BIOCHEMICKÉ METODY IZOLACE A CHARAKTERIZACE PROTEINŮ

Jana Novotná

Charakterizace proteinu

1. Molekulová hmotnost celého proteinu

2. Molekulová hmotnost polypeptidových řetězců

3. Určení primární struktury

4. Aminokyselinové složení

5. Aminokyselinové sekvence

6. Trojrozměrná struktura

7. Izoelektrický bod proteinu

8. Spektroskopické vlastnosti

A. Separace založené na velikosti molekul(dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie)

B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů(izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly)

C. Separace založené na základě elektrického náboje(elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie)

Separační metody

Separační metodyA. Separace založené na velikosti molekul

Dialýza a ultrafiltrace

Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem Propustnost membrány pro rozpuštěné látky Velikost povrchu membrány Pohyb částic < 1000 Da

Centrifugace v hustotním gradientu

Zóny obsahujícízahuštěný protein

zkumavka je naplněná roztokem sacharózy s lineárně stoupající hustotou směrem ke dnu

hladina gradientového roztoku se převrství směsí proteinů

centrifugace za použití vysokých otáček, proteiny sedimentují určitou rychlostí podle velikosti, density a tvaru molekul (je dosažena rovnováha mezi hustotou roztoku a částicí)

po centrifugaci jsou proteiny v gradientu sacharózy rozděleny a zahuštěny

Hydrofilní gelové částice (polymer) Uvnitř každé částice jsou póry Látky se rozdělují podle velikosti

(molekulové hmotnosti)

Gelová filtrační chromatografie

(molekulová vylučovací chromatografie)

Optimální gel pro gelovou filtraci by měl mít následující vlastnosti:

inertní matrice gelu pro dělené složky i pro eluční roztoky.

chemicky stabilní gel během několika kroků, při různém pH a při různé teplotě.

mechanicky stabilní gel, aby se při větším tlaku nedeformoval.

velikost gelových částic nesmí být ani příliš malá (rozdělení je přesnější, ale pomalejší) ani příliš velká (rozdělení je rychlejší, ale může být nepřesné). Na rychlou chromatografii tedy použijeme gel s hrubšími zrny. Na vysoký stupeň rozlišení použijeme gel s malými zrny.

rozpustnost globulárních proteinů ovlivňuje pH při pH = pI je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat – mají 0 náboj

protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný

(NH3+ nebo COO- postranních řetězců aminokyselin v

proteinu)

princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pI a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má pH = jeho pI.

pH roztoku je nižší pI pH roztoku je vyšší

náboj proteinu náboj proteinu

+ -

B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů

Izoelektrická precipitace

Rozpustnost proteinu prudce stoupá je-li v pH nižším než pI proteinu nebo v pH vyšším než pI proteinu (molekuly mají stejné náboje a odpuzují se).

Vysolování neutrálními solemi

Princip

Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky

(čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný)

Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní

plášť Interakce protein/protein je silnější než

protein/roztok Molekuly proteinu koagulují díky hydrofóbním

interakcím

Vyšší koncentrace neutrální soli (NaCl, KCl) ovlivňuje rozpustnost globulárních proteinů.

Povaha aniontu (Cl-) se ve vysolovacím efektu uplatňuje více než povaha kationtu Na+).

Dvojmocné a vícemocné anionty jsou účinnější než jednomocné anionty {MgCl2 a (NH4)SO4 více než

NaCl}.

Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %).

etanol sníží dielektrickou konstantu (nižší než voda)

sníží se stupeň ionizace a zvýší přitažlivé síly mezi opačnými náboji, tím se sníží rozpustnost. udržování roztoku při teplotách kolem Oo C se snižuje nebezpečí denaturace proteinu.

Frakcionace organickými rozpouštědly

Metody vycházejí z acidobazického chování proteinů (typ a počet ionizovatelných skupin aminokyselin)

Elektroforetické metody Soubor separačních metod. Využívají k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při elektroforéze dělí nabité molekuly (ionty):

při pH > pI - protein je aniontem, má celkový (-) náboj – pohyb k anodě

při pH < pI - protein je kationtem, má celkový (+) náboj – pohyb ke katodě

C. Separace na základě elektrického náboje

Proužek acetátcelulózy – nanesení vzorku.

Elektroforéza ( rozdělení podle různých elektroforetických pohyblivostí).

Rozdělené proteiny na zóny.

Densitogram(densita je přímo úměrná koncentraci)

Zónová elektroforéza (dělení plasmatických bílkovin)

Iontově výměnná chromatografie

Různá afinita dělených molekul k povrchu gelových částic s kovalentně vázanými částicemi s nábojem.

Proteiny se váží díky elektrostatickým interakcím.

Síla vazby závisí:a. celkovém povrchové náboji (funkce pH pufru a pI proteinu)

Substance používaná k dělení má upravený povrch zrn (+) nabité gelové částice váží anionty

DEAE celulóza (diethylaminoethyl)

(-) nabité gelové částice váží kationty CM celulóza (carboxymethyl)

navázané proteiny se z vazby uvolní změnou iontové síly nebo změnou pH roztoku procházejícího chromatografickou kolonou

D. Separace pomocí specifického ligandu

Afinitní chromatografie (adsorpční)

Využití biologických vlastností proteinů - specifická nekovalentní vazba s jinou molekulou (ligand)

enzym + koenzym

hormon + receptor

antigen + protilátka

inhibitor+substrát

lektin+cukr

použití nosiče - agarózové partikule (Sephadex)

Chromatografie na molekulovém sítu (gelová filtrace)

Určení molekulové hmotnosti z kalibrační křivky

Kalibrační křivka

Jednotlivé frakce proteinůse detekují spektrofotometrem.Rychlost průtoku proteinuje úměrná velikosti molekuly

Gelová elektroforéza

Gel z polymerovaného akrylamidu (nebo agarózy). Polymer vytváří síť (podle koncentrace akrylamidu určitá velikost ok sítě) Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji).Detergent SDS (sodium dodecyl sulfate) přidaný do dělícího pufru dodá všem

proteinům celkový záporný náboj. Všechny proteiny migrují jedním směrem - k anodě.

Děkuji za pozornost