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Diagnostic Virologique du VIH
Pr S. Fafi-Kremer
Institut de Virologie, CHU de Strasbourg
Séminaire de Formation Jeudi 14 Novembre 2013
1
Objectifs
Comprendre la cinétique des marqueurs de l’infection par le VIH
connaitre les principes généraux des tests de dépistage
conventionnels et des TROD
connaitre et comprendre les performances d’un TROD et ses limites
connaitre l’algorithme de dépistage VIH à partir d’un TROD
2
VIH: Structure virale
• Famille Retroviridae- genre lentivirus
• Virus ARN (2 copies), enveloppé
Enveloppe virale:
ARN viral
Protéase (p11)
Intégrase (p32)
RT (p55-p63)
3
gp120
gp41
Capside (p24)
Matrice (p17)
Nucleocapside (P7)
Core:
•Transcriptase inverse: ARN ADN
• Intégration génome cellule hote ADN
proviral
VIH: Diversité et origine
Afrique de l’Ouest
A B C D F G H J K
56 recombinants (CRF 01 à 56)
CRF: Circulating Recombinant Form
Sous-types
4
Marqueurs virologiques de la primo-infection par le VIH en
l'absence de traitement
11-12 14-15 20-21 28-29 Temps (jours)
anti-gp 160
anti-gp 120
anti-gp 41
anti-p24
Contage J 0
taux
des marqueurs
Ag p24
seuil de détection
des marqueurs
Phase d’éclipse Risque majeur de transmission
5
ARN viral
Tests de diagnostic de l’infection par le VIH
6
Diagnostic sérologique: Mise en évidence des anticorps (Ac) anti-VIH et/ou de
l’Ag P24
Tests de dépistage
• Méthode immuno-enzymatique type ELISA
•Tests mixtes: Detection Ac anti-VIH1 et anti-VIH2
•Tests combinés (4ème génération): détection Ac anti-VIH et Ag P24
Tests de confirmation
• Western blot ou Immunoblot
Diagnostic moléculaire: Mise en évidence de acides nucléaires
•Quantification de l’ARN VIH
•Détection et/ou quantification de l’ADN proviral
Tests de dépistage
7
Evolution des tests de dépistage ELISA
1ère génération
(1985)
2ème génération 3ème génération 4ème génération
(1990)
cible Virus purifié
Détection
IgG anti-VIH
Protéines d’enveloppe purifiés
Protéines recombinantes
Peptides de synthèse
IgM + IgG anti-VIH IgM + IgG anti-VIH
+ Ag P24
Test ELISA
8
9
Evolution des tests de dépistage ELISA
Branson and Stekler JID 2012
Amélioration progressive des performances:
+ 20 jours entre 1ère et 3ème génération
+ 4 – 5 jours entre 3ème et 4ème génération
Marqueurs virologiques de la primo-infection par le VIH en
l'absence de traitement
11-12 14-15 20-21 28-29 Temps (jours)
anti-gp 160
anti-gp 120
anti-gp 41
anti-p24
Contage J 0
taux
des marqueurs
Ag p24
seuil de détection
des marqueurs
Phase d’éclipse 1ère
génération
2ème
génération
3ème
génération
4ème
génération
10
11
Performance des tests
Spécificité : capacité à donner un résultat négatif lorsque l’infection n’est pas
présente.
Sensibilité : capacité à donner un résultat positif lorsque l’infection est
présente.
Valeur prédictive positive: probabilité pour un individu ayant un
test positif d’être infecté par le VIH
Valeur prédictive négative: probabilité pour un individu ayant
un test négatif de ne pas être infecté par le VIH
Si spécificité faible, risque important de faux positif
Si sensibilité faible, risque important de faux négatif
AMM: 100% (hors per-seroconversion)
AMM: >99,5%
Les limites des tests de
dépistage
12
Diversité VIH en France
HIV-1 4 groupes HIV-2
HIV-1 O
HIV-1M
HIV-1N
A
C
virus
mosaïques
B
D (E)
G
H
(I) J
F
A
B C
D E
56 formes recombinantes ou CRFs
K
F
H G
A
B
CRF02
?
HIV-1 P
13
Diversité VIH en France
A. Maillard, Formation SFLS 2012 14
Stade de l’infection
11-12 14-15 20-21 28-29 Temps (jours)
anti-gp 160
anti-gp 120
anti-gp 41
anti-p24
Contage J 0
taux
des marqueurs
Ag p24
seuil de détection
des marqueurs
Phase d’éclipse
4ème génération
Fenêtre sérologique
Test ELISA mixte combiné (4ème génération) un résultat négatif du test 6
semaines après l’exposition peut être considéré comme négatif
15
Dépistage de l’infection par le
VIH en pratique
16
17
Diagnostic de l’infection par le VIH
Chez l’adulte et l’enfant >18 mois:
• Test ELISA 4ème génération + test de confirmation
• Confirmation positivité sur 2ème prélèvement
• Charge virale si test sérologique indéterminé
Chez le nouveau-né et le nourrisson <18 mois:
• Charge virale (quantification ADN proviral)
18
A. Maillard, Formation SFLS Rennes
Test ELISA 4ème génération
Spécificité minimale: 99,5%
Sensibilité: 100%
19
VIH 1
VIH 2
Immunoblot
mixte Enveloppe virale:
ARN viral
Protéase (p11)
Intégrase (p32)
RT (p55-p63)
gp120
gp41
Capside (p24)
Matrice (p17)
Nucleocapside (P7)
Core:
• Réalisé en cas de test de dépistage positif
ou douteux
• Spécifique du type de virus (VIH-1 ou VIH-2)
• Mise en évidence spécificité des Anticorps
anti-VIH
Confirmation: Immunoblots ou western blots
20
Enveloppe virale:
ARN viral
Protéase (p11)
Intégrase (p32)
RT (p55-p63)
gp120
gp41
Capside (p24)
Matrice (p17)
Nucleocapside (P7)
Core:
• Réalisée sur plasma EDTA si test de confirmation
indéterminé (et avant traitement)
• Très bonne sensibilité, très bonne spécificité
• Test couteux, risque de faux négatif chez les
patients controleurs
Quantification de l’ARN viral = charge virale VIH
ARN viral
21
Barin F et Simon F, Virologie 2013
Tests rapides d’orientation
diagnostique (TROD)
22
23
Tests Rapides d’Orientation Diagnostique VIH
24
Principes généraux des TROD
• Ag HIV1/2 de synthèse fixés sur support
• Détection IgG et IgM (1 seul test détecte Ag P24)
• Contrôle de migration et qualité de l’échantillon (Ac anti Ig
humaines le plus souvent): Positivité du contrôle indispensable à la
validation du test+++
• Révélation du complexe Ag-Ac par colorimétrie
ligne contrôleLigne
du testConjugé avec or colloidal
+proteine A.
Ac anti anticorps humain
Antigene HIV-1/2
Or Colloidal
Conjugé à laProteine A
AC Humains non HIV
Ac HIV-1/2
Prélèvement
Absorbant
Immunofiltration sur membrane
(Through flow) Immunochromatographie
(lateral flow)
Matrices des TROD
• Fluide gingival (créviculaire): Recueil
standardisé entre gencive et face interne
lèvre
Non autorisé en France (arrêté nov 2010)
• Sérum/ plasma: recueil après
centrifugation en milieu spécialisé
• Sang total:sang non décanté avec
globules rouges et plasma
25
Délai de 1ère positivité des TROD
11-12 14-15 20-21 30
Temps (jours)
anti-gp 160
anti-gp 120
anti-gp 41
anti-p24
Contage J 0
taux
des marqueurs
Ag p24
seuil de détection
des marqueurs
Délai de 1ère positivité des TROD
3ème
génération
4ème
génération
Risque majeur de transmission
40 50
Sensibilité équivalente aux tests EIA 3ème génération pour les
TRODs les + performants
26
Les tests disponibles en France
Vikia
Biomérieux
Oraquick Advance
Orasure/Orgentec
Determine
Inverness/Alere
INSTI
Nephrotek
• Réalisation simple auprès du patient (pas d’instrumentation)
• Test unitaire
• Lecture subjective visuelle
• Rendu rapide (qq minutes – 30 min) 27
28
Les tests disponibles en France
Pavie et al, PlosOne 2010
TROD: prélèvement sang capillaire
29
Réalisation simple manuelle
30
Réalisation simple manuelle
31
Lecture Subjective Visuelle
Un trait Deux traits
= négatif = positif
32
33
Limites des TROD
- Moins sensible que les tests Elisa (risque de faux négatifs) . Sang total capillaire < sérum
. Pas adapté en primo-infection délai d’apparition Ac VIH : ≈ 21-42 jours
• Variabilité individuelle
• Diversité virale
• Risque de faux positifs nécessité de test de confirmation
• Opérateur dépendant
• Difficulté d’évaluation (contrôle qualité)
• Négligeance des autres IST
34
• Entre 2008-2009, étude comparative 200 patients:
HIV-1 (n=194) 63,3% sous type B ; HIV-2 (n=6); 68, 5% traités par
ARVs; HIV neg (n=20)
Sensibilité des TROD sur sang capillaire et « salive »
Pavie et al, PlosOne 2010
Sang capillaire > salive
Taux Ac dans liquide créviculaire 100 à 1000 fois
inférieur au taux AC dans sérum
35
Pavie et al, PlosOne 2010
Sensibilité combinée sang capillaire + sérum
Sérum> Sang capillaire > salive
• Diminution affinité Ag-Ac à cause de l’hémolyse
• Dilution des Ac dans le sang total
• Durée contact Ag-Ac plus courte sur TROD
• Réaction à température ambiante au lieu de 37°C
Moins adaptés à la primo-infection
Etude comparative
Population étudiée: 64 patients en primo-infection ou infection VIH très récente
Pandori et al, JCM 2009
36
37
Pavie et al, PlosOne 2010
TROD et diversité VIH
La bande contrôle reste bleu
. opérateur dépendant
. contrôle de qualité difficile hors laboratoire
Tests Rapides d’Orientation Diagnostique
40
TROD 4ème génération: Determine Combo(Ac+AgP24 (12,5 – 25 pg/mL)
Laperche et al, JID 2012
Algorithme d’interprétation des TROD
TROD Négatif
VIH négatif
VPN 100% si
exposition > 3mois
TROD Positif ou indéterminé
Nouveau prélèvement
ELISA 4G et WB
ELISA 4G +
WB +
ELISA 4G -
WB + ou -
ELISA 4G +
WB +/- ou -
Réaction non
spécifique
Erreur d’identification
PI probable Infection VIH
Contrôle sérologique
charge virale 41
Attention prise tt
Cas pratiques (A. Maillard, Rennes 2012)
Patient 1
Patient 2
Patient 3
Patient 4
4
4
Patient 5
Patient 6
Délai de 1ère positivité des TROD
11-12 14-15 20-21 30
Temps (jours)
anti-gp 160
anti-gp 120
anti-gp 41
anti-p24
Contage J 0
taux
des marqueurs
Ag p24
seuil de détection
des marqueurs
Délai de 1ère positivité des TROD
3ème
génération
4ème
génération
Risque majeur de transmission
40 50
Sensibilité équivalente aux tests EIA 3ème génération pour les
TRODs les + performants
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