek
tartjuk, hogy ezek a sejtek a fent leírt GABAerg és/vagy „hármas negatív” populációkba
tartoznak, de mivel csak négy fluoreszcens csatornát tudtunk megjeleníteni, vGAT-
riporter egerekbe nem adtunk retrográd pályajelölő anyagot, ezért ezen sejteket
neurokémiailag nem azonosítottuk.
Összességében véve azt figyeltük meg, hogy a korábbi elgondolással szemben a
MRR-ból az előagyba vetítő sejtek legnagyobb része glutamaterg, vGluT3-pozitív, tehát
képes egy igen hatékony és gyors serkentő hatást közvetíteni a beidegzett agyterületeken.
VII.4. A median raphe régió sejtjei egyszerre több agyterületet is beidegeznek
Mivel azt tapasztaltuk, hogy a MRR-ból az előagyba vetítő sejtek legnagyobb része képes
a glutamaterg transzmisszióra, így egy hatékony és gyors serkentő hatást közvetíthet a
célterületein, célkitűzéseink 4a pontjának megfelelően meg akartuk vizsgálni, hogy egyes
MRR sejtek több agyterületet is beidegeznek-e egyszerre. Ebben az esetben ugyanis ezek
a sejtek képesek lehetnének a különböző agyterületeken gyors és hatékony, szinkron
hatást létrehozni. Hogy ezt megvizsgáljuk, kettős retrográd pályajelölést végeztünk;
ennek során 7 egér mediális prefrontális kérgébe FG-ot injektáltunk, melyből 4 egér
medális szeptumába, valamint 3 egér hippokampuszába párhuzamosan CTB-t adtunk.
Megfelelő túlélési idő után megvizsgáltuk, hogy a MRR-ban vannak-e olyan sejtek,
melyek mindkét retrográd pályajelölő anyagot tartalmazzák (9. és 10. táblázat).
Mivel már ismert volt, hogy vannak a MRR-ban a HIPP és MS területére
egyszerre vetítő sejtek, és ezek neurokémiai jellemzőit is részben leírták (Acsády és mtsai
1996; McKenna és Vertes 2001), HIPP-MS kettős retrográd pályajelölést nem végeztünk.
Azonban az eddig még nem vizsgált mPFC-HIPP és mPFC-MS kettős pályajelölés
esetében is azt tapasztaltuk, hogy a MRR sejtjeinek jelentős része beidegzi mindkét
elárasztott agyterületet. A mPFC-HIPP kettős pályajelölés esetében, abban az egérben,
amelyben a legnagyobb mértékben sikerült elárasztani a célzott előagyi területeket, a
MRR sejtjeinek átlagosan mintegy 9-12%-a mindkét agyterületet beidegezte. A mPFC-
MS kettős pályajelölés esetében ez átlagosan mintegy 11-16%-nak adódott (9. és 10.
táblázat).
76
9. táblázat: Hippokampusz-mPFC kettős retrográd pályajelölési kísérletek és a két
agyterületre vetítő sejtek neurokémiai tulajdonságai. A táblázat adatai 80%-ban Szőnyi
András, 20%-ban Mayer Márton munkájának eredményei.
Állat azonosítója: Egér 1 Egér 2 Egér 5
Az egyik oldali hippokampusz pályajelölő anyaggal megjelölt
térfogata (százalék) 11% 12% 13%
Az egyik oldali mPFC pályajelölő anyaggal megjelölt
térfogata (százalék) 8% 9% 13%
A hippokampuszba vetítő sejtek azon része, amelyek a mPFC
pályajelölő anyaggal jelölt részére vetítenek
9/166
(5.4%)
11/96
(11.5%)
46/391
(11.9%)
A mPFC-be vetítő sejtek azon része. amelyek a hippokampusz
pályajelölő anyaggal jelölt részére vetítenek
9/156
(5.8%)
11/304
(3.6%)
46/506
(8.7%)
A két agyterület pályajelölő anyaggal jelölt
területére vetítő sejtek neurokémiai
jellemzése
SG sejtek - - 71%
GO sejtek - - 20%
SO sejtek - - 9%
jelöletlen sejtek - - 0%
10. táblázat: MS-mPFC kettős retrográd pályajelölési kísérletek. és a két agyterületre
vetítő sejtek neurokémiai tulajdonságai. A táblázat adatai 80%-ban Szőnyi András, 20%-
ban Mayer Márton munkájának eredményei.
Állat azonosítója: Egér 3 Egér 4 Egér 6 Egér 7
A MS pályajelölő anyaggal megjelölt térfogata
(százalék) 16% 11% 23% 9%
A kétoldali mPFC pályajelölő anyaggal megjelölt
térfogata (százalék) 21% 24% 17% 21%
A MS-ba vetítő sejtek azon része. amelyek a mPFC
pályajelölő anyaggal jelölt részére vetítenek
23/395
(5.8%)
30/319
(9.4%)
91/850
(10.9%)
64/710
(9.2%)
A mPFC-be vetítő sejtek azon része. amelyek a MS
pályajelölő anyaggal jelölt részére vetítenek
23/686
(3.4%)
30/1050
(2.9%)
91/555
(16.0%)
64/334
(18.6%)
A két agyterület pályajelölő
anyaggal jelölt területére vetítő
sejtek neurokémiai jellemzése
SG sejtek - - 32% 37%
GO sejtek - - 35% 56%
SO sejtek - - 15% 5%
jelöletlen sejtek - - 18% 3%
77
Fontos megjegyezni, hogy ezek az eredmények mindenképpen alulbecslik a
mindkét agyterületet egyszerre beidegezni képes idegsejtek arányát. Ennek az okai, hogy
nem lehet úgy elárasztani egy agyterületet pályajelölő anyaggal, hogy annak teljes
területét elérjük, viszont más területre ne kerüljön pályajelölő anyag, így a célzott
agyterületnek mindig csupán egy részéről jelölünk vissza sejteket. Az agyterületen belül
is változhat a beadóanyag koncentrációja, továbbá az egyes agyterületekre érkező rostok
sűrűsége az agyterületen belül is változhat, így az egyes beadások hatékonysága nagyon
változó lehet. Végül a különböző típusú sejtek más-más hatékonysággal szállíthatják a
különböző beadóanyagokat.
A fenti vizsgálatok mellett a mPFC-HIPP retrográd pályajelölések esetében 1
egérben (16. ábra), a mPFC-MS pályajelölések esetében 2 egérben (17. ábra)
megvizsgáltuk a két helyre vetítő sejtek neurokémiai tulajdonságait is. Az tapasztaltuk,
hogy a mPFC-be és MS-ba vetítő sejtek átlagosan mintegy 45%-a csak vGluT3-pozitív,
átlagosan mintegy 35%-a vGluT3 és 5HT-pozitív, valamint átlagosan mintegy 10%-a
csak 5HT-pozitív volt. A mPFC-be és HIPP-ba vetítő sejtek mintegy 20%-a csak vGluT3-
pozitív, mintegy 71%-a vGluT3 és 5HT-pozitív, és mintegy 9%-a csak 5HT-pozitív volt.
Az egyszerre két agyterületre vetítő sejtek döntő többsége tehát képes a glutamaterg
transzmisszióra, így a beidegzett célsejtek aktivitásának egyszerre, szinkron történő
befolyásolására. A retrográd pályajelöléses kísérletekből nyert adatok összefoglalása a
18. ábrán látható.
78
16. ábra: A MRR
sejtjei egyszerre
vetítenek a mPFC-be
és a HIPP-ba. A1-
A2: A fluo-reszcens
mikro-szkópiával
készült képek az
ugyanazon
agyfélteke mPFC-be
injektált FG (A1) és
HIPP-ba adott CTB
(A2) beadási helyét
mutatják. A met-
szeteken jelöltük a
mPFC és a HIPP
alrégióit.
Lépték: 200 μm mindkét képen. B1-B4: A MRR-ban retrográd pályajelöléssel megjelölt
mPFC-be vetítő FG-pozitív (zöld), HIPP-ba vetítő CTB-pozitív (piros), vGluT3-pozitív
(kék) és 5HT-pozitív (magenta) sejtek. A MR és a PMR határait a sztereotaxiás atlasz
(Paxinos és Franklin 2012) alapján határoztuk meg. A C-vel jelölt téglalap a C1-C4
képeken felnagyított sejtek helyzetét jelzi. Lépték: 100 μm minden képen. C1-C4: A MRR-
ban található, különböző területekre vetítő, eltérő neurokémiai tulajdonságú sejtek. Az
üres nyíl egy csak a mPFC-be vetítő, vGluT3- és 5HT-pozitív sejtet, a teli nyílhegy egy, a
MS-ba vetítő 5HT-pozitív sejtet jelöl. A teli nyilak mindkét agyterületre vetítő sejteket
jelölnek, melyek közül a felső vGluT3- és 5HT-pozitív, míg az alsó csak vGluT3-pozitív.
Lépték: 30 μm minden képen. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban Mayer Márton
munkájának eredménye.
79
17. ábra: A MRR
sejtjei egyszerre
vetítenek a mPFC-
be és a MS-ba. A1-
A2: A fluoreszcens
mikroszkópiával ké-
szült képek mindkét
agyfélteke mPFC-be
injektált FG (A1) és
a MS-ba adott CTB
(A2) beadási helyét
mutatják. A met-
szeteken jelöltük a
mPFC és a MS
alrégióit. Lépték:
200 μm mindkét
képen. B1-B4: A MRR-ban retrográd pályajelöléssel megjelölt mPFC-be vetítő FG-
pozitív (zöld), MS-ba vetítő CTB-pozitív (piros), vGluT3-pozitív (kék) és 5HT-pozitív
(magenta) sejtek. A MR és a PMR határait a sztereotaxiás atlasz (Paxinos és Franklin
2012) alapján határoztuk meg. A C-vel jelölt téglalap a C1-C4 képeken felnagyított sejtek
helyzetét jelzi. Lépték: 100 μm minden képen. C1-C4: A MRR-ban található, különböző
területekre vetítő, eltérő neurokémiai tulajdonságú sejtek. Az üres nyilak csak a mPFC-
be vetítő, vGluT3+ sejteket jelölnek, a teli nyílhegyek a MS-ba vetítő sejteket jelölnek,
melyek közül a felső vGluT3-pozitav, az alsó 5HT-pozitív. A teli nyilak mindkét
agyterületre vetítő sejteket jelölnek, melyek közül a felső vGluT3- és 5HT-pozitív, míg az
alsó csak vGluT3-pozitív. Lépték: 30 μm minden képen. Az ábra 80%-ban Szőnyi András,
20%-ban Mayer Márton munkájának eredménye.
80
18. ábra: A MRR-ból felszálló pályarendszerben résztvevő 5HT és/vagy vGluT3-pozitív
sejtek megoszlásának aránya. A kék nyilak az egyes területekre vetítő pályákat mutatják,
a téglalapokban az egyes területekre, vagy mindkét területre egyszerre vetítő sejtek
neurokémiai eloszlása látható, az azonosított sejttípusok százalékában.
VII.5. A median raphe régió előagyban létrehozott szinapszisai NMDA-
receptorokat tartalmaznak
Fenti vizsgálataink azt mutatják, hogy a MRR legnagyobb részben glutamaterg
sejtekkel célozza meg a mPFC-t, a MS-t és a HIPP-t. Célkitűzéseink 3a-3b pontjainak
megfelelően meg akartuk vizsgálni, hogy a MRR által létrehozott előagyi
szinapszisokban megvan-e a glutamaterg transzmisszióhoz szükséges molekuláris
felépítés. Mivel a klasszikus serkentő szinapszisok jelentős része posztszinaptikusan
NMDA-receptorokat fejez ki, megvizsgáltuk, hogy a MRR által létrehozott előagyi
szinapszisokban is megtalálható-e az NMDA-receptorok GluN2A alegysége. Ezekhez a
vizsgálatokhoz az anterográd pályajelölő anyag 10kDA BDA-t adtunk be vad típusú
egerek MRR-ba; csak olyan egereket használtunk, melyben a BDA a MRR-n kívüli
81
19. ábra: Az NMDA-receptorok GluN2A-alegysége megtalálható a MRR HIPP-ban
létrehozott szinapszisaiban. A: a fénymikroszkópiával készült felvétel a MRR-ba injektált
10 kDA BDA beadási helyét mutatja. A MR és PMR határait a sztereotaxiás atlasz
(Paxinos és Franklin 2012) alapján határoztuk meg. Lépték: 200 μm. B1-B3: A BDA-val
jelölt, DAB-csapadékot tartalmazó, MRR-ból származó terminális által létrehozott
szinapszis posztszinaptikus aktív zónájában ezüst-intenzifikált immunarany szemcsék
jelölik a GluN2A-alegység jelenlétét (nyílhegyek). A képsorozat a sorozatmetszeteken
teljesen rekonstruált ugyanazon szinapszis egyes ultravékony metszeteiről készült képeket
tartalmazza. C1-C3, D, E1-E2: A HIPP CA1 régiójának str. radiatum és str. lacunosum
moleculare határán elhelyezkedő interneuronok szómájára és proximális dendritjeire
érkező vGluT3-pozitív, DAB-csapadékkal jelölt terminálisok szinapszisainak
posztszinaptikus aktív zónájában ezüst-intenzifikált immunarany szemcsék jelölik a
GluN2A-alegység jelenlétét (nyílhegyek). A C1-C3 és E1-E2 képek ugyanazoknak a
szinapszisoknak a különböző ultravékony metszeteiről készültek. F: Az ugyanezen
interneuronok szómájára érkező vGluT3-pozitív terminálisok jelentős része nem
tartalmaz NL2-jelölést (görbe nyíl), míg a közvetlenül mellettük elhelyezkedő, DAB-
negatív GABAerg szimmetrikus szinapszisok NL2-pozitívak (nyílhegyek). Lépték: 300 nm
a B-F képeken. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban Mayer Márton munkájának
eredménye.
82
területeket nem festette meg (19. ábra, A). 7-10 nap túlélési idő után kettős immunarany-
immunperoxidáz jelölést végeztünk a GluN2A alegység és a BDA ellen. A BDA jelölés
a MRR előagyi rostjainak mintázatával egyezett az összes vizsgált agyterületen (Freund
és mtsai 1990; Vertes és mtsai 1999). A HIPP-ban a MRR rostjai legnagyobb sűrűségben
a str. radiatum és a str. lacunosum-moleculare határán helyezkedtek el, ahol lokális
interneuronok sejttestjeit és proximális dendritjeit idegezték be kosárszerűen
elhelyezkedő szinapszisokkal. Korrelált fény-és elektronmikroszkópia segítségével
teljesen rekonstruáltunk összesen 42 darab szinapszist (n=15, 12, 15; 3 egér), melyet
véletlenszerűen kiválasztott BDA-pozitív terminálisok hoztak létre a HIPP disztális
dendritikus régióiban. Méréseink szerint ezeknek a szinapszisoknak legalább egyharmada
tartalmazta az NMDA-receptorok GluN2A alegységét posztszinaptikusan (19. ábra B1-
B3, 20. ábra, C).
Bár a beágyazás előtti immunarany jelölés szemikvantitatív módszer, és az epitóp
abszolút mennyiségének meghatározására nem alkalmas, segítségével jól meg lehet
becsülni egyes membránszakaszok egymáshoz képesti epitópsűrűségét. Ezért a fenti
reakciókban teljesen rekonstruáltunk BDA-pozitív, MRR-ból származó szinapszisokat,
illetve lokális, DAB-csapadékot nem tartalmazó, aszimmetrikus (feltehetően
glutamaterg) szinapszisokat, ugyanis ez utóbbiakban is megtalálható volt az NMDA-
receptorok GluN2A alegysége. Ezután összehasonlítottuk az ezen szinapszisok
posztszinaptikus aktív zónájában található GluN2A immunarany-jelölés sűrűségét. A
teljes rekonstrukció során azt találtuk, hogy a MRR-ból érkező szinapszisok területe
átlagosan mintegy kétszer nagyobb, mint a lokális aszimmetrikus szinapszisoké (20.
ábra, E), viszont a GluN2A immunarany jelölés sűrűsége a két populációban nem tért el
egymástól (MRR: 0.41 ± 0.24 aranyrészecske/szinapszis, DAB-negatív aszimmetrikus:
0.38 ± 0.20 aranyrészecske/szinapszis), vagyis a MRR-ból érkező terminálisok által
létrehozott szinapszisok hasonló mennyiségű NMDA-receptort tartalmaznak, mint a
klasszikus serkentő szinapszisok. Emellett a korábban publikált adatokkal összhangban
(Szabadits és mtsai 2011) ritkán megfigyeltünk immunarany-jelölést extraszinaptikus
membránszakaszokon is. A DAB-negatív aszimmetrikus szinapszisok preszinaptikus
terminálisainak membránján mért háttérjelölés mértéke elhanyagolható volt (VI/9 fejezet,
20. ábra, D).
83
Az NMDA-receptorok megjelöléséhez pepszines emésztést kellett végrehajtani a
szöveten, hogy feltárjuk az antitest epitópját (Watanabe és mtsai 1998; Szabadits és mtsai
2011). Mivel a pepszinnel történő emésztés hatékonysága a szövet mélyebb rétegei felé
haladva csökken, eddigi eredményeinket megerősítendő a HIPP-ban kettős GluN2A-
vGluT3 immunarany-immunperoxidáz jelölést is végeztünk, hogy nagyobb mintát
tudjunk venni a szövet felszínéről, ahol a legjobb volt a GluN2A-jelölés jel-zaj aránya. A
vGluT3-jelölés a szakirodalomból ismert mintázatot adta a HIPP-ban (Somogyi és mtsai
2004). Mivel a HIPP-ban lokális vGluT3-pozitív interneuronok is találhatóak, melyek a
piramissejtek szómáját és proximális dendritjeit idegzik be (és amely jelölési mintázatot
a mi festésünk is mutatta), korrelált fény- és elektronmikroszkópia segítségével olyan
vGluT3-pozitív terminálisokból vettünk mintát, melyek a str. radiatum és str. lacunosum-
moleculare határán találhatóak, legnagyobb részben a MRR-ból erednek, és igazoltan az
ott található interneuronok szómájára vagy proximális dendritjeire adtak szinapszisokat.
2 egérben végzett méréseink szerint (n=20 szinapszis/egér) ezen szinapszisok majdnem
mindegyike tartalmazta a GluN2A alegységet a posztszinaptikus oldalon (19. ábra C-E,
20. ábra, A). Ebből a mintából is rekonstruáltunk lokális, aszimmetrikus DAB-negatív
szinapszisokat, és azt találtuk, hogy az egyes membránszakaszokon mért immunarany-
jelölés sűrűségének egymáshoz viszonyított aránya hasonló volt az anterográd-
pályajelölés során mért adatokhoz (20. ábra, B).
Bár a HIPP-ban található vGluT3-pozitív interneuronok terminálisainak
legnagyobb része a periszomatikus régióban található, előfordulhat, hogy néhány
terminálisuk a disztális dendritikus régiókban létesít szinapszist. Mivel a lokális vGluT3-
pozitív interneuronok GABAergek, az általuk létrehozott szinapszisok posztszinaptikus
oldalán megtalálható egy transzmembrán fehérje, a neuroligin-2 (NL2), mely csak a
GABAerg és kolinerg szinapszisokban található meg (Takács és mtsai 2013; Varoqueaux
és mtsai 2004). Ezért vGluT3-NL2 kettős immunarany-immunperoxidáz jelölést
végeztünk a disztális dendritikus régiókban található, lokális vGluT3-pozitív
interneuronoktól származó szinapszisok arányának meghatározására. A NL2 jelölés a
korábbi szakirodalmi adatoknak megfelelően posztszinaptikus membránokhoz
kapcsolódott (Takács és mtsai 2013). 2 egérben végzett méréseink
84
85
20. ábra: Az elektronmikroszkópos mérések során gyűjtött adatok összegzése. A: Az
oszlopok a str. radiatum és str. lacunosum-moleculare határán elhelyezkedő
interneuronok sejttestjeire vagy proximális dendritjeire érkező vGluT3-pozitív
terminálisok posztszinaptikus NL2 vagy GluN2A-alegység pozitivitását mutatják, 2-2
egérben. B: Az oszlopok 2 egér HIPP-ban, különböző membránszakaszokon mért GluN2A
immunarany-jelölés átlagos sűrűségét mutatják. Az első oszlop a vGluT3-pozitív
terminálisok posztszinaptikus aktív zónájában (vGluT3 term), a második oszlop a
közvetlenül ezen terminálisok mellett elhelyezkedő jelöletlen, aszimmetrikus szinapszisok
posztszinaptikus aktív zónájában (serk. term), a harmadik oszlop ezen aszimmetrikus
szinapszisok posztszinaptikus aktív zónájának szélétől 200-200nm-re található
membránszakaszon (extra), a negyedik oszlop ezen aszimmetrikus szinapszisok
preszinaptikus terminálisainak membránján (háttér) mért immunarany-sűrűséget
mutatja. A teljes lemért membránfelületet μm2-ben határoztuk meg. C: A GluN2A-
alegységet kifejező BDA-pozitív terminálisok százalékos aránya a HIPP-ban, MS-ban és
mPFC-ben, 3 egérben. D, F, H: Az oszlopok 3 egér HIPP-ban (D), MS-ban (F), illetve
mPFC-ben (H), különböző membránszakaszokon mért GluN2A immunarany-jelölés
átlagos sűrűségét mutatják. Az első oszlop a BDA-pozitív terminálisok posztszinaptikus
aktív zónájában (MRR term), a második oszlop a közvetlenül ezen terminálisok mellett
elhelyezkedő jelöletlen, aszimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus aktív zónájában
(serk. term), a harmadik oszlop ezen aszimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus aktív
zónájának szélétől 200-200nm-re található membránszakaszon (extra), a negyedik oszlop
ezen aszimmetrikus szinapszisok preszinaptikus terminálisainak membránján (háttér)
mért immunarany-sűrűséget mutatja. A teljes lemért membránfelületet μm2-ben
határoztuk meg. E,G,I: Az oszlopok a fenti egerek HIPP-ban (E), MS-ban (G), illetve
mPFC-ben (I) mért BDA-pozitív (MRR term) és jelöletlen, aszimmetrikus szinapszisok
(serk. term) posztszinaptikus aktív zónájának területét mutatják, μm2-ben. A függőleges
vonalak a standard deviációt jelölik. A mintaként szolgáló teljesen rekonstruált
szinapszisok számát az oszlopokban jelöltük. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban
Mayer Márton munkájának eredménye.
86
szerint (n=49 és 39 teljesen rekonstruált szinapszis) a vizsgált vGluT3-pozitív
terminálisok által létrehozott szinapszisok átlagosan csupán mintegy 10%-a tartalmazott
NL2-jelölést (20. ábra, A). Ezzel szemben a közvetlenül ezen szinapszisok mellett
elhelyezkedő, az interneuronok szómájára érkező szimmetrikus, GABAerg szinapszisok
mindegyike NL2-pozitív volt (19. ábra, F). Mivel ezek alapján azt mondhatjuk, hogy az
ebben a rétegben található vGluT3-pozitív terminálisok által létrehozott szinapszisok
90%-a a MRR-ból származik, összességében a MRR-ból származó szinapszisok legalább
88%-a tartalmaz NMDA-receptorokat. Ezek az arányok azért magasabbak az anterográd
pályajelölés során mért adatokhoz képest, mert lehetőségünk volt a metszetek felszínéről
mintát venni, ahol a legjobb volt az immunreakció minősége.
Az anterográd pályajelöléses vizsgálatok segítségével a MS-ban és a mPFC-ben
is megvizsgáltuk a MRR-ból származó szinapszisok NMDA-receptor tartalmát (21.
ábra). A MS-ban a BDA-pozitív rostok eloszlása a szakirodalomból ismert eloszlást
mutatta: a medialis szeptális területen és a Broca-féle diagonális köteg területén is sűrű
rosthálózatot láttunk, melyek egyes sejtek körül kosárszerű terminálishálót hoztak létre
(Aznar és mtsai 2004; Leranth és Vertes 1999). A mPFC területén a rostozat ritkább volt,
viszont minden esetben kosárszerű termináliseloszlást láttunk, főleg a kéreg felszíni
rétegeiben, mely 10-15 terminálist is tartalmazott egy csoportban. 3 egérben végzett
méréseink alapján (MS: n= 15, 15, 15, összesen 45 darab; mPFC: n= 15, 14, 15, összesen
44 darab teljesen rekonstruált szinapszis) azt tapasztaltuk, hogy a MRR MS-ban
létrehozott szinapszisainak átlagosan legalább 40%-a (20. ábra, C, 21. ábra, A-C), míg
az mPFC-ben létrehozott szinapszisok átlagosan legalább a fele tartalmazta a GluN2A
alegységet posztszinaptikusan (20. ábra, C, 21. ábra, D-F). Hasonlóan a HIPP-ban
megfigyeltekhez, a MRR-ból származó szinapszisok mérete átlagosan mintegy kétszerese
volt a lokális aszimmetrikus szinpaszisokénak (20. ábra, G, I). Az egyes
membránszakaszokon mért aranyszemcse-sűrűség értékek hasonlóak voltak a HIPP-ban
mért adatokhoz, és itt is azt tapasztaltuk, hogy az NMDA-receptorok sűrűsége a MRR
által létrehozott szinapszisokban összemérhető a lokális aszimmetrikus szinapszisok
NMDA-receptor tartalmával, mind a MS-ban (MRR: 0.89 ± 0.48 aranyszemcse/
szinapszis, DAB-negatív aszimmetrikus: 0.65 ± 0.40 aranyszemcse/ szinapszis, 20. ábra,
F), mind a mPFC-ben ( MRR: 0.92 ± 0.42 aranyszemcse/ szinapszis, DAB-negatív
aszimmetrikus: 0.52 ± 0.24 aranyszemcse/ szinapszis, 20. ábra, H).
87
21. ábra: Az NMDA-receptorok GluN2A-alegysége megtalálható a MRR előagyi
szinapszisaiban. A BDA-val jelölt, DAB-csapadékot tartalmazó, MRR-ból származó
terminálisok által a MS-ban (A1-A4, B, C), illetve a mPFC-ben (D1-D2, E1-E3, F)
létrehozott szinapszisok posztszinaptikus aktív zónájában ezüst-intenzifikált immunarany
szemcsék jelölik a GluN2A-alegység jelenlétét (nyílhegyek). Az A1-A4, D1-D2 és E1-E3
képek ugyanazoknak a szinapszisoknak a különböző ultravékony metszeteiről készültek.
Lépték: 500 nm minden képen. Az ábra 80%-ban Szőnyi András, 20%-ban Mayer Márton
munkájának eredménye.
88
VIII. MEGBESZÉLÉS
VIII.1. A median raphe régió sejtszintű felépítése
Méréseink az egér MRR-ban található különböző típusú idegsejtek számának
eddigi legpontosabb, torzításmentes, statisztikai szempontok által megalapozott
meghatározását adják. Ezen mérések során külön elemeztük a MR-ra és a PMR-ra
vonatkozó adatokat. Azonban a MR és a PMR között húzott határvonalat mesterségesen,
a patkányban készült korai vizsgálatok alapján határozták meg (Paxinos és Franklin
2012). Mivel méréseink során a MR-ban és a PMR-ban vizsgált sejtpopulációk
semmilyen tekintetben nem különböztek egymástól, valamint az egyes sejtek dendritjei
minden irányból áthaladnak ezeken a határokon (Calizo és mtsai 2011), minden okunk
megvan azt feltételezni, hogy a MR-ban és a PMR-ban található sejtek ugyanabba a
populációba tartoznak. Az egér MRR szélessége nem haladja meg az 1mm-t (Paxinos és
Franklin 2012), amely még a legmodernebb optogenetikai vizsgálatok esetében is azt
jelenti, hogy a megvilágításhoz használt fény a MR és PMR területét is képes hatékonyan
elárasztani (Yizhar és mtsai 2011). Úgy gondoljuk tehát, hogy az egérben történő
vizsgálatok esetében a MR és PMR elkülönítése funkcionális szempontból nem célszerű,
és helyesebb a MRR-t egységes agyterületként kezelni.
Az eddigi munkák sejtszámokra vonatkozó adatai főleg patkányban végzett
mérésekből származnak. Ezek az adatok vagy csak a MRR-ban található 5HT-pozitív
sejtekre vonatkoznak, melyek altípusai között további különbségeket nem tettek, vagy
csupán becsléseit adták a MRR-ban található sejteknek, közelítő méréseket alkalmazva
(Aldahmash 2015; Ishimura és mtsai 1988; Ito és mtsai 2014; Jackson és mtsai 2009). A
patkány MRR-ban található szerotonerg sejtek számát eddig mintegy 1100-2100 darabra
becsülték; a mi méréseink alapján az egér MRR-ban található szerotonerg sejtek száma
mintegy 2700 darab, melyek nagyobb része – mintegy 1700 darab – vGluT3-mat is
kifejez fiatal felnőttkorban.
A MRR-ban jelenlévő vGluT3-pozitív sejteket már régóta ismerjük (Fremeau és
mtsai 2004; Gras és mtsai 2005; Herzog és mtsai 2004), és ismert volt, hogy ezek,
legalábbis részben, a 5HT-pozitív sejtek csoportjával is átfednek (Hioki és mtsai 2010;
89
Jackson és mtsai 2009), azonban pontos számuk meghatározása eddig nem történt meg.
Méréseink szerint a 5HT- és vGluT3-pozitív sejteken felül további, mintegy 3300 darab
csak vGlut3-pozitív sejt található a MRR-ban. A 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtek
legnagyobb többsége a MR-ban helyezkedett el. A PMR-ban található, ilyen típusú sejtek
a MR-hoz közelebbi határokon helyezkedtek el, a PMR szélei felé egyre kevésbé voltak
megfigyelhetőek.
A MRR-ban található további sejttípusok számára és működésére vonatkozóan
még kevesebb adattal rendelkezünk. Bár a MRR területén található GABAerg sejtek
jelenléte már régóta ismert volt (Stamp 1995; Calizo és mtsai 2011), jellemzőiket és
működésüket csak az utóbbi időben kezdték feltárni (Wang és mtsai 2015; Domonkos és
mtsai 2016). Anatómiai módszerekkel azonban sem számukat, sem a többi sejthez
viszonyított arányukat nem vizsgálták meg alaposabban. A MRR GABAerg sejtjeinek
döntő többsége a PMR-ban helyezkedik el, méréseink szerint számuk mintegy 29000
darab, mely a teljes MRR-ban található sejtpopuláció mintegy kétharmada. Kísérleteink
alapján ezek a sejtek a 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtektől eltérő populációba
tartoznak: mint ahogy azt korábbi vizsgálatok is mutatták, sosem tartalmaztak 5HT-t
(Stamp, 1995), és vGluT3-mat is csupán elenyésző töredékük (mintegy 400 darab)
tartalmazott. Ez utóbbi, vGAT- és vGluT3-pozitív sejtek olyan fenotípusúak, melyhez
hasonló az agykérgi területek egyes interneuronjaiban is megfigyelhető (Somogyi és
mtsai 2004), azonban ezen sejtek szerepe a MRR működésében teljesen ismeretlen.
Az utolsó, „hármas negatív” populáció tagjai sem 5HT-t, sem vGluT3-mat, sem
pedig vGAT-ot nem fejeztek ki; ezen sejtek száma a MRR-ban mintegy 12000 darab volt,
ezzel a MRR sejtjeinek mintegy 25%-át tették ki. Előfordulhatna, hogy ezek olyan sejtek
voltak, melyekben a megjelölni kívánt molekulák mennyisége nem érte el az általunk
használt antitestek érzékelési küszöbét, de ezt több okból is valószínűtlennek tartjuk.
Egyrészt ezeknek a sejteknek a mennyisége a metszetek felszínén, ahol nincsenek
penetrációs problémák, is ugyanannyi volt, mint a metszetek belsejében. Olyan
területeken is láttunk „hármas negatív” sejteket, ahol az antitestekkel megjelölt többi
sejtpopuláció tagjai erős, határozott jelölést adtak, így az adott helyen nem volt gyengébb
az immunreakció minősége. A „hármas negatív” sejtek a szövetben egyenletesen
oszlottak el, továbbá nagy részük a PMR területén helyezkedett el, ahol a 5HT- és/vagy
vGluT3-pozitív sejtek egyébként is ritkábban voltak megtalálhatók, ezért valószínűtlen,
90
hogy ezek álnegatív sejtek lettek volna. Továbbá igazoltuk, hogy a 5HT-festésünk
minden szerotonerg sejtet megjelöl, ugyanis minden olyan sejt, amely a 5HT szintézisért
felelős TpH enzimet tartalmazta, 5HT-pozitív volt. A vGAT genetikai jelölés erős,
egyértelmű és egyenletes volt, mintázata nem tért el attól, amire számítottunk, és egyezett
a korábbi leírásokkal (Vong és mtsai 2011).
Mi lehet a „hármas negatív” sejtek neurokémiai profilja? Az agy glutamaterg
sejtjeinek jelentős része nem vGluT3 segítségével tölti fel a szinaptikus vezikulákat
glutamáttal, hanem vGluT1-et vagy vGluT2-t fejez ki (Fremeau és mtsai 2004). Ezeknek
a vezikuláris transzportereknek a jelenlétét in situ hibridizációs módszerek segítségével
vizsgálták a MRR területén, de a vGluT1 génjének transzkriptumát egyáltalán nem
sikerült kimutatni, és a vGluT2 transzkriptumának jele is gyenge és ritkán észlelhető volt
(Hioki és mtsai 2010). A raphe magok területén dopaminerg sejtek is találhatók, melyek
tirozin-hidroxiláz festéssel mutathatók ki, de a MRR régió területén ezen sejtek
mennyisége elenyésző (Jahanshahi és mtsai 2013), ezért valószínűtlen, hogy a „hármas
negatív” populációba tartozó sejtek mind dopaminergek lennének. Leírtak továbbá
nitrogén-monoxid szintázt, galanint vagy szomatosztatin kifejező sejteket is a MRR
területén, de ezek jelentős része TpH-pozitív, szerotonerg sejt volt (Araneda és mtsai
1999; Fernandez és mtsai 2016; Lu és mtsai 2010). Tudomásunk szerint további
vizsgálatok nem történtek a MRR-ben található egyéb sejtpopulációk vizsgálatára.
VIII.2. Az ePet nem specifikus a median raphe régió szerotonerg sejtjeire
A ETS-doménnal rendelkező transzkripciós faktorok családjába tartozó PET-1-et
már régóta ismerjük, mint a szerotonerg rendszer fejlődéséhez, differenciálódásához, és
felnőttkori működéséhez szükséges fehérjét (Hendricks és mtsai 1999; Liu és mtsai 2010;
Wyler és mtsai 2015; Wyler és mtsai 2016). A PET-1-et és a hozzá tartozó 1.8 kb
hosszúságú enhancer régiót, az ePet-et nagyon sokáig a szerotonerg sejtekre specifikus
elemnek gondolták (Depuy és mtsai 2011; Hendricks és mtsai 1999; Hendricks és mtsai
2003; Kiyasova, és mtsai 2013; Scott 2005a; Scott és mtsai 2005b; Wylie és mtsai 2010).
Ezen vizsgálatok során már megfigyelték, hogy a PET-1 és az ePet csak a szerotonerg
sejtek 70-80%-ában fejeződik ki (Hendricks és mtsai 2003; Kiyasova és mtsai 2011; Pfaar
és mtsai 2002). Később azonban a PET-1 kifejeződését megfigyelték a MRR nem
91
szerotonerg sejtjeiben is, melyek a teljes PET-1-pozitív sejtpopuláció mintegy 20%-át
adták (Pelosi és mtsai 2014). Emellett azt is megfigyelték, hogy PET-1 KO egerekben a
MRR vGluT3-mat kifejező sejtjeinek jelentős része továbbra is jelen van (Gaspar és
Lillesaar 2012).
Kvantitatív sztereológiai méréseink igazolták a fenti adatokat. Az összes MRR-
ban található 5HT-pozitív sejtnek mintegy 70%-át (mintegy 1900-at a 2700-ból) ePet-
pozitívnak találtuk. Azonban azt is megfigyeltük, hogy a „csak vGluT3-pozitív”
sejtpopuláció jelentős része, mintegy 40%-a is ePet-pozitív, továbbá vannak olyan
„hármas negatív” sejtek is (ugyan jelentősen kisebb számban), melyek szintén kifejezik
az ePet-et. Összességében véve a MRR ePet-pozitív sejtjeinek mintegy fele nem fejezett
ki 5HT-t. Mivel az ePet genetikai jelölésünk a szakirodalomban jól karakterizált, erős és
egyértelmű jelölést adta (Depuy és mtsai 2011; Scott 2005a; Scott és mtsai 2005b; Wylie
és mtsai 2010), azt gondoljuk, hogy az ePet-pozitivitás nem specifikus a szerotonerg
sejtekre, és az eddigi és jövőbeni szakirodalmi adatokat ennek tükrében kell értelmezni.
Méréseink azonban azt is mutatják, hogy az ePet-pozitív sejteknek csupán
mintegy 10%-a tartozik olyan populációba, amely nem fejez ki 5HT-t és/vagy vGluT3-
mat, és ezek a „csak ePet-pozitív” sejtek a teljes MRR-ban található sejtpopulációnak
csupán mintegy 1%-át alkotják. Az ePet és a PET-1 olyan gének felnőttkori működését
segítik, melyek a MRR szerotonerg és/vagy glutamaterg sejtjeire jellemző fenotípust
határozzák meg: PET-1 KO egerekben jelentősen csökken többek között a TpH, a
szerotonin-transzporter, az 5HT1A és 5HT1B autoreceptorok, valamint a vGluT3 mRNS-
ének átíródása, és ezáltal a kódolt fehérjék mennyisége is (Hendricks és mtsai 2003; Liu
és mtsai 2010; Wyler és mtsai 2015; Wyler és mtsai 2016). Méréseink szerint a vGAT-
pozitív sejtek nem fejeznek ki 5HT-t, és vGluT3-mat is csak elenyésző menyiségben; ez
azt sugallja, hogy az ePet-pozitív és a vGAT-pozitív sejtek eltérő populációba tartoznak.
Ezért a „csak ePet-pozitív” sejteket neurotranszmitter-tartalmuk szerint a „hármas
negatív” csoportba soroltuk.
92
VIII.3. A median raphe régió 5HT-és/vagy vGluT3-tartalmú sejtjeinek jellemzése
A MRR 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtjeinek száma állatonként nagy
variabilitást mutatott: például a GM1 egérben a SO sejtek száma nagyobb volt a többi
állatban mérthez képest, de kevesebb SG és GO sejtet tartalmazott, mint például a GM2
egér; valamint az egyes kategóriákon belül az ePet-negatív és -pozitív sejtek aránya is
változó volt. Azonban az összes 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejt száma meglehetősen
állandó volt a MRR területén. Ezek a sejtek közösen alkotják a MRR-ból felszálló
pályarendszert (Aznar és mtsai 2004; Shutoh és mtsai 2008; Somogyi és mtsai 2004), az
általuk megcélzott agyterületek hasonlóak, és ott elsődlegesen helyi GABAerg sejteket
céloznak meg (Aznar és mtsai 2004; Freund és mtsai 1990; Varga és mtsai 2009).
Eredményeink azt sugallják, hogy a MRR-ból származó információ jelentős részét ezek
a sejtek közösen továbbítják az előagyi területek felé, a szerotonerg és glutamaterg
rendszer szoros együttműködésével.
A 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtek ePet-pozitivitásával kapcsolatos adataink
azonban azt sugallják, hogy különbségek is vannak ezen sejtpopulációkon belül.
Méréseink során a 5HT-pozitív sejteknek csak mintegy 70%-át találtuk ePet-pozitívnak.
Korábbi munkák szerint a 5HT-pozitív sejteknek hasonló aránya mutat PET-1 pozitivitást
(Hendricks és mtsai 2003; Pfaar és mtsai 2002). A PET-1-et nem kifejező szerotonerg
sejtek egy külön populációt alkotnak, jellemzően a bazolaterális amygdalába és egyes
thalamikus magokba vetítenek, ahol funkcionális szinaptikus kapcsolatokkal
rendelkeznek (Kiyasova és mtsai 2011). A bazolaterális amygdalába, mPFC-be vagy
HIPP-ba vetítő sejtek elektrofiziológiai és neurokémiai tulajdonságai további eltéréseket
mutatnak (Fernandez és mtsai 2016). Továbbá genetikai nyomonkövetési módszerek
segítségével leírták, hogy a MRR-ban található 5HT- (és részben vGluT3-) pozitív sejtek
több rhombomérából fejlődtek ki (Bang és mtsai 2012; Jensen és mtsai 2008),
egymáshoz, és más raphe magokban található szerotonerg sejtekhez képest eltérő előagyi
vetítési mintázatuk van, és rostjaik morfológiája is különböző (Bang és mtsai 2012;
Deneris és Wyler 2012; Jensen és mtsai 2008; Muzerelle és mtsai 2016). A vGluT3-
pozitív sejtek hasonlóan heterogén csoportot képeznek ePet-pozotivitás szempontjából
(Gaspar és Lillesaar 2012), és ezt a mi méréseink is alátámasztották. Újabb mérések
szerint a MRR-ban található 5HT- és/vagy vGluT3-pozitív sejtek alapvető
93
elektrofiziológiai tulajdonságokban térnek el egymástól (Calizo és mtsai 2011;
Domonkos és mtsai 2016).
Összefoglalva tehát úgy tűnik, hogy a MRR-ban található 5HT- és/vagy vGluT3-
pozitív sejtek alapvetően hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek, és feladatuk a MRR-
ból származó információ közvetítése az előagy felé; a sejtpopuláción belüli különbségek
azonban lehetővé tehetik, hogy a különböző sejtek a szerotonerg rendszer sokrétű
funkcióinak különböző céljait valósítsák meg.
VIII.4. A median raphe régióból felszálló pályát döntően glutamaterg rostok
alkotják
A MRR-ból felszálló pályát klasszikusan szerotonergnek tartják, bár már egyes
korai szakirodalmi adatok is leírtak nem szerotonerg, előagyba vetítő sejteket (Acsády,
Arabadzisz, és mtsai 1996; Dahlström és Fuxe 1964; Hensler 2006; Köhler és mtsai 1982;
Köhler és Steinbusch 1982). Később patkányban mind retrográd, mind anterográd
pályajelöléssel kimutatták, hogy a MRR-ban található nem szerotonerg sejtek részt
vesznek a MRR-ból felszálló pálya létrehozásában (Aznar és mtsai 2004; Jackson és
mtsai 2009; Somogyi és mtsai 2004), majd egérben végzett vizsgálatok is megerősítették
ezeket az adatokat (Amilhon és mtsai 2010; Kiyasova és mtsai 2011; Varga és mtsai
2009). Ezekben a munkákban a szerotonerg sejtekre jellemző jelölés mellett a vGluT3
jelenlétét figyelték meg ezekben a sejtekben és axonjaikban. Csoportunk korábbi
munkájából kiderült, hogy a vGluT3 működőképes ezekben a rostokban, ugyanis az egér
HIPP-ban egyes interneuronokon serkentő posztszinaptikus potenciálokat tudtunk
kiváltani a MRR-ból felszálló rostok optogenetikai ingerlésével, melyek glutamaterg
blokkolószerek jelenlétében szinte teljesen eltűntek (Varga és mtsai 2009).
Fenti méréseink szerint a MRR-ból felszálló pálya gerincét a vGluT3-pozitív GO
és SG sejtek adják. Az egér HIPP-ból, MS-ból és mPFC-ből végzett retrográd
pályajelölésünk szerint az ezen agyterületekre vetítő sejtek mintegy 60-80%-a kifejezi a
vGluT3-mat; ezen adatok hasonlóak a korábban patkányban mért értékekhez (Jackson és
mtsai 2009). Azonban meglepő módon, főleg a MS-ot célzó rostok esetében, azt találtuk,
hogy a retrográd pályajelöléssel azonosított sejtek mintegy 25%-a nem tartalmazott sem
5HT-t, sem vGluT3-mat, ami szintén összhangban van a korábbi szakirodalmi adatokkal
94
(Jackson és mtsai 2009). Mivel a használt antitestek szenzitivitását a sztereológiai
mérések esetében igazoltuk, azt gondoljuk, hogy ezek a rostok vagy a MRR GABAerg,
vagy az eddig még neurokémiailag nem azonosított sejtjeitől erednek. A mPFC és a HIPP
területére az ilyen típusú rostokból jóval kevesebb érkezett, ami azt sejteti, hogy ezek a
sejtek a MRR fő pályáját képviselő vGluT3- és/vagy 5HT-pozitív rostoktól eltérő
célterület-, és feltehetőleg célsejt-szelektivitással rendelkeznek.
A MRR sejtjeinek több agyterületre való vetítését eddig viszonylag kevés
tanulmányban vizsgálták, és ezekben is döntően a HIPP és MS viszonyában (Acsády és
mtsai 1996; Köhler és mtsai 1982; Köhler és Steinbusch 1982; McKenna és Vertes 2001).
Fenti méréseink szerint a MRR sejtjeire jellemző, hogy több agyterületet egyszerre
idegezzenek be; a retrográd pályajelölő anyagokkal megjelölt sejtek átlagosan mintegy
10%-a két pályajelölő anyagot is tartalmazott. Továbbá kimutattuk, hogy ezen sejtek
jelentős része, mintegy 70-90%-uk kifejezi a vGluT3-mat.
A MRR rostjai jellemzően lokális GABAerg interneuronokat céloznak meg a
beidegzett kortikális területeken és a mediális szeptumban; illetve a MS-ban a HIPP
interneuronjait célzó PV-pozitív, GABAerg sejtek is erős beidegzést kapnak (Aznar és
mtsai 2004; Freund és mtsai 1990; Leranth és Vertes 1999). Ezeken a sejteken egy rost
akár 40 terminálist is létesíthet, többnyire azok periszomatikus régiójában (Freund és
mtsai 1990; Leranth és Vertes 1999). Méréseink szerint ezekben a szinapszisokban
NMDA-receptorok is találhatók, melyek sűrűsége hasonló a klasszikus serkentő
szinapszisokban mérhetőhöz. A MRR tehát nagyon hatékonyan aktiválhatja ezeket a
sejteket glutamaterg serkentésen keresztül, így befolyásolva a helyi hálózati működést.
Mivel a MRR sejtjei több agyterületet is képesek egyszerre beidegezni, a hatékony
glutamaterg transzmisszió segítségével ezeken az agyterületeken szinkron hatásokat is
kiválthatnak, így összehangolva azok aktivitását.
VIII.5. A glutamaterg és a szerotonerg neurotranszmisszió kapcsolódási pontjai
A glutamaterg és szerotonerg rendszerek több molekuláris eleme is
összekapcsolódik; ezeket a kapcsolatokat – melyekben az NMDA-receptorok is részt
vesznek – több agyterületen is kimutatták. A MRR által célzott interneuronok
működőképes ionotróp 5HT3-receptorokat fejeznek ki a HIPP, MS és mPFC területén is
95
(McMahon és Kauer 1997; Morales és Bloom 1997; Puig és mtsai 2004; Ropert és Guy
1991). Bár közvetlen anatómiai módszerekkel nem bizonyítottuk az 5HT3-receptorok
szinaptikus jelenlétét, és NMDA-receptorokhoz képesti helyzetüket, hatásukat a HIPP-
ban korábbi munkánk során mi is kimutattuk (Varga és mtsai 2009). Az 5HT3-receptorok
áram-feszültség görbéjének lefutása függ az extracelluláris Ca2+-szinttől (McMahon és
Kauer 1997). Így az 5HT3-receptorok közvetlenebb kapcsolatban is állhatnak a
glutamaterg ingerületátvitellel ezekben a szinapszisokban, ugyanis az NMDA-receptorok
képesek lehetnek az extracelluláris Ca2+-ot átmenetileg eltüntetni a szinaptikus térből
(Arens és mtsai 1992; Vassilev és mtsai 1997). Továbbá az 5HT3-receptorok által okozott
posztszinaptikus depolarizáció segíthet az NMDA-receptorok Mg2+-blokkját
megszüntetni, így azokat aktiválni.
A vGluT3 a hippokampuszban és az agykéregben segíti a 5HT vezikulákba
történő felvételét, és ezáltal hatékonyabbá teszi ezeken a területeken a szerotonerg
ingerületátvitelt (Amilhon és mtsai 2010). A 5HT képes lehet az NMDA-receptorokat
közvetlenül blokkolni, ahogy azt patkány ventrális gerincvelő kultúrában kimutatták
(Chesnoy-Marchais és Barthe 1996). Elképzelhető, hogy a MRR erős aktiválása során
felszabaduló 5HT a szinaptikus NMDA-receptorok közvetlen blokkolásával
megakadályozza a posztszinaptikus sejtbe történő fokozott Ca2+-beáramlást, így megvédi
azt az excitotoxicitástól. Bár közvetlen vizsgálatok ezen kölcsönhatások felmérésére
eddig még nem történtek, az NMDA-receptorok jelenléte ezekben a szinapszisokban új
megvilágításba helyezi a két rendszer közötti együttműködési lehetőségeket.
96
IX. KÖVETKEZTETÉSEK
A MRR alapvetően fontos szerepet tölt be több kognitív funkció szabályozásában,
és ennek a régiónak a hibás működését több neuropszichiátriai betegségben is leírták.
Vizsgálataink során kvantitatív, torzításmentes sztereológiai módszerek segítségével
meghatároztuk a MRR-ban található különböző sejttípusok számát és egymáshoz
viszonyított arányát. Méréseink szerint a MRR sejtjeinek mintegy 60%-a GABAerg és
csupán mintegy 15%-uk tartalmaz 5HT-t és/vagy vGluT3-mat. Továbbá a MRR
sejtjeinek mintegy 25%-a az eddig ismert kategóriákba nem besorolható neurokémiai
fenotípusba tartozik. Ugyanezen módszerek segítségével azt figyeltük meg, hogy az eddig
a kifejezetten szerotonerg sejtekre specifikusnak gondolt ePet csupán a 5HT-pozitív
sejtek mintegy felében expresszálódik felnőttkorban, és a 5HT-negatív sejtek egy jelentős
része is kifejezi az ePet-et. Így az ePet nem alkalmas a 5HT-pozitív sejtek célzott
azonosítására a MRR-ban, és az eddigi ePet/PET-1 rendszerrel kapcsolatos adatokat is
ennek tükrében kell újraértelmeznünk. Ez a munka nem csupán az egér MRR sejtszintű
felépítésének első statisztikailag pontos leírása, de ráirányítja a figyelmet, hogy eddig a
MRR-ban található sejteknek csupán töredékét vizsgáltuk behatóan. A MRR-ban
található sejtek funkcióinak, viselkedésben betöltött szerepének megértéséhez további,
specifikus vizsgálatok szükségesek.
A MRR-ből felszálló pálya az előagy több területét is beidegzi, ahol erős hatással
bír a helyi hálózati aktivitásra. Retrográd pályajelölés és fluoreszcens immunhisztokémiai
módszerek segítségével kimutattuk, hogy a MRR-ból a HIPP-ba, MS-ba és mPFC-be
vetítő rostok legnagyobb része a vGluT3-pozitív sejtektől ered. Így a MRR képes lehet
gyors és hatékony serkentő hatást kifejteni az ezeken a területeken található célsejtjein.
Emellett kettős retrográd pályajelölés segítségével kimutattuk, hogy a MRR egyes sejtjei
képesek több agyterület szimultán beidegzésére, valamint a két agyterületet egyszerre
beidegző sejtek legnagyobb része tartalmaz vGluT3-mat. A MRR tehát képes lehet több
agyterületen gyors, szinkron hatást kiváltani, rendkívül hatékonyan befolyásolva az
előagyi aktivitást.
Anterográd pályajelölés, valamint korrelált fény-és elektronmikroszkópos
módszerek segítségével kimutattuk, hogy a MRR előagyban létrehozott szinapszisai
97
valóban rendelkeznek a gyors glutamaterg ingerületátvitelhez szükséges molekuláris
felépítéssel, ugyanis ezeknek a szinapszisokban megtaláltuk az NMDA-receptorok
GluN2A alegységét. Az immunarany-jelölés sűrűségének elemzése azt mutatta, hogy a
MRR szinapszisaiban található NMDA-receptorok sűrűsége hasonló a klasszikus
serkentő szinapszisokban találhatóhoz, ami tovább erősíti a MRR hatékonyságát az
előagyi hálózatok befolyásolásában.
Összességében tehát úgy tűnik, hogy a MRR előagyra gyakorolt elsődleges hatása
a területeken található célsejtek, vagyis egyes helyi interneuronok hatékony glutamaterg
serkentése, melyhez az ezzel párhuzamos szerotonerg vetítés egy fontos modulációs
mechanizmussal járul hozzá.
98
X. ÖSSZEFOGLALÁS
A median raphe régió (MRR) alapvetően fontos szerepet tölt be egyes kognitív
funkciók szabályozásában. A MRR-ból eredő pálya a felszálló szerotonerg rendszerhez
tartozik, melynek fontos szerepe van az előagyi hálózati aktivitás szabályozásában. A
szerotonerg sejtek fenotípusának fenntartásában az ePet/PET-1 transzkripciós faktor-
rendszer alapvető szerepet tölt be, mely rendszert sokáig a szerotonerg sejtekre
specifikusnak gondolták.
A MRR-ban azonban a szerotonerg sejtek mellett a vezikuláris glutamát
transzporter 3 típusát (vGluT3) kifejező glutamaterg, és GABAerg sejtek is vannak. A
MRR-ban található különböző sejttípusok számának pontos leírása, és ezen sejttípusok
ePet-pozitivitásának aránya azonban eddig nem volt ismert.
Kutatócsoportunk korábbi munkáiból kiderült, hogy a MRR-ból hatékony
glutamaterg serkentés érkezik a hippokampusz egyes interneuronjaira. Azonban eddig
nem vizsgálták, hogy a glutamaterg beidegzés mennyire jellemző más előagyi
területeken, illetve hogy a MRR sejtjei képesek-e egyes agyterületeket egyszerre
beidegezni, így azokat gyorsan és hatékonyan szinkron módon szabályozni.
Vizsgálataink során kvantitatív, torzításmentes sztereológiai módszerekkel
kimutattuk, hogy az egér MRR sejtjeinek csupán mintegy 15%-a szerotonerg vagy
vGluT3-pozitív, mintegy 60%-uk GABAerg, és mintegy 25%-uk a fenti jelölésekkel nem
azonosítható fenotípusú. Az ePet csupán a szerotonerg sejtek mintegy 70%-ában
fejeződött ki, és a glutamaterg sejtek mintegy 70%-a is ePet-pozitív volt. Az ePet tehát
nem alkalmas a szerotonerg fenotípusú sejtek specifikus azonosítására.
Retrográd pályajelölés és konfokális lézer-pásztázó mikroszkópia segítségével
kimutattuk, hogy a MRR hippokampuszba, mediális szeptumba és mediális prefrontális
kéregbe küldött vetítésének döntő része a glutamaterg sejtektől származik, és a MRR
sejtjei képesek egyszerre beidegezni ezeket az agyterületeket. Anterográd pályajelölés és
elektronmikroszkópos vizsgálatok segítségével kimutattuk, hogy a MRR fenti területeken
létrehozott szinapszisai a klasszikus serkentő szinapszisokhoz hasonló sűrűségben
tartalmaznak NMDA-receptorokat. A MRR tehát igen hatékonyan és gyorsan képes
szinkron módon szabályozni egyes előagyi területek aktivitását, melyhez a szerotonerg
transzmisszió egy jelentős modulációs mechanizmussal járulhat hozzá.
99
SUMMARY
The median raphe region (MRR) plays an important role in the regulation of
several cognitive functions. The pathway arising from the MRR belongs to the ascending
serotonergic system that was shown to have a powerful effect on the network activity of
several forebrain areas. The ePet/PET-1 transcription factor system has an essential role
in the maintenance of the serotonergic phenotype of these cells. The expression of ePet is
thought to be specific to the serotonergic cells located to the brainstem.
Besides serotonergic cells, vesicular glutamate transporter type 3 (vGluT3)-
positive glutamatergic and GABAergic cells were also described in the MRR. However,
the exact numbers and ratios of the different cell types of the MRR was never examined.
The ePet-positivity of these populations is also unknown.
The vGluT3-positive cells of the MRR also project to the forebrain, and our
workgroup has shown before that these fibers can exert a powerful glutamatergic
excitation on certain hippocampal interneurons. However the presence of this
glutamatergic effect was not examined in other brain areas. It is also unknown whether
these cells can project to different forebrain areas simultaneously, modulating the network
activity in these areas in a synchronous manner.
Using unbiased, quantitative stereological methods, we have shown that about
60% of the cells in the MRR are GABAergic, and only about 15% of them contains
serotonin or vGluT3, furthermore, about 25% of them belongs to an unidentified
population. Only about 70% of the serotonergic cells expressed ePet, and about 70% of
vGluT3-positive cells were also ePet-positive. Therefore ePet can not be used as a specific
marker for serotonergic cells.
Using retrograde tracing and confocal laser-scanning microscopy we have shown that the
majority of the MRR cells projecting to the hippocampus, medial septum or medial
prefrontal cortex express vGluT3, and these cells can innervate these areas
simultaneously. Furthermore, anterograde tracing and electron microscopy showed that
the synapses established by MRR in these areas express postsynaptic NMDA-receptors.
Therefore, MRR is in an ideal position to exert a fast, synchronous effect through
glutamatergic transmission in these areas that is supported by serotonergic modulation.
100
XI. IRODALOMJEGYZÉK
Acsády L, Arabadzisz D, Freund TF (1996a) Correlated morphological and
neurochemical features identify different subsets of vasoactive intestinal
polypeptide-immunoreactive interneurons in rat hippocampus. Neuroscience
73:299–315.
Acsády L, Görcs TJ, Freund TF (1996b) Different populations of vasoactive intestinal
polypeptide-immunoreactive interneurons are specialized to control pyramidal
cells or interneurons in the hippocampus. Neuroscience 73:317–334.
Adam V. Orvosi biokemia. Medicina Könyvkiadó Zrt. Budapest; 2006:545-546.
Aizawa H, Yanagihara S, Kobayashi M, Niisato K, Takekawa T, Harukuni R, Mchugh
TJ, Fukai T, Isomura Y, Okamoto H, Takakawa T, Harukuni R, Mchugh TJ, Fukai
T, Isomura Y, Okamoto H (2013) The Synchronous Activity of Lateral Habenular
Neurons Is Essential for Regulating Hippocampal Theta Oscillation. J Neurosci
33:8909–8921.
Aldahmash A (2015) Cell numbers in the dorsal and median raphe nuclei of AS and AS
/ AGU rats. Biomed Res 21:15–22.
Almada RC, Borelli KG, Albrechet-Souza L, Brandão ML (2009) Serotonergic
mechanisms of the median raphe nucleus-dorsal hippocampus in conditioned fear:
Output circuit involves the prefrontal cortex and amygdala. Behav Brain Res
203:279–287.
Almeida P, Trovo M, Tokumoto A, Pereira A, Padovan C (2013) Role of serotonin 1A
receptors in the median raphe nucleus on the behavioral consequences of forced
swim stress. J Psychopharmacol 27:1134–1140.
Amilhon B, Lepicard E, Renoir T, Mongeau R, Popa D, Poirel O, Miot S, Gras C,
Gardier AM, Gallego J, Hamon M, Lanfumey L, Gasnier B, Giros B, El
Mestikawy S (2010) VGLUT3 (vesicular glutamate transporter type 3)
contribution to the regulation of serotonergic transmission and anxiety. J Neurosci
30:2198–2210.
Andersen P. (2007) The Hippocampus book. Oxford University Press.
Andrade TG, Zangrossi H, Graeff FG (2013) The median raphe nucleus in anxiety
revisited. J Psychopharmacol 27:1107–1115.
101
Andrade TGC., Graeff F. (2001) Effect of electrolytic and neurotoxic lesions of the
median raphe nucleus on anxiety and stress. Pharmacol Biochem Behav 70:1–14.
Araneda S, Gysling K, Calas A (1999) Raphe serotonergic neurons projecting to the
olfactory bulb contain galanin or somatostatin but not neurotensin. Brain Res Bull
49:209–214.
Arens J, Stabel J, Heinemann U (1992) Pharmacological properties of excitatory amino
acid induced changes in extracellular calcium concentration in rat hippocampal
slices. Can J Physiol Pharmacol 70 Suppl:S194-205.
Assaf SY, Miller JJ (1978) The role of a raphe serotonin system in the control of septal
unit activity and hippocampal desynchronization. Neuroscience 3:539–550.
Avanzi V, Brandão M. (2001) Activation of somatodendritic 5-HT1A autoreceptors in
the median raphe nucleus disrupts the contextual conditioning in rats. Behav Brain
Res 126:175–184.
Avanzi V, Castilho VM, De Andrade TGCS, Brandão ML (1998) Regulation of
contextual conditioning by the median raphe nucleus. Brain Res 790:178–184.
Ayzenshtat I, Karnani MM, Jackson J, Yuste R (2016) Cortical Control of Spatial
Resolution by VIP + Interneurons. J Neurosci 36:11498–11509.
Aznar S, Qian ZX, Knudsen GM (2004) Non-serotonergic dorsal and median raphe
projection onto parvalbumin- and calbindin-containing neurons in hippocampus
and septum. Neuroscience 124:573–581.
Aznavour N, Watkins KC, Descarries L (2005) Postnatal development of the
cholinergic innervation in the dorsal hippocampus of rat: Quantitative light and
electron microscopic immunocytochemical study. J Comp Neurol 486:61–75.
Bang SJ, Jensen P, Dymecki SM, Commons KG (2012) Projections and
interconnections of genetically defined serotonin neurons in mice. Eur J Neurosci
35:85–96.
Barnes NM, Sharp T (1999) A review of central 5-HT receptors and their function.
Neuropharmacology 38:1083–1152.
Bassant MH, Apartis E, Jazat-Poindessous FR, Wiley RG, Lamour Y a (1995) Selective
immunolesion of the basal forebrain cholinergic neurons: effects on hippocampal
activity during sleep and wakefulness in the rat. Neurodegeneration 4:61–70.
Beck SG (2003) Median and Dorsal Raphe Neurons Are Not Electrophysiologically
102
Identical. J Neurophysiol 91:994–1005.
Behzadi G, Kalén P, Parvopassu F, Wiklund L (1990) Afferents to the median raphe
nucleus of the rat: Retrograde cholera toxin and wheat germ conjugated
horseradish peroxidase tracing, and selective d-[3H]aspartate labelling of possible
excitatory amino acid inputs. Neuroscience 37:77–100.
Bezaire MJ, Soltesz I (2013) Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge
base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus 23:751–785.
Bird SJ, Aghajanian GK (1975) Denervation supersensitivity in the cholinergic septo-
hippocampal pathway: A microiontophoretic study. Brain Res 100:355–370.
Bland BH, Oddie SD (1998) Anatomical, electrophysiological and pharmacological
studies of ascending brainstem hippocampal synchronizing pathways. Neurosci
Biobehav Rev 22:259–273.
Blasco-Ibáñez JM, Freund TF (1995) Synaptic Input of Horizontal Interneurons in
Stratum Oriens of the Hippocampal CA1 Subfield: Structural Basis of Feed-back
Activation. Eur J Neurosci 7:2170–2180.
Borelli KG, Gárgaro AC, Dos Santos JM, Brandão ML (2005) Effects of inactivation of
serotonergic neurons of the median raphe nucleus on learning and performance of
contextual fear conditioning. Neurosci Lett 387:105–110.
Borhegyi Z (2004) Phase Segregation of Medial Septal GABAergic Neurons during
Hippocampal Theta Activity. J Neurosci 24:8470–8479.
Boyce R, Glasgow SD, Williams S, Adamantidis A (2016) Causal evidence for the role
of REM sleep theta rhythm in contextual memory consolidation. Science (80- )
352:812.
Brioni JD, Decker MW, Gamboa LP, Izquierdo I, McGaugh JL (1990) Muscimol
injections in the medial septum impair spatial learning. Brain Res 522:227–234.
Buzsáki G (2002) Theta oscillations in the hippocampus. Neuron 33:325–340.
Buzsáki G, Grastyán E, Tveritskaya IN, Czopf J (1979) Hippocampal evoked potentials
and EEG changes during classical conditioning in the rat. Electroencephalogr Clin
Neurophysiol 47:64–74.
Cai L, Gibbs RB, Johnson DA (2012) Recognition of novel objects and their location in
rats with selective cholinergic lesion of the medial septum. Neurosci Lett 506:261–
265.
103
Calizo LH, Akanwa A, Ma X, Pan YZ, Lemos JC, Craige C, Heemstra LA, Beck SG
(2011) Raphe serotonin neurons are not homogenous: Electrophysiological,
morphological and neurochemical evidence. Neuropharmacology 61:524–543.
Chesnoy-Marchais D, Barthe JY (1996) Voltage-dependent block of NMDA responses
by 5-HT agonists in ventral spinal cord neurones. Br J Pharmacol 117:133–141.
Chittajallu R, Craig MT, McFarland A, Yuan X, Gerfen S, Tricoire L, Erkkila B, Barron
SC, Lopez CM, Liang BJ, Jeffries BW, Pelkey K a, McBain CJ (2013) Dual
origins of functionally distinct O-LM interneurons revealed by differential 5-
HT(3A)R expression. Nat Neurosci 16:1598–1607.
Clody DE, Carlton PL (1969) Behavioral effects of lesions of the medial septum of rats.
J Comp Physiol Psychol 67:344–351.
Colgin LL (2016a) Rhythms of the hippocampal network. Nat Rev Neurosci 17:239–
249.
Colgin LL (2016b) Rhythms of the hippocampal network. Nat Rev Neurosci 17:239–
249.
Colom L V. (2006) Septal networks: Relevance to theta rhythm, epilepsy and
Alzheimer’s disease. J Neurochem 96:609–623.
Colom L V., Bland BH (1991) Medial septal cell interactions in relation to hippocampal
field activity and the effects of atropine. Hippocampus 1:15–30.
Commons KG (2016) Ascending serotonin neuron diversity under two umbrellas. Brain
Struct Funct 221:3347–3360.
Conn PJ, Pin J-P (1997) PHARMACOLOGY AND FUNCTIONS OF
METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTORS. Annu Rev Pharmacol Toxicol
37:205–237.
Crooks R, Jackson J, Bland BH (2012) Dissociable pathways facilitate theta and non-
theta states in the median raphe-Septohippocampal circuit. Hippocampus 22:1567–
1576.
Dahlström A, Fuxe K (1964) Localization of monoamines in the lower brain stem.
Experientia 20:398–399.
de Almeida L, Idiart M, Lisman JE (2012) The single place fields of CA3 cells: a two-
stage transformation from grid cells. Hippocampus 22:200–208.
Dederen PJWC, Gribnau AAM, Curfs MHJM (1994) Retrograde neuronal tracing with
104
cholera toxin B subunit: Comparison of three different visualization methods.
Histochem J 26:856–862.
Degroot A, Treit D (2003) Septal gabaergic and hippocampal cholinergic systems
interact in the modulation of anxiety. Neuroscience 117:493–501.
Deneris ES, Wyler SC (2012) Serotonergic transcriptional networks and potential
importance to mental health. Nat Neurosci 15:519–527.
Depuy SD, Kanbar R, Coates MB, Stornetta RL, Guyenet PG (2011) Control of
breathing by raphe obscurus serotonergic neurons in mice. J Neurosci 31:1981–
1990.
Dingledine R, Borges K, Bowie D, Traynelis SF (1999) The glutamate receptor ion
channels. Pharmacol Rev 51:7–61.
Domonkos A, Nikitidou Ledri L, Laszlovszky T, Cserép C, Borhegyi Z, Papp E, Nyiri
G, Freund TF, Varga V (2016) Divergent in vivo activity of non-serotonergic and
serotonergic VGluT3-neurones in the median raphe region. J Physiol 594:3775–
3790.
Dorph-Petersen KA, Nyengaard JR, Gundersen HJG (2001) Tissue shrinkage and
unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc 204:232–
246.
Dragoi G, Buzsáki G (2006) Temporal Encoding of Place Sequences by Hippocampal
Cell Assemblies. Neuron 50:145–157.
Dragoi G, Carpi D, Recce M, Csicsvari J, Buzsáki G (1999) Interactions between
hippocampus and medial septum during sharp waves and theta oscillation in the
behaving rat. J Neurosci 19:6191–6199.
Eichenbaum H (1999) The hippocampus and mechanisms of declarative memory.
Behav Brain Res 103:123–133.
Eichenbaum H (2001) The hippocampus and declarative memory: cognitive
mechanisms and neural codes. Behav Brain Res 127:199–207.
Elvander-Tottie E, Eriksson TM, Sandin J, Ögren SO (2009) 5-HT1A and NMDA
receptors interact in the rat medial septum and modulate hippocampal-dependent
spatial learning. Hippocampus 19:1187–1198.
Euston DR, Gruber AJ, McNaughton BL (2012) The Role of Medial Prefrontal Cortex
in Memory and Decision Making. Neuron 76:1057–1070.
105
Fanselow MS (2000) Contextual fear, gestalt memories, and the hippocampus. Behav
Brain Res 110:73–81.
Fernandez SP, Cauli B, Cabezas C, Muzerelle A, Poncer JC, Gaspar P (2016)
Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons
projecting to the forebrain. Brain Struct Funct 221:4007–4025.
Fischette CT, Nock B, Renner K (1987) Effects of 5, 7-dihydroxytryptamine on
serotonin1 and serotonin2 receptors throughout the rat central nervous system
using quantitative autoradiography. Brain Res 421:263–279.
Fox SR, Deneris ES (2012) Engrailed is required in maturing serotonin neurons to
regulate the cytoarchitecture and survival of the dorsal raphe nucleus. J Neurosci
32:7832–7842.
Fremeau RT, Voglmaier S, Seal RP, Edwards RH (2004) VGLUTs define subsets of
excitatory neurons and suggest novel roles for glutamate. Trends Neurosci 27:98–
103.
Freund TF (2003) Interneuron Diversity series: Rhythm and mood in perisomatic
inhibition. Trends Neurosci 26:489–495.
Freund TF, Antal M (1988) GABA-containing neurons in the septum control inhibitory
interneurons in the hippocampus. Nature 336:170–173.
Freund TF, Buzsáki G (1996) Interneurons of the hippocampus. Hippocampus 6:347–
470.
Freund TF, Gulyás AI, Acsády L, Görcs T, Tóth K (1990) Serotonergic control of the
hippocampus via local inhibitory interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A 87:8501–
8505.
Freund TF, Katona I (2007) Perisomatic Inhibition. Neuron 56:33–42.
Fu W, Le Maître E, Fabre V, Bernard JF, Xu ZQD, Hökfelt T (2010) Chemical
neuroanatomy of the dorsal raphe nucleus and adjacent structures of the mouse
brain. J Comp Neurol 518:3464–3494.
Fuchs EC, Neitz A, Pinna R, Melzer S, Caputi A, Monyer H (2016) Local and Distant
Input Controlling Excitation in Layer II of the Medial Entorhinal Cortex. Neuron
89:194–208.
Fuhrmann F, Justus D, Sosulina L, Kaneko H, Beutel T, Friedrichs D, Schoch S,
Schwarz M, Fuhrmann M, Remy S (2015) Locomotion, Theta Oscillations, and the
106
Speed-Correlated Firing of Hippocampal Neurons Are Controlled by a Medial
Septal Glutamatergic Circuit. Neuron 86:1253–1264.
Fyodorov D, Nelson T, Deneris E (1998) Pet-1, a novel ETS domain factor that can
activate neuronal nAchR gene transcription. J Neurobiol 34:151–163.
Gaffan D, Gaffan EA (1991) Amnesia in man following transection of the fornix: A
review. Brain 114:2611–2618.
Gangadharan G, Shin J, Kim S-W, Kim A, Paydar A, Kim D-S, Miyazaki T, Watanabe
M, Yanagawa Y, Kim J, Kim Y-S, Kim D, Shin H-S (2016) Medial septal
GABAergic projection neurons promote object exploration behavior and type 2
theta rhythm. Proc Natl Acad Sci U S A 113:6550–6555.
Gaspar P, Lillesaar C (2012) Probing the diversity of serotonin neurons. Philos Trans R
Soc B Biol Sci 367:2382–2394.
Gaykema RPA, Lutten PGM, Twakas C, Traber J (1990) Cortical Projection Patterns of
the Medial Septum-Diagonal Band Complex. J Comp Neurol 124:293103–293124.
George Paxinos KF (2012) Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic
Coordinates. São Paulo, Acad Press:360 p.
Graeff FG, Silveira Filho NG (1978) Behavioral inhibition induced by electrical
stimulation of the median raphe nucleus of the rat. Physiol Behav 21:477–484.
Granger AJ, Mulder N, Saunders A, Sabatini BL (2016) Cotransmission of
acetylcholine and GABA. Neuropharmacology 100:40–46.
Gras C, Vinatier J, Amilhon B, Guerci A, Christov C, Ravassard P, Giros B, El
Mestikawy S (2005) Developmentally regulated expression of VGLUT3 during
early post-natal life. Neuropharmacology 49:901–911.
Gulyás AI, Hájos N, Freund TF (1996) Interneurons containing calretinin are
specialized to control other interneurons in the rat hippocampus. J Neurosci
16:3397–3411.
Gulyás AI, Hájos N, Katona I, Freund TF (2003) Interneurons are the local targets of
hippocampal inhibitory cells which project to the medial septum. Eur J Neurosci
17:1861–1872.
Gundersen HJ (1986) Stereology of arbitrary particles. A review of unbiased number
and size estimators and the presentation of some new ones, in memory of William
R. Thompson. J Microsc 143:3–45.
107
Gyires K., Furst Zs., Bartho L. (2011) A farmakologia alapjai. Medicina Könyvkiadó
Zrt. Budapest, 2011.
Hafting T, Fyhn M, Molden S, Moser M-B, Moser EI (2005) Microstructure of a spatial
map in the entorhinal cortex. Nature 436:801–806.
Hagan JJ, Salamone JD, Simpson J, Iversen SD, Morris RGM (1988) Place navigation
in rats is impaired by lesions of medial septum and diagonal band but not nucleus
basalis magnocellularis. Behav Brain Res 27:9–20.
Hájos N, Papp EC, Acsády L, Levey AI, Freund TF (1997) Distinct interneuron types
express m2 muscarinic receptor immunoreactivity on their dendrites or axon
terminals in the hippocampus. Neuroscience 82:355–376.
Halasy K, Miettinen R, Szabat E, Freund TF (1992) GABAergic Interneurons are the
Major Postsynaptic Targets of Median Raphe Afferents in the Rat Dentate Gyrus.
Eur J Neurosci 4:144–153.
Hamorsky KT, Kouokam JC, Bennett LJ, Baldauf KJ, Kajiura H, Fujiyama K, Matoba
N (2013) Rapid and Scalable Plant-based Production of a Cholera Toxin B Subunit
Variant to Aid in Mass Vaccination against Cholera Outbreaks. PLoS Negl Trop
Dis 7.
Hangya B, Borhegyi Z, Szilágyi N, Freund TF, Varga V (2009) GABAergic neurons of
the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci
29:8094–8102.
Heidbreder CA, Groenewegen HJ (2003) The medial prefrontal cortex in the rat:
evidence for a dorso-ventral distinction based upon functional and anatomical
characteristics. Neurosci Biobehav Rev 27:555–579.
Hendricks T, Francis N, Fyodorov D, Deneris ES (1999) The ETS domain factor Pet-1
is an early and precise marker of central serotonin neurons and interacts with a
conserved element in serotonergic genes. J Neurosci 19:10348–10356.
Hendricks TJ, Fyodorov D V., Wegman LJ, Lelutiu NB, Pehek EA, Yamamoto B,
Silver J, Weeber EJ, Sweatt JD, Deneris ES (2003) Pet-1 ETS gene plays a critical
role in 5-HT neuron development and is required for normal anxiety-like and
aggressive behavior. Neuron 37:233–247.
Hensler JG (2006) Serotonergic modulation of the limbic system. Neurosci Biobehav
Rev 30:203–214.
108
Herzog E, Gilchrist J, Gras C, Muzerelle A, Ravassard P, Giros B, Gaspar P, El
Mestikawy S (2004) Localization of VGLUT3, the vesicular glutamate transporter
type 3, in the rat brain. Neuroscience 123:983–1002.
Hioki H, Fujiyama F, Nakamura K, Wu SX, Matsuda W, Kaneko T (2004) Chemically
specific circuit composed of vesicular glutamate transporter 3- and
preprotachykinin B-producing interneurons in the rat neocortex. Cereb Cortex
14:1266–1275.
Hioki H, Nakamura H, Ma YF, Konno M, Hayakawa T, Nakamura KC, Fujiyama F,
Kaneko T (2010) Vesicular glutamate transporter 3-expressing nonserotonergic
projection neurons constitute a subregion in the rat midbrain raphe nuclei. J Comp
Neurol 518:668–686.
Huh CYL, Goutagny R, Williams S (2010) Glutamatergic neurons of the mouse medial
septum and diagonal band of Broca synaptically drive hippocampal pyramidal
cells: relevance for hippocampal theta rhythm. J Neurosci 30:15951–15961.
Ishimura K, Takeuchi Y, Fujiwara K, Tominaga M, Yoshioka H, Sawada T (1988)
Quantitative analysis of the distribution of serotonin- immunoreactive cell bodies
in the mouse brain. Neurosci Lett 91:265–270.
Ito H, Moriizumi T, Shimogawa Y, Yamanouchi K (2014) Postnatal changes in the
number of serotonin-immunoreactive cells in midbrain raphe nuclei of male rats.
Anat Sci Int 89:199–206.
Jackson J, Bland BH, Antle MC (2009) Nonserotonergic projection neurons in the
midbrain raphe nuclei contain the vesicular glutamate transporter VGLUT3.
Synapse 63:31–41.
Jackson J, Dickson CT, Bland BH (2008) Median raphe stimulation disrupts
hippocampal theta via rapid inhibition and state-dependent phase reset of theta-
related neural circuitry. J Neurophysiol 99:3009–3026.
Jahanshahi A, Steinbusch HWM, Temel Y (2013) Distribution of dopaminergic cell
bodies in the median raphe nucleus of the rat brain. J Chem Neuroanat 53:60–63.
Jensen P, Farago AF, Awatramani RB, Scott MM, Deneris ES, Dymecki SM (2008)
Redefining the serotonergic system by genetic lineage. Nat Neurosci 11:417–419.
Jinno S, Klausberger T, Marton LF, Dalezios Y, Roberts JDB, Fuentealba P, Bushong
EA, Henze D, Buzsáki G, Somogyi P (2007) Neuronal diversity in GABAergic
109
long-range projections from the hippocampus. J Neurosci 27:8790–8804.
Jinno S, Kosaka T (2002) Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal
projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: A retrograde
labeling study. Brain Res 945:219–231.
Justus D, Dalügge D, Bothe S, Fuhrmann F, Hannes C, Kaneko H, Friedrichs D,
Sosulina L, Schwarz I, Anthony Elliott D, Schoch S, Bradke F, Karl Schwarz M,
Remy S (2016) Glutamatergic synaptic integration of locomotion speed via
septoentorhinal projections. Nat Publ Gr.
Kaifosh P, Lovett-Barron M, Turi GF, Reardon TR, Losonczy A (2013) Septo-
hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nat
Neurosci 16:1182–1184.
Katona L, Micklem B, Borhegyi Z, Swiejkowski DA, Valenti O, Viney TJ,
Kotzadimitriou D, Klausberger T, Somogyi P (2017) Behavior-dependent activity
patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.
Hippocampus 27:359–377.
Kelsey JE, Landry BA (1988) Medial septal lesions disrupt spatial mapping ability in
rats. Behav Neurosci 102:289–293.
Kesner RP, Adelstein TB, Crutcher KA (1989) Equivalent spatial location memory
deficits in rats with medial septum or hippocampal formation lesions and patients
with dementia of the Alzheimer’s type. Brain Cogn 9:289–300.
Kinney GG, Kocsis B, Vertes RP (1994) Injections of excitatory amino acid antagonists
into the median raphe nucleus produce hippocampal theta rhythm in the urethane-
anesthetized rat. Brain Res 654:96–104.
Kinney GG, Kocsis B, Vertes RP (1995) Injections of muscimol into the median raphe
nucleus produce hippocampal theta rhythm in the urethane anesthetized rat.
Psychopharmacology (Berl) 120:244–248.
Kinney GG, Kocsis B, Vertes RP (1996) Medial septal unit firing characteristics
following\ninjections of 8-OH-DPAT into the median raphe\nnucleus. Brain Res
708:116–122.
Kiss J, Maglóczky Z, Somogyi J, Freund TF (1997) Distribution of calretinin-
containing neurons relative to other neurochemically identified cell types in the
medial septum of the rat. Neuroscience 78:399–410.
110
Kiss J, Patel AJ, Baimbridge KG, Freund TF (1990) Topographical localization of
neurons containing parvalbumin and choline acetyltransferase in the medial
septum-diagonal band region of the rat. Neuroscience 36:61–72.
Kiyasova V, Bonnavion P, Scotto-Lomassese S, Fabre V, Sahly I, Tronche F, Deneris
E, Gaspar P, Fernandez SP (2013a) A subpopulation of serotonergic neurons that
do not express the 5-HT1A Autoreceptor. ACS Chem Neurosci 4:89–95.
Kiyasova V, Bonnavion P, Scotto-lomassese S, Sahly I, Deneris E, Gaspar P, Fernandez
SP (2013b) A Subpopulation of Serotonergic Neurons That Do Not Express the 5 ‑
HT1A Autoreceptor.
Kiyasova V, Fernandez SP, Laine J, Stankovski L, Muzerelle A, Doly S, Gaspar P
(2011) A genetically defined morphologically and functionally unique subset of 5-
HT neurons in the mouse raphe nuclei. J Neurosci 31:2756–2768.
Klausberger T, Magill PJ, Márton LF, Roberts JDB, Cobden PM, Buzsáki G, Somogyi
P (2003) Brain-state- and cell-type-specific firing of hippocampal interneurons in
vivo. Nature 421:844–848.
Klausberger T, Somogyi P (2008) Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity
of hippocampal circuit operations. Science 321:53–57.
Knox D, Keller SM (2016) Cholinergic neuronal lesions in the medial septum and
vertical limb of the diagonal bands of Broca induce contextual fear memory
generalization and impair acquisition of fear extinction. Hippocampus 26:718–726.
Kocsis B, Varga V, Dahan L, Sik A (2006) Serotonergic neuron diversity: identification
of raphe neurons with discharges time-locked to the hippocampal theta rhythm.
Proc Natl Acad Sci U S A 103:1059–1064.
Köhler C, Chan-Palay V, Steinbusch H (1982) The distribution and origin of serotonin-
containing fibers in the septal area: a combined immunohistochemical and
fluorescent retrograde tracing study in the rat. J Comp Neurol 209:91–111.
Köhler C, Steinbusch H (1982) Identification of serotonin and non-serotonin-containing
neurons of the mid-brain raphe projecting to the entorhinal area and the
hippocampal formation. A combined immunohistochemical and fluorescent
retrograde tracing study in the rat brain. Neuroscience 7:951–975.
Konopacki J, Bruce MacIver M, Bland BH, Roth SH (1987) Carbachol-induced EEG
“theta” activity in hippocampal brain slices. Brain Res 405:196–198.
111
Kvirkvelia L, Buzsaki G, Grastyan E (1987) Septal deafferentation produces continuous
rhythmic slow activity (theta) in the rat hippocampus. Acta Physiol Hung 70:127–
131.
Lacaille JC, Schwartzkroin P a (1988a) Stratum lacunosum-moleculare interneurons of
hippocampal CA1 region. I. Intracellular response characteristics, synaptic
responses, and morphology. J Neurosci 8:1400–1410.
Lacaille JC, Schwartzkroin P a (1988b) Stratum lacunosum-moleculare interneurons of
hippocampal CA1 region. II. Intrasomatic and intradendritic recordings of local
circuit synaptic interactions. J Neurosci 8:1411–1424.
Lanciego JL, Wouterlood FG (2011) A half century of experimental neuroanatomical
tracing. J Chem Neuroanat 42:157–183.
Leao RN, Targino ZH, Colom L V, Fisahn A (2014) Interconnection and
Synchronization of Neuronal Populations in the Mouse Medial Septum/Diagonal
Band of Brocca. J Neurophysiol 1986:jn.00367.2014.
LeDoux JE (2000) Emotion Circuits in the Brain. Annu Rev Neurosci 23:155–184.
Lee MG, Chrobak JJ, Sik A, Wiley RG, Buzs??ki G (1994) Hippocampal theta activity
following selective lesion of the septal cholinergic systeM. Neuroscience 62:1033–
1047.
Lehmann O, Grottick AJ, Cassel JC, Higgins GA (2003) A double dissociation between
serial reaction time and radial maze performance in rats subjected to 192 IgG-
saporin lesions of the nucleus basalis and/or the septal region. Eur J Neurosci
18:651–666.
Leranth C, Vertes RP (1999) Median raphe serotonergic innervation of medial
septum/diagonal band of Broca (MSDB) parvalbumin-containing neurons: Possible
involvement of the MSDB in the desynchronization of the hippocampal EEG.
598:586–598.
Li S, Varga V, Sik A, Kocsis B (2005) GABAergic control of the ascending input from
the median raphe nucleus to the limbic system. J Neurophysiol 94:2561–2574.
Li XG, Somogyi P, Tepper JM, Buzsáki G (1992) Axonal and dendritic arborization of
an intracellularly labeled chandelier cell in the CA1 region of rat hippocampus.
Exp brain Res 90:519–525.
Lidov HGW, Molliver ME (1982) An immunohistochemical study of serotonin neuron
112
development in the rat: Ascending pathways and terminal fields. Brain Res Bull
8:389–430.
Liu C, Maejima T, Wyler SC, Casadesus G, Herlitze S, Deneris ES (2010) Pet-1 is
required across different stages of life to regulate serotonergic function. Nat
Neurosci 13:1190–1198.
Lovett-Barron M, Kaifosh P, Kheirbek M, Danielson N, Zaremba J, Reardon T, Turi G,
Hen R, Zemelman B, Losonczy A (2014) Dendritic inhibition in the hippocampus
supports fear learning. Science (80- ) 343:857–863.
Lu Y, Simpson KL, Weaver KJ, Lin RCS (2010) Coexpression of Serotonin and Nitric
Oxide in the Raphe Complex: Cortical Versus Subcortical Circuit. Anat Rec
293:1954–1965.
Ma S, Olucha-Bordonau FE, Hossain MA, Lin F, Kuei C, Liu C, Wade JD, Sutton SW,
Nuñez A, Gundlach AL (2009) Modulation of hippocampal theta oscillations and
spatial memory by relaxin-3 neurons of the nucleus incertus. Learn Mem 16:730–
742.
Malenka RC, Bear MF (2004) LTP and LTD: An embarrassment of riches. Neuron
44:5–21.
Mamounas LA, Mullen CA, O’hearn E, Molliver ME (1991) Dual serotoninergic
projections to forebrain in the rat: Morphologically distinct 5-HT axon terminals
exhibit differential vulnerability to neurotoxic amphetamine derivatives. J Comp
Neurol 314:558–586.
Manseau F, Goutagny R, Danik M, Williams S (2008) The hippocamposeptal pathway
generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and
diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in
vitro. J Neurosci 28:4096–4107.
Maru E, Takahashi LK, Iwahara S (1979) Effects of median raphe nucleus lesions on
hippocampal EEG in the freely moving rat. Brain Res 163:223–234.
Mattis J, Brill J, Evans S, Lerner TN, Davidson TJ, Hyun M, Ramakrishnan C,
Deisseroth K, Huguenard JR (2014) Frequency-Dependent, Cell Type-Divergent
Signaling in the Hippocamposeptal Projection. J Neurosci 34:11769–11780.
McKenna JT, Vertes RP (2001) Collateral projections from the median raphe nucleus to
the medial septum and hippocampus. Brain Res Bull 54:619–630.
113
McMahon LL, Kauer J a (1997) Hippocampal interneurons are excited via serotonin-
gated ion channels. J Neurophysiol 78:2493–2502.
McNaughton N, Azmitia EC, Williams JH, Buchan A, Gray JA (1980) Septal elicitation
of hippocampal theta rhythm after localized de-afferentation of serotoninergic
fibers. Brain Res 200:259–269.
Melik E, Babar-Melik E, Ozgünen T, Binokay S (2000) Median raphe nucleus mediates
forming long-term but not short-term contextual fear conditioning in rats. Behav
Brain Res 112:145–150.
Melzer S, Michael M, Caputi A, Eliava M, Fuchs EC, Whittington M a., Monyer H
(2012) Long-Range – Projecting GABAergic. Science (80- ) 335:1506–1510.
Menard J, Treit D (1996) Lateral and medial septal lesions reduce anxiety in the plus-
maze and probe-burying tests. Physiol Behav 60:845–853.
Miettinen R, Freund TF (1992) Neuropeptide Y-containing interneurons in the
hippocampus receive synaptic input from median raphe and Gabaergic septal
afferents. Neuropeptides 22:185–193.
Miles R, Tóth K, Gulyás AI, Hájos N, Freund TF (1996) Differences between somatic
and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron 16:815–823.
Morales M, Battenberg E, Bloom FE (1998) Distribution of neurons expressing
immunoreactivity for the 5HT3 receptor subtype in the rat brain and spinal cord. J
Comp Neurol 402:385–401.
Morales M, Bloom FE (1997) The 5-HT3 receptor is present in different subpopulations
of GABAergic neurons in the rat telencephalon. J Neurosci 17:3157–3167.
Morris NP, Fyffe REW, Robertson B (2004) Characterisation of hyperpolarization-
activated currents (Ih) in the medial septum/diagonal band complex in the mouse.
Brain Res 1006:74–86.
Mullen RJ, Buck CR, Smith AM (1992) NeuN, a neuronal specific nuclear protein in
vertebrates. Development 116:201–211.
Mumby DG (2001) Perspectives on object-recognition memory following hippocampal
damage: lessons from studies in rats. In: Behavioural Brain Research, pp 159–181.
Muñoz W, Tremblay R, Levenstein D, Rudy B (2017) Layer-specific modulation of
neocortical dendritic inhibition during active wakefulness. Science (80- ) 355:954–
959.
114
Murray EA, Davidson M, Gaffan D, Olton DS, Suomi S (1989) Effects of fornix
transection and cingulate cortical ablation on spatial memory in rhesus monkeys.
Exp Brain Res 74:173–186.
Muzerelle A, Scotto-Lomassese S, Bernard JF, Soiza-Reilly M, Gaspar P (2016)
Conditional anterograde tracing reveals distinct targeting of individual serotonin
cell groups (B5-B9) to the forebrain and brainstem. Brain Struct Funct 221:535–
561.
Nategh M, Nikseresht S, Khodagholi F, Motamedi F (2015) Nucleus incertus
inactivation impairs spatial learning and memory in rats. Physiol Behav 139:112–
120.
Numan R (2015) A Prefrontal-Hippocampal Comparator for Goal-Directed Behavior:
The Intentional Self and Episodic Memory. Front Behav Neurosci 9:323.
Nyakas C, Luiten PGM, Spencer DG, Traber J (1987) Detailed projection patterns of
septal and diagonal band efferents to the hippocampus in the rat with emphasis on
innervation of CA1 and dentate gyrus. Brain Res Bull 18:533–545.
O’Keefe J, Conway DH (1978) Hippocampal place units in the freely moving rat: why
they fire where they fire. Exp brain Res 31:573–590.
O’Keefe J, Dostrovsky J (1971) The hippocampus as a spatial map. Preliminary
evidence from unit activity in the freely-moving rat.
O’Neill P-K, Gordon JA, Sigurdsson T (2013) Theta oscillations in the medial
prefrontal cortex are modulated by spatial working memory and synchronize with
the hippocampus through its ventral subregion. J Neurosci 33:14211–14224.
Okaty BW, Freret ME, Rood BD, Brust RD, Hennessy ML, deBairos D, Kim JC, Cook
MN, Dymecki SM (2015) Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin
Neuron System. Neuron 88:774–791.
Pang KC, Nocera R (1999) Interactions between 192-IgG saporin and intraseptal
cholinergic and GABAergic drugs: role of cholinergic medial septal neurons in
spatial working memory. Behav Neurosci 113:265–275.
Paoletti P (2011) Molecular basis of NMDA receptor functional diversity. Eur J
Neurosci 33:1351–1365.
Papp EC, Hájos N, Acsády L, Freund TF (1999) Medial septal and median raphe
innervation of vasoactive intestinal polypeptide-containing interneurons in the
115
hippocampus. Neuroscience 90:369–382.
Paxinos G (2004) The Rat Nervous System.
Pelosi B, Migliarini S, Pacini G, Pratelli M, Pasqualetti M (2014) Generation of
Pet1210-Cre transgenic mouse line reveals non-serotonergic expression domains of
Pet1 both in CNS and periphery. PLoS One 9:24–29.
Pfaar H, von Holst A, Vogt Weisenhorn DM, Brodski C, Guimera J, Wurst W (2002)
MPet-1, a mouse ETS-domain transcription factor, is expressed in central
serotonergic neurons. Dev Genes Evol 212:43–46.
Pi H-J, Hangya B, Kvitsiani D, Sanders JI, Huang ZJ, Kepecs A (2013) Cortical
interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature 503:521–524.
Puig MV, Santana N, Celada P, Mengod G, Artigas F (2004) In vivo excitation of
GABA interneurons in the medial prefrontal cortex through 5-HT3 receptors.
Cereb Cortex 14:1365–1375.
Ramón y Cajal S (1909) Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des Vertebres.
Maloine, Paris: 1911. chap. II.
Richardson-Jones JW, Craige CP, Guiard BP, Stephen A, Metzger KL, Kung HF,
Gardier AM, Dranovsky A, David DJ, Beck SG, Hen R, Leonardo ED (2010) 5-
HT1A Autoreceptor Levels Determine Vulnerability to Stress and Response to
Antidepressants. Neuron 65:40–52.
Robinson J, Manseau F, Ducharme G, Amilhon B, Vigneault E, El Mestikawy S,
Williams S (2016) Optogenetic Activation of Septal Glutamatergic Neurons Drive
Hippocampal Theta Rhythms. J Neurosci 36:3016–3023.
Rood BD, Calizo LH, Piel D, Spangler ZP, Campbell K, Beck SG (2014) Dorsal raphe
serotonin neurons in mice: immature hyperexcitability transitions to adult state
during first three postnatal weeks suggesting sensitive period for environmental
perturbation. J Neurosci 34:4809–4821.
Ropert N, Guy N (1991) Serotonin facilitates GABAergic transmission in the CA1
region of rat hippocampus in vitro. J Physiol 441:121–136.
Rubin A, Yartsev MM, Ulanovsky N (2014) Encoding of Head Direction by
Hippocampal Place Cells in Bats. J Neurosci 34:1067–1080.
Sanacora G, Zarate CA, Krystal JH, Manji HK (2008) Targeting the glutamatergic
system to develop novel, improved therapeutics for mood disorders. Nat Rev Drug
116
Discov 7:426–437.
San Paulo A, García R (2000) High-resolution imaging of antibodies by tapping-mode
atomic force microscopy: attractive and repulsive tip-sample interaction regimes.
Biophys J 78:1599–1605.
Saunders A, Granger AJ, Sabatini BL (2015) Corelease of acetylcholine and GABA
from cholinergic forebrain neurons. Elife 2015.
Schlingloff D, Kali S, Freund TF, Hajos N, Gulyas AI, Káli S, Freund TF, Hájos N,
Gulyás AI (2014) Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. J
Neurosci 34:11385–11398.
Schmitz C, Hof PR (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience
130:813–831.
Scott MM (2005) A Differentially Autoregulated Pet-1 Enhancer Region Is a Critical
Target of the Transcriptional Cascade That Governs Serotonin Neuron
Development. J Neurosci 25:2628–2636.
Scott MM, Wylie CJ, Lerch JK, Murphy R, Lobur K, Herlitze S, Jiang W, Conlon RA,
Strowbridge BW, Deneris ES (2005) A genetic approach to access serotonin
neurons for in vivo and in vitro studies. ProcNatlAcadSciUSA 102:16472–16477.
Seal RP, Akil O, Yi E, Weber CM, Grant L, Yoo J, Clause A, Kandler K, Noebels JL,
Glowatzki E, Lustig LR, Edwards RH (2008) Sensorineural Deafness and Seizures
in Mice Lacking Vesicular Glutamate Transporter 3. Neuron 57:263–275.
Shepherd GM (2004) The Synaptic Organization of the Brain.
Shutoh F, Ina A, Yoshida S, Konno J, Hisano S (2008) Two distinct subtypes of
serotonergic fibers classified by co-expression with vesicular glutamate transporter
3 in rat forebrain. Neurosci Lett 432:132–136.
Somogyi J, Baude A, Omori Y, Shimizu H, El Mestikawy S, Fukaya M, Shigemoto R,
Watanabe M, Somogyi P (2004) GABAergic basket cells expressing
cholecystokinin contain vesicular glutamate transporter type 3 (VGLUT3) in their
synaptic terminals in hippocampus and isocortex of the rat. Eur J Neurosci 19:552–
569.
Somogyi P, Freund TF, Hodgson AJ, Somogyi J, Beroukas D, Chubb IW (1985)
Identified axo-axonic cells are immunoreactive for GABA in the hippocampus
visual cortex of the cat.
117
Sotty F, Danik M, Manseau F, Laplante F, Quirion R, Williams S (2003) Distinct
electrophysiological properties of glutamatergic, cholinergic and GABAergic rat
septohippocampal neurons: novel implications for hippocampal rhythmicity. J
Physiol 551:927–943.
Stamp JA (1995) Extent of colocalization of serotonin and G A B A in the neurons of
the rat raphe nuclei. Surgery 677:39–49.
Stäubli U, Xu FB (1995) Effects of 5-HT3 receptor antagonism on hippocampal theta
rhythm, memory, and LTP induction in the freely moving rat. J Neurosci 15:2445–
2452.
Sterio DC (1984) The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles
using the disector. J Microsc 134:127–136.
STUMPF C, PETSCHE H, GOGOLAK G (1962) The significance of the rabbit’s
septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The
differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the
hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 14:212–219.
Szabadits E, Cserep C, Szonyi A, Fukazawa Y, Shigemoto R, Watanabe M, Itohara S,
Freund TF, Nyiri G (2011a) NMDA receptors in hippocampal GABAergic
synapses and their role in nitric oxide signaling. J Neurosci 31:5893–5904.
Szabadits E, Cserép C, Szonyi A, Fukazawa Y, Shigemoto R, Watanabe M, Itohara S,
Freund TF, Nyiri G (2011b) NMDA receptors in hippocampal GABAergic
synapses and their role in nitric oxide signaling. J Neurosci 31:5893–5904.
Szirmai I (2005) Neurológia. Medicina Könyvkiadó Zrt. Budapest.
Takács VT, Freund TF, Gulyás AI (2008) Types and synaptic connections of
hippocampal inhibitory neurons reciprocally connected with the medial septum.
Eur J Neurosci 28:148–164.
Takács VT, Freund TF, Nyiri G (2013) Neuroligin 2 Is Expressed in Synapses
Established by Cholinergic Cells in the Mouse Brain. PLoS One 8.
Teissier A, Chemiakine A, Inbar B, Bagchi S, Ray RS, Palmiter RD, Dymecki SM,
Moore H, Ansorge MS (2015) Activity of Raph?? Serotonergic Neurons Controls
Emotional Behaviors. Cell Rep 13:1965–1976.
Thierry AM, Gioanni Y, Dégénétais E, Glowinski J (2000) Hippocampo-prefrontal
cortex pathway: Anatomical and electrophysiological characteristics. Hippocampus
118
10:411–419.
Tremblay R, Lee S, Rudy B (2016) GABAergic Interneurons in the Neocortex: From
Cellular Properties to Circuits. Neuron 91:260–292.
Umbriaco D, Garcia S, Beaulieu C, Descarries L (1995) Relational features of
acetylcholine, noradrenaline, serotonin and GABA axon terminals in the stratum
radiatum of adult rat hippocampus (CA1). Hippocampus 5:605–620.
Unal G, Joshi A, Viney TJ, Kis V, Somogyi P (2015) Synaptic Targets of Medial Septal
Projections in the Hippocampus and Extrahippocampal Cortices of the Mouse. J
Neurosci 35:15812–15826.
van der Staay FJ, Raaijmakers WGM, Lammers AJJC, Tonnaer JADM (1989) Selective
fimbria lesions impair acquisition of working and reference memory of rats in a
complex spatial discrimination task. Behav Brain Res 32:151–161.
Vandecasteele M, Varga V, Berényi A, Papp E, Barthó P, Venance L, Freund TF,
Buzsáki G (2014) Optogenetic activation of septal cholinergic neurons suppresses
sharp wave ripples and enhances theta oscillations in the hippocampus. Proc Natl
Acad Sci 111:13535–13540.
Vanderwolf CH, Leung LW, Baker GB, Stewart DJ (1989) The role of serotonin in the
control of cerebral activity: studies with intracerebral 5,7-dihydroxytryptamine.
Brain Res 504:181–191.
Varga C, Sík A, Lavallée P, Deschênes M (2002) Dendroarchitecture of relay cells in
thalamic barreloids: a substrate for cross-whisker modulation. J Neurosci 22:6186–
6194.
Varga V, Hangya B, Kránitz K, Ludányi A, Zemankovics R, Katona I, Shigemoto R,
Freund TF, Borhegyi Z (2008) The presence of pacemaker HCN channels
identifies theta rhythmic GABAergic neurons in the medial septum. J Physiol
586:3893–3915.
Varga V, Losonczy A, Zemelman B V., Borhegyi Z, Nyiri G, Domonkos A, Hangya B,
Holderith N, Magee JC, Freund TF (2009) Fast Synaptic Subcortical Control of
Hippocampal Circuits. Science (80- ) 326:449–453.
Varoqueaux F, Jamain S, Brose N (2004) Neuroligin 2 is exclusively localized to
inhibitory synapses. Eur J Cell Biol 83:449–456.
Vassilev PM, Mitchel J, Vassilev M, Kanazirska M, Brown EM (1997) Assessment of
119
frequency-dependent alterations in the level of extracellular Ca2+ in the synaptic
cleft. Biophys J 72:2103–2116.
Vertes RP, Fortin WJ, Crane AM (1999) Projections of the median raphe nucleus in the
rat. J Comp Neurol 407:555–582.
Vertes RP, Kinney GG, Kocsis B, Fortin WJ (1994) Pharmacological suppression of the
median raphe nucleus with serotonin1A agonists, 8-OH-DPAT and buspirone,
produces hippocampal theta rhythm in the rat. Neuroscience 60:441–451.
Vertes RP, Kocsis B (1997) Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems
controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience 81:893–926.
Vicente MA, Zangrossi H, dos Santos L, de Macedo CE, Andrade TGCS (2008)
Involvement of median raphe nucleus 5-HT1A receptors in the regulation of
generalized anxiety-related defensive behaviours in rats.
Vida I, Halasy K, Szinyei C, Somogyi P, Buhl EH (1998) Unitary IPSPs evoked by
interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the
CA1 area of the rat hippocampus in vitro. J Physiol 506:755–773.
Viney TJ, Lasztoczi B, Katona L, Crump MG, Tukker JJ, Klausberger T, Somogyi P
(2013) Network state-dependent inhibition of identified hippocampal CA3 axo-
axonic cells in vivo. Nat Neurosci 16:1802–1811.
Vitalis T, Ansorge MS, Dayer AG (2013) Serotonin homeostasis and serotonin
receptors as actors of cortical construction: special attention to the 5-HT3A and 5-
HT6 receptor subtypes. Front Cell Neurosci 7:93.
Vong L, Ye C, Yang Z, Choi B, Chua S, Lowell BB (2011) Leptin Action on
GABAergic Neurons Prevents Obesity and Reduces Inhibitory Tone to POMC
Neurons. Neuron 71:142–154.
Wang D V, Yau H-J, Broker CJ, Tsou J-H, Bonci A, Ikemoto S (2015) Mesopontine
median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation.
Nat Neurosci 18:728–735.
Watanabe M, Fukaya M, Sakimura K, Manabe T, Mishina M, Inoue Y (1998) Selective
scarcity of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum (mossy fibre-
recipient layer) of the mouse hippocampal CA3 subfield. Eur J Neurosci 10:478–
487.
West MJ, Slomianka L, Gundersen HJ (1991) Unbiased stereological estimation of the
120
total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical
fractionator. Anat Rec 231:482–497.
Wirth S, Baraduc P, Planté A, Pinède S, Duhamel J-R (2017) Gaze-informed, task-
situated representation of space in primate hippocampus during virtual navigation.
PLoS Biol 15:e2001045.
Wong DT, Perry KW, Bymaster FP (2005) Case history: The discovery of fluoxetine
hydrochloride (Prozac). Nat Rev Drug Discov 4:764–774.
Wu C-T, Haggerty D, Kemere C, Ji D (2017) Hippocampal awake replay in fear
memory retrieval. Nat Neurosci 20:571–580.
Wyler SC, Donovan LJ, Yeager M, Deneris E (2015) Pet-1 Controls
Tetrahydrobiopterin Pathway and Slc22a3 Transporter Genes in Serotonin
Neurons. ACS Chem Neurosci 6:1198–1205.
Wyler SC, Spencer WC, Green NH, Rood BD, Crawford L, Craige C, Gresch P,
McMahon DG, Beck SG, Deneris E (2016) Pet-1 Switches Transcriptional Targets
Postnatally to Regulate Maturation of Serotonin Neuron Excitability. J Neurosci
36:1758–1774.
Wylie CJ, Hendricks TJ, Zhang B, Wang L, Lu P, Leahy P, Fox S, Maeno H, Deneris
ES (2010) Distinct Transcriptomes Define Rostral and Caudal Serotonin Neurons.
J Neurosci 30:670–684.
Yamakawa GR, Antle MC (2010) Phenotype and function of raphe projections to the
suprachiasmatic nucleus. Eur J Neurosci 31:1974–1983.
Yamamoto T, Watanabe S, Oishi R, Ueki S (1979) Effects of midbrain raphe
stimulation and lesion on EEG activity in rats. Brain Res Bull 4:491–495.
Yizhar O, Fenno LE, Davidson TJ, Mogri M, Deisseroth K (2011) Optogenetics in
Neural Systems. Neuron 71:9–34.
Zhang L, Ren G (2012) IPET and FETR: Experimental approach for studying molecular
structure dynamics by cryo-electron tomography of a single-molecule structure.
PLoS One 7.
121
XII. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
I. Az értekezés témájában megjelent eredeti közlemények:
Sos KE, Mayer MI, Cserep C, Takacs FS, Szonyi A, Freund TF, Nyiri G
Cellular architecture and transmitter phenotypes of neurons of the mouse median raphe region
BRAIN STRUCTURE & FUNCTION 222: (1) pp. 287-299. (2017)
IF: 4,698*
Szonyi A, Mayer MI, Cserep C, Takacs VT, Watanabe M, Freund TF, Nyiri G
The ascending median raphe projections are mainly glutamatergic in the mouse forebrain
BRAIN STRUCTURE & FUNCTION 221: (2) pp. 735-751. (2016)
IF: 4,698
II. Egyéb — nem az értekezés témájában megjelent — eredeti közlemények:
Takacs VT, Szonyi A, Freund TF, Nyiri G, Gulyas AI
Quantitative ultrastructural analysis of basket and axo-axonic cell terminals in the mouse
hippocampus
BRAIN STRUCTURE & FUNCTION 220: (2) pp. 919-940, (2015)
IF: 5,811
Cserep C, Szabadits E, Szonyi A, Watanabe M, Freund TF, Nyiri G NMDA Receptors in
GABAergic Synapses during Postnatal Development PLOS ONE 7: (5) e37753. 13 p. (2012)
IF: 3,730
Cserep C, Szonyi A, Veres JM, Nemeth B, Szabadits E, de Vente J, Hajos N, Freund TF,
Nyiri G
Nitric Oxide Signaling Modulates Synaptic Transmission during Early Postnatal Development
CEREBRAL CORTEX 21: (9) pp. 2065-2074. (2011)
IF: 6,544
122
Szabadits E, Cserep C, Szőnyi A, Fukazawa Y, Shigemoto R, Watanabe M, Itohara S, Freund
TF, Nyiri G
NMDA Receptors in Hippocampal GABAergic Synapses and Their Role in Nitric Oxide
Signaling
JOURNAL OF NEUROSCIENCE 31: (16) pp. 5893-5904. (2011)
IF: 7,115
Zádori D, Nyiri G, Szőnyi A, Szatmári I, Fülöp F, Toldi J, Freund TF, Vécsei I.,
Klivényi P
Neuroprotective effects of a novel kynurenic acid analogue in a transgenic mouse model of
Huntington's disease
JOURNAL OF NEURAL TRANSMISSION 118: (6) pp. 865-875. (2011)
IF: 2,730
A PhD-fokozat megszerzése előtt álló szerzőtársak munkájának aránya a disszertáció
témájában megjelent első szerzős publikációban, beleértve minden adatot, táblázatot és
ábrát:
Szőnyi András: 80%
Mayer Márton: 20%
A PhD-fokozat megszerzése előtt álló szerzőtársak munkájának aránya a disszertáció
témájában megjelent nem első szerzős publikációban, beleértve minden adatot, táblázatot
és ábrát:
Szőnyi András: 13%
Sós Katalin Eszter: 62%
Mayer Márton: 25%
123
XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Szeretném megköszönni szüleimnek, Szőnyiné Simon Beatricének és Szőnyi Lászlónak,
hogy az elmúlt évek alatt végig hittek abban, amit csinálok, és mindvégig támogattak az
orvosi egyetem és a doktori iskola elvégzésében. Az ő áldozataik és biztatásuk nélkül ez
a munka nem készülhetett volna el. Köszönöm testvérem, Szőnyi Péter szerető
támogatását is. Itt mondok köszönetet családom minden tagjának, akik mindannyian
végig érdeklődéssel és biztatással fordultak felém.
Külön köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, Dr. Nyiri Gábornak, és
csoportvezetőnknek, Dr. Freund Tamásnak, akik megmutatták nekem az idegtudomány
szépségét és a helyes tudományos gondolkodást. Az ő példamutatásuk a jövőben is végig
el fog kísérni és útmutatásul fog szolgálni.
Közvetlen munkatársaim közül szeretném kiemelni Sós Katalin Eszter és Mayer Márton
támogatását, emberi és szakmai alázatát és példamutatását, akik az elmúlt évek közös
munkájában a legtöbb segítséget nyújtották nekem, amely jóval túlmutatott és túlmutat a
közös publikációk társszerzőségén.
Végül, de nem utolsósorban szeretném megköszönni az Agykéreg Kutatócsoport, a
Thalamusz Kutatócsoport, a Celluláris Idegélettan Kutatócsoport és a Hálózat-Idegélettan
Kutatócsoport tagjainak, és a MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet
munkatársainak azt, hogy az általuk megteremtett, páratlanul inspiráló és baráti légkörben
dolgozhatok már középiskolás korom óta.
A kutatás a TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság
Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer
kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretében zajlott. A
projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával
valósul meg.
Recommended