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DNA 손상에 의한 ATM 활성화와
H2AX 작용기구 해석
강종석․이 재
머 리 말
21세기는 지식과 정보가 그 국가의 경쟁력을 좌우하는 지식
기반 산업사회로 나아가고 있으며, 최고가 아니면 살아남을
수 없는 무한경쟁시 가 되어가고 있습니다. 이러한 변화 속
에서 각 국가에서는 미래 유망기술(Emerging Technology)을
선정하여 국가 역량을 집 함으로써 차세 국가경쟁력을 확
보하려는 여러 가지 노력을 기울이고 있습니다.
최근 우리나라에서도 미래 유망기술에 한 심이 어느 때
보다도 증 되고 있는 가운데, 한국과학기술정보연구원에서는
과학계량학 인 방법으로 미래 국가 유망기술을 측하기
한 일련의 연구를 수행하고 있습니다.
본 보고서는 과학기술정보데이터베이스(SCIE)에서 최근 6
년간 분야별 피인용도가 높은 핵심논문들을 가지고 정보계량
학 인 분석을 행하여 선정된 핵심 유망 연구 역에 해
련 국내 문가들의 자문을 토 로 작성된 R&D 동향보고서입
니다. 본 보고서가 련 과학기술정보를 국내에 확산시키고,
미래 국가유망기술의 략 육성을 한 연구개발 활동에 작
으나마 도움이 되었으면 합니다.
마지막으로 본 보고서를 집필한 자들의 노고에 감사드리
며, 본고의 내용은 한국과학기술정보연구원의 공식의견이 아
님을 밝 둡니다.
2005년 12월
한국과학기술정보연구원
원 장
ⅰ
목 차
제1장 서 론 ······················································································1
1. 연구의 배경 ·····························································································1
2. 연구의 방법 ·····························································································2
제2장 기술의 개요 ·············································································3
제3장 H2AX의 역할 ·········································································7
1. double-strand break 치로의 γ-H2AX와 repair factor의
colocalization ···························································································7
2. IR이후 repair factor의 순차 결합 ······················································8
3. DNA damage 후 foci로의 Brca1 recruitment ······································9
4. wortmannin은 radiation-induced foci 형성을 해한다. ····················11
5. repair-deficient cell에서의 γ-H2AX foci 형성 ····································12
제4장 분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한 ATM 활성화 ····15
1. IR에 의한 ATM의 자동인산화 ····························································15
2. active monomer로의 ATM의 분리 ·····················································18
3. ATM 활성화에 련된 세포내 신호 ···················································19
제5장 DNA strand break에 의한 ATR 활성화 ·························23
제6장 결론 제언 ·········································································25
참고 문헌 ··························································································29
ⅲ
그림 목차
<그림 1> DSB에 의해 유발되는 ATM고 ATR의 활성화 ·························24
1
제1장
서 론
1. 연구의 배경
○ 21세기 지식기반사회에서 과학기술경쟁력은 국가경쟁력
의 원천이며, 이에 세계 각국들은 미래의 경쟁에 살아남
기 해 핵심기술과제를 선정하여 연구개발에 박차를
가하고 있음.
○ 우리나라 과학기술부도 2005년 6월 ‘미래국가유망기술
원회’를 구성하여 ‘과학기술 측조사(2005-2030)’ 결과
(2005년 5월, 국가과학기술 원회 보고)에서 도출된 기
술후보군을 바탕으로 『미래 국가유망기술 21』을 선정
하여 발표한 바 있음.
○ 한 한국과학기술정보연구원(KISTI)에서는 2005년 SCIE
논문데이터베이스를 이용한 정보계량학 분석을 통해
『미래 유망연구 역 선정연구』를 시도하 으며, 본 보고
서는 그 결과에 기 하여 최근 2～3년간 논문의 인용도가
속히 높아지고 있는 유망 연구 역을 심으로 기술논
평 형식으로 풀이한 심층 Expert Review임.
2 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
2. 연구의 방법
○ 한국과학기술정보연구원에서는 SCIE 데이터베이스에 등
록된 논문(1999~2005년 상반기까지 발표된 논문) 에
서, 각 연도 각 분야별( 분류 22분야)로 피인용수
가 상 1%인 고인용 논문(HCP; Highly cited papers)
을 추출하고 공인용분석(Co-citation analysis) 동시단
어분석(Co-word analysis) 등의 과학계량학 방법들과
문가 평가(Expert evaluation)를 통해 ‘미래 유망연구
역’을 도출하 음.
○ 상기 도출된 미래 유망연구 역 에서 통계학 방법으
로 최근 논문의 인용도가 격히 상승하는 연구 역을
과학기술 분야별로 추출하여 본 테크이슈 보고서의 주제
로 삼았음.
○ 본 보고서는 DNA damage에 의한 ATM 활성화와
H2AX 작용기구 해석에 있어서 최근 많이 발표되고 있
는 논문들을 종합하여 련 분야 연구에 한 기 지
식과 함께 세계 인 연구동향을 개 으로 살펴보고,
미래 핵심기술로 자리잡기 한 연구개발 략을 제시
하 음.
3
제2장
기술의 개요
○ 진핵세포에서 double-strand break이 발생하게 되면 다
양한 반응이 일어나는데 즉 cell cycle arrest, DNA
repair factor의 재배치 혹은 apoptosis등이 일어난다. 세
포내 기능을 arrest하지 않는다면 게놈의 불완 성이 크
게 증가하며 발암에도 계된다. DNA repair나 damage
존재에 한 신호 달에 계하는 것으로 알려진 여러
factor가 double-strand break 이후 커다란 nuclear
domain(foci)에 축 되게 된다(1-6).
○ 를 들어 Mre11-Rad50-Nbs1(MRN) complex가 ionizing
radiation(IR)에 노출된 후에 형성되며(1) 이들 foci는
damage를 받은 DNA가 포함되는 부분에 치하게 된다(7).
Saccharomyces cerevisiae에서도 Mre11-Rad50-Xrs2
complex가 non-homologous end joining(11,12), meiotic
recombination(9,10,13)
, telomere 유지(14-16)
뿐만 아니라 IR
노출에서도 기능하며(8-10)
homologous recombination에서
도 기능한다(17,18). MRN complex는 exo-와 endonuclease
활성을 가지고 있는데 이를 통해 double-strand break의 repair
과정에서 DNA end processing을 담당하게 된다(19-21)
.
4 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
○ 진핵생물의 RecA homolog인 Rad51은 DNA damage 후
single-stranded DNA에 foci를 형성하고 MRN과 달리 S
phase동안 비처리된 세포에서도 foci를 형성한다(22)
. 흥
미롭게도 Rad50 foci와 Rad51 foci는 damage후에 동일
한 세포에서는 거의 발견되지 않는데(1,23) 이는 상호 배
타 인 repair과정이 존재함을 의미한다. Brca1 tumor
suppressor gene 생성물은 Rad50 혹은 Rad51과는 별도
로 모이게 되는데 이를 통해 DNA double-strand break
repair에 Brca1이 기능한다는 것을 상할 수 있다(4,23)
.
○ double-strand break가 일어나게 되면 제일 처음 세포내
에서 일어나는 반응 하나는 진핵세포의 세 종류의
H2A 분자의 하나인 H2AX의 인산화이다(24)
. H2AX의
독특한 C-terminal tail에 존재하는 Ser 139이 damage
후 1-3분 안에 인산화 되며 인산화 된 H2AX 분자의 수
는 damage가 심할수록 그에 비례하여 증가한다.
double-strand break를 도입할 경우에는 이러한 반응이
일어나나 다른 종류의 damage 즉 UV 조사에 의해서는
일어나지 않는다. 인산화 된 형태의 H2AX(γ-H2AX)에
특이 인 항체가 최근 생산되어 이를 이용하여 γ-H2AX
는 DNA damage가 일어난 치의 chromatin domain에
치함을 알게 되었다(25)
.
○ double-strand break가 일어난 후 H2AX의 특이 인 변형
은 매우 빠르게 일어나는데 이 게 인산화 된 분자의 foci
가 시간 으로는 훨씬 뒤에 찰되는 repair factor의 foci와
련이 있는지 여부를 연구하 다. 그 결과 핵에서 형성되
제2장 기술의 개요 5
는 γ-H2AX 분자의 기 패턴이 후의 recovery과정에서 발
견되는 damage-induced foci의 Rad50과 Rad51의 패턴과
일치하 다. Brca1 역시 recruit되는데 그 시기는 두 종
보다 선행하 다. kinase inhibitor wortmannin을 사용해
H2AX 인산화를 방해하거나 kinase가 결핍된 cell line을 사
용하여 인산화 된 H2AX가 DNA damage 후 repair factor
에 의한 foci 형성 개시에 기능한다는 것과 H2AX 활성화에
phosphoinosite(PI)-3 kinase가 계한다는 것을 밝 냈다.
○ 인간 질병 ataxia-telangiectasia(AT)에서 돌연변이 되어
있는 유 자인 ATM은 DNA에 double-strand break를
일으키는 방사선이나 기타 약제에 노출된 후에 나타나는
포유류 세포의 신호 달과정 개시에 요하다(26,27)
. AT
환자의 세포에는 개 ATM 단백질이 결핍되어 있으며
telomere morphology상의 비정상이 보이고 IR에 비정상
인 반응을 보여 세포사 증가, chromosome break 증가,
cell-cycle checkpoint 결함이 나타난다(28). 더욱이 AT
환자는 진 인 소뇌 기능장애, 면역결핍, 생식능력 감
퇴, 방사선 민감성, 조로, 암 험 증가를 겪게 된다.
○ ATM 유 자는 지질보다는 단백질을 주로 인산화 시키
는 phosphoinositide 3-kinase(PI(3)K) superfamily(29,30,31)
에 속하는 370kDa크기의 단백질을 encoding한다. 이 거
단백질 C-terminal에 치한 350개의 아미노산으
로 된 kinase domain이 ATM의 주된 기능을 담당한다.
세포가 IR에 노출되면 ATM kinase 활성이 나타나며 이
기능이 cell cycle에서 G1, S, G2 phase의 arrest를 해
6 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
필요하다(27)
. ATM kinase의 수 개의 기질이 이러한 IR
에 의한 cell cycle arrest과정에 여한다. 여기에는 G1
checkpoint에서 p53, Mdm2, Chk2(30-34)
, S phase arrest
에서 Nbs1, Brca1, FancD2, SMC1(35-41)
, G2/M
checkpoint에서 Brca1, hRad17이 포함된다(42,43).
○ 진핵세포가 DNA strand break를 인식하는 자세한 기작
에 해서는 아직 더 연구되어야 할 것이나 IR후에 나
타나는 빠른 ATM kinase 활성은 ATM kinase가 포유
류 세포에서 신호 달의 기 단계에 작용함을 시사한다(29,30). transfected ATM은 phosphoprotein으로서 ATM
kinase 활성이 번역 후 모사에 의해 조 될 확률을 높여
다. ATM에서 IR에 의해 유발된 인산화가 일어나는
치가 확인되었다. 이는 분자간 자동인산화과정을 통해
일어나며 이러한 인산화 과정의 기능상 요성도 탐구되
었다. 인산화 과정 자체가 직 으로 kinase의 활성을
조 하지는 않으나 신 ATM oligomer를 붕괴시켜
ATM kinase domain에 기질이 근가능 하도록 한다.
반응의 신속성과 화학량론을 고려하면 ATM은 직
으로 DNA strnad break에 결합하여 활성화되지는 않으
며 이보다는 DNA damage로 인해 chromatin 구조상의
격한 변화가 일어나 ATM 활성을 개시하는 모델을
상정할 수 있다.
7
제3장
H2AX의 역할
repair factor의 nuclear foci로의 recruitment
1. double-strand break 위치로의 γ-H2AX와 repair
factor의 colocalization
○ breast tumor line MCF7을 laser scissor 기법(25)
으로 조
사하고 30분간 recover 시간을 후 고정하고 항체를
이용해 면역 염색하 다. γ-H2AX과 Rad50에 한 항체
를 이용한 결과 두 분자들은 세포 핵에서 laser를 쏘아
경로를 따라 특이 으로 치하 다. 즉 MRN
complex는 double-strand break이 치하는 곳에서
H2AX 인산화가 일어나는 지 에 치한다.
○ 면역형 연구에 의하면 Brca1는 DNA damage후에 Rad51
과 함께 foci에 모이게 된다(4). Brca1과 γ-H2AX간의 계
를 알기 해 laser scissor를 이용해 double-strand break를
도입하고 각 단백질에 특이 인 항체를 이용하 다. 그 결
과 Brca1은 DNA break line과 γ-H2AX에 정확하게 일치
하여 치하 다. 이러한 패턴은 γ-H2AX 패턴을 가진 세
포의 체는 아니지만 부분에서 나타났다. Brca1이
MRN complex와 같이 치한다고 보고되었기 때문에(23)
8 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
Brca1과 Nbs1 항체를 조합하여 시도하 고 두 factor가 자
주 DNA break line에 함께 치한다는 사실을 발견하 다.
그러나 몇 개의 세포에서는 Nbs1 염색패턴은 나타내나
Brca1 염색패턴은 나타내지 않았다. laser scissor를 이용한
연구결과에 의하면 MRN complex와 Brca1은 실제로 γ
-H2AX와 DNA double-strand break 치에 치하나
Brca1과 MRN의 결합은 일부에서만 발견되었다.
2. IR이후 repair factor의 순차적 결합
○ 조사량이 을 경우와 laser scissor에 내성이 덜한 cell
line에 해 연구하기 해 표 인 137Cs source를 사용
하여 double-strand break를 유발하 다. 보통의
fibroblast line IMR90에 12 Gy 조사 후 시간에 따른
foci 형성 과정을 항체를 이용해 조사하지 않은 세포와
비교하 다. 조사하지 않은 IMR90 세포에서는 γ-H2AX
에 해 분명히 구별되는 2개의 집단을 찰할 수 있었
다. 90-95%의 세포에서 γ-H2AX 염색이 상당히 약하고
퍼져있었으며 반면에 5-10%의 세포에서 하나 는 수
개의 밝은 γ-H2AX foci를 찰하 다. 이 소수의 세포
군집에서 Rad50 foci와 같이 치한 γ-H2AX foci는 거
의 없었는데 이는 MRN complex가 방사선 조사가 없는
상태에서 일어난 double-strand break에 recruit되었다는
것을 의미한다.
제3장 H2AX의 역할 9
○ IMR90 세포를 12 Gy IR에 노출시킨 후 γ-H2AX foci는
100%의 세포군집에서 나타났다. 반면에 Rad50 foci는
더 늦게 수 시간에 걸쳐 나타났다. 를 들어 2시간에서
γ-H2AX foci는 존재하나 Rad50 foci는 존재하지 않았다.
그러나 Rad50 foci가 조사 6-8시간 후에 나타났을 때 그
치는 이미 존재하던 γ-H2AX foci와 상당히 일치하
다. 후반에는 감소하기는 하 으나 최소 24시간에 걸쳐
Rad50은 γ-H2AX와 같이 치하게 되었다. NIH Image
로그램을 이용하여 정량 분석을 한 결과 γ
-H2AX-Rad50 colocalizing foci의 수는 차 증가하여
조사 후 6-8시간에서 최 치에 이르며 이때 략 70%의
γ-H2AX foci가 Rad50 foci와 일치하게 된다.
3. DNA damage 후 foci로의 Brca1 recruitment
○ IMR90 세포에서 Brca1 foci 형성의 시간경과에 따른 과
정을 조사한 결과 Rad50 colocalization 과정과는 상당히
다름을 발견하 다. 조사 10-15%의 세포군집이
Brca1 foci를 보 으며 이들 세포 약 50-70%가 γ-
H2AX foci와 같이 치하는 최소한 하나의 Brca1 foci
를 가지고 있었다. 12 Gy 조사와 45분의 recovery후
S-phase Brca1 foci가 사라졌다. 2시간의 recovery후
10-15%의 세포에서 Brca1 foci가 나타났고 이들 세포에
서 부분의 Brca1 foci는 γ-H2AX foci와 겹쳐졌다. 시
각분석과 정량분석 결과 Brca1/γ-H2AX colocalized foci
10 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
의 도는 조사 2시간 후 최 에 이르며 이는 Rad50/γ-
H2AX foci보다 상당히 빠른 것이다. Brca1 foci가 이 시
간 에 가장 밝게 나타난 것은 아니지만 최소한 60%의
Brca1 foci가 핵 내에서 조사 2시간 후의 γ-H2AX foci
와 일치하 다. Brca1이 γ-H2AX와 함께 치하게 되는
상은 6시간에 걸쳐 계속되었다. 따라서 찰된 foci 형
성의 순서는 γ-H2AX이 가장 먼 고 그 후에 Brca1,
MRN이 따르게 된다.
○ IR후 Rad51 foci의 출 에 해 검사한 결과 이들 foci는
IMR90 세포의 소수에만 존재하고 이들 소수 세포들은
Brca1 foci를 나타낸 것들과 겹친다는 사실을 발견하
다. 조사하지 않은 세포를 Rad51 항체로 염색한 결과 S
phase Rad51 foci는 γ-H2AX foci와 거의 겹치지 않았
다. 12 Gy 조사와 2 시간의 recovery 후 Rad51과 Brca1
foci는 10-15%의 세포에서 분명하게 나타났으나 Rad51
foci와 γ-H2AX foci간에는 겹치지 않았다. 그러나 6시간
후 Rad51 foci가 20-25%의 세포에 존재하 으며 Rad51
과 γ-H2AX간에 분명한 일치를 찰하 다. 다른 시간
에서 Rad51과 Brca1의 결합을 탐구한 결과 이들의
colocalization은 차 으로 증가하여 6시간의 recovery
후 최소한 55%에서 같이 치하 다. 일반 으로 Rad50
과 Rad51은 같은 세포 핵에서는 발견되지 않았다. 즉
Rad51-γ-H2AX colocalization은 비록 다른 세포 군집에
서 일어나기는 하 으나 Rad50-γ-H2AX의 경우와 유사
하며 Brca1이 γ-H2AX와 colocalization한 후의 recovery
과정에서 일어났다.
제3장 H2AX의 역할 11
○ SV40-transformed human fibroblast line인 SVG p12 세
포를 이용한 경우에도 비록 나타나는 시간과 Rad51과
Rad50 foci의 비율은 달랐으나 foci 형성 순서는 동일하
다. 즉 γ-H2AX이 먼 일어나고 다음으로 Brca1-γ-
H2AX, 그 다음으로 Rad50-γ-H2AX 혹은 Rad51-γ-
H2AX colocalization이 각기 다른 세포에서 일어났다.
4. wortmannin은 radiation-induced foci 형성을 저
해한다.
○ 비처리된 MCF7 세포와 비교하여 30분동안 wortmannin
과 incubation하고 12 Gy 조사한 세포는 γ-H2AX foci가
히 고 그 밝기도 떨어졌다. 이 세포들을 Brca1과
Rad51에 특이 인 항체로 염색한 결과 wortmannin을
preincubation하면 이들 단백질들에 의한 foci 형성도 완
히 제거됨을 알게 되었다. 반면에 wortmannin을 조사
후 5분 안(γ-H2AX foci는 나타나나 Brca1-Rad51 foci는
나타나기 )에 첨가하면 모든 foci가 정상 으로 나타
났다. 그러므로 foci 형성에서 wortmannin에 민감한 단
계는 조사에 한 반응에서 기에 해당하며 γ-H2AX
인산화 과정일 것이다. wortmannin에 의해 γ-H2AX
foci 형성을 제거하면 다른 factor에 의한 foci도 형성되
지 않는데 이는 γ-H2AX 인산화가 이 과정에서 필수
이라는 것을 의미한다.
12 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
5. repair-deficient cell에서의 γ-H2AX foci 형성
○ DNA dependent protein kinase(DNA-PK)가 완 히 결
핍되어 있고(48) ATM 단백질은 극히 소량만을 가진 것
으로 알려진(45-47)
M059J 세포에 IR을 조사하여 그 반응
을 찰하 다. 놀랍게도 M059J 세포는 정상 인 성장
조건에서도 높은 수 의 γ-H2AX foci를 나타났다. 이
세포들을 IR에 노출시켜도 세포당 foci수가 증가하지는
않았다.
○ 더욱 정확한 찰을 해 더 강한 IR을 조사하고 2
dimensional electrophoresis를 통해 인산화와 비인산화 γ
-H2AX 수 을 비교한 결과 DNA-PK-positive 세포에
서는 recovery 시간에 인산화된 형태의 histone이 격
히 증가하여 최 약 70%의 세포내 H2AX가 인산화
되었다. M059J 세포에서는 γ-H2AX의 양이 조 증가
하 으나 정상 인 cell line에 비교하 을 때 수배 감소
된 수치 다. 이러한 결과에서 DNA-PK와 ATM이 없
을 경우 γ-H2AX 응이 히 감소하나 완 히 제거
되지는 않음을 알 수 있다. 이는 다른 종류의 kinase에
의한 것이다.
○ Nijmegen breakage syndrome(NSB) 유 자가 돌연변이
되어 있는 NBS cell line의 경우 IR에 노출 후 높은 수
의 chromosone aberration이 나타났으며(48) MRN foci
를 보이지 않았다. M059J cell line과 같이 조사하지 않
제3장 H2AX의 역할 13
은 culture에서 높은 수 의 γ-H2AX foci가 찰되었다.
어도 50-70%의 조사하지 않은 세포가 γ-H2AX foci를
나타내었으며 정상 인 fibroblast의 경우에는 5-10%이
다. NBS 세포는 chromosome의 불안정성이 높기 때문에
γ-H2AX foci가 많다는 것은 이러한 세포에서
double-strand break가 많이 일어난다는 것을 시각 으
로 보여주는 것이다. 그러나 M059J 세포와는 달리 NBS
세포는 2 Gy에 노출된 후에는 γ-H2AX foci수가 5-10배
증가하 다. 더욱이 이들 세포에서 Brca1과 Rad51이 정
상 으로 γ-H2AX와 colocalization되었다. 즉 이러한 반
응에 MRN foci 형성이 필수 이지는 않다.
15
제4장
분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한
ATM 활성화
1. IR에 의한 ATM의 자동인산화
○ 세포가 IR에 노출되게 되면 transfected ATM과
endogenous ATM 모두에서 도입되는 32P-orthophosphate
의 양이 증가하게 된다. kinase가 불활성화된 ATM의 경우
에는 IR후에도 증가하지 않는다. 방사성 phosphate의 도입
은 in vitro ATM kinase 활성 실험에서도 나타난다(30,49)
.
이러한 in vitro ATM 인산화는 kinase가 불활성화된
ATM 단백질에서는 나타나지 않으며 30nM wortmannin
에 의해 해되고 마그네슘 첨가에 의존 이며 exogenous
DNA 첨가에는 의존 이지 않다. ATM의 기질 인산화 역
시 동일한 성질을 보인다(30,49,50). 이러한 찰 모두가 ATM
이 자신을 인산화 시킨다는 모델에 잘 들어맞는다. 인산화
되는 아미노산의 종류를 확인하기 해 trypsin 처리한 조
각들을 2D 기 동 등을 통해 조사한 결과 Ser이었다.
○ 인산화 되는 Ser의 정확한 치를 알기 해 Edman
degradation 등 다양한 실험을 통한 결과 그 서열은
16 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
1974-SLAFEEGSPQSTTISSLSEK-1992 이었으며 1981
Ser이 인산화되는 것으로 측되었다. Ser 1981은
mouse와 Xenopus ATM에서는 보존되었으나 덜 복잡한
metazoan의 homologue에서는 발견되지 않았다. Ser
1981은 FAT domain의 N-terminal에 치하 으며 이
지역은 략 500 아미노산으로 이루어지며 Frap, ATM,
Trapp을 포함하는 PI(3) kinase family에서 보존되는
부분이다(51). Ser이 'SQ' site에 있기 때문에 자동인산화
나 ATM family member에 의한 인산화가 상된다(49)
.
○ Ser 1981의 인산화된 형태와 비인산화된 형태를 인식하
는 각각의 polyclonal 항체(anti-1981S-P, anti-1981S)를
생산하 다. 10 Gy 조사후 30분내에 anti-1981S를 이용
해 검출한 야생형 ATM은 수배 감소하 으나 kinase 불
활성 ATM은 변화가 없었다. 반 로 IR후 anti-1981S-P
결합은 수배 증가하 으나 kinase 불활성 ATM은 향
이 없었다. anti-1981S 결합이 감소한다는 것은 세포내
총 ATM의 많은 양이 IR후 Ser1981에서 변형이 일어난
다는 것이다. 인산화에 특이 인 항체를 이용하여 검출
된 ATM은 cell-cycle상의 변화에 의한 것은 아니다. 왜
냐하면 IR 조사 후 한시간 내에는 cell-cycle상에 큰 변
화가 없었고 IR이나 UV를 조사한 후 G0에 고정되어 있
는 fibroblast에서도 이러한 인산화가 발견되었기 때문이
다.
○ ATM 자동인산화는 다음과 같은 증거에 의해 제시되었
다. 첫째 IR후 in vivo, in vitro에서 phosphate의 도입은
제4장 분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한 ATM 활성화 17
ATM kinase 활성에 의존 이며 둘째 wortmannin에 민
감하다는 것, 셋째 target Ser이 ‘SQ' site라는 이다.
1981 치에 Ser residue를 가지고 있는 polypeptide는 in
vitro에서 ATM kinase의 훌륭한 기질이 되는데 이는
ATM이 이 치를 인산화 할 수 있다는 것이다. 더욱이
20μM 혹은 그 이상의 wortmannin은 human diploid
fibroblast의 IR후 Ser1981 인산화를 해한다. 이 농도의
wortmannin은 in vivo에서 ATM과 DNA-PK 모두를
해하지만 ATR(ataxia-telangiectasia와 Rad3에 련된)
은 해하지 못한다(50)
. IR에 의해 유발되는 Ser1981 인
산화의 kinetics와 수 은 DNA-PK 활성이 있는 cell
line에서도 그리고 없는 cell line에서도 각각 응하는
경우에 일치하 는데 이는 DNA-PK는 제외됨을 의미한
다.
○ ATM의 kinase가 불활성화된 돌연변이조차도 세포내에
서 어느 정도까지는 인산화될 수 있기 때문에 Ser1981
의 인산화에서 ATM kinase 활성의 요성을 더욱 확실
히 하기 해 ATM kinase 활성의 근원이 transgene에
서만 나타나도록 실험하 다. 그 결과 kinase 불활성화
된 ATM의 인산화가 transfection 후 어느 정도 찰되
었지만(이 경우 endogenous ATM 활성은 가지고 있다)
ATM kinase 활성이 없는 cell line으로 transfection한
경우 Ser1981에 인산화를 검출할 수 없었다. 즉 Ser1981
의 인산화는 ATM kinase 자체의 활성에 의존하며
transfection된 kinase 불활성 ATM의 인산화는 다른
kinase에 의한 것이다.
18 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
2. active monomer로의 ATM의 분리
○ Ser1981의 기능을 세분화하여 알아보기 한 연구가 진행되
었다. 야생형 ATM을 도입하면 AT 세포에 IR 유발 p53 인
산화가 복구되나 kinase가 불활성된 경우나 S1981A- ATM
의 경우에는 그 지 않았다. 반면에 S1981A-ATM의 in
vitro kinase 활성은 야생형 ATM과 다름이 없었다. HeLa
cell에 S1981A-ATM을 transfection한 경우 IR 유발 G2
checkpoint와 S-phase 복제 arrest를 kinase 불활성 ATM
construct와 구별할 수 없을 정도로 유사한 식으로 해한
다. IR 유발 cell-cycle checkpoint를 막는 것과 같이
S1981A를 transfection한 돌연변이도 endogenous ATM 단
백질의 Ser1981에의 IR 유발 인산화를 해하 다. 따라서
Ser1981의 돌연변이가 in vitro에서 ATM kinase 활성을 없
애지는 못했지만 S9181A-ATM의 발 은 AT 세포를 보완
하지 못하 고 endogenous ATM의 세포내 활성을
dominant-inhibitory하게 해하 다.
○ ATM의 세포내 활성에 해 Ser1981 돌연변이의 in
vitro에서의 효과의 차이에 한 원인을 탐구하기 해
ATM domain과 단백질-단백질 결합에 해 생화학
으로 연구하 다. 이에 의하면 kinase domain과 인산화
domain은 서로 안정 으로 결합하며 Ser1981 의 서열
이 이 결합에 요하다. Ser1981을 인산화 된 Ser과 유
사한 하를 띤 side chain을 가지고 있는 Asp나 Glu로
돌연변이 시키면 이 결합이 일어나지 않는데 이는
제4장 분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한 ATM 활성화 19
Ser1981의 인산화가 이 domain이 kinase domain과 결합
하는 것을 막아 다는 의미이다.
○ ATM의 Ser1981 domain이 ATM의 kinase domain과 결
합할 때 cis 혹은 trans로 결합하는지 단백질 complex를
이루고 있는지를 조사하기 해 formaldehyde등으로 고
정하고 면역침 시키는 등의 방법으로 실험하 다. 그
결과 보통의 세포에서 ATM은 dimer 혹은 더 높은 차
원의 multimer로 존재하며 DNA damage 후 complex
분리에는 분자간 ATM Ser1981 인산화가 필요하다는 것
을 확인하 다.
3. ATM 활성화에 관련된 세포내 신호
○ IR 후의 ATM 자동 인산화의 kinetics, 반응성, 화학량론
을 연구한 결과 DNA strand break이 일어날 경우에 상
당히 민감하게 ATM 인산화가 일어남을 확인하 다(52,53). 한 제한효소에 의해 몇 개의 DNA break을 도
입한 경우에는 ATM 인산화가 찰되었다(54)
.
○ DNA damage 후 인산화 되는 세포내 ATM 단백질의
비율을 확인한 결과 기하 수 으로 성장하는 primary
human fibroblast culture의 경우 0.5 Gy IR에 노출된
후(18 DNA break 추정) 15분간 50% 이상의 세포내
ATM이 자동 인산화 되었다.
20 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
○ 비교 소수의 DNA strand의 존재 하에 상당한 비율의
세포내 ATM이 빠르게 인산화 된 으로 미루어 활성
화와 자동 인산화를 해 ATM oligomer가 직 DNA
strand break에 결합하지는 않을 것이다. 이러한 찰은
DNA strand break이 일어날 경우 break이 일어난 지
자체로부터는 거리가 떨어진 곳에서 ATM을 활성화시
킬 수 있는 핵내 변화가 일어나리라는 것을 시사해 다.
IR에 노출되어 DNA strand break이 일어날 경우 DNA
상의 topological constraint가 격히 변화하기 때문에(55-57) chromatin 구조상의 변화에 의해 핵 내에서 이와
는 떨어져 있는 지 에서 격한 변경을 가져올 수도 있
을 것이다. chromatin과 chromosome 구조는 DNA
break이 없더라도 hypotonic 조건에 의해 변경될 수 있
는데(58,59)
이를테면 chloroquine에 노출되거나(60-62)
histone deacetylase inhibitor를 처리하는 경우에 가능하
다(63-65). 세포를 mild한 hypotonic buffer에 노출시키거나
혹은 이 두 chromatin-modifying 약제에 노출시키면
ATM 단백질에 격하고도 리 퍼진 인산화가 일어남
을 면역형 법 등에 의해 확인하 다.
○ 이러한 처리에서 histone H2AX의 인산화나 인산화 된
ATM이나 γ-H2AX의 foci가 찰되지 않았기 때문에
이들 처리가 DNA break를 일으킨다는 증거는 없다(66)
.
흥미롭게도 이들 chromatin-modifying 처리는 p53을 인
산화하게 되는데 ATM에 의한 p53의 인산화는 DNA
break 치에서는 일어나지 않는다. 반면에 IR 조사를
제4장 분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한 ATM 활성화 21
단독으로 처리하 건 다른 처리와 함께 처리하 건
ATM과 H2AX의 인산화는 분명하다. 더욱이 이들 세
처리는 최 치이하의 IR(0.2Gy)에 세포를 노출시킨 후
보이는 ATM 인산화의 양을 증가시킬 수 있었다. 인산
화된 ATM의 면역형 염색 패턴에 의해서도 정보를 얻
을 수 있는데 IR 처리 후 가장 이른 시간에는 염색은
핵에 걸쳐 리 퍼져 있었다. 그러나 수분 후에는 일부
foci가 리 퍼진 핵내 염색에 더하여 찰되었다. 다른
chromatin-modifying 약제를 처리한 경우 리 퍼진 염
색은 찰되었으나 foci는 찰되지 않았다. 즉 ATM이
리 퍼져 활성화되고 일부의 ATM 단백질이 IR에 의
해 발생한 DNA break 치로 이동되어 아마도 break
치에서 기질을 인산화 할 것으로 보인다.
23
제5장
DNA strand break에 의한 ATR 활성화
○ 최근 delayed DSB(DNA double-strand break)-induced
intra-S-phase 신호경로에 여하는 것으로 알려진
ATR kinase의 기작을 설명하는 모델이 제안되었다(67)
.
ATR은 IR에 의해 DSB 치에 생기는 핵내 foci도 형
성하며 효소 활성면에서 불활성화 된 ATR의 과발 은
IR에 의해 유발되는 S-phase checkpoint를 손상시킨다.
DSB-ATR의 연계의 주된 특징은 DSB recession(즉
DNA 말단의 효소 단)이 필요하며 이로 인해
single-stranded DNA(ssDNA)가 생성된다는 것이다. 이
는 ATM의 경우와는 구별되는 특징이다. 뒤이어
ssDNA를 RPA가 감싸게 되면 ATR interacting
protein(ATRIP)-ATR complex가 모이게 된다. 여기에
다른 factor들도 모여 ATR 기질의 인산화를 도와
checkpoint 신호가 개시되도록 한다.
24 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
<그림 1> DSB에 의해 유발되는 ATM고 ATR의 활성화
25
제6장
결론 및 제언
○ 최근 몇 년간 S-phase checkpoint를 비롯해 DNA damage
에 한 세포내 반응에 해 상당한 이해가 이루어졌다.
이러한 checkpoint의 생물학 요성은 이러한 과정에
결함이 있는 세포나 생명체의 표 형을 살펴보면 확연하
다. 그러한 연구를 통해 효모에서 인간에 이르기까지 진핵
생물에서 S-phase checkpoint의 심 한 역할을 발견하게
되었다. 를 들어 intra-S-phase DNA-damage
checkpoint에 결함이 있어 나타나는 Ataxia telangiectasia,
Nijmegen breakage syndrome과 같은 질병뿐만 아니라 심
각한 신경퇴화, 면역결핍 그리고 몇 종류의 암에 쉽게 걸
리는 상이 나타난다. 환자나 종양의 checkpoint 상태도
방사선과 화학요법과 같은 DNA에 피해를 주는 치료법의
결과에 향을 주기 때문에 치료효과를 측하거나 그러
한 치료를 최 화하고 checkpoint 결함을 가진 암을 선택
으로 제거하는 새롭고 정교한 치료 략을 수립하기
해 한 노력이 checkpoint 결함을 이용하는 연구에 투
자되어왔다(68).
○ checkpoint 개념에 해서는 복제, 재조합, repair등 다양
한 DNA 처리에 여하는 checkpoint sensor, mediator,
단백질간의 흥미로운 연결 계가 나오고 있다. 이들 연
26 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
결 계와 상호 신호 달 과정, checkpoint 신호과정에서
phosphatase의 역할, checkpoint로부터의 회복 등에 한
더 정확한 이해는 앞으로의 도 과제가 될 것이다. 한
ATR 활성화가 DSB에 반응하여 시간 으로 지연이 있
다는 사실을 탐구하는 것도 요할 것이다. Seckel
syndrome을 가진 환자의 ATR 발 에 향을 주는
splicing mutation이 밝 진 것(69)
이 이 문제에 큰 도움
이 될 것이다. 다른 요한 문제는 checkpoint가 어떻
게 chromatin remodelling과 사에 향을 미치며 어떤
기작에 의해 결과 으로 세포가 다시 증식할 것인지 아
니면 cell-cycle상에서 정지하거나 사멸할 것인지가 결정
되는가라고 할 수 있다. checkpoint에 의해 유발되는
chromatin 조 과정의 하나로 악되는 것이 순간 인
ATM/ATR-CHK1에 의존한 인간 TLK1고 TLK2의
해를 들 수 있다. TLK1, TLK2는 서로 련된 S-phase
kinase로서 chromatin assembly factor ASF1을 조 한
다(70,71).
○ intra-S-phase checkpoint 과정에서 해결해야 할 특정 문
제 에서 요한 것으로 DNA-damage sensor의 확인,
checkpoint mediator의 역할에 한 더 정확한 이해 등을
들 수 있다. 이외에도 ssDNA gap에 응하여 Xenopus
laevis CDC7-DBF4 kinase(발생계통학 으로 보존된
S-phase kinase)의 ATR과 RPA 의존 해(72,73)
도 명확
히 해야 할 것이다.
○ 살아있는 세포를 직 시각 으로 찰할 수 있는 live-
제6장 결론 및 제언 27
cell imaging 기술의 발 도 의심할 여지없이 이루어져
야 할 것이며 이를 통해 단백질-단백질 결합의 동 분
석이 용이해질 수 있을 것이며 더 나아가 실시간으로
인산화 과정을 직 으로 악할 수도 있을 것이다.
지난 수년간은 이 분야에서 단히 생산 인 기간이었
으며 앞으로도 더 많은 흥미로운 발견들과 연구를 통해
더욱 확실한 정보를 얻게 된다면 생물 의학 측면에서
의 그 가치는 따로 언 할 필요가 없을 것이다.
29
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Mol. Cell 11, 203-213 (2003).
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kinase: target of the S phase checkpoint? EMBO Rep. 1,
319-322 (2000).
저자소개 자문위원
강 종 석
․공학박사
․ , 한국과학기술정보연구원 선임연구원
․ 서: BT분야 국가연구개발 심층분석,
리튬이차 지 등
이 재
․이학박사
․ , 한국과학기술기획평가원 선임연구원
․ , 한국과학기술정보연구원 선임연구원
․ 서: BT분야 국가연구개발 심층분석
평가 등
신 석
․이학박사
․ , 고려 생명공학원 선임연구원
BB091 강종석․이 재
DNA 손상에 의한 ATM 활성화와
H2AX 작용기구 해석
2005년 12월 19일 인쇄
2005년 12월 23일 발행
발행처
서울특별시 동 문구 청량리동 206-9
ꂕ 130-742
화 : 3299-6114
등록: 1991년 2월 12일 제5-258호
발행인
조 화
인쇄처
신기획
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